JP5748441B2

JP5748441B2 - シトルリンを有効成分として含有する骨量低下改善剤

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Publication number: JP5748441B2
Application number: JP2010215769A
Authority: JP
Inventors: 諭高杉; 暢子神野; ゆかり駒場; 昌士長田; 伊藤　裕之; 裕之伊藤
Original assignee: Meiji Co Ltd
Current assignee: Meiji Co Ltd
Priority date: 2010-09-27
Filing date: 2010-09-27
Publication date: 2015-07-15
Anticipated expiration: 2030-09-27
Also published as: JP2012067062A

Description

本発明は、骨量低下の予防及び／又は改善剤、および骨量低下の予防及び／又は改善用食品、およびこれらを製造するためのシトルリンの使用に関する。

骨粗鬆症は日本において患者数が1000万人以上もいる国民病である。骨粗鬆症は患者のQOLを大きく低下させ、要介護・要支援の大きな原因の一つである骨折等を引き起こす。骨粗鬆症の予防・改善は非常に重要である。
骨粗鬆症には、原発性骨粗鬆症、続発性骨粗鬆症などが知られている。また、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症などの疾患により、低骨量をきたす場合もある。骨粗鬆症が進行すると、骨折や骨の変形がおこりやすくなる。例えば、股関節の骨折は患者の自立歩行を困難とし、椎骨の圧迫骨折は老人性の円背につながるなど、患者のQOLは著しく低下する。
従来、骨粗鬆症の予防又は改善のために、カルシウム、ビタミンＤ、ビスホスホネート製剤またはカルシトニン等の摂取や、適度な運動、エストロゲンの補充等の手段が取られているが、安全で長期継続が可能である更なる手段が求められていた。これまでに、グルタミン酸塩（特許文献１：特表２００５−５１８３５３）、必須アミノ酸の混合物（特許文献２：特表２００５−５０５５００）、酸性アミノ酸誘導体（特許文献３：特表２００７−５３４６１０）またはネギ属植物に由来するγ−グルタミル−ペプチド（特許文献４：特表２００７−５１２２８４）等も骨粗鬆症の予防又は改善のために有効であると知られている。

シトルリンは、ウリ科植物に含まれるアミノ酸の一種であり、これまでに一酸化窒素（NO）生成を介した血管拡張作用や（非特許文献１：Food STYLE21、12(5)、pp96(2008)）、保湿作用（特許文献５：特開2004-323401）等の生理機能が知られている。

特表２００５−５１８３５３号公報特表２００５−５０５５００号公報特表２００７−５３４６１０号公報特表２００７−５１２２８４号公報特開２００４−３２３４０１号公報

Food STYLE21、12(5)、pp96(2008)

本発明の課題は、安全性が高く、長期摂取が可能な骨量低下予防及び／又は改善剤を提供する事である。

本発明者らは鋭意検討した結果、シトルリンに骨量低下の予防及び／又は改善効果を見出し、本発明を完成させた。

具体的には、尾部懸垂による骨粗鬆症モデルを用いたin vivo試験において、シトルリンが大腿骨遠位部の骨量低下を改善する効果を見出した。

すなわち、本発明は、
[１] シトルリンを有効成分として含有する、不動性骨粗鬆症または廃用性骨粗鬆症による骨量低下の予防及び／又は改善剤、
[２] シトルリンおよび製剤化のための補助剤のみを含む、前記[１]に記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤、
[３] シトルリンとしての１日当たりの摂取量が0.1〜10.0ｇである、前記[１]又は[２]に記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤、
[４] シトルリンとしての含有量が0.2〜100w/w %である、前記[１]〜[３]のいずれかに記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤、
[５] 不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症が全身性又は局所性である、前記[１]〜[４]のいずれかに記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤、
[６] 宇宙飛行士、長期療養者、対麻痺患者、廃用症候群患者、高齢者、骨折者に用いられる、前記[１]〜[５]のいずれかに記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤、
[７] シトルリンを有効成分として含有する、不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症の予防及び／又は改善剤、
[８] シトルリンおよび製剤化のための補助剤のみを含む、前記[７]に記載の不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症の予防及び／又は改善剤、
[９] シトルリンとしての１日当たりの摂取量が0.1〜10.0ｇである、前記[７]又は[８]に記載の不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症の予防及び／又は改善剤、
[１０] シトルリンとしての含有量が0.2〜100w/w %である、前記[７]〜[９]のいずれかに記載の不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症の予防及び／又は改善剤、
[１１] 不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症が全身性又は局所性である、前記[７]〜[１０]のいずれかに記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤、
[１２] 宇宙飛行士、長期療養者、対麻痺患者、廃用症候群患者、高齢者、骨折者に用いられる、前記[７]〜[１１]のいずれかに記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤、からなる。

本発明の骨量低下の予防及び／又は改善剤は、安全に骨粗鬆症、とりわけ不動性（廃用性）の骨粗鬆症の予防及び／又は改善をすることができる。

実施例１で測定した、大腿骨遠位部の位置を示す。大腿骨を長尺方向（骨端〜骨頭）に4分割した骨端側（膝側）の1分割分（A）が大腿骨遠位部に相当する。実施例１における、各群の大腿骨遠位部の骨密度を示す。＊：p<0.05、n=4、vs. Normal群、Dunnett多重検定法。

以下、本発明を詳細に説明する。ただし、本発明は以下の好ましい実施態様に限定されず、本発明の範囲内で自由に変更できるものである。

本発明の有効成分であるシトルリンは、Cas No.が372-75-8であり、N⁵-(アミノカルボニル)-L-オルニチン(N⁵-(aminocarbonyl)-L-Ornithine)、N⁵-カルバモイル-L-オルニチン（N⁵-carbamoyl-L-Ornithine）、(S)-2-アミノ-5-ウレイド吉草酸（(S)-2-Amino-5-ureidovaleric acid）、L-(+)-シトルリン、L-シトルリンともいう。シトルリンの略号としてH-CIT-OH、CITを用いる場合もある。シトルリンは水に可溶、メタノールおよびエタノールには不溶である（The Merck Index eleventh edition、Merck & CO., Inc.、1989）。シトルリンはウリ科植物に含まれるアミノ酸として知られている。特に、野生スイカ「Citrullus vulgaris（シトルラスブルガリス）」に多く含まれ、他にメロン、きゅうり、ニガウリ等にも含まれる（Food STYLE21、12(5)、pp96(2008)）。シトルリンは身体のタンパク質を構成するアミノ酸に属しないが、一酸化窒素(NO)合成酵素の働きによりＬ−アルギニンから体内で合成される。

本発明において、シトルリンは前記植物、シトルリンを多く含む食品等から搾汁、濃縮、精製、結晶化または各種溶媒で抽出する等して得ることができる。各種溶媒としては、水や通常用いられる溶媒、例えば、アルコール類、炭化水素類、有機酸、有機塩基、無機酸、無機塩基、超臨界流体等を単独あるいは複数を組み合わせて用いることができる。あるいは、微生物を用いてシトルリンを生産することも可能である（特開平05-168486、特公平07-055155、WO2006/035831等）。シトルリン生産性を有する乳酸菌や、該乳酸菌の培養物または該乳酸菌を用いて製造した発酵乳等、あるいは化学的に合成されたシトルリン、シトルリンを多く含む食品を本発明の骨量低下予防及び／又は改善剤に用いてもよい。

本発明の骨量低下予防及び／又は改善剤は、尾部懸垂による骨粗鬆症モデルを用いたin vivo試験において、大腿骨遠位部の骨量低下を改善する効果が確認された。

原発性骨粗鬆症の診断基準（2000年度改訂版、日本骨代謝学会骨粗鬆症診断基準検討委員会）において、骨粗鬆症は低骨量でかつ骨組織の微細構造が変化し、そのために骨が脆くなり骨折しやすくなった病態であると定義されている。骨粗鬆症には、原発性骨粗鬆症（閉経後骨粗鬆症、老人性骨粗鬆症、退行期骨粗鬆症、特発性骨粗鬆症、妊娠後骨粗鬆症等）、続発性骨粗鬆症（内分泌性骨粗鬆症、薬物性骨粗鬆症、栄養性骨粗鬆症、不動性（廃用性）骨粗鬆症、先天性骨粗鬆症等）などが知られている。また、骨軟化症、副甲状腺機能亢進症などの疾患により、低骨量をきたす場合もある。これらは、エストロゲンレベルの低下、カルシウムやビタミンＤ等の欠乏、骨形成・骨吸収のバランスの崩れ、身体運動の低下等々、多様な因子により引き起こされることが分かっている。骨粗鬆症が進行すると、骨折や骨の変形がおこりやすくなる。例えば、股関節の骨折は患者の自立歩行を困難とした結果、寝たきりにつながり、また、椎骨の圧迫骨折は老人性の円背につながるなど、患者のQOLは著しく低下する。

本発明のシトルリンは、動物を用いた試験において、人工的に後肢を非荷重状態とした実験モデル（尾部懸垂モデル）の骨密度の低下を抑制する効果が見出された。したがって、本発明のシトルリンを骨量低下の予防及び／又は改善剤として、あるいは骨量低下の予防及び／又は改善用食品として用いることができる。さらにシトルリンは、骨粗鬆症などの骨量低下を伴う疾患を予防及び／又は改善のために有効に用いることができる。また、とりわけ、全身性又は局所性の不動性（廃用性）骨粗鬆症を予防及び／又は改善に有効であるため、宇宙飛行士、長期療養者、対麻痺患者、廃用症候群患者、高齢者、骨折患者、体をあまり動かさない者等の骨量低減を予防及び／又は改善することができる。

本発明の骨量低下予防及び／又は改善剤の医薬品または飲食品への配合量は形態、剤型、症状、体重、用途などによって異なるため、特に限定されないが、あえて挙げるなら、シトルリンとして0.2〜100 w/w %の含量で配合することができ、好ましくはシトルリンとして0.3〜100 w/w %、さらに好ましくはシトルリンとして0.4〜100 w/w %の含量で配合することができる。

本発明の骨量低下予防及び／又は改善剤の医薬品または飲食品の一日当たりの摂取量は年齢、症状、体重、用途などによって異なるため、特に限定されないが、あえて挙げるなら、シトルリンとして0.1〜10.0gを摂取することができ、好ましくはシトルリンとして0.4〜9.0g、さらに好ましくはシトルリンとして0.8〜8.0g、より好ましくはシトルリンとして2.4〜8.0g、4.0〜8.0g 、または4.0gを摂取することができる。
また、従来知られる骨量低下予防及び／又は改善効果を有する医薬品や食品と併用して用いてもよい。具体的には、カルシウム、ビタミンＤ、ビスホスホネート類、カルシトニン等を挙げることができるが、これらの例に限定されない。

本発明の骨量低下予防及び／又は改善剤は医薬品又は飲食品いずれの形態でも利用することができる。例えば、医薬品として直接投与することにより、又は特定保健用食品等の特別用途食品、栄養機能食品、栄養補助食品やサプリメントとして直接摂取することにより骨量低下を予防及び／又は改善することが期待される。また、液状、ペースト状、固形、粉末等の形態を問わず、各種食品（牛乳、清涼飲料、発酵乳、ヨーグルト、チーズ、パン、ビスケット、クラッカー、ピッツァクラスト、調製粉乳、流動食、病者用食品、栄養食品、冷凍食品、加工食品その他の市販食品等）に添加し、これを摂取してもよい。

本発明の骨量低下予防及び／又は改善剤を含有する食品には、水、タンパク質、糖質、脂質、ビタミン類、ミネラル類、有機酸、有機塩基、果汁、フレーバー類等を使用することができる。タンパク質としては、例えば全脂粉乳、脱脂粉乳、部分脱脂粉乳、カゼイン、ホエイ粉、ホエイタンパク質、ホエイタンパク質濃縮物、ホエイタンパク質分離物、ホエイタンパク質加水分解物、α―カゼイン、β―カゼイン、κ−カゼイン、β―ラクトグロブリン、α―ラクトアルブミン、ラクトフェリン、大豆タンパク質、鶏卵タンパク質、肉タンパク質等の動植物性タンパク質、これらの分解物；バター、乳清ミネラル、クリーム、ホエイ、非タンパク態窒素、シアル酸、リン脂質、乳糖等の各種乳由来成分などが挙げられる。カゼインホスホペプチド、リジン等のペプチドやアミノ酸を含んでいてもよい。糖質としては、例えば、糖類、加工澱粉（テキストリンのほか、可溶性澱粉、ブリティッシュスターチ、酸化澱粉、澱粉エステル、澱粉エーテル等）、食物繊維などが挙げられる。脂質としては、例えば、ラード、魚油等、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の動物性油脂；パーム油、サフラワー油、コーン油、ナタネ油、ヤシ油、これらの分別油、水素添加油、エステル交換油等の植物性油脂などが挙げられる。ビタミン類としては、例えば、ビタミンA、カロチン類、ビタミンB群、ビタミンC、ビタミンD群、ビタミンE、ビタミンK群、ビタミンP、ビタミンQ、ナイアシン、ニコチン酸、パントテン酸、ビオチン、イノシトール、コリン、葉酸などが挙げられ、ミネラル類としては、例えば、カルシウム、カリウム、マグネシウム、ナトリウム、銅、鉄、マンガン、亜鉛、セレンなどが挙げられる。有機酸としては、例えば、リンゴ酸、クエン酸、乳酸、酒石酸、エリソルビン酸などが挙げられる。これらの成分は、２種以上を組み合わせて使用することができ、合成品及び／又はこれらを多く含む食品を用いてもよい。食品の形態としては、固体でも液体でもかまわない。またゲル状などであってもよい。

本発明の骨量低下予防及び／又は改善剤を医薬品又はサプリメントとして使用する場合には、種々の形態で投与することができる。その形態として、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、シロップ剤等による経口投与を挙げることができる。これらの各種製剤は、常法に従って主剤に賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、矯臭剤、溶解補助剤、懸濁剤、コーティング剤などの医薬の製剤技術分野において通常使用しうる、既知の製剤化のための補助剤を用いて製剤化することができる。また、適当量のカルシウムを含んでいてもよい。さらに適当量のビタミン、ミネラル、有機酸、糖類、アミノ酸、ペプチド類などを添加してもよい。

以下、本発明に関して実施例を挙げて説明するが、本発明は、これにより限定されるものではない。

[尾部懸垂ラットにおけるシトルリン給与が骨密度に及ぼす影響]
（動物実験）
7週齢のWistar系雄性ラット（日本チャールズリバー（株）)16匹を購入し、5日間の馴化を行った後、平均体重がなるべく均一になるように、4試験群(Normal群、Unload群（対照群、シトルリン(Citrulline)投与群、非必須アミノ酸（NEAA）投与群）、各n=4)に分けた。群分け後、Unload群は尾部を懸垂し、後肢が地面に付かない状態（ラット頭部を水平面から約30°下方に傾けた状態）を保持して試験を開始し(day0)、そのまま1週間飼育した。Normal群は尾部懸垂群と同じケージ内で尾部を懸垂せずに試験を開始し(day0)、1週間飼育した。全ての期間を通じて、各試験群にはUV殺菌水を自由摂取させた。試験開始から１週間は、各試験群に表１の試験飼料を給与した。試験飼料の作成に用いたNEAA mix, シトルリンmixの組成の組成を表２に示す。Normal群および対照群にはAIN-93M（オリエンタル酵母社製）とコーンスターチを混合して作製した飼料[改変AIN-93M飼料]を給与した。シトルリン投与群にはシトルリンを飼料中に5%添加した飼料[シトルリン飼料]を給与した。NEAA投与群にはシトルリン添加飼料と同じN量となるようにNEAA混合物（L-Proline, L-Alanine, L-Histidine, L-Glycine, L-Aspartic acid, L-Serineを等モルで混合）を添加した飼料[NEAA飼料]を給与した。また、試験期間中、各群には各試験飼料を摂取量が同じになるようにペアフィーディングし、試験開始から１週間(day0〜day7)に各群の個体が摂取した餌の重量を測定した。
なお、AIN-93Mは、米国国立栄養研究所（American Institute of Nutrition)から1993年に発表されたマウス・ラット用の栄養研究のための標準精製飼料組成である。

試験開始から1週間後にX線CT(La Theta; ALOKA社製)を用いて大腿骨遠位部（大腿骨を長尺方向（骨端〜骨頭）に4分割した骨端側（膝側）の1分割分、図１のAに相当する）の骨密度を測定した。
測定値は全て平均値±標準誤差で表した。統計解析は、Normal群と他群間の平均値の有意差検定をDunnett多重検定法によって行った。

（結果）
結果を表３および図２に示す。表３に示された通り、シトルリン投与群が７日間に摂取したシトルリンの平均摂取量は8.07ｇであった（一日当たりのシトルリン平均摂取量は1.15g/day）。また、試験開始から７日後(day7)のシトルリン投与群の平均体重が287.5gであったから、一日当たりのシトルリン平均摂取量は4.01ｇ/kg/dayに相当する。また、day7の体重および摂餌量については、各群に差は認められなかった。
図２に示された通り、対照群は、Normal群と比べ有意に骨密度が減少した（図２）。これによって、本実施例で用いた尾部懸垂モデルにおいて、不動性の骨粗鬆症が発生したことを確認できた。また、シトルリン投与群は骨密度が減少しなかったのに対し、非必須アミノ酸投与群では有意に骨密度が減少した。よって、シトルリンは不動性の骨量低下を抑制し、その効果は単に飼料中の窒素含量の効果ではないことが示された。

本発明のシトルリンを骨量低下の予防及び／又は改善剤として、骨量低下のあるいは予防及び／又は改善用食品として用いることができる。さらにシトルリンは、骨粗鬆症などの骨量低下を予防及び／又は改善のために有効に用いることができる。また、とりわけ、全身性又は局所性の不動性（廃用性）骨粗鬆症を予防及び／又は改善に有効であるため、宇宙飛行士、長期療養者、対麻痺患者、廃用症候群患者、高齢者、骨折者等の骨量低減を予防及び／又は改善することができる。

Claims

シトルリンを有効成分として含有する、不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症による骨量低下の予防及び／又は改善剤。
シトルリンおよび製剤化のための補助剤のみを含む、請求項１に記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤。
シトルリンとしての１日当たりの摂取量が0.1〜10.0ｇである、請求項１又は２に記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤。
シトルリンとしての含有量が0.2〜100w/w %である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤。
不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症が全身性又は局所性である、請求項１〜４のいずれか１項に記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤。
宇宙飛行士、長期療養者、対麻痺患者、廃用症候群患者、高齢者、骨折者に用いられる、請求項１〜５のいずれか１項に記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤。
シトルリンを有効成分として含有する、不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症の予防及び／又は改善剤。
シトルリンおよび製剤化のための補助剤のみを含む、請求項７に記載の不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症の予防及び／又は改善剤。
シトルリンとしての１日当たりの摂取量が0.1〜10.0ｇである、請求項７又は８に記載の不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症の予防及び／又は改善剤。
シトルリンとしての含有量が0.2〜100w/w %である、請求項７〜９のいずれか１項に記載の不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症の予防及び／又は改善剤。
不動性骨粗鬆症又は廃用性骨粗鬆症が全身性又は局所性である、請求項７〜１０のいずれか１項に記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤。
宇宙飛行士、長期療養者、対麻痺患者、廃用症候群患者、高齢者、骨折者に用いられる、請求項７〜１１のいずれか１項に記載の骨量低下の予防及び／又は改善剤。