CN105175371B - 预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和食品组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和食品组合物，更具体而言，涉及作为有效物质含有由从南极地衣类的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物的预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和功能性食品。本发明的新型化合物具有非常优秀的抑制蛋白酪氨酸磷酸酶‑1b(protein tyrosine phosphatase‑1b)活性的作用，在蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中选择性地只对蛋白酪氨酸磷酸酶‑1b起作用，并能够作为实质性的蛋白酪氨酸磷酸酶‑1b抑制剂来应用于糖尿病的治疗中，对糖尿病和肥胖症的预防或治疗非常有效。

Description

预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和食品组合物
本申请是申请日为2011年07月01日、申请号为201180059184.3、发明名称为“预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和食品组合物”的发明专利申请的分案申请。
技术领域
本发明涉及用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和食品组合物，更具体而言，涉及作为有效成分含有由从南极地衣类的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物的预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和功能性食品。
背景技术
已知地衣类会产生与高等植物不同的独特的二次代谢物(Ingolfsdottir,K.,Phytochemistry,61：729,2002)，这些地衣类产生的二次代谢物大部分属于缩酚酸(depside)、缩酚酸环醚(depsidone)和二苯并呋喃(dibenzfurane)，推测这些化合物与地衣类较低的生长率有关联(Kumar,K.C.S.et al.,J.Nat.Prod.,62：817,1999；Huneck,S.,Naturwissenschaften,86：559,1999)。另外，通过筛查确认了包含抗生素、抗分枝杆菌、抗病毒、镇痛作用和解热作用等在内的地衣类代谢物的多种生物学活性(Ingolfsdottir,K.,Phytochemistry,61：729,2002；Kumar,K.C.S.et al.,J.Nat.Prod.,62：817,1999)。因此，对利用地衣类代谢物的医药品开发的关注日益增加。
另外，糖尿病是由于胰岛素作用、胰岛素分泌或该两种均有缺陷而发生的包括高血糖的代谢紊乱综合症，是未来血管并发症可能性高的疾患，主要可分为一型糖尿病和二型糖尿病。第一型(胰岛素依赖性)糖尿病的原因是免疫介导的胰岛β细胞的破坏及因此而导致的胰岛素的绝对缺乏，第二型(非胰岛素依赖性)糖尿病是因为虽分泌胰岛素，但分泌量不充分，或人的身体不能有效利用所分泌的胰岛素而发生的。在体细胞不能起到有效作用的“胰岛素抵抗(Insulin resistance)”状态下，由于不能有效利用体内的能源，尤其是不能有效利用体内的糖，因而缺乏必要的能源，而未能使用的糖在血液中堆积过量，结果，通过尿液排出。糖尿病是不能根治的慢性退化性疾病中的一种。
世界卫生组织(World health organization：WHO)和联合国(United Nations：UN)强调了到2007年末全世界糖尿病患者将达到约2亿4600万名，因糖尿病导致的死亡也在逐年增加，因此预防糖尿病的发生、严格的血糖控制及预防并发症是很重要的。而且，根据韩国糖尿病学会和健康保险审查评估院的调查结果，在韩国，2003年的糖尿病患者总数为401万名，到2030年将达到720万名，将每7名中有1名为糖尿病患者。尤其是，急速增加的医疗费不仅与糖尿病患者数的增加有密切的关系，而且与糖尿病并发症的持续增加及糖尿病患者的平均寿命的增加也有密切的关系。随着快速的经济发展，饮食生活的变化使平均寿命延长，但是糖尿病等慢性退化性疾病反而呈现增加的现象。
韩国的糖尿病的特征是第二型糖尿病占99％以上，第一型糖尿病的发病概率为约1％以下，这与国外所报告的第二型糖尿病为90％左右，第一型糖尿病为10％左右的情况不同。糖尿病的发病原因是多种要因复合形成的，其重要因素有遗传(家庭病史为约20％)和环境、年龄(40岁-49岁之间为约60％上下)、肥胖、身体的抵抗力低下、乱用药物和因压力的刺激等。糖尿病的发病机理尚未详细查明，但除了几种特殊的糖尿病(例如MODY等)之外，糖尿病是由于多个遗传因素而发病的疾患，找到具有一致性的相关基因有局限性。即，糖尿病的发病与多种基因有复杂的关联，目前也不断有很多新的基因被发现。
由于糖尿病是因多种发病机理而发病的，因此其治疗方法也是多样化，而且，在多种情况下，仅凭现有的常用的治疗方法不能取得令人满意的效果，因此需要新的治疗方法。有关治疗糖尿病药物的研究主要以治疗占糖尿病患者的90％以上的第二型糖尿病的药物为中心(表1和表2)。
表1
韩国糖尿病相关药物开发现况
资料：2004-医药行业白皮书，韩国保健产业振兴院，2004年12月
有很多有关促进胰岛素分泌的化合物(吡咯格列、利诺格列、2，4-二氨基-5-氰基-二溴吡啶、肠促胰岛素、瑞格列奈和那格列奈)、胰岛素作用增强剂(曲格列酮)、胰岛素抵抗性改善剂、在靶组织显示胰岛素类似效果的药物(吡咯格列、利诺格列、二氯乙酸盐、赖脯胰岛素、速效胰岛素制剂)、葡萄糖新合成抑制剂(脂肪分解抑制剂、肉碱转移酶抑制剂、肉碱转移酶抑制剂)、延缓吸收碳水化合物的药物(膳食纤维及α-葡萄糖苷酶抑制剂)和胰淀素类似物(普兰林肽)的研究。
其中部分已上市，但大部分还处于不足以在人体使用的实验阶段，或处于毒性检查阶段。特别是，基于生物节律的速效性胰岛素分泌促进剂和胰岛素抵抗性改善剂会成为糖尿病治疗手段中的有效的方法之一，预计未来这些药物的开发将更加活跃。
另外，以往，在胰岛素抵抗性的原因在于胰岛素受体缺陷的推定下，有关糖尿病病因的研究已进行了十年，但目前，正向胰岛素的信号传达体系转换研究方向。
表2
用于治疗糖尿病的新药物的开发现状
资料：保健产业技术动向，“糖尿病治疗剂的最新研究动向”，2003
据报告，检查肥胖型(obese type)及非-肥胖型(non-obese type)的第二型糖尿病患者的脂肪细胞中的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(PTP-1b，protein tyrosine phosphatase-1b)活性的结果，与正常组相比，蛋白质的表达分别增加3倍和5.5倍，活性为71％和88％。另外，最近，据报告，敲除蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的小鼠表现出对胰岛素的敏感性增加和对高脂肪饮食的抵抗性。而且，根据最近发表的多数研究，似乎抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的化合物在靶细胞中增加胰岛素的敏感性，从而能够克服胰岛素抵抗性。韩国化合物银行为了从尚未开发成药物的数万个的化合物开发蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性抑制剂，正进行随机的大量筛查。
另外，瘦素(Leptin)从脂肪细胞释放到血液，并通过血脑屏障(blood-brainbarrier)后，在中枢神经系统内的受体起作用，从而抑制食物的摄入，减轻体重，促进能源消耗。由此，有了蛋白酪氨酸磷酸酶-1b调节瘦素活性本身的新的发现，并基于此，期待在将蛋白酪氨酸磷酸酶-1b与瘦素激动剂一起使用时，能够表现出上升效应。(Koren,S.,BestPract.Res.Clin.Endocrinol.Metab.,21：621,2007)。
因此，在肥胖和肥胖型糖尿病的治疗开发中，蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂的重要性正在增加，最近有了有关通过高吞吐量的筛选(HTS，hight throughput screening)发现的先导化合物的报道。到目前为止，有关蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的研究和蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制剂的开发没有临床上成功的例子，但是，如表3所示，有很多研究团体和企业在关注和进行开发。
表3
开发中的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制剂
资料：Pharmaproject，2002
然而，由于大部分的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制剂被开发成以带正电荷的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的活性部位为目标的非水解性磷酸酪氨酸类似物，因而，降低了选择性和生物学的利用可能性(Liu,S.et al.,J.Am.Chem.Soc.,130：17075,2008)。
因此，为了开发有效治疗糖尿病和肥胖症的药物，本发明人经过锐意研究，确认了：作为从南极地衣类的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的罗巴酸(Lobaric acid)的盐的罗巴酸钠(Sodium Lobarate)，能够溶解于水，便于使用，而且，除了这些罗巴酸钠(Sodium Lobarate)之外，新合成的罗巴林(,Lobarin)和罗巴斯汀(,Lobarstin)与罗巴酸相比，能够更有效地抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b，并在蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中只对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地起作用，在向疾病模型动物给药时，表现出抗糖尿病效果，从而完成了本发明。
发明内容
本发明的目的在于，提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和功能性食品，所述药物组合物和功能性食品作为有效成分含有由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物。
本发明的目的在于，提供一种预防或治疗糖尿病或肥胖症的方法，该方法包括给予由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物的步骤。
本发明的目的在于，提供一种抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(protein tyrosinephosphatase-1b)活性的方法，其包括给予由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物的步骤。
本发明的目的在于，提供由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物在预防或治疗糖尿病或肥胖症中的用途。
为了达成上述目的，本发明提供一种由下述化学式1表示的化合物，
化学式1
其中，上述R1和R2选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基所组成的组中。
本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作为有效成分含有由上述化学式1表示的化合物。
本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的食品，其作为有效成分含有由上述化学式1表示的化合物。
本发明还提供一种由下述化学式2表示的化合物，
化学式2
分子式：C25H27NaO8
分子量：478.47
本发明还提供一种由上述化学式2表示的化合物的制备方法，包括：
步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)；
步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈(CH3CN)水溶液洗脱在步骤(a)中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物；
步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈(CH3CN)或甲醇水溶液洗脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及
步骤(d)，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加NaHCO3、Na2CO3或NaH2PO4并进行搅拌，从而获得由上述化学式2表示的化合物。
本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作为有效成分含有由上述化学式2表示的化合物。
本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的食品，其作为有效成分含有由上述化学式2表示的化合物。
本发明还提供一种由下述化学式3表示的化合物，
化学式3
其中，上述R1和R2选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基所组成的组中。
本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作为有效成分含有由上述化学式3表示的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的食品，其作为有效成分含有由上述化学式3表示的化合物。
本发明还提供一种由下述化学式4表示的化合物，
化学式4
分子式：C25H30O9
分子量：474.5
本发明还提供一种由上述化学式4表示的化合物的制备方法，包括：
步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)；
步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈(CH3CN)水溶液洗脱在步骤(a)中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物；
步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈(CH3CN)或甲醇水溶液洗脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及
步骤(d)，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加碱并进行搅拌，然后添加酸性溶液而结束反应，从而获得由上述化学式4表示的化合物。
本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作为有效成分含有由上述化学式4表示的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品，其作为有效成分含有由上述化学式4表示的化合物。
本发明还提供一种由下述化学式5表示的化合物，
化学式5
其中，上述R1和R2选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基所组成的组中。
本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作为有效成分含有由上述化学式5表示的化合物或其药学上可接受的盐。
本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品，其作为有效成分含有由上述化学式5表示的化合物。
本发明还提供一种由下述化学式6表示的化合物，
化学式6
分子式：C25H28O8
分子量：456.49
本发明还提供一种由上述化学式6表示的化合物的制备方法，包括：
步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)；
步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈(CH3CN)水溶液洗脱在步骤(a)中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物；
步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈(CH3CN)或甲醇水溶液洗脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及
步骤(d)，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加水和碱并进行搅拌，然后添加酸性溶液而结束反应，从而获得由上述化学式6表示的化合物。
本发明还提供一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作为有效成分含有由上述化学式6表示的化合物或其在药学上可接受的盐。
本发明还提供一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品，其作为有效成分含有由上述化学式6表示的化合物。
本发明还提供一种预防或治疗糖尿病或肥胖症的方法，其包括：给予由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表示的化合物的步骤。
本发明还提供由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表示的化合物的在预防或治疗糖尿病或肥胖症中的用途。
本发明还提供一种抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的方法，其利用由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表示的化合物。
本发明还提供一种用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的组合物，其含有由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表示的化合物。
通过下面的详细说明和附加的权利要求书，更明确本发明的其它特征和实例。
附图说明
图1表示根据HPLC(高效液相色谱法)的罗巴酸钠(Sodium Lobarate)的纯度。
图2表示罗巴酸钠的1H核磁共振光谱(400MHz,DMSO-d6)。
图3表示罗巴酸钠的13C核磁共振光谱(100MHz,DMSO-d6)。
图4表示罗巴酸钠的HSQC(异核单量子关系)数据(400MHz,DMSO-d6)。
图5表示罗巴酸钠的HMBC(异核多键相关)数据(400MHz,DMSO-d6)。
图6是表示罗巴酸钠的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性的曲线图。
图7是通过在620nm测定吸光度来显示对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7和PTPN13的抑制活性的图表。
图8是测定罗巴酸钠的腹腔给药后的血糖变化的曲线图。
图9是表示罗巴酸钠的腹腔给药并禁食6小时后的血糖的测定结果的曲线图。
图10是测定罗巴酸钠的腹腔给药28天后的血糖变化的曲线图。
图11表示根据HPLC分析的罗巴林(Lobarin)纯度。
图12表示罗巴林(Lobarin)的HRESIMS(高分辨率电喷雾电离质谱)分析结果。
图13表示罗巴林(Lobarin)的1H核磁共振光谱(400MHz,DMSO-d6)。
图14表示罗巴林(Lobarin)的13C核磁共振光谱(400MHz,DMSO-d6)。
图15表示罗巴林(Lobarin)的HSQC数据(400MHz,DMSO-d6)。
图16表示罗巴林(Lobarin)的HMBC数据(400MHz,DMSO-d6)。
图17是表示罗巴林(Lobarin)的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性的曲线图。
图18是通过在620nm测定吸光度来显示罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7及PTPN13的抑制活性的图表。
图19是测定罗巴林(Lobarin)的腹腔给药后的血糖变化的曲线图。
图20是表示罗巴林(Lobarin)的腹腔给药并禁食6小时后的血糖测定结果的曲线图。
图21是测定罗巴林(Lobarin)的腹腔给药28天后的血糖变化的曲线图。
图22表示根据HPLC分析的罗巴斯汀(Lobarstin)的纯度。
图23表示罗巴斯汀(Lobarstin)的HRESIMS分析结果。
图24表示罗巴斯汀(Lobarstin)的1H核磁共振光谱(400MHz,DMSO-d6)。
图25表示罗巴斯汀(Lobarstin)的13C核磁共振光谱(400MHz,DMSO-d6)。
图26表示罗巴斯汀(Lobarstin)的COSY(二维核磁共振相关)数据(400MHz,DMSO-d6)。
图27表示罗巴斯汀(Lobarstin)的HSQC数据(400MHz,DMSO-d6)。
图28表示罗巴斯汀(Lobarstin)的HMBC数据(400MHz,DMSO-d6)。
图29表示罗巴斯汀(Lobarstin)的NOESY数据(400MHz,DMSO-d6)。
图30是表示罗巴斯汀(Lobarstin)的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性的曲线图。
图31是通过在620nm测定吸光度来显示罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7及PTPN13的抑制活性的图表。
图32是测定罗巴斯汀(Lobarstin)的腹腔给药后的血糖变化的曲线图。
图33是罗巴斯汀(Lobarstin)的腹腔给药并禁食6小时后的血糖的测定结果的曲线图。
图34是验证罗巴斯汀(Lobarstin)的腹腔给药28天后的葡萄糖耐量的曲线图。
具体实施方式
在没有其它方式的定义的情况下，本说明书中使用的所有技术用语和科学术语与本领域技术人员的通常理解具有相同的意义。通常，本说明书中使用的命名法是在本技术领域已知且通常使用的命名法。
在本发明中，由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)的提取物分离的罗巴酸，获得了作为罗巴酸的盐的、以下述化学式2表示的罗巴酸钠(Sodium Lobarate)，
化学式2
分子式：C25H27NaO8
分子量：478.47
优选通过包括以下步骤的方法来制备由上述化学式2表示的罗巴酸钠：
步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)；
步骤(b)，利用柱色谱，并利用甲醇或乙腈(CH3CN)水溶液洗脱在步骤(a)中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物；
步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并利用乙腈(CH3CN)或甲醇水溶液洗脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及
步骤(d)，将含有上述罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加NaHCO3、Na2CO3或NaH2PO4并进行搅拌，从而获得由上述化学式2表示的化合物。
此时，优选地，在上述步骤(d)中，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于丙酮后，添加NaHCO3、Na2CO3或NaH2PO4并搅拌，然后，对添加NaHCO3、Na2CO3或NaH2PO4的同时生成的固体进行过滤后加以浓缩，获得由上述化学式2表示的化合物。
在本发明的一实施方式中，地衣类高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)(Hedw.)G.L.Sm.)是于2003年1月从南极乔治王岛的世宗王站(S 62°13.3',W58°47.0')周围的巴顿半岛(Barton Peninsular)上采集而使用。罗巴酸是通过下述方法进行分离：用甲醇经24小时提取干燥的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)后，蒸发溶剂，获得提取物，将该提取物装入填充有硅胶(C18)的闪式柱色谱(flash column chromatography,5×25㎝)，并按顺序注入10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％(v/v)的甲醇(MeOH)，获得各自的分馏物后，从上述分馏物中选择对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性出色的分馏物，从而作为蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性出色的化合物，分离了由下述化学式7表示的罗巴酸(Lobaric acid)，
化学式7
分子式：C25H28O8
分子量：456.49
用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)后，利用柱色谱，并利用甲醇水溶液洗脱所获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物，然后，对所得到的分馏物，利用反相高效液相色谱并通过乙腈(CH3CN)水溶液进行洗脱，由此能够获得罗巴酸。将所获得的罗巴酸溶解于丙酮后，添加NaHCO3、Na2CO3或NaH2PO4并进行搅拌，对添加NaHCO3、Na2CO3或NaH2PO4的同时生成的固体进行过滤，然后，立即用旋转蒸发器使其完全浓缩，从而获得由下述化学式2表示的罗巴酸钠，
化学式2
分子式：C25H27NaO8
分子量：478.47
迄今为止，没有有关上述罗巴酸钠的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性的报告，更没有其对糖尿和肥胖的治疗效果的报告。
另外，在上述化学式2的罗巴酸钠中部分烷基获得改性的其它衍生物也属于本发明的范围。基于这种观点，本发明涉及化学式1的化合物，
化学式1
其中，上述R1和R2选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基所组成的组中。
例如，上述烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基的碳原子数可以为1～20，或者可以为1～10，上述烷基包括取代或未取代的烷基、环烷基等。
通过本领域已知的化合物的合成方法和改性方法，从上述化学式2的罗巴酸钠获得化学式1的化合物是对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，化学式1的化合物的R可以通过碳原子的个数和结合结构的变化来获得多种衍生物。例如，当R1和R2为丙基链(propyl chain)的情况下，是从与戊酸钠(sodium pentanoate)的反应衍生的，可以利用与该戊酸钠碳原子数不同的丁酸钠(sodium butyrate)、丙酸钠(sodium propionate)、己酸钠(sodium hexanoate)等来合成碳原子数不同的衍生物。
在本发明中，确认了：从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)的提取物分离的罗巴酸盐即罗巴酸钠，与罗巴酸相比具有更优秀的抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的功能，从而对预防或治疗糖尿病或肥胖症有效。因此，在另一方面，本发明涉及作为有效成分含罗巴酸钠的用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物。而且，本发明可以提供一种功能性食品，其作为有效成分包含罗巴酸钠。因此，在另一方面，本发明涉及用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品，其作为有效成分包含罗巴酸钠。
另外，不仅是由上述化学式2表示的罗巴酸钠，如下所述的部分烷基得以改性的化学式1的化合物或其药学上可接受的盐也会发挥相同或类似的效果，因此，本发明还可以提供包含这些的用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和功能性食品。
在本发明的一实施方式中，比较分析了罗巴酸钠和罗巴酸的对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性程度，其结果，罗巴酸的IC50为870nM，与此相对，罗巴酸钠的IC50为350nM，显示出非常出色的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制效果，由此，确认了罗巴酸钠是能够对糖尿病和肥胖症进行医学治疗和预防的化合物。
而且，在本发明的一实施例中，调查了罗巴酸钠对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性，其结果，确认了在包括TC-PTP(PTPN2)的蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中，仅对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地起作用，在此，所述TC-PTP在氨基酸序列和3D结构上与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b最类似，具有胚胎致死性，并具有与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b类似的酶特性，并且已知包括第二芳基磷酸盐结合位点在内的活性部位(active site)相类似。这样的实验结果表明，本发明的化合物即罗巴酸钠能够作为蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂而用于糖尿病的治疗中。
在本发明的其它实施例中，通过向作为疾病模型动物的db/db小鼠给药罗巴酸钠，并测量血液中的葡萄糖浓度、血液中的胰岛素浓度的变化，确认了罗巴酸钠与血糖和胰岛素抵抗性的关系，从而验证了抗糖尿病效果。
另外，在本发明中，由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)的提取物分离的罗巴酸，分离出以下述化学式4表示的新型化合物，并将其命名为罗巴林(、Lobarin)，
化学式4
分子式：C25H30O9
分子量：474.5
优选地，通过包括下述步骤的方法来制备上述由化学式4表示的新型化合物罗巴林(Lobarin)：
步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)；
步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈(CH3CN)水溶液洗脱在步骤(a)中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物；
步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈(CH3CN)或甲醇水溶液洗脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及
步骤(d)，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后,添加碱并进行搅拌，然后添加酸性溶液而结束反应，从而获得由上述化学式4表示的化合物。
此时，在上述步骤(d)中，酸性溶液可以使用能够中和水溶液的所有种类的酸性溶液，优选地，上述步骤(d)中，溶剂为丙酮，碱为NaOH或KOH，酸性溶液为HCl溶液、H2SO4溶液或HNO3溶液。浓缩上述步骤(d)的反应结束后的反应液，然后，通过二氯甲烷、氯仿或氯乙烯、和水溶液之间的分配来获得二氯甲烷、氯仿或氯乙烯溶解层，并进行浓缩，由此获得由上述化学式4表示的化合物。
在本发明的一实施方式中，将罗巴酸溶解于丙酮后，添加NaOH，并在常温下进行搅拌，然后，添加HCl溶液而结束反应，浓缩反应混合物后，通过二氯甲烷(Methylenechloride)和水溶液(pH＝2)之间的分配来获得二氯甲烷溶解层，由此获得下述化学式4的罗巴林(Lobarin)，
化学式4
分子式：C25H30O9
分子量：474.5
另外，上述化学式4的罗巴林(Lobarin)的部分烷基得以改性的其它衍生物也属于本发明的范围，基于该观点，本发明涉及由化学式3表示的化合物，
化学式3
其中，上述R1和R2选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基所组成的组中。
例如，上述烷基、芳基、芳烷基和酰基的碳原子数可以为1～20，或者可以为1～10，上述烷基包括取代或未取代的烷基、环烷基等。
通过本领域已知的化合物的合成方法及改性方法,从上述化学式4的罗巴林(Lobarin)获得化学式3的化合物是对本领域技术人员来说是显而易见的。例如，通过碳原子的个数和结合结构的变化，化学式3的化合物的R可以获得多种衍生物。例如，在R1和R2为丙基链的情况下，是从与戊酸钠的反应衍生的，可以利用与该戊酸钠碳原子数不同的丁酸钠、丙酸钠和己酸钠等来合成碳原子数不同的衍生物。
本发明确认了从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)的提取物分离的罗巴酸的新型衍生物即罗巴林(Lobarin)具有出色的抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的功能，从而对预防或治疗糖尿病或肥胖症有效。因此，在另一方面，本发明涉及用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作为有效成分含有上述化学式4的罗巴林(Lobarin)或其药学上可接受的盐。而且，本发明可以提供一种功能性食品，其作为有效成分包含罗巴林(Lobarin)。因此，在另一方面，本发明涉及用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品，其作为有效成分包含罗巴林(Lobarin)。
另外，不仅是上述化学式4的罗巴林(Lobarin)，如下所述的部分烷基被改性的化学式3的化合物或其药学上可接受的盐也能够发挥相同或类似的效果，因此，本发明可提供包含这些的用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物、功能性食品。
在本发明的一实施例中，测定了罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性程度，其结果为IC50＝149nM，显示出非常出色的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制效果，由此确认了新型化合物罗巴林(Lobarin)是能够对糖尿病和肥胖症进行医学的治疗和预防的化合物。
而且，在本发明的一实施例中，调查了罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性，其结果，确认了在包括TC-PTP(PTPN2)的蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中，仅对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地起作用，在此，所述TC-PTP(PTPN2)在氨基酸序列和3D结构上与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b最类似，具有胚胎致死性，并具有与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b类似的酶特性，并且已知包括第二芳基磷酸盐结合位点在内的活性部位(active site)相类似。这样的实验结果表明，本发明的化合物罗巴林(Lobarin)能够作为蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂用于糖尿病的治疗中。
在本发明的其它实施例中，通过向作为疾病模型动物的db/db小鼠给药罗巴林(Lobarin)，并测量血液中的葡萄糖浓度和血液中的胰岛素浓度的变化，确认了罗巴林(Lobarin)与胰岛素抵抗性的关系，从而验证了抗糖尿病效果。
另外，本发明的上述化学式4的罗巴林(Lobarin)可以是药学上可接收的盐的形态。本发明的药学上可接受的盐能够根据本技术领域的通常的方法来制备，例如，可与如盐酸、溴化氢、硫酸、硫酸氢钠、磷酸和碳酸等形成无机酸的盐，或者，与如甲酸、醋酸、草酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、龙胆酸、富马酸、乳糖酸、水杨酸或乙酰水杨酸(阿司匹林)等有机酸共同形成药学上可接受的酸的盐；或者与如钠、钾等的碱金属离子进行反应，形成它们的金属盐；或者与铵离子进行反应，从而形成另一形态的药学上可接受的盐。
另外，在本发明中，由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)的提取物分离的罗巴酸，分离出以下述化学式6表示的新型化合物，并将此命名为罗巴斯汀(、Lobarstin)，
化学式6
分子式：C25H28O8
分子量：456.49
优选地，通过包括以下步骤的方法来制备上述由化学式6表示的新型化合物罗巴斯汀(Lobarstin)：
步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)；
步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈(CH3CN)水溶液洗脱在步骤(a)中获得的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物；
步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈(CH3CN)或甲醇水溶液洗脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，从而获得含有罗巴酸的分馏物；以及
步骤(d)，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加水和碱并进行搅拌，然后添加酸性溶液而结束反应后，获得由下述化学式6表示的化合物。
此时，上述步骤(d)的酸性溶液可以使用能够中和水溶液的所有种类的酸性溶液，优选地，在上述步骤(d)中，溶剂为丙酮，碱为NaOH或KOH，酸性溶液为HCl溶液、H2SO4溶液或HNO3溶液。浓缩上述步骤(d)的反应结束后的反应液，然后，通过二氯甲烷、氯仿或氯乙烯、和水溶液之间的分配来获得二氯甲烷、氯仿或氯乙烯溶解层，并进行浓缩，获得由下述化学式6表示的化合物。
在本发明的一实施方式中，将罗巴酸溶解于丙酮后，添加NaOH，并在常温下搅拌，然后，添加HCl溶液结束反应，浓缩反应混合物后，通过二氯甲烷和水溶液(pH＝2)之间的分配来获得二氯甲烷溶解层，由此可获得下述化学式6的罗巴斯汀(Lobarstin)，
化学式6
分子式：C25H28O8
分子量：456.49
另外，由上述化学式6表示的罗巴斯汀(Lobarstin)的部分烷基得以改性的其它衍生物也属于本发明的范围，基于该观点，本发明涉及化学式5的化合物，
化学式5
其中，上述R1和R2选自于由H、烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基所组成的组中。
例如，上述烷基、芳基、烯丙基、芳烷基和酰基的碳原子数可以为1～20，或者可以为1～10，上述烷基包括取代或未取代的烷基和环烷基等。
通过本领域已知的化合物的合成方法和改性方法，从上述化学式6的罗巴斯汀(Lobarstin)获得化学式5的化合物对本技术领域技术人员来说是显而易见的。例如，化学式5的化合物的R可以通过碳原子的个数和结合结构的变化来获得多种衍生物。例如，在R1及R2为丙基链的情况下，是从与戊酸钠的反应衍生的，可以利用与该戊酸钠碳原子数不同的丁酸钠、丙酸钠、己酸钠等来合成碳原子数不同的衍生物。
本发明确认了从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)的提取物分离的罗巴酸的新型衍生物即罗巴斯汀(Lobarstin)具有非常出色的抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的功能，从而对预防或治疗糖尿病或肥胖症有效。因此，在另一方面，本发明涉及一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其作为有效成分含有上述化学式6的罗巴斯汀(Lobarstin)或其药学上可接受的盐。而且，本发明可以提供作为有效成分含有罗巴斯汀(Lobarstin)的功能性食品。即，本发明涉及用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品，其作为有效成分包含罗巴斯汀(Lobarstin)。
另外，不仅是上述化学式6的罗巴斯汀(Lobarstin)，如下所述的部分烷基被改性的化学式5的化合物或其药学上可接受的盐也发挥相同或类似的效果，因此，可以提供包含它们的用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物和功能性食品。
本发明的一实施例中，测量了罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性程度，结果为IC50＝154.6nM，显示出非常出色的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制效果，由此确认了新型化合物罗巴斯汀(Lobarstin)是能够对糖尿病进行医学的治疗或预防的化合物。
而且，本发明的一实施例中，调查了罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性，其结果，确认了在包括TC-PTP(PTPN2)的蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中，仅对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地起作用，在此，所述TC-PTP(PTPN2)在氨基酸序列和3D结构上与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b最类似，具有胚胎致死性，并具有与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b类似的酶特性，并且已知包括第二芳基磷酸盐结合位点在内的活性部位(active site)相类似。这样的实验结果表面，本发明的化合物罗巴斯汀(Lobarstin)能够作为蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂用于糖尿病的治疗中。
在本发明的其它实施例中，通过向疾病模型动物db/db小鼠给药罗巴斯汀(Lobarstin)，并测量血液中的葡萄糖浓度和血液中的胰岛素浓度的变化来确认了与血糖、胰岛素抵抗性的关系，从而验证了抗糖尿病效果。
另外，本发明的上述化学式6的罗巴斯汀(Lobarstin)可以是药学上可接受的盐的形态。本发明的药学上可接受的盐能够根据本技术领域的通常的方法来制备，例如，可与如盐酸、溴化氢、硫酸、硫酸氢钠、磷酸、碳酸等的无机酸形成盐，或者与如甲酸、醋酸、草酸、苯甲酸、柠檬酸、酒石酸、葡糖酸、龙胆酸、富马酸、乳糖酸、水杨酸或乙酰水杨酸(阿司匹林)等的有机酸共同形成药学上可接受酸的盐；或者与如钠、钾等的碱金属离子进行反应，形成它们的金属盐；或者与铵离子进行反应，形成另一形态的药学上可接受的盐。
根据常规的方法，包含本发明化合物的药物组合物可以制成粉末剂、颗粒剂、片剂、胶囊剂、悬浮液、乳剂、糖浆、喷雾剂等口服制剂、外用剂、栓剂和无菌注射液的形态。作为包含本发明化合物的组合物可具有的载体、赋形剂和稀释剂，可举出乳糖、葡萄糖、蔗糖、山梨糖醇、甘露糖醇、木糖醇、赤藓醇、麦芽糖醇、淀粉、阿拉伯胶、藻酸盐、明胶、磷酸钙、硅酸钙、纤维素、甲基纤维素、微晶纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、水、甲基羟基苯甲酸酯、丙基羟基苯甲酸酯、滑石、硬脂酸镁和矿物油。
在制成制剂时，使用常用的填充剂、增量剂、粘合剂、湿润剂、崩解剂、表面活性剂等稀释剂或赋形剂。用于口服给药的固体制剂包括片剂、丸剂、粉末剂、颗粒剂、胶囊剂等，这种固体剂型通过在上述化合物中混合至少一种以上的赋形剂来配制，如淀粉、碳酸钙(calcium carbonate)、蔗糖(sucrose)或乳糖(lactose)、明胶等。除了单纯的赋形剂外，还使用如硬脂酸镁、滑石等的润滑剂。用于口服给药的液体制剂有悬浮液、內用液剂、乳剂、糖浆剂等，除了包括通常使用的单纯稀释剂，例如，水、液体石蜡等以外，还可以包括多种赋形剂，例如，湿润剂、甜味剂、芳香剂、防腐剂等。用于肠胃外给药的制剂包括无菌水溶液、非水性溶剂、悬浮液、乳剂、冻干剂、栓剂等。非水性溶剂、悬浮液可以使用丙二醇(propyleneglycol)、聚乙二醇、如橄榄油等的植物油、如油酸乙酯等的可注射的酯等。作为栓剂的基质可以使用witepsol(，药用辅料，是饱和脂肪酸混合物的甘油酯，有H、W、S、E的4种类型)、聚乙二醇、吐温(tween)60、可可脂、月桂酸甘油酯、甘油明胶等。
作为本发明的功能性食品，例如可举出各种食品类、糖果、巧克力、饮料、口香糖、茶、复合维生素、健康辅助食品类等，可以作为粉末、颗粒、片剂、胶囊或饮料的形式来使用。
本发明的化合物可以加入到食品或饮料中，以预防糖尿病和肥胖症。此时，对于食品或饮料中的上述化合物含量而言，当为本发明的保健功能食品组合物的情况下，通常是食品总重量的0.01重量％～50重量％，优选为0.1重量％～20重量％；当为保健饮料组合物的情况下，相对于100ml保健饮料组合物添加0.02g～10g，优选为0.3g～1g。
对本发明的保健饮料组合物而言，除了作为必要成分按规定比率包含本发明化合物以外，对其它液体组分没有特别的限制，与常用的饮料相同地，还可以包含多种香味剂或天然碳水化合物。作为天然碳水化合物，例如可举出葡萄糖、果糖等的单糖；麦芽糖、蔗糖等的二糖；糊精、环糊精等的多糖等常用的糖，以及例如木糖醇、山梨糖醇、赤藓醇等的糖醇。作为香味剂，可以有利地使用天然香味剂(索马甜、甜叶菊提取物(例如，莱鲍迪甙A、甘草甜素等)以及合成香味剂(糖精、阿斯巴甜等)。相对于100ml的本发明的组合物，上述天然碳水化合物的比率通常是约1g～20g，优选为约5g～12g。除上述之外，本发明的功能性食品可以包含多种营养素、维生素、矿物质(电解质)、合成香精和天然香精等香精、着色剂和改进剂(奶酪、巧克力等)、果胶酸及其盐、藻酸及其盐、有机酸、保护胶体增稠剂、pH调节剂、稳定剂、防腐剂、甘油、醇类、碳酸饮料中使用的碳酸化试剂等。此外，本发明的功能性食品可以包括用于制备天然果汁饮料、果汁饮料及蔬菜饮料的果肉。这些成分可以单独使用或组合使用。在本发明的组合物中，虽然这些添加剂的比率不是特别重要，但通常相对于100重量份的本发明的组合物包含0重量份至约20重量份。
在另一方面，本发明涉及一种预防或治疗糖尿病或肥胖症的方法，其包括将由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表示的化合物进行给药的步骤。
作为本发明的新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表示的化合物的优选的给药量，是根据患者的状态和体重、疾病的程度、药物形态、给药途径以及给药时间而不同，本领域技术人员可进行适当的选择。但是，为了理想的效果，本发明化合物的每日给药量为0.1μg/kg～1000μg/kg，优选为1μg/kg～100μg/kg。给药可以是一天一次，也可以是分几次口服给药，上述的给药量不以任何方式限制本发明。
在另一方面，本发明涉及由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表示的化合物在预防或治疗糖尿病或肥胖症中的用途。
本发明的由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的罗巴酸钠、罗巴林(Lobarin)和罗巴斯汀(Lobarstin)，显示出了优秀的抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的效果，因此，利用这些，本发明提供一种抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的方法。具体地，本发明涉及一种抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的方法，其包括向所需对象给予新型化合物即由化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表示的化合物的步骤。
本发明涉及一种抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的组合物，其包含由从高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物分离的化合物合成的新型化合物即以化学式1、化学式2、化学式3、化学式4、化学式5或化学式6表示的化合物。
实施例
下面，通过实施例来详细说明本发明。这些实施例只是用于例示本发明，本发明的范围并不限定于这些实施例，这对本领域技术人员来说是显而易见的。
实施例1
从地衣类高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物制备罗巴酸(Lobaricacid)
1-1：制备地衣类高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物
地衣类高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)(Hedw.)G.L.Sm.)是于2003年1月从南极乔治王岛的世宗王站(S 62°13.3',W58°47.0')周围的巴顿半岛采集，是在巴顿半岛容易采集到的地衣类。
将50g干燥的高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)用1L甲醇经24小时提取2次，获得3.6g甲醇提取物。将上述所获得的提取物装入填充有硅胶(C18)的闪式柱色谱(flash column chromatography，5×25cm)，并以阶段式的浓度梯度添加10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％和100％(v/v)的甲醇(MeOH)，分别获得各分馏物。
1-2：从地衣类高山珊瑚枝地衣(Stereocaulon alpinum)提取物制备罗巴酸
将在实施例1-1中用80％甲醇洗脱而获得的204.6mg分馏物再装入到填充有硅胶(C18)的闪式柱色谱(2.5×30cm)，并分别注入200ml的1％、2％、3％、4％、5％、6％、7％、8％、9％和10％的甲醇(在CH2Cl2中)溶液及100％(v/v)甲醇，以获得基于TLC分析的8个主要分馏物。
将用9％甲醇洗脱的59mg分馏物再注入到半制备反相(semi-preparativereverse-phase)HPLC后，以75％至83％的浓度梯度添加含0.1％甲酸(formic acid)的乙腈(CH3CN)水溶液，并洗脱30分钟以上，从而分离了化学式7表示的罗巴酸(22.9mg；tR＝39分钟)，
化学式7
分子式：C25H28O8
分子量：456.49
实施例2
合成罗巴酸钠(sodium lobarate)
2-1：从罗巴酸制备罗巴酸钠
将从实施例1-2获得的10mg(22umol)罗巴酸溶解在3ml丙酮(Acetone)中，向其添加50ul的1M NaHCO3后搅拌1-2分钟。对添加NaHCO3的同时生成的固体进行过滤，然后立即用旋转蒸发器进行完全浓缩。浓缩结束后，得到了白色固体状的罗巴酸钠(<10mg)。然后，为了除去多余的盐以提高纯度，使用安捷伦(Agilent)Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm，美国)，通过反相(reverse phase)HPLC进行了分析。分析中的溶剂体系采用了含0.1％甲酸的水(A线)和含0.1％甲酸的乙腈(B线)。分析条件如下：开始是40％乙腈至50％乙腈为5分钟，50％乙腈至80％乙腈为15分钟，80％乙腈至90％乙腈为10分钟。最后纯度为92.1％(图1)。所获得的罗巴酸钠100％溶解于水，确保了水溶性，
化学式2
分子式：C25H27NaO8
分子量：478.47
2-2：罗巴酸钠的结构分析
通过将化合物核磁共振数据与罗巴酸的核磁共振数据进行比较来确认了罗巴酸钠的结构。将每个试样溶解在DMSO-d6溶剂后，使用JEOL ECP-400光谱仪(JEOL，日本)，测定了各个核磁共振数据，以作为溶剂使用的DMSO-d6的化学位移值(dC/dH＝40.0/2.50ppm)为基准表示了化学位移。在异核多量子相干(HMQC，1H-检测的heteronuclear Multiple-Quantum Coherence)的情况下，设定为1JCH＝140Hz后进行了测定，设定为nJCH＝8Hz后进行了异核多键相关(HMBC，Heteronuclear Multiple-Bond Coherence)实验。
化学式8
1：罗巴酸，2：罗巴酸钠
罗巴酸和罗巴酸钠的核磁共振数据如表4所示。
表4
罗巴酸和罗巴酸钠的核磁共振(NMR)数据(400MHz,DMSO-d6)
比较的结果，特别是观察到了由于C-7'的官能团从羧酸(carboxylic acid)变化为羧酸盐(carboxylate)阴离子而带来的化学位移的变化及其周边碳的化学位移的变化，这是查明化合物2(罗巴酸钠)结构的重要资料。图2至图5分别表示罗巴酸钠的1H核磁共振光谱(400MHz，DMSO-d6)、13C核磁共振光谱(100MHz，DMSO-d6)、HSQC数据(400MHz,DMSO-d6)以及HMBC数据(400MHz，DMSO-d6)。
实施例3
分析罗巴酸钠的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性
为了分析蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(PTP-1b)抑制活性，用光谱测量了酶的活性。
即，在0.5mg/ml浓度的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(Bioneer公司，韩国)以及蛋白酪氨酸磷酸酶-1b缓冲液(20mM的Tris-HCl，pH 8.0,0.75mM氯化钠，0.5mM EDTA，5mMβ-巯基乙醇，50％甘油)中，分别添加罗巴酸钠0，1，3，10，30，100，300，1000，3000nM和基质[pTyr1146]胰岛素受体(Insulin Recepter)(1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟-30分钟，然后，添加孔雀绿(Malachite Green)-钼酸盐染料溶液(Molybdate DyeSolution)(1142-1153，Sigma公司，美国)，并在常温下反应10分钟，结束与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b、罗巴酸钠及基质的反应后，在620nm测量了吸光度。
结果，如图6所示，罗巴酸钠的对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性分析结果为IC50＝350nM，显示了出色的对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制效果，并确认了抑制率浓度依赖性地增加。
另外，作为对照组，测量了罗巴酸对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性，并进行了比较。实验中使用的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b购自BIOMOL公司(美国)。为了光谱测量酶的活性，添加约0.2μm/ml浓度的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b、蛋白酪氨酸磷酸酶-1b缓冲液(50mMcitrate,pH 6.0,0.1M氯化钠,1mM EDTA,1mM DTT)、罗巴酸以及4mM pNPP后轻轻摇动，在37℃下反应30分钟后，在405nm测量了吸光度。结果，确认了IC50＝0.87μM，即870nM。
由此可以确认，本发明的罗巴酸钠的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制效果更优秀，而且，这样的罗巴酸钠是能够药学治疗和预防糖尿病和肥胖症的化合物。
实施例4
分析罗巴酸钠对蛋白酪氨酸磷酸酶族的选择性
为了研究罗巴酸钠对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性，通过光谱测量酶的活性来研究了对PTP-1b(蛋白酪氨酸磷酸酶-1b)、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7和PTPN13的抑制活性。
首先，在0.5mg/ml/浓度的PTP-1b、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7、PTPN13(Bioneer公司，韩国)和蛋白酪氨酸去磷酸化酶缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，0.75mM氯化钠，0.5mMEDTA，5mMβ-巯基乙醇,50％甘油)中，分别添加罗巴酸钠0,50,100,200nM和基质[pTyr1146]胰岛素受体(1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟-30分钟，然后，添加孔雀绿-钼酸盐染料溶液(Sigma公司，美国)，并在常温下反应10分钟。结束与基质的反应后，在620nm测量了吸光度。
调查罗巴酸钠对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性的结果，如图7所示，可以确认，罗巴酸钠对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的IC50＝200uM，抑制率为50.0％，而对TC-PTP(PTPN2)的抑制率为83.7％，TC-PTP(PTPN2)是已知的与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b最类似的磷酸化酶。
TC-PTP(PTPN2)是已知在氨基酸序列和3D结构中与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b最类似的磷酸化酶，具有胚胎致死性，并具有与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b类似的酶特性，而且，包括第二芳基磷酸盐结合位点在内的活性部位(active site)类似。虽然已有757个物质以蛋白酪氨酸磷酸酶-1b作为目标进行了登记，但尚不存在以蛋白酪氨酸磷酸酶-1b作为主要目标进入临床的化合物，仅公开了作用于包括蛋白酪氨酸磷酸酶-1b在内的多个目标的植物提取物，或正在处于临床阶段。
显示仅对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地起作用的上述实验结果表明，本发明的化合物即罗巴酸钠能够作为蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂来用于糖尿病的治疗中。
实施例5
验证罗巴酸钠对疾病模型动物的疗效
5-1：观察腹腔给药罗巴酸钠后的血糖变化
根据对罗巴酸钠的预测试、有效性测试及毒性试验资料来决定了给药量(表示为测试化合物(mg)/试验动物的体重(Kg))。在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)中，向对照组每天腹腔给药PBS 200μl，向实验组每天腹腔给药蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性抑制化合物即罗巴酸钠10mg/kg，并每周测量两次血糖。
向7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)腹腔给药蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性抑制化合物即罗巴酸钠后，测定了血糖变化，结果，如图8所示，在腹腔给药罗巴酸钠10mg/kg的实验组(n＝6)中，平均第0天为267mg/dL，第3天为276mg/dL，第7天为378mg/dL，第10天为378mg/dL，第14天为407mg/dL，第17天为415mg/dL，第21天为459mg/dL。可以确认，血糖增加现象低于对照组。
5-2：观察腹腔给药罗巴酸钠并禁食6小时后的血糖变化
为了测定罗巴酸钠的更为准确的抗糖尿病效果，在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)中，向对照组每天腹腔给药PBS 200μl，向实验组每天腹腔给药罗巴酸钠10mg/kg，并每周测量两次血糖。此时，腹腔给药后禁食6小时，然后测量了血糖。
结果，如图9所示，在腹腔给药罗巴酸钠10mg/kg的实验组(n＝6)中，平均第0天为141mg/dL，第3天为142mg/dL，第7天为185mg/dL，第10天为206mg/dL，第14天为232mg/dL，第17天为236mg/dL，第21天为313mg/dL。与实施例4-1相同，血糖增加现象低于对照组。
5-3：罗巴酸钠的腹腔给药28天后的葡萄糖耐量试验(IPGTT,Intraperitonealglucose tolerance test)
为了进行罗巴酸钠在模型动物中的腹腔内葡萄糖耐量试验，进行了如下的实验。
在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)中，向对照组每天腹腔给药生理盐水共28天，并向实验组每天腹腔给药罗巴酸钠10mg/kg共28天后，在分别不给予生理盐水及罗巴酸钠的状态下，禁食16小时后，腹腔给药葡萄糖(500mg/ml，给药量200μl)，然后在0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟及120分钟时从尾静脉采集血样，并观察血糖变化。
向第二型糖尿病模型动物皮下给药葡萄糖后观察了葡萄糖耐量变化，结果，如图10所示，在对照组(注射生理盐水)的情况下，给药葡萄糖后，0分钟时为341mg/dL，15分钟时为579mg/dL，30分钟时为557mg/dL，60分钟时为589mg/dL，90分钟时为600mg/dL，120分钟时为555mg/dL，显示出急剧的血糖增加和缓慢的血糖降低。然而，在腹腔给药罗巴酸钠10mg/kg共28天的实验组的情况下，0分钟时为153mg/dL，15分钟时为291mg/dL，30分钟时为361mg/dL，60分钟时为385mg/dL，90分钟时为335mg/dL，120分钟时为290mg/dL。可以确认，通过药物浓度依赖性的缓慢的血糖增加和快速的血糖下降来恢复血糖的正常化。
这些实施例5-1至5-3的结果表明，本发明的罗巴酸钠具有非常优秀的抗糖尿病效果。
实施例6
从罗巴酸制备作为新型化合物罗巴林(Lobarin)
将实施例1-2的罗巴酸50mg溶解在5mL丙酮中，向其添加1mL的0.5N NaOH后，在常温下搅拌5分钟，添加0.5mL的1N HCl溶液而结束反应。浓缩反应混合物后，通过二氯甲烷及水溶液(pH＝2)之间的分配来获得二氯甲烷溶解层，并进行浓缩，获得了50mg由下述化学式4表示的新型化合物，并将该化合物命名为“罗巴林(Lobarin)”，
化学式4
分子式：C25H30O9
分子量：474.5
另外，为了提高纯度，使用安捷伦Eclipse XDB-C18柱(4.6×150mm，美国)用反相HPLC进行了分析。分析中的溶剂体系使用了含0.1％甲酸的水(A线)和含0.1％甲酸的乙腈(B线)。分析条件如下：开始是40％乙腈至50％乙腈为5分钟，50％乙腈至80％乙腈为15分钟，80％乙腈至90％乙腈为10分钟。最后纯度为96.1％(图11)。
实施例7
分析新型化合物罗巴林(Lobarin)的结构
通过高分辨率电喷雾电离质谱(HRESIMS)和核磁共振(NMR)光谱分析来确定了实施例6合成的罗巴林(Lobarin)的分子结构。
采用Q-TOF micro LC-MS/MS分析仪(Waters公司，美国)来进行了HRESIMS的阴离子分析。如图12所示，罗巴林(Lobarin)表现出m/z 473.1774的分子离子峰，这表明罗巴林(Lobarin)的分子式为C25H30O9。
将罗巴林(Lobarin)溶解于DMSO-d6溶剂后，使用JEOL ECP-400光谱仪(JEOL，日本)来测量了罗巴林(Lobarin)的核磁共振谱(NMR spectra)，并以作为溶剂使用的DMSO-d6的化学位移值(δC/δH＝40.0/2.50ppm)为基准表示了化学位移值。在HMQC(1H-detectedheteronuclear multiple-quantum coherence)的情况下，设定为1JCH＝140Hz后进行了测定，设定为nJCH＝8Hz后进行了HMBC(heteronuclear multiple-bond coherence)实验。使用Q-TOF micro LC-MS/MS来进行了质量分析。
首先，根据1H核磁共振和13C核磁共振光谱的结果，如图13和图14所示，罗巴林(Lobarin)的1H核磁共振和13C核磁共振谱显示出与罗巴酸的核磁共振谱非常类似的形态。由此，可预测罗巴林(Lobarin)具有与罗巴酸非常类似的结构，考虑到分子量之差为18dalton，可以推测罗巴林(Lobarin)是通过罗巴酸的水合反应生成的化合物。比较罗巴酸的核磁共振数据和罗巴林(Lobarin)的核磁共振数据发现，特别是在罗巴酸的13C核磁共振波谱(NMR spectrum)中观察到的对应于酮官能团的13C峰消失了，取而代之，在106.3ppm观察到了13C峰值，并在1H核磁共振中观察到了对应于OH官能团的质子的峰(7.65ppm)。根据核磁共振数据中的这些差异，推测罗巴林(Lobarin)的结构是：如化学式7所示，罗巴酸的酮官能团因羟基的亲核攻击而转变为氧阴离子，由此，相邻的酯官能团中连续发生亲核加成反应而分解酯基的化合物结构。通过追加的二维核磁共振光谱分析法即HMQC和HMBC分析，证实了推测的罗巴林(Lobarin)结构(表5)。
通过HMQC数据(图15)和HMBC数据(图16)的分析，确认了与罗巴林(Lobarin)的各个碳和氢相对应的峰的位置，从这些资料可知，与罗巴酸的核磁共振测量值类似。另外，与OH官能团的质子相对应的峰(7.65ppm)乃至与C-6、C-7和C-8位置相对应的13C核磁共振峰的HMBC相干性，提供了确定所揭示的罗巴林(Lobarin)结构的重要资料。
表5
罗巴林(Lobarin)的核磁共振数据(400MHz,DMSO-d6)
异核多键相关(HMBC，Heteronuclear Multiple-Bond Coherence)分析，优化为8Hz，从质子到指定的碳
a异核多键相关(HMBC，Heteronuclear Multiple-Bond Coherence)分析，优化为8Hz，从质子到指定的碳。
实施例8
分析罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性
为了分析罗巴林(Lobarin)对蛋白质的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b抑制活性，用光谱测量了酶的活性。
即，在0.5mg/ml浓度的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(Bioneer公司，韩国)、蛋白酪氨酸磷酸酶-1b缓冲液(20mM的Tris-HCl，pH 8.0，0.75mM氯化钠，0.5mM EDTA，5mMβ-巯基乙醇，50％甘油)中，分别添加罗巴林(Lobarin)0,1,3,10,30,100,300,1000,3000nM和基质[pTyr1146]胰岛素受体(1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟～30分钟，然后，添加孔雀绿-钼酸盐染料溶液(1142-1153，Sigma公司，美国)，并在常温下反应10分钟。结束与蛋白酪氨酸磷酸酶-1b、罗巴林(Lobarin)及基质的反应后，在620nm测量了吸光度。
结果，如图17所示，罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性分析结果为IC50＝149nM，显示了出色的对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制效果，确认了抑制率浓度依赖性地增加，从而确认了罗巴林(Lobarin)是能够药学治疗和预防糖尿病和肥胖症的化合物。
实施例9
分析罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶族的选择性
为了研究罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶族的选择性，通过光谱测量酶的活性来研究了对PTP-1b(蛋白酪氨酸磷酸酶-1b)、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7和PTPN13的抑制活性。
首先，在0.5mg/ml浓度的PTP-1b、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7、PTPN13(Bioneer公司，韩国)和蛋白酪氨酸去磷酸化酶缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，0.75mM氯化钠，0.5mMEDTA，5mMβ-巯基乙醇，50％甘油)中，分别添加罗巴林(Lobarin)0,50,100,200nM和基质[pTyr1146]胰岛素受体(1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟-30分钟，然后，添加孔雀绿-钼酸盐染料溶液(Sigma公司，美国)，并在常温下反应10分钟，结束与基质的反应后，在620nm测量了吸光度。
调查了罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性的结果，如图18所示，在IC50200nM时，罗巴林(Lobarin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制率为52.2％，特别是，对包括TC-PTP(PTPN2)的其它蛋白酪氨酸磷酸酶没有抑制活性。
显示出在蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中只对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地起作用的上述实验结果表明，本发明的化合物罗巴林(Lobarin)能够作为蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂来用于糖尿病的治疗中。
实施例10
验证罗巴林(Lobarin)对疾病模型动物的疗效
10-1：腹腔给药罗巴林(Lobarin)后观察血糖变化
根据对罗巴林(Lobarin)的预测试、有效性测试、毒性试验资料为基础，决定了给药量(用测试化合物(mg)/试验动物的体重(Kg)表示)。在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)中，向对照组每天腹腔给药PBS200μl，向实验组每天腹腔给药罗巴林(Lobarin)10mg/kg，并每周测量两次血糖。
向7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)腹腔给药罗巴林(Lobarin)后，观察了血糖变化，结果，如图19所示，在对照组(n＝6)中，平均第0天为268mg/dL，第3天为381mg/dL，第7天为404mg/dL，第10天为432mg/dL，第14天为454mg/dL，第17天为479mg/dL，第21天为482mg/dL，显示出急剧的血糖增加现象。然而，在腹腔给药10mg/kg罗巴林(Lobarin)的实验组(n＝6)中，平均第0天为267mg/dL，第3天为278mg/dL，第7天为298mg/dL，第10天为315mg/dL，第14天为352mg/dL，第17天为379mg/dL，第21天为425mg/dL，由此可以确认，显示出低于对照组的血糖增加。
10-2：观察腹腔给药罗巴林(Lobarin)并禁食6小时后的血糖变化
为了测量罗巴林(Lobarin)的更为准确的抗糖尿病效果，在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)中，向对照组每天腹腔给药PBS 200μl，向实验组每天腹腔给药罗巴林(Lobarin)10mg/kg，并每周测量两次血糖。此时，腹腔给药后禁食6小时，然后测量了血糖。
结果，如图20所示，在对照组(n＝6)中，平均第0天为151mg/dL，第3天为199mg/dL，第7天为262mg/dL，第10天为291mg/dL，第14天为397mg/dL，第17天为455mg/dL，第21天为483mg/dL，显示出急剧的血糖增加。然而在腹腔给药罗巴林(Lobarin)10mg/kg的实验组(n＝6)中，平均第0天为152mg/dL，第3天为141mg/dL，第7天为155mg/dL，第10天为198mg/dL，第14天为261mg/dL，第17天为287mg/dL，第21天为340mg/dL，与实施例10-1相同，显示出低于对照组的血糖增加。
10-3：腹腔给药罗巴林(Lobarin)28天后的葡萄糖耐量试验
为了实施罗巴林(Lobarin)在模型动物中的腹腔葡萄糖耐量试验，进行了如下的实验。
在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)中，向对照组每天腹腔给药20％DMSO共28天，并向实验组每天腹腔给药罗巴林(Lobarin)10mg/kg共28天后，在分别不给药20％DMSO和罗巴林(Lobarin)的状态下，禁食16小时，然后，以腹腔给药的方式注入葡萄糖(500mg/ml，给药量200μl)，然后在0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟、120分钟时从尾静脉采集血样，并观察了该血样的血糖变化。
向第二型糖尿病模型动物皮下给药葡萄糖后观察了葡萄糖耐量变化，结果，如图21所示，在对照组(腹腔给药20％DMSO)的情况下，给药葡萄糖后的0分钟时为293mg/dL，15分钟时为429mg/dL，30分钟时为557mg/dL，60分钟时为553mg/dL，90分钟时为539mg/dL，120分钟时为568mg/dL，显示出急剧的血糖增加倾向及非常缓慢的血糖降低现象。相反，在给药作为抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b活性的化合物的罗巴林(Lobarin)10mg/kg的实验组的情况下，0分钟时为153mg/dL，15分钟时为358mg/dL，30分钟时为436mg/dL，60分钟时为390mg/dL，90分钟时为335mg/dL，120分钟时为290mg/dL。可以确认，通过药物浓度依赖性的缓慢的血糖增加和快速的血糖下降来恢复血糖的正常化。
这些实施例10-1至10-3的结果表明，本发明的新型化合物罗巴林(Lobarin)具有非常优秀的抗糖尿病效果。
实施例11
从罗巴酸制备新型化合物罗巴斯汀(Lobarstin)
将实施例1-2的50mg罗巴酸溶解在50mL的丙酮中后，向其加入50mL水，并进行搅拌。添加0.25mL的2N NaOH后，在常温下搅拌15分钟，添加0.5mL的1N HCl溶液而结束反应。浓缩反应混合物后，通过氯甲烷及水溶液(pH＝2)之间的分配来获得氯甲烷溶解层，并进行浓缩，获得50mg由下述化学式6表示的新型化合物，并将该化合物命名为“罗巴斯汀(Lobarstin)”。
化学式6
分子式：C25H28O8
分子量：456.49
另外，为了提高纯度，使用安捷伦Eclipse XDB-C18柱(4.6x150mm，美国)，用反相HPLC进行了分析。分析中的溶剂体系使用了含0.1％甲酸的水(A线)和含0.1％甲酸的乙腈(B线)。分析条件如下：开始是40％乙腈至50％乙腈为5分钟，50％乙腈至80％乙腈为15分钟，80％乙腈至90％乙腈为10分钟。最后纯度为97.6％(图22)。
实施例12
分析新型化合物罗巴斯汀(Lobarstin)的结构
通过高分辨率电喷雾电离质谱(HRESIMS)和核磁共振(NMR)光谱分析来确定在实施例11中合成的罗巴斯汀(Lobarstin)的分子结构。采用Q-TOF micro LC-MS/MS分析仪(Waters公司，美国)来进行了高分辨率电喷雾电离质谱的阴离子分析。如图12所示，罗巴斯汀(Lobarstin)表现出m/z 455.1708的分子离子峰，这表明罗巴斯汀(Lobarstin)的分子式为C25H28O8。
将罗巴斯汀(Lobarstin)溶解于DMSO-d6溶剂后，使用JEOL ECP-400光谱仪(JEOL，日本)来测量了罗巴斯汀(Lobarstin)的核磁共振谱，并以作为溶剂使用的MSO-d6的化学位移值(δC/δH＝40.0/2.50ppm)为基准表示了化学位移值。在HSQC(异核单量子关系)(1H-detected heteronuclear single-quantum coherence)的情况下，设定为1JCH＝140Hz后进行了测定，设定为nJCH＝8Hz后进行了HMBC(heteronuclear multiple-bond coherence)实验。
首先，根据1H核磁共振和13C核磁共振光谱，如图24及图25所示，罗巴斯汀(Lobarstin)的1H核磁共振及13C核磁共振谱显示出与化学式4的罗巴林(Lobarin)核磁共振谱非常类似的形态。
化学式4
分子式：C25H30O9
分子量：474.5
由此可知，罗巴斯汀(Lobarstin)具有与罗巴林(Lobarin)非常类似的结构，考虑到分子量之差为18dalton，可以推测罗巴斯汀(Lobarstin)是通过罗巴林(Lobarin)的水分子消除反应来生成的化合物。比较罗巴林(Lobarin)的核磁共振资料和罗巴斯汀(Lobarstin)的核磁共振资料可知，特别是，罗巴林(Lobarin)的13C核磁共振光谱中观察到的在低磁场区(down field shifted)显示出吸收峰的sp3混合碳(罗巴斯汀的C-8，106.3ppm)和脂肪族亚甲基碳的吸收峰消失了，取而代之，观察到了两个双键领域的吸收峰。另外，观察到了在罗巴林(Lobarin)化合物的1H核磁共振中不存在的、典型出现在烯烃氢的磁场区的吸收峰(6.00ppm)，而且通过COSY资料分析，确认了该峰与脂肪族亚甲基进行自旋-自旋耦合(图26)。因此，推测罗巴斯汀(Lobarstin)是罗巴林(Lobarin)中的叔醇官能团通过脱水反应被消除，从而在C-8和C-9上形成双键而成的化合物。通过追加的作为二维核磁共振光谱分析法的HSQC和HMBC的分析，证实了以上推测的罗巴斯汀(Lobarstin)的结构(表6)。通过HSQC(图27)和HMBC资料(图28)分析，确认了与罗巴斯汀(Lobarstin)的各个碳和氢相对应的峰的位置，特别是，从罗巴斯汀(Lobarstin)结构内的H-5,9,10和11观察到的HMBC相关内容，提供了确定所揭示的罗巴斯汀(Lobarstin)结构的重要资料。另外，根据H-5和H-9之间的NOE关系，确认了形成于C-8和C-9的双键几何立体结构为Z-型(顺式)(图29)。
表6
罗巴斯汀(Lobarstin)的核磁共振数据(400MHz,DMSO-d6)
位置(Position) δC δH,mult.(Jin Hz) HMBCa
1 104.2 -- --
2 157.4 -- --
3 101.7 5.90,d(1.8) 1,2,4,5,7
4 166.4 -- --
5 96.7 7.19,d(1.8) 1,2,3,4,8
6 143.4 -- --
7 163.2 -- --
8 144.9 -- --
9 109.3 6.00,t(7,7) 6,8
10 27.3 2.36,m 8,9,11,12
11 21.9 1.52,m 9,10,12
12 3.63 0.96,t(7.0) 10，11
1’ 108.4 -- --
2’ 158.2 -- --
3’ 101.9 6.41,s 1’,2’,4’,5’,7’
4’ 153.2 -- --
5’ 131.8 -- --
6’ 137.3 -- --
7’ 171.2 -- --
8’ 27.5 2,70,m/2.52,m --
9’ 29.5 1.39,m/1.27,m --
10’ 31.4 1.12,m --
11’ 21.4 1.12,m --
12’ 13.56 0.69,t(7.0) 10’,11’
4-OCH3 56.3 3.79,s 4
4’-OH -- 10.39,s 3’,4’,5’
a异核多键相关(HMBC，Heteronuclear Multiple-Bond Coherence)分析，优化为8Hz，从质子到指定的碳。
实施例13
分析罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性
为了分析罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性，用光谱测量了酶的活性。即，在0.5mg/ml浓度的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(Bioneer公司，韩国)、蛋白酪氨酸磷酸酶-1b缓冲液(20mM Tris-HCl，pH 8.0，0.75mM氯化钠，0.5mM EDTA，5mMβ-巯基乙醇，50％甘油)中，添加罗巴斯汀(Lobarstin)0,1,3,10,30,100,300,1000,3000nM和基质[pTyr1146]胰岛素受体(1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟～30分钟，然后，添加孔雀绿-钼酸盐染料溶液(1142-1153，Sigma公司，美国)，并在常温下反应10分钟，结束与用于抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的化合物即罗巴斯汀(Lobarstin)和基质的反应后，在620nm测量了吸光度。
结果，如图30所示，罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性分析结果为IC50＝154.6nM，显示了出色的抑制蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的效果，确认了抑制率浓度依赖性地增加，从而确认了罗巴斯汀(Lobarstin)是能够药学治疗和预防糖尿病和肥胖症的化合物。
实施例14
分析罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶族的选择性
为了研究罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性，通过光谱测量酶的活性来研究了蛋白酪氨酸磷酸酶-1b(PTP-1b)、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7及PTPN13的抑制活性。首先在0.5单位浓度的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b、PTPN2、PTPN5、PTPN6、PTPN7、PTPN13(Bioneer公司，韩国)和蛋白酪氨酸去磷酸化酶缓冲液(20mM Tris-HCl，pH8.0，0.75mM氯化钠，0.5mM EDTA，5mMβ-巯基乙醇，50％甘油)中，分别添加罗巴斯汀(Lobarstin)0,50,100,200nM和基质[pTyr1146]胰岛素受体(1142-1153，Sigma公司，美国)后，在常温下反应10分钟-30分钟，然后，添加孔雀绿-钼酸盐染料溶液(Sigma公司，美国)，并在常温下反应10分钟，结束与基质的反应后，在620nm测量了吸光度。
调查罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸去磷酸化酶族的选择性的结果，如图31所示，200nML的罗巴斯汀(Lobarstin)对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的IC50抑制率为47.96％，特别是，确认了对包括TC-PTP(PTPN2)在内的其它蛋白酪氨酸去磷酸化酶没有抑制活性(图31)。
显示出在蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中仅对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地作用的上述实验结果表明，本发明的化合物罗巴斯汀(Lobarstin)能够作为蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂用于糖尿病的治疗中。
实施例15
验证罗巴斯汀(Lobarstin)对糖尿病模型动物的疗效
15-1：腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)后观察血糖变化
根据对罗巴斯汀(Lobarstin)的预测试、有效性测试及毒性试验资料，决定了给药量(用测试化合物(mg)/试验动物的体重(Kg)表示)。在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)中，向对照组每天腹腔给药PBS 200μl，向实验组每天腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)10mg/kg，并每周测量两次血糖。
向7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)后观察血糖变化的结果，如图32所示，在对照组(n＝6)中，平均第0天为271mg/dL，第7天为326mg/dL，第14天为479mg/dL，第21天为486mg/dL，显示出急剧的血糖增加现象。然而，在腹腔给药10mg/kg罗巴斯汀(Lobarstin)的实验组(n＝6)中，平均第0天为299mg/dL，第7天为259mg/dL，第14天为267mg/dL，第21天为242mg/dL，确认显示出低于对照组的血糖增加现象(图32)。
15-2：观察腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)并禁食6小时后的血糖变化
为了测量罗巴斯汀(Lobarstin)的更为准确的抗糖尿病效果，在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)中，向对照组每天给药PBS 200μl，向实验组每天腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)10mg/kg，并每周测量两次血糖，此时，腹腔给药后禁食6小时，然后测量了血糖。
结果，如图33所示，在对照组(n＝6)中，平均第0天为134mg/dL，第7天为238mg/dL，第14天为350mg/dL，第21天为479mg/dL，显示出急剧的血糖增加现象。然而在腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)10mg/kg的实验组(n＝6)中，平均第0天为134mg/dL，第7天为182mg/dL，第14天为162mg/dL，第21天为204mg/dL。与实施例5-1相同，显示出低于对照组的血糖增加现象。
15-3：罗巴斯汀(Lobarstin)的腹腔给药28天后的葡萄糖耐量试验
为了测量腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)后动物模型中的葡萄糖耐量，进行了如下的实验
在7周大的雄性db/db小鼠(第二型糖尿病模型动物，C57/BLKS/J-db/db，韩国生命工学研究院)中，向对照组每天腹腔给药20％DMSO共28天，向实验组每天腹腔给药罗巴斯汀(Lobarstin)10mg/kg共28天后，在分别不给药20％DMSO及罗巴斯汀(Lobarstin)的状态下，禁食16小时后，腹腔给药葡萄糖(500mg/ml，给药量200μl)，然后在0分钟、15分钟、30分钟、60分钟、90分钟及120分钟时从尾静脉采集的血样，并观察血糖变化。
向第二型糖尿病动物模型皮下给药葡萄糖后观察了葡萄糖量变化，结果，如图34所示，在对照组(腹腔给药20％DMSO)的情况下，给药葡萄糖后，0分钟时为204mg/dL，15分钟时为496mg/dL，30分钟时为572mg/dL，60分钟时为542mg/dL，90分钟时为483mg/dL，120分钟时为424mg/dL，显示出急剧的血糖增加倾向及非常缓慢的血糖降低现象。然而，在给药罗巴斯汀(Lobarstin)10mg/kg的实验组的情况下，0分钟时为152mg/dL，15分钟时为229mg/dL，30分钟时为307mg/dL，60分钟时为205mg/dL，90分钟时为162mg/dL，120分钟时为147g/dL。可以确认，通过药物浓度依赖性的缓慢的血糖增加和快速的血糖下降来恢复血糖的正常化(图34)。这些实施例15-1至15-3的结果表明，本发明的新型化合物罗巴斯汀(Lobarstin)具有非常优秀的抗糖尿病效果。
以上，详细说明了本发明内容的特定部分，本领域技术人员应当明白，这些具体的技术只是优选的实施方式，本发明的范围并不局限于此。因此，本发明的实质性的范围将根据附件的权利要求书及其等价物来定义。
工业实用性
如上所述，本发明的新型化合物对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制活性非常优秀，在蛋白酪氨酸去磷酸化酶族中仅对蛋白酪氨酸磷酸酶-1b选择性地起作用，能够作为实质性的蛋白酪氨酸磷酸酶-1b的抑制剂来用于糖尿病的治疗中，因此，有效预防或治疗糖尿病和肥胖症。

Claims (12)

1.一种化合物，由下述化学式4表示，
化学式4
2.一种由下述化学式4表示的化合物的制备方法，包括：
步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣；
步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈水溶液洗脱在步骤(a)中获得的高山珊瑚枝地衣提取物；
步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈或甲醇水溶液洗脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，获得含有罗巴酸的分馏物；以及
步骤(d)，将所述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加碱并进行搅拌，然后添加酸性溶液而结束反应，从而获得由下述化学式4表示的化合物，
化学式4
3.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
在所述步骤(d)中，溶剂为丙酮，碱为NaOH或KOH，酸性溶液为HCl溶液、H2SO4溶液或HNO3溶液。
4.根据权利要求2所述的制备方法，其特征在于，
浓缩所述步骤(d)的反应液，然后，通过二氯甲烷、氯仿或氯乙烯、以及水溶液之间的分配来获得二氯甲烷、氯仿或氯乙烯溶解层，并进行浓缩，从而获得由下述化学式4表示的化合物，
化学式4
5.一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其中，作为有效成分含有由下述化学式4表示的化合物或其药学上可接受的盐，
化学式4
6.一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品，其中，作为有效成分含有由下述化学式4表示的化合物或其药学上可接受的盐，
化学式4
7.一种化合物，由下述化学式6表示，
化学式6
8.一种由下述化学式6表示的化合物的制备方法，包括：
步骤(a)，用甲醇提取高山珊瑚枝地衣；
步骤(b)，利用柱色谱，并通过甲醇或乙腈水溶液洗脱在步骤(a)中获得的高山珊瑚枝地衣提取物；
步骤(c)，利用反相高效液相色谱，并通过乙腈或甲醇水溶液洗脱在步骤(b)中洗脱的分馏物，获得含有罗巴酸的分馏物；以及
步骤(d)，将上述含有罗巴酸的分馏物溶解于溶剂后，添加水和碱并进行搅拌，然后添加酸性溶液而结束反应，从而获得由下述化学式6表示的化合物，
化学式6
9.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，
在所述步骤(d)中，溶剂为丙酮，碱为NaOH或KOH，酸性溶液为HCl溶液、H2SO4溶液或HNO3溶液。
10.根据权利要求8所述的制备方法，其特征在于，
浓缩所述步骤(d)的反应液后，通过二氯甲烷、氯仿或氯乙烯、以及水溶液之间的分配来获得二氯甲烷、氯仿或氯乙烯溶解层，并进行浓缩，从而获得由下述化学式6表示的化合物，
化学式6
11.一种用于预防或治疗糖尿病或肥胖症的药物组合物，其中，作为有效成分含有由下述化学式6表示的化合物或其药学上可接受的盐，
化学式6
12.一种用于预防或改善糖尿病或肥胖症的功能性食品，其中，作为有效成分含有由下述化学式6表示的化合物，
化学式6
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