JP5742061B2 - 関節リウマチ治療剤 - Google Patents

Description

本発明は、インターロイキン-26を含有する関節リウマチ治療剤及び破骨細胞形成抑制剤に関する。

インターロイキン（以降「IL」と称することもある）-26は、IL-10ファミリーに属するサイトカインであり、そのシグナルは、IL-20R1及びIL-10R2から構成される受容体複合体を介して伝達される(非特許文献１〜３)。
IL-26は、IL-23刺激によりTh17細胞から産生されるとの報告がある(非特許文献４)。しかし、IL-26の詳細な作用はいまだ不明である。その理由として、現在までIL-26のマウスのホモログが同定されていないことが挙げられる。
本発明者らは、これまでに、関節リウマチ患者関節液中のIL-17濃度が変形性関節症患者の関節液中のIL-17濃度に比し有意に高値であること（非特許文献５）、IL-23が少なくともIL-17経路を介してヒト破骨細胞形成を促進することを報告した（非特許文献６）。
しかしながら、IL-26がヒト破骨細胞形成に与える影響は不明である。

Dambacher J et al. Gut 58;1207-1217, 2009. Fickenscher H et al. Trends Immunol 23;89-96, 2002. Sheikh F et al. J Immunol 172；2006-2010, 2004. Wilson et al. Nat Immunol 8；950-957, 2007. Kotake S et al. J Clin Invest 103;1345-1352, 1999. Yago T et al. Inflammation and Regeneration 27;184-186, 2007.

本発明は、IL-26の新規用途を提供することを目的とする。

本発明者らが鋭意検討した結果、本発明者らは、IL-26によりヒト破骨細胞形成が抑制されることを見出した。本発明は係る知見に基づいてなされたものである。
すなわち、本発明は、IL-26を含有する関節リウマチ治療剤を提供する。
本発明はまた、関節リウマチ治療剤を製造するためのIL-26の使用を提供する。
本発明はまた、IL-26を含有する破骨細胞形成抑制剤を提供する。
本発明はまた、破骨細胞形成抑制剤を製造するためのIL-26の使用を提供する。

IL-26は、破骨細胞形成及び骨吸収を抑制することができることから、本発明により、優れた関節リウマチ治療剤及びヒト破骨細胞形成抑制剤を提供することができる。

インターロイキン-26のヒト破骨細胞形成抑制活性を示す。（Ａ）は、100ng/mLのM-CSF存在下、ヒト末梢血単核球より分離した単球を37℃で３日間培養した結果を示す。（Ｂ）は、100ng/mLのM-CSF存在下、ヒト末梢血単核球より分離した単球を37℃で３日間培養した培養系に、30ng/mLのsRANKLを添加し、その後、37℃で10日間培養した結果を示す。（Ｃ）は、100ng/mLのM-CSF存在下、ヒト末梢血単核球より分離した単球を37℃で３日間培養した培養系に、30ng/mLのsRANKL及び0.1ng/mLのrhIL-26を添加し、その後、37℃で10日間培養した結果を示す。（Ｄ）は、100ng/mLのM-CSF存在下、ヒト末梢血単核球より分離した単球を37℃で３日間培養した培養系に、30ng/mLのsRANKL及び1.0ng/mLのrhIL-26を添加し、その後、37℃で10日間培養した結果を示す。（Ｅ）は、100ng/mLのM-CSF存在下、ヒト末梢血単核球より分離した単球を37℃で３日間培養した培養系に、30ng/mLのsRANKL及び10ng/mLのrhIL-26を添加し、その後、37℃で10日間培養した結果を示す。（Ｆ）は、100ng/mLのM-CSF存在下、ヒト末梢血単核球より分離した単球を37℃で３日間培養した培養系に、30ng/mLのsRANKL及び100ng/mLのrhIL-26を添加し、その後、37℃で10日間培養した結果を示す。 インターロイキン-26の骨吸収能（骨吸収窩）を示す。（Ａ）は、100ng/mLのM-CSF存在下、合成リン酸カルシウム上で、ヒト末梢血単核球より分離した単球を37℃で３日間培養した結果を示す。（Ｂ）は、100ng/mLのM-CSF存在下、合成リン酸カルシウム上で、ヒト末梢血単核球より分離した単球を37℃で３日間培養した培養系に、50ng/mLのsRANKLを添加し、その後、37℃で10日間培養した結果を示す。（Ｃ）は、100ng/mLのM-CSF存在下、合成リン酸カルシウム上で、ヒト末梢血単核球より分離した単球を37℃で３日間培養した培養系に、50ng/mLのsRANKL及び10ng/mLのrhIL-26を添加し、その後、37℃で10日間培養した結果を示す。（Ｄ）は、100ng/mLのM-CSF存在下、合成リン酸カルシウム上で、ヒト末梢血単核球より分離した単球を37℃で３日間培養した培養系に、50ng/mLのsRANKL及び100ng/mLのrhIL-26を添加し、その後、37℃で10日間培養した結果を示す。 ヒト単球上のRANKのmRNAの発現率を示す。

本発明の有効成分であるIL-26は、従前AK155と呼ばれ（Knappe A. et al., (2000) J. Virology 74: 3881）、21アミノ酸からなるシグナルペプチドと、６つのへリックスと、４つの保存システイン配列とを含む、全長171アミノ酸のポリペプチドである。IL-26は、生体が体内に産生するサイトカインのファミリーであるから、生体に投与しても安全である。
本発明で用いるIL-26としては、天然物だけでなく人工物も使用することができる。人工物には、組換え型のものが含まれる。遺伝子工学法により、ILが本来有する生物活性を実質的に変更することなく、そのアミノ酸の一部を削除、置換又は挿入等により改変する方法も知られている。従って、本発明で用いるIL-26としては、そのような改変したものも含まれる。ヒト由来のIL-26（hIL-26）が好ましい。組換え型（rIL-26）もまた好ましい。

本発明で用いるIL-26としては、市販品を用いてもよいし、公知の方法により合成することもできる。市販品としては、例えば、R&D Systems Inc.製, "Recombinant Human IL-26/AK155 Monomer"；Abnova製、"Recombinant Human IL-26/AK155 Monomer"等があげられる。また、ゲルろ過、イオン交換クロマトグラフィー、逆相クロマトグラフィー及びマススペクトル等を用いる公知の方法により、リンパ節および滑膜組織から単離及び精製することにより得ることができる。本発明で用いるIL-26はまた、一般的なアミノ酸の化学合成法、例えばＦｍｏｃ法により合成することもできるし、市販のアミノ酸合成装置を使用して合成することもできる。

上記IL-26は、そのままあるいは各種の医薬組成物として投与される。投与対象は、関節リウマチの治療が必要であるか、又は破骨細胞形成の抑制が必要な、ヒトを含む動物である。破骨細胞としてはヒト破骨細胞が好ましい。
医薬組成物の剤形としては、例えば錠剤、散剤、丸剤、顆粒剤、カプセル剤、坐剤、溶液剤、糖衣剤、デボー剤、またはシロップ剤にしてよく、普通の製剤助剤を用いて常法に従って製造することができる。
例えば錠剤は、本発明の有効成分であるIL-26を既知の補助物質、例えば乳糖、炭酸カルシウムまたは燐酸カルシウム等の不活性希釈剤、アラビアゴム、コーンスターチまたはゼラチン等の結合剤、アルギン酸、コーンスターチまたは前ゼラチン化デンプン等の膨化剤、ショ糖、乳糖またはサッカリン等の甘味剤、ペパーミント、アカモノ油またはチェリー等の香味剤、ステアリン酸マグネシウム、タルクまたはカルボキシメチルセルロース等の滑湿剤、脂肪、ワックス、半固形及び液体のポリオール、天然油または硬化油等のソフトゼラチンカプセル及び坐薬用の賦形剤、水、アルコール、グリセロール、ポリオール、スクロース、転化糖、グルコース、植物油等の溶液用賦形剤と混合することによって得られる。

IL-26は、成人一日当たり、通常、精製蛋白質換算で３〜10μg/kg体重、好ましくは3〜5μg/kg体重の用量を一回又は複数回で投与する。
本発明の治療剤又は抑制剤の投与量は、投与ルート、治療期間、患者の年齢及び体重などにより決定される。

１．IL-26
IL-26として、組み替えヒトIL-26（recombinant human IL-26, rhIL-26, R&D Systems Inc.製, "Recombinant Human IL-26/AK155 Monomer"、カタログ番号：1375-IL/CF、寄託番号Q9NPH9で寄託されているE.coliを起源とする。予測分子量17.7kDa）を用いた。
２．対象と方法
（１）ヒト末梢血単核球より単球をin vitroで分離した。分離した単球を、5x10⁴/wellとなるように48wellプレートに接種した。該単球を、マクロファージコロニー刺激因子（Macrophage colony-stimulating factor（M-CSF）(100 ng/ml)存在下、37℃において3日間培養した（図１（Ａ））。
培養開始後４日目に、この培養系に、M-CSFおよび可溶性receptor-activator of NFκB ligand(sRANKL)を30 ng/ml添加し、37℃において10日間培養した（図１（Ｂ））。
他方、培養開始後４日後の培養系に、rhIL-26を、それぞれ0.1, 1.0, 10, 100 ng/ml添加し、37℃において10日間培養した（図１（Ｃ）〜（Ｆ））。
培養終了後、破骨細胞を抗CD51/61抗体で免疫染色し、rhIL-26によるヒト破骨細胞形成抑制活性を評価した。

（２）骨培養システム（BD Bioscience製、BD BioCoat（TM）オステオロジック（TM））を用い、破骨細胞の骨吸収能を吸収窩で評価した。前記システムの培養容器には、骨代替物として合成リン酸カルシウム薄膜がコートされており、このコート上で破骨細胞を培養することにより、前記薄膜上に骨吸収窩が形成され、骨吸収能を評価することができる。
先ず、ヒト末梢血単核球より単球をin vitroで分離し、分離した単球を、5x10⁴/wellとなるように前記システムの培養容器に接種し、該単球を、M-CSF(100 ng/ml)存在下、37℃において3日間培養した（図２（Ａ））。
培養開始後４日目に、この培養系に、M-CSFおよび可溶性sRANKLを50 ng/ml添加し、37℃において10日間培養した（図２（Ｂ））。
他方、培養開始後４日後の培養系に、rhIL-26を、それぞれ10, 100 ng/ml添加し、37℃において10日間培養した（図２（Ｃ）〜（Ｄ））。

（３）5x10⁴/wellのヒト単球をM-CSF(100 ng/ml)と共に37℃において24時間培養した。非付着細胞を取り除いた後、一方の培養系にM-CSF(100 ng/ml)及びrhIL-26(10 ng/ml)を添加した。もう一方の培養系にはM-CSF(100 ng/ml)のみを添加した。37℃において24時間培養後、単球上のreceptor-activator of NFκB（RANK）のｍRNA発現率をRT-PCRにて測定した（図３）。

３．結果
（１）図１（Ｂ）〜（Ｆ）に見られる、黒点を取り囲むように存在する不定形の灰色の部分が破骨細胞を示す（実際には、抗CD51/61抗体によりピンクに染色されている）。M-CSFにsRANKLを添加すると、ヒト破骨細胞が分化誘導される（図１（Ｂ））。このrhIL-26不存在下と同温度で同期間、rhIL-26存在下で培養したところ（図１（Ｃ）〜（Ｆ））、図１（Ｂ）に比べて灰色部分の面積が減った。これは、rhIL-26不存在下において誘導されるヒト破骨細胞の量よりも、rhIL-26存在下において誘導されるヒト破骨細胞の量の方が少ないことを示す。つまり、rhIL-26により、ヒト破骨細胞の形成が抑制された。加えて、rhIL-26の濃度が高くなるにつれてヒト破骨細胞形成が抑制された。つまり、図１に示されるとおり、rhIL-26添加により、ヒト破骨細胞形成は濃度依存的に抑制された。
（２）図２（Ｂ）及び（Ｃ）に見られる白色の円が骨吸収窩を示す。図２に示されるとおり、rhIL-26添加により、RANKLにより誘発される骨吸収窩は濃度依存的に減少した。
（３）図３に示されるとおり、単球上のRANK mRNA発現はrhIL-26添加により減少した。

以上、実施例から明らかなように、rhIL-26はヒト破骨細胞形成および骨吸収を抑制した。この抑制効果の機序として、少なくともIL-26による単球上のRANK mRNA発現の抑制が考えられる。加えて、破骨細胞形成抑制作用のあるIL-26と破骨細胞形成促進作用のあるIL-23のバランスがヒト破骨細胞形成を制御している可能性が示唆される。
破骨細胞形成抑制及び骨吸収抑制の両者に有効な点から、今後、rhIL-26の関節リウマチの治療への応用が期待される。

Claims (9)

1. インターロイキン-26を含有する関節リウマチ治療剤。
2. インターロイキン-26が、ヒトインターロイキン-26である請求項１記載の関節リウマチ治療剤。
3. インターロイキン-26が、組換えインターロイキン-26である請求項１又は２記載の関節リウマチ治療剤。
4. 関節リウマチ治療剤を製造するためのインターロイキン-26の使用。
5. IL-26を含有する破骨細胞形成抑制剤。
6. 破骨細胞が、ヒト破骨細胞である請求項５記載の破骨細胞形成抑制剤。
7. インターロイキン-26が、ヒトインターロイキン-26である請求項５又は６記載の破骨細胞形成抑制剤。
8. インターロイキン-26が、組換えインターロイキン-26である請求項５〜７のいずれか１項記載の破骨細胞形成抑制剤。
9. 破骨細胞形成抑制剤を製造するためのIL-26の使用。