JP5732603B2 - 骨標的アルカリホスファターゼ、キット及びその使用方法 - Google Patents

Description

本出願は、２００７年５月１１日出願の米国仮出願第６０／９１７，５８９号の優先権を主張する。上記の文献はすべて、参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。

連邦支援研究又は開発に関する陳述
該当なし。

本発明は、骨標的アルカリホスファターゼ、キット及びその使用方法に関する。

低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）は、希少な遺伝型のくる病又は骨軟化症（Ｗｈｙｔｅ、２００１）であり、発生率はカナダのメノナイトでは２，５００出生当たり１もあり（Ｇｒｅｅｎｂｅｒｇ、１９９３）、本疾患の更に重症な型は一般集団において１００，０００出生当たり１の発生率である。もっと軽度の型は更に蔓延している。この「代謝の先天異常」は、アルカリホスファターゼの組織非特異的イソ酵素（ＴＮＡＬＰ；ａ．ｋ．ａ肝臓／骨／腎臓型ＡＬＰ）をコードする遺伝子（ＡＬＰＬ）の機能喪失突然変異（単数又は複数）により引き起こされる（Ｗｅｉｓｓら、１９８８；Ｈｅｎｔｈｏｒｎら、１９９２ａ；Ｈｅｎｔｈｏｒｎら、１９９２ｂ；Ｚｕｒｕｔｕｚａら、１９９９；Ｍｉｌｌａｎ、１９９５）。その生化学的特徴は、血清中の亜正常ＡＬＰ活性であり（低リン血症）、それにより、３種類のホスホ化合物基質、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）及びピロドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）の血液及び／又は尿中レベルが上昇する（Ｗｈｙｔｅ、１９９４）。

ＨＰＰは、歴史的に診断時の年齢によって分類され、（最も重症から最も軽度まで）出生時、乳児期、小児期、成人期、及び歯限局型低ホスファターゼ血症型の幅がある著しい範囲の重症度を特徴とする（Ｗｈｙｔｅ、２００１）。死産では子宮内でほぼ完全に骨ミネラル化がなく、又は突発性骨折及び歯科疾患が成人期にはじめて起こることもある。出生時（致死性）低ホスファターゼ血症は子宮内で発現され、死産を引き起こすことがある。一部の新生児は数日間生き延びることもあるが、胸部の再生不良性のくる病のため呼吸困難が深刻化する。乳児期ＨＰＰでは、６月齢前に診断すると、生後発育は、食欲不振の開始、不十分な体重増加、及びくる病の出現までは正常であると思われる。放射線学的特徴は独特であり、障害性骨格ミネラル化を示し、進行性骨格脱ミネラル化が肋骨骨折及び胸部奇形をもたらすこともある。小児期低ホスファターゼ血症は、きわめて変化しやすい臨床的発現も有する。乳歯の成熟前の喪失は、歯根と歯周靭帯を繋いでいるセメント質の形成不全、発育不全又は異形成から生じる。くる病は低身長を引き起こし、骨格奇形には、フレアー骨幹端の結果として湾曲脚、手関節、膝及び足関節の拡張が挙げられることがある。成人期ＨＰＰは通常中年期に症状が見つかるが、くる病及び／又は歯の早期脱落、それに続く青年期及び若年成人期の健康という経歴があることが多い。再発中足骨疲労骨折がよく起こり、ピロリン酸カルシウム二水和物結晶沈着が関節炎の発作及びピロリン酸関節症を引き起こす。唯一の臨床的異常が歯科疾患であるときには、歯限局型低ホスファターゼ血症と診断され、放射線学的研究及び骨生検でさえくる病又は骨軟化症の症状をなにも明らかにしない。

重症臨床型の低ホスファターゼ血症は、通常、亜正常レベルの血清ＡＰ活性を示しているような患者の親の常染色体劣性遺伝形質として遺伝する（Ｗｈｙｔｅ、２００１）。もっと軽度の型の低ホスファターゼ血症、即ち、成人期及び歯限局型低ホスファターゼ血症では、常染色体優性遺伝形式も記述されている（Ｗｈｙｔｅ、２００１）。

健康な骨格では、ＴＮＡＬＰは、エクト酵素が特に豊富な（Ｍｏｒｒｉｓら、１９９２）脱落基質小胞（ＭＶ）の膜上を含む、骨芽細胞及び軟骨細胞の細胞膜の表面に存在するエクト酵素である（Ａｌｉら、１９７０；Ｂｅｒｎａｒｄ、１９７８）。骨ミネラル化中のヒドロキシアパタイトの沈着は、通常はこれらのＭＶの管腔内で開始される（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００５ａ）。電子顕微鏡法により、重症ＨＰＰ患者及びＡｋｐ２^−１−マウス（ＴＮＡＬＰヌルマウスモデル、下参照）由来のＴＮＡＬＰ欠損ＭＶはヒドロキシアパタイト結晶を含有するが、小胞外結晶増殖は遅延しているように思われることが明らかにされている（Ａｎｄｅｒｓｏｎ、１９９７；Ａｎｄｅｒｓｏｎ、２００４）。この欠損は、ＴＮＡＬＰ活性の欠損によるカルシウム沈着（Ｍｅｙｅｒ、１９８４）の強力な阻害剤であるＰＰｉの細胞外蓄積のせいだと考えられている（Ｈｅｓｓｌｅら、２００２；Ｈａｒｍｅｙら、２００４；Ｈａｒｍｅｙら、２００６）。

ＰＰｉが、０．０１〜０．１ｍＭの範囲でほぼ生理的濃度で存在している場合、ＰＰｉには、器官培養ニワトリ大腿骨中でのミネラル化を刺激する能力があり（Ａｎｄｅｒｓｏｎ＆Ｒｅｙｎｏｌｄｓ、１９７３）、単離されたラットＭＶによってもミネラル化を刺激する能力がある（Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００５ｂ）が、１ｍＭを超える濃度では、ＰＰｉはヒドロキシアパタイト結晶を被膜することによりリン酸カルシウムミネラル形成を阻害し、したがって、ミネラル結晶成長及び増殖性自己核形成を妨げる。したがって、ＰＰｉには二重の生理学的役割があることになり、即ち、ＰＰｉは、低濃度ではミネラル化の促進剤として、しかし高濃度ではミネラル化の阻害剤として機能することができる。ＴＮＡＬＰは、ミネラル化阻害剤ＰＰｉを加水分解してミネラル沈殿及び成長を促進することが明らかにされている（Ｒｅｚｅｎｄｅら、１９９８）。Ａｋｐ２^−１−マウスを使った最近の研究では、インビボでのＴＮＡＬＰの主な役割は、細胞外ＰＰｉプールの大きさを制限して、適切な骨格ミネラル化を可能にすることが示されている（Ｈｅｓｓｌｅら、２００２；Ｈａｒｍｅｙら、２００４）。

低ホスファターゼ血症の重症度は変わりやすく、ＴＮＡＬＰ突然変異の性質により調節される。酵素活性部位近傍、ホモ二量体界面、クラウンドメイン、アミノ末端アーム及びカルシウム結合部位におけるミスセンス突然変異はすべて、ＴＮＡＬＰの触媒活性に影響を与えることが見出されている（Ｚｕｒｕｔｕｚａら、１９９９）。更に、他のミスセンス、ナンセンス、フレームシフト及びスプライス部位突然変異は、異常性突然変異タンパク質又は細胞表面上に亜正常活性をもたらす細胞内輸送欠損を生じることが明らかにされている。突然変異の数の多さ及び低ホスファターゼ血症では複合ヘテロ接合体が頻繁に発生しているという事実も、この疾患でよく観察される変わりやすい発現度及び不完全な表現率を説明する（Ｗｈｙｔｅ、２００１）。

ヒト型のこの疾患に関する進歩は、動物モデルとしてのＴＮＡＬＰヌルマウス（Ａｋｐ２^−１−）の存在から大きな恩恵を受けている。これらのＡｋｐ２^−１−マウスは、正常にミネラル化された骨格を持って生まれると、乳児期ＨＰＰを著しくよく表現型模写するが、生後約６日でＸ線検査的に明らかなくる病を発症し、１２〜１６日の間で重症の骨格低ミネラル化及び無呼吸の発症及びＰＬＰ（ビタミンＢ_６）代謝の障害に起因し得るてんかん性発作を患って死ぬ（Ｗａｙｍｉｒｅら、１９９５；Ｎａｒｉｓａｗａら、１９９７；Ｆｅｄｄｅら、１９９９；Ｎａｒｉｓａｗａら、２００１）。

一部のＴＮＡＬＰ活性部位突然変異は、ＰＰｉ又はＰＬＰを別々に代謝する酵素の能力に影響を与えることが明らかにされている（Ｄｉ Ｍａｕｒｏら、２００２）。ＰＬＰとＰＰｉの両方がＴＮＡＬＰの確証済みの天然基質であり、ＰＬＰ代謝における異常は、Ａｋｐ２^−１−マウスで観察されるてんかん性発作を説明し（Ｗａｙｍｉｒｅら、１９９５；Ｎａｒｉｓａｗａら、２００１）、ＰＰｉ代謝における異常は、低ホスファターゼ血症のこのマウスモデルにおける骨格表現型を説明する（Ｈｅｓｓｌｅら、２００２；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００４；Ｈａｒｍｅｙら、２００４；Ｈａｒｍｅｙら、２００６；Ａｎｄｅｒｓｏｎら、２００５ａ）。

ＨＨＰには確立した薬物療法は存在しない。骨パジェット病患者由来のＴＮＡＬＰ豊富血漿及び精製胎盤ＡＬＰの静脈内（ｉ．ｖ．）注入を使った酵素補充療法（ＥＲＴ）の事例報告では、患児を救うことはできなかったことが記載されている（Ｗｈｙｔｅら、１９８２；Ｗｈｙｔｅら、１９８４）。別の類似の研究では、Ｗｅｎｉｎｇｅｒら（Ｗｅｎｉｎｇｅｒら、１９８９）は、精製ヒト肝臓ＴＮＡＬＰの注入により、低ホスファターゼ血症が重症の早熟男児にＥＲＴを試みた。治療（１．２ＩＵ／ｋｇ／ｍｉｎ）は生後３週間で開始され、生後１０週まで週１回の間隔で繰り返されたが、その時期に子供は死亡した。ＴＮＡＬＰの試料は１０ｍｌの生理食塩水で希釈され、臍帯動脈カテーテルを介して３０分かけて注入された。毒性又はアレルギー性の副作用は観察されなかった。血清ＴＮＡＬＰ活性は、３７と６２時間の間の半減期で、治療前の３ＩＵ／Ｌから最大レベルの１９５ＩＵ／Ｌまで増加した。しかし、経時的放射線学的検査では、骨ミネラル化の改善はまったく示されなかった（Ｗｅｎｉｎｇｅｒら、１９８９）。

ＡＬＰ活性は、血行路ではなく、骨格それ自体で増加させなければならないと思われる。この仮説は、乳児期ＨＰＰに罹った２人の女子が、ＴＮＡＬＰ含有細胞を骨格全体に導入する骨髄細胞移植の後、一見有利な応答を示したことによって支持されている（Ｗｈｙｔｅら、２００３）。したがって、これらの患者の骨格に活性ＴＮＡＬＰを供給する必要性があるように思われる。最近の報告では、ポリアスパラギン酸配列は組換えＴＮＡＬＰに骨ホーミング特性を与えることが示されている（Ｃｒｉｎｅらの国際公開第２００５／１０３２６３号；Ｎｉｓｈｉｏｋａら、２００６）。

最近の報告では、突然変異型のＴＮＡＬＰ Ｒ４５０Ｃ（ＮａｓｕらはＲ４３３Ｃ突然変異体に言及しているが、彼のナンバリングは成熟タンパク質に適用し、シグナルペプチドを含むタンパク質には適用しない）は、アルカリホスファターゼ活性を強く阻害する各サブユニットの４５０位のシステイン残基間のジスルフィド架橋により結合された二量体構造を有するタンパク質を産生することが明らかにされた。Ｎａｓｕらは、機能の喪失は鎖間のジスルフィド架橋から生じ、Ｒ４５０Ｃに関連する致死的低ホスファターゼ血症の分子的機序であると結論づけた（Ｎａｓｕら、２００６）。

本説明はいくつかの文献に言及しており、その文献の内容は参照によりその全体が本明細書に組み込まれているものとする。

ＨＰＰに罹った患者の臨床管理及び治療の現在の限界を考慮すると、代わりの効率的治療が必要とされた。したがって、本発明は、ＨＰＰの治療のための効率的酵素補充療法を提供する。

本出願人の知る限り、及びＴＮＡＬＰ又は他のＡＬＰイソ酵素が静脈内に送達されたＴＮＡＬＰヌルマウス又はＨＰＰ乳児のいずれかにおける以前の酵素補充療法の試みとは対照的に、本発明は、臨床Ｘ線検査上の及び生化学的変化のほぼ完全な回復が酵素補充のみで生じることが実証された最初の機会を印す。

骨標的ｓＡＬＰ
本発明の骨標的組成物は、アミノ側からカルボキシル側へ順に、ｓＡＬＰ、スペーサー、及び骨標的負に帯電したペプチドを含む融合タンパク質を含む。

ＡＬＰ
ＡＬＰの４種類の既知イソ酵素があり、即ち、下で更に説明される組織非特異的アルカリホスファターゼ、胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬＰ）（例えば、［ＮＰ₋１１２６０３］、［ＮＰ₋００１６２３］）、生殖細胞アルカリホスファターゼ（ＧＣＡＬＰ）（例えば、［Ｐ１０６９６］）及び腸アルカリホスファターゼ（例えば、［ＮＰ₋００１６２２］）である。これらの酵素は、きわめて類似の三次元構造を有する。その触媒部位のそれぞれには、２つのＺｎと１つのＭｇを含む酵素活性に必要な金属イオンのための４つの金属結合ドメインを含有する。これらの酵素は、リン酸のモノエステルの加水分解を触媒し、高濃度のリン酸受容体の存在下でリン酸転移反応も触媒する。ＰＡＬＰは、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピロドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）に向かって生理学的に活性であり、３つ全てがＴＮＡＬＰに対する既知の天然基質であることが特に明らかにされている（Ｗｈｙｔｅ、１９９５）。これらのイソ酵素間のアラインメントは図３０に示されている。

ＴＮＡＬＰ
前述の通り、ＴＮＡＬＰは、糖脂質を通じてそのＣ末端に固定された膜結合型タンパク質である（Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ、Ｐ０５１８６）。この糖脂質アンカー（ＧＰＩ）は、一時的膜アンカーとしても前記ＧＰＩの付加のためのシグナルとしても働く疎水性Ｃ末端の除去後、翻訳後的に付加される。したがって、下の全ての実施例で使用される可溶性ヒトＴＮＡＬＰは、疎水性Ｃ末端配列の最初のアミノ酸、即ちアラニンが終止コドンにより置き換えられているＴＮＡＬＰを含む。そのようにして形成された可溶性ＴＮＡＬＰ（本明細書ではｓＴＮＡＬＰと呼ばれる）は、触媒部位の形成に必要な天然固定化型のＴＮＡＬＰの全アミノ酸を含有しているが、ＧＰＩ膜アンカーを欠いている。既知のＴＮＡＬＰには、ヒトＴＮＡＬＰ［ＮＰ₋０００４６９、ＡＡＩ１０９１０、ＡＡＨ９０８６１、ＡＡＨ６６１１６、ＡＡＨ２１２８９、ＡＡＩ２６１６６］；アカゲザルＴＮＡＬＰ［ＸＰ−００１１０９７１７］；ラットＴＮＡＬＰ［ＮＰ₋０３７１９１］；イヌＴＮＡＬＰ［ＡＡＦ６４５１６］；ブタＴＮＡＬＰ［ＡＡＮ６４２７３］、マウス［ＮＰ₋０３１４５７］、ウシ［ＮＰ₋７８９８２８、ＡＡＩ１８２０９、ＡＡＣ３３８５８］、及びネコ［ＮＰ₋００１０３６０２８］が挙げられる。

本発明の骨標的組成物は、ヒトＡＬＰイソ酵素の及び既知の機能的ＴＮＡＬＰ（ヒト、マウス、ラット、ウシ、ネコ及びイヌ）のＡＬＰ細胞外ドメインから導かれるコンセンサス配列を満たす配列を包含する。本明細書で使用するように、用語「細胞外ドメイン」とは、天然タンパク質のどんな機能的細胞外部分（即ち、ペプチドシグナルがない）にも言及することを意図されている。最初のアミノ酸１〜５０１（分泌されると１８〜５０１）（Ｏｄａら、Ｊ．Ｂｉｏｃｈｅｍ １２６：６９４〜６９９、１９９９）、アミノ酸１〜５０４（分泌されると１８〜５０４）（Ｂｅｒｎｄらの米国特許第６，９０５，６８９号）及びアミノ酸１〜５０５（分泌されると１８〜５０５）（Ｔｏｍａｔｓｕらの米国特許出願公開第２００７／００８１９８４号）を保持する組換えｓＴＮＡＬＰは酵素的に活性であることが明らかにされている。本明細書に示される実施例は、最初のＴＮＡＬＰのアミノ酸１〜５０２（分泌されると１８〜５０２）（図３）を保持する組換えｓＴＮＡＬＰも酵素的に活性であることを明らかにしている。これは、アミノ酸残基は、その酵素活性に影響を与えずに天然タンパク質のＣ末端から取り除くことができることを示している。

下の表１は、ＨＰＰを引き起こすことが知られている１９４突然変異体の一覧を示す。本発明の骨標的ポリペプチドの特定の実施形態では、ＡＬＰ配列はこれらの突然変異体のどれも含まない。

したがって、本発明のｓＡＬＰでは、種々のＴＮＡＬＰの及びヒトＡＬＰイソ酵素のアラインメントから導かれるコンセンサス配列のナンバリングを使用して、２２位のアミノ酸はフェニルアラニン残基ではなく；３３位（シグナルペプチドのない配列では１１位）のアミノ酸はシステイン残基ではなく；３８位（シグナルペプチドのない配列では１６位）のアミノ酸はバリン残基ではなく；４２位（シグナルペプチドのない配列では２０位）のアミノ酸はプロリン残基ではなく；４５位（シグナルペプチドのない配列では２３位）のアミノ酸はバリン残基ではなく；５６位（シグナルペプチドのない配列では３４位）のアミノ酸残基はセリン又はバリン残基ではなく；６７位（シグナルペプチドのない配列では４５位）のアミノ酸残基はロイシン、イソロイシン又はバリン残基ではなく；６８位（シグナルペプチドのない配列では４６位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；７３位（シグナルペプチドのない配列では５１位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；７６位（シグナルペプチドのない配列では５４位）のアミノ酸残基はシステイン、セリン、プロリン又はヒスチジン残基ではなく；７７位（シグナルペプチドのない配列では５５位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；８０位（シグナルペプチドのない配列では５８位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；８１位（シグナルペプチドのない配列では５９位）のアミノ酸残基はアスパラギン残基ではなく；１０５位（シグナルペプチドのない配列では８３位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；１１３位（シグナルペプチドのない配列では８９位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；１１６位（シグナルペプチドのない配列では９４位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；１１７位（シグナルペプチドのない配列では９５位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；１１９位（シグナルペプチドのない配列では９７位）のアミノ酸残基はグリシン残基ではなく；１２１位（シグナルペプチドのない配列では９９位）のアミノ酸残基はセリン又はスレオニン残基ではなく；１２５位（シグナルペプチドのない配列では１０３位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；１２８位（シグナルペプチドのない配列では１０６位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；１３３位（シグナルペプチドのない配列では１１１位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；１３４位（シグナルペプチドのない配列では１１２位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；１３７位（シグナルペプチドのない配列では１１５位）のアミノ酸残基はスレオニン又はバリン残基ではなく；１３９位（シグナルペプチドのない配列では１１７位）のアミノ酸残基はヒスチジン又はアスパラギン残基ではなく；１４１位（シグナルペプチドのない配列では１１９位）のアミノ酸残基はヒスチジン残基ではなく；１５３位（シグナルペプチドのない配列では１３１位）のアミノ酸残基はアラニン又はイソロイシン残基ではなく；１６７位（シグナルペプチドのない配列では１４５位）のアミノ酸残基はセリン又はバリン残基ではなく；１７２位（シグナルペプチドのない配列では１５０位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；１７５位（シグナルペプチドのない配列では１５３位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；１７６位（シグナルペプチドのない配列では１５４位）のアミノ酸残基はチロシン又はアルギニン残基ではなく；１８１位（シグナルペプチドのない配列では１５９位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；１８２位（シグナルペプチドのない配列では１６０位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；１８４位（シグナルペプチドのない配列では１６２位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；１８６位（シグナルペプチドのない配列では１６４位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；１８９位（シグナルペプチドのない配列では１６７位）のアミノ酸残基はトリプトファン残基ではなく；１９４位（シグナルペプチドのない配列では１７２位）のアミノ酸残基はグルタミン酸残基ではなく；１９６位（シグナルペプチドのない配列では１７４位）のアミノ酸残基はリシン又はグリシン残基ではなく；１９７位（シグナルペプチドのない配列では１７５位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；１９８位（シグナルペプチドのない配列では１７６位）のアミノ酸残基はアラニン残基ではなく；２０６位（シグナルペプチドのない配列では１８４位）のアミノ酸残基はチロシン残基ではなく；２０８位（シグナルペプチドのない配列では１８６位）のアミノ酸残基はグルタミン酸残基ではなく；２０７位（シグナルペプチドのない配列では１９０位）のアミノ酸残基はプロリン残基ではなく；２１６位（シグナルペプチドのない配列では１９４位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；２１７位（シグナルペプチドのない配列では１９５位）のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基ではなく；２２３位（シグナルペプチドのない配列では２０１位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；２２５位（シグナルペプチドのない配列では２０３位）のアミノ酸残基はバリン又はアラニン残基ではなく；２２６位（シグナルペプチドのない配列では２０４位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；２２８位（シグナルペプチドのない配列では２０６位）のアミノ酸残基はトリプトファン又はグルタミン残基ではなく；２２９位（シグナルペプチドのない配列では２０７位）のアミノ酸残基はグルタミン酸残基ではなく；２３１位（シグナルペプチドのない配列では２０９位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；２４０位（シグナルペプチドのない配列では２１８位）のアミノ酸残基はグリシン残基ではなく；２５１位（シグナルペプチドのない配列では２２９位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；２５４位（シグナルペプチドのない配列では２３２位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；２６９位（シグナルペプチドのない配列では２４７位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；２７７位（シグナルペプチドのない配列では２５５位）のアミノ酸残基はシステイン、ロイシン又はヒスチジン残基ではなく；２８０位（シグナルペプチドのない配列では２５８位）のアミノ酸残基はプロリン残基ではなく；２９５位（シグナルペプチドのない配列では２７３位）のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基ではなく；２９７位（シグナルペプチドのない配列では２７５位）のアミノ酸残基はリシン残基ではなく；２９８位（シグナルペプチドのない配列では２７６位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；３００位（シグナルペプチドのない配列では２７８位）のアミノ酸残基はチロシン又はアラニン残基ではなく；３０１位（シグナルペプチドのない配列では２７９位）のアミノ酸残基はバリン、スレオニン又はイソロイシン残基ではなく；３０３位（シグナルペプチドのない配列では２８１位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；３０４位（シグナルペプチドのない配列では２８２位）のアミノ酸残基はリシン残基ではなく；３０５位（シグナルペプチドのない配列では２８３位）のアミノ酸残基はプロリン残基ではなく；３１２位（シグナルペプチドのない配列では２９０位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；３１３位（シグナルペプチドのない配列では２９１位）のアミノ酸残基はセリン又はロイシン残基ではなく；３１７位（シグナルペプチドのない配列では２９５位）のアミノ酸残基はリシン残基ではなく；３３２位（シグナルペプチドのない配列では３１０位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；３３３位（シグナルペプチドのない配列では３１１位）のアミノ酸残基はシステイン、グリシン又はロイシン残基ではなく；３３４位（シグナルペプチドのない配列では３１２位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；３４０位（シグナルペプチドのない配列では３１８位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；３４５位（シグナルペプチドのない配列では３２３位）のアミノ酸残基はアルギニン又はグルタミン酸残基ではなく；３５４位（シグナルペプチドのない配列では３３２位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；３６０位（シグナルペプチドのない配列では３３８位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；３６１位（シグナルペプチドのない配列では３３９位）のアミノ酸残基はスレオニン又はイソロイシン残基ではなく；３７７位（シグナルペプチドのない配列では３５５位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；３８０位（シグナルペプチドのない配列では３５８位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；３８３位（シグナルペプチドのない配列では３６１位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；３８４位（シグナルペプチドのない配列では３６２位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；３８７位（シグナルペプチドのない配列では３６５位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；３８８位（シグナルペプチドのない配列では３６６位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；３９５位（シグナルペプチドのない配列では３７３位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；３９７位（シグナルペプチドのない配列では３７５位）のアミノ酸残基はシステイン又はヒスチジン残基ではなく；３９８位（シグナルペプチドのない配列では３７６位）のアミノ酸残基はアラニン残基ではなく；４０１位（シグナルペプチドのない配列では３７９位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；４０５位（シグナルペプチドのない配列では３８３位）のアミノ酸残基はセリン又はバリン残基ではなく；４０６位（シグナルペプチドのない配列では３８４位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；４１２位（シグナルペプチドのない配列では３９０位）のアミノ酸残基はグリシン残基ではなく；４１６位（シグナルペプチドのない配列では３９４位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；４１７位（シグナルペプチドのない配列では３９５位）のアミノ酸残基はアラニン残基ではなく；４２０位（シグナルペプチドのない配列では３９８位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；４２３位（シグナルペプチドのない配列では４０１位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；４２６位（シグナルペプチドのない配列では４０４位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；４２９位（シグナルペプチドのない配列では４０７位）のアミノ酸残基はアラニン残基ではなく；４３０位（シグナルペプチドのない配列では４０８位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；４３２位（シグナルペプチドのない配列では４１０位）のアミノ酸残基はシステイン又はアスパラギン酸残基ではなく；４３４位（シグナルペプチドのない配列では４１２位）のアミノ酸残基はプロリン残基ではなく；４３５位（シグナルペプチドのない配列では４１３位）のアミノ酸残基はリシン残基ではなく；４４２位（シグナルペプチドのない配列では４２０位）のアミノ酸残基はヒスチジン残基ではなく；４５１位（シグナルペプチドのない配列では４２９位）のアミノ酸残基はプロリン残基ではなく；４５６位（シグナルペプチドのない配列では４３４位）のアミノ酸残基はヒスチジン又はシステイン残基ではなく；４５８位（シグナルペプチドのない配列では４３６位）のアミノ酸残基はリシン残基ではなく；４６０位（シグナルペプチドのない配列では４３８位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；４６１位（シグナルペプチドのない配列では４３９位）のアミノ酸残基はセリン又はアスパラギン酸残基ではなく；４６２位（シグナルペプチドのない配列では４４０位）のアミノ酸残基はトリプトファン又はアルギニン残基ではなく；４６５位（シグナルペプチドのない配列では４４３位）のアミノ酸残基はメチオニン又はロイシン残基ではなく；４７２位（シグナルペプチドのない配列では４５０位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；４７３位（シグナルペプチドのない配列では４５１位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；４７４位（シグ
ナルペプチドのない配列では４５２位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；４７９位（シグナルペプチドのない配列では４５７位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；４８２位（シグナルペプチドのない配列では４６０位）のアミノ酸残基はリシン又はグリシン残基ではなく；４８４位（シグナルペプチドのない配列では４６２位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；４９５位（シグナルペプチドのない配列では４７３位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；４９６位（シグナルペプチドのない配列では４７４位）のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基ではなく；及び４９７位（シグナルペプチドのない配列では４７５位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではない。

その上更に具体的には、ｓＴＮＡＬＰを本発明の骨標的ｓＡＬＰにおいて使用する場合、ヒトＴＮＡＬＰ配列のナンバリングを使用して、１７位のアミノ酸はフェニルアラニン残基ではなく；２８位（シグナルペプチドのない配列では１１位）のアミノ酸はシステイン残基ではなく；３３位（シグナルペプチドのない配列では１６位）のアミノ酸はバリン残基ではなく；３７位（シグナルペプチドのない配列では２０位）のアミノ酸はプロリン残基ではなく；４０位（シグナルペプチドのない配列では２３位）のアミノ酸はバリン残基ではなく；５１位（シグナルペプチドのない配列では３４位）のアミノ酸残基はセリン又はバリン残基ではなく；６２位（シグナルペプチドのない配列では４５位）のアミノ酸残基はロイシン、イソロイシン又はバリン残基ではなく；６３位（シグナルペプチドのない配列では４６位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；６８位（シグナルペプチドのない配列では５１位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；７１位（シグナルペプチドのない配列では５４位）のアミノ酸残基はシステイン、セリン、プロリン又はヒスチジン残基ではなく；７２位（シグナルペプチドのない配列では５５位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；７５位（シグナルペプチドのない配列では５８位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；７６位（シグナルペプチドのない配列では５９位）のアミノ酸残基はアスパラギン残基ではなく；１００位（シグナルペプチドのない配列では８３位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；１０８位（シグナルペプチドのない配列では８９位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；１１１位（シグナルペプチドのない配列では９４位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；１１２位（シグナルペプチドのない配列では９５位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；１１４位（シグナルペプチドのない配列では９７位）のアミノ酸残基はグリシン残基ではなく；１１６位（シグナルペプチドのない配列では９９位）のアミノ酸残基はセリン又はスレオニン残基ではなく；１２０位（シグナルペプチドのない配列では１０３位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；１２３位（シグナルペプチドのない配列では１０６位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；１２８位（シグナルペプチドのない配列では１１１位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；１２９位（シグナルペプチドのない配列では１１２位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；１３２位（シグナルペプチドのない配列では１１５位）のアミノ酸残基はスレオニン又はバリン残基ではなく；１３４位（シグナルペプチドのない配列では１１７位）のアミノ酸残基はヒスチジン又はアスパラギン残基ではなく；１３６位（シグナルペプチドのない配列では１１９位）のアミノ酸残基はヒスチジン残基ではなく；１４８位（シグナルペプチドのない配列では１３１位）のアミノ酸残基はアラニン又はイソロイシン残基ではなく；１６２位（シグナルペプチドのない配列では１４５位）のアミノ酸残基はセリン又はバリン残基ではなく；１６７位（シグナルペプチドのない配列では１５０位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；１７０位（シグナルペプチドのない配列では１５３位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；１７１位（シグナルペプチドのない配列では１５４位）のアミノ酸残基はチロシン又はアルギニン残基ではなく；１７６位（シグナルペプチドのない配列では１５９位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；１７７位（シグナルペプチドのない配列では１６０位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；１７９位（シグナルペプチドのない配列では１６２位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；１８１位（シグナルペプチドのない配列では１６４位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；１８４位（シグナルペプチドのない配列では１６７位）のアミノ酸残基はトリプトファン残基ではなく；１８９位（シグナルペプチドのない配列では１７２位）のアミノ酸残基はグルタミン酸残基ではなく；１９１位（シグナルペプチドのない配列では１７４位）のアミノ酸残基はリシン又はグリシン残基ではなく；１９２位（シグナルペプチドのない配列では１７５位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；１９３位（シグナルペプチドのない配列では１７６位）のアミノ酸残基はアラニン残基ではなく；２０１位（シグナルペプチドのない配列では１８４位）のアミノ酸残基はチロシン残基ではなく；２０３位（シグナルペプチドのない配列では１８６位）のアミノ酸残基はグルタミン酸残基ではなく；２０７位（シグナルペプチドのない配列では１９０位）のアミノ酸残基はプロリン残基ではなく；２１１位（シグナルペプチドのない配列では１９４位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；２１２位（シグナルペプチドのない配列では１９５位）のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基ではなく；２１８位（シグナルペプチドのない配列では２０１位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；２２０位（シグナルペプチドのない配列では２０３位）のアミノ酸残基はバリン又はアラニン残基ではなく；２２１位（シグナルペプチドのない配列では２０４位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；２２３位（シグナルペプチドのない配列では２０６位）のアミノ酸残基はトリプトファン又はグルタミン残基ではなく；２２４位（シグナルペプチドのない配列では２０７位）のアミノ酸残基はグルタミン酸残基ではなく；２２６位（シグナルペプチドのない配列では２０９位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；２３５位（シグナルペプチドのない配列では２１８位）のアミノ酸残基はグリシン残基ではなく；２４６位（シグナルペプチドのない配列では２２９位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；２４９位（シグナルペプチドのない配列では２３２位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；２６４位（シグナルペプチドのない配列では２４７位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；２７２位（シグナルペプチドのない配列では２５５位）のアミノ酸残基はシステイン、ロイシン又はヒスチジン残基ではなく；２７５位（シグナルペプチドのない配列では２５８位）のアミノ酸残基はプロリン残基ではなく；２８９位（シグナルペプチドのない配列では２７２位）のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基ではなく；２９１位（シグナルペプチドのない配列では２７４位）のアミノ酸残基はリシン残基ではなく；２９２位（シグナルペプチドのない配列では２７５位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；２９４位（シグナルペプチドのない配列では２７７位）のアミノ酸残基はチロシン又はアラニン残基ではなく；２９５位（シグナルペプチドのない配列では２７８位）のアミノ酸残基はバリン、スレオニン又はイソロイシン残基ではなく；２９７位（シグナルペプチドのない配列では２８０位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；２９８位（シグナルペプチドのない配列では２８１位）のアミノ酸残基はリシン残基ではなく；２９９位（シグナルペプチドのない配列では２８２位）のアミノ酸残基はプロリン残基ではなく；３０６位（シグナルペプチドのない配列では２８９位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；３０７位（シグナルペプチドのない配列では２９０位）のアミノ酸残基はセリン又はロイシン残基ではなく；３１１位（シグナルペプチドのない配列では２９４位）のアミノ酸残基はリシン残基ではなく；３２６位（シグナルペプチドのない配列では３０９位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；３２７位（シグナルペプチドのない配列では３１０位）のアミノ酸残基はシステイン、グリシン又はロイシン残基ではなく；３２８位（シグナルペプチドのない配列では３１１位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；３３４位（シグナルペプチドのない配列では３１７位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；３３９位（シグナルペプチドのない配列では３２２位）のアミノ酸残基はアルギニン又はグルタミン酸残基ではなく；３４８位（シグナルペプチドのない配列では３３１位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；３５４位（シグナルペプチドのない配列では３３７位）のアミノ酸残基はアスパラギン酸残基ではなく；３５５位（シグナルペプチドのない配列では３３８位）のアミノ酸残基はスレオニン又はイソロイシン残基ではなく；３７１位（シグナルペプチドのない配列では３５４位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；３７４位（シグナルペプチドのない配列では３５７位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；３７７位（シグナルペプチドのない配列では３６０位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；３７８位（シグナルペプチドのない配列では３６１位）のアミノ酸残基はバリン残基ではなく；３８１位（シグナルペプチドのない配列では３６４位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；３８２位（シグナルペプチドのない配列では３６５位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；３８９位（シグナルペプチドのない配列では３７２位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；３９１位（シグナルペプチドのない配列では３７４位）のアミノ酸残基はシステイン又はヒスチジン残基ではなく；３９２位（シグナルペプチドのない配列では３７５位）のアミノ酸残基はアラニン残基ではなく；３９５位（シグナルペプチドのない配列では３７８位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；３９９位（シグナルペプチドのない配列では３８２位）のアミノ酸残基はセリン又はバリン残基ではなく；４００位（シグナルペプチドのない配列では３８３位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；４０６位（シグナルペプチドのない配列では３８９位）のアミノ酸残基はグリシン残基ではなく；４１０位（シグナルペプチドのない配列では３９３位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；４１１位（シグナルペプチドのない配列では３９４位）のアミノ酸残基はアラニン残基ではなく；４１４位（シグナルペプチドのない配列では３９７位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；４１７位（シグナルペプチドのない配列では４００位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；４２０位（シグナルペプチドのない配列では４０３位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；４２３位（シグナルペプチドのない配列では４０６位）のアミノ酸残基はアラニン残基ではなく；４２４位（シグナルペプチドのない配列では４０７位）のアミノ酸残基はメチオニン残基ではなく；４２６位（シグナルペプチドのない配列では４０９位）のアミノ酸残基はシステイン又はアスパラギン酸残基ではなく；４２８位（シグナルペプチドのない配列では４１１位）のアミノ酸残基はプロリン残基ではなく；４２９位（シグナルペプチドのない配列では４１２位）のアミノ酸残基はリシン残基ではなく；４３６位（シグナルペプチドのない配列では４１９位）のアミノ酸残基はヒスチジン残基ではなく；４４５位（シグナルペプチドのない配列では４２８位）のアミノ酸残基はプロリン残基ではなく；４５０位（シグナルペプチドのない配列では４３３位）のアミノ酸残基はヒスチジン又はシステイン残基ではなく；４５２位（シグナルペプチドのない配列では４３５位）のアミノ酸残基はリシン残基ではなく；４５４位（シグナルペプチドのない配列では４３７位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではなく；４５５位（シグナルペプチドのない配列では４３８位）のアミノ酸残基はセリン又はアスパラギン酸残基ではなく；４５６位（シグナルペプチドのない配列では４３９位）のアミノ酸残基はトリプトファン又はアルギニン残基ではなく；４５９位（シグナルペプチドのない配列では４４２位）のアミノ酸残基はメチオニン又はロイシン残基ではなく；４６６位（シグナルペプチドのない配列では４４９位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；４６７位（シグナルペプチドのない配列では４５０位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；４６８位（シグナルペプチドのない配列では４５１位）のアミノ酸残基はスレオニン残基ではなく；４７３位（シグナルペプチ
ドのない配列では４５６位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；４７６位（シグナルペプチドのない配列では４５９位）のアミノ酸残基はリシン又はグリシン残基ではなく；４７８位（シグナルペプチドのない配列では４６１位）のアミノ酸残基はロイシン残基ではなく；４８９位（シグナルペプチドのない配列では４７２位）のアミノ酸残基はセリン残基ではなく；４９０位（シグナルペプチドのない配列では４７３位）のアミノ酸残基はフェニルアラニン残基ではなく；及び４９１位（シグナルペプチドのない配列では４７４位）のアミノ酸残基はアルギニン残基ではない。他の特定の実施形態では、１つ又は複数のＸは、アラインメントの配列中のその位置に見出されるアミノ酸のいずれか、又はこれらのアミノ酸のいずれかの保存若しくは半保存された置換を構成する残基であると定義される。他の特定の実施形態では、Ｘはアラインメントの配列中のその位置に見出されるアミノ酸のいずれかであると定義される。例えば、５１位（シグナルペプチドのない配列では３４位）のアミノ酸残基はアラニン又はバリン残基であり；１７７位（シグナルペプチドのない配列では１６０位）のアミノ酸残基はアラニン又はセリン残基であり；２１２位（シグナルペプチドのない配列では１９５位）のアミノ酸残基はイソロイシン又はバリン残基であり；２９１位（シグナルペプチドのない配列では２７４位）のアミノ酸残基はグルタミン酸又はアスパラギン酸残基であり；及び３７４位（シグナルペプチドのない配列では３５７位）のアミノ酸残基はバリン又はイソロイシン残基である。

特定の実施形態では、本発明の骨標的融合タンパク質中のｓＡＬＰフラグメントは、ヒトＡＬＰイソ酵素と、ヒトＴＮＡＬＰのアミノ酸残基１８〜４９８、１８〜４９９、１８〜５００、１８〜５０１、１８〜５０２、１８〜５０３、１８〜５０４又は１８〜５０５に対応する種々の哺乳動物種由来のＴＮＡＬＰのアラインメントから導かれるコンセンサス配列のフラグメントのうちのいずれか１つからなる。これらのコンセンサスフラグメントは、それぞれ配列番号１５のアミノ酸残基２３〜５０８、２３〜５０９、２３〜５１０、２３〜５１１、２３〜５１２、２３〜５１３、２３〜５１４及び２３〜５１５である。これらのコンセンサスフラグメントでは、Ｘは、表１に報告されているヒトＴＮＡＬＰのその位置での病的突然変異に対応するアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。他の特定の実施形態では、これらのコンセンサスフラグメントは、それぞれ配列番号１８のアミノ酸残基２３〜５０８、２３〜５０９、２３〜５１０、２３〜５１１、２３〜５１２、２３〜５１３、２３〜５１４及び２３〜５１５である。これらのコンセンサスフラグメントでは、Ｘは、前記コンセンサスが導かれるアラインメントの前記種のいずれか１つのＡＬＰ及びヒトＡＬＰイソ酵素の中のその位置に見出される任意のアミノ酸であるが、表１に報告されているヒトＴＮＡＬＰのその位置での病的突然変異に対応するアミノ酸ではない（図３０参照）。

他の特定の実施形態では、本発明の骨標的融合タンパク質中のｓＡＬＰフラグメントは、ヒトＴＮＡＬＰのアミノ酸残基１８〜４９８、１８〜４９９、１８〜５００、１８〜５０１、１８〜５０２、１８〜５０３、１８〜５０４及び１８〜５０５に対応する種々の哺乳動物種由来のＴＮＡＬＰのアラインメントから導かれるコンセンサス配列のフラグメントのうちのいずれかからなる。これらのコンセンサスフラグメントは、それぞれ配列番号１６のアミノ酸残基１８〜４９８、１８〜４９９、１８〜５００、１８〜５０１、１８〜５０２、１８〜５０３、１８〜５０４及び１８〜５０５である。これらのコンセンサスフラグメントでは、Ｘは、表１に報告されているヒトＴＮＡＬＰのその位置での病的突然変異に対応するアミノ酸を除く任意のアミノ酸である。他の特定の実施形態では、これらのコンセンサスフラグメントは、それぞれ配列番号１９のアミノ酸残基１８〜４９８、１８〜４９９、１８〜５００、１８〜５０１、１８〜５０２、１８〜５０３、１８〜５０４及び１８〜５０５である。これらのコンセンサスフラグメントでは、Ｘは、前記コンセンサスが導かれるアラインメントの種のいずれか１つのＴＮＡＬＰ中のその位置に見出される任意のアミノ酸であるが、表１に報告されているヒトＴＮＡＬＰのその位置での病的突然変異に対応するアミノ酸ではない（図３１参照）。

表１：ヒトＴＮＡＬＰにおける病的突然変異体

スペーサー
この理論に限定されることなく、下の実施例に示される骨標的ｓＡＬＰ融合タンパク質中で使用されるＦｃフラグメントは、ｓＴＮＡＬＰ−Ｆｃ−Ｄ１０の発現がｓＴＮＡＬＰ−Ｄ１０の発現より高度であった（下の実施例２参照）ので、前記タンパク質をより効率よく折り畳ませるスペーサーとして働くと考えられる。１つの可能な説明は、Ｆｃフラグメントの導入により、試験されたｓＡＬＰ配列のＣ末端に付加された高度に負に帯電したＤ１０配列の存在により引き起こされる反発力が軽減されるというものである。

本発明に有用なスペーサーには、Ｆｃを含むポリペプチド、及びｓＡＬＰ配列のＣ末端に付加された高度に負に帯電したＤ１０配列の存在により引き起こされる反発力を軽減することができる親水性で可動性のポリペプチドが挙げられる。特定の実施形態では、前記スペーサーは、２つのｓＡＬＰ単量体由来の２つのｓＡＬＰドメインが互いに相互作用をして最小の触媒的に活性な実体を構成するのを妨げる立体障害を軽減する。

フラグメント結晶化可能領域（Ｆｃ）フラグメント
本発明に有用なＦｃフラグメントには、ヒンジ並びにＣＨ２及びＣＨ３ドメインを含むＩｇＧのＦＣフラグメントが挙げられる。例えば、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４を使うことができる。

負に帯電したペプチド
本発明による負に帯電したペプチドは、Ｄ１０〜Ｄ１６又はＥ１０〜Ｅ１６からなる群から選択されるポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸でもよい。

特定の実施形態では、本発明の骨標的ｓＡＬＰ融合タンパク質は、二量体又は四量体を形成するように会合される。

この特定の理論に限定されることなく、Ｆｃをスペーサーとして含むポリペプチドを使用する本発明の特定の実施形態では、二量体は、２つのＦｃフラグメントのヒンジ領域に位置する２つのジスルフィド結合を通じて共有結合している２つの骨標的ｓＡＬＰ単量体で構成されていると推定される。この二量体立体配置では、鎖間ジスルフィド結合の形成により課せられる立体障害は、会合して正常細胞に存在する二量体の最小触媒的に活性な実体になるｓＡＬＰドメインの会合を妨げていると推定される。

この特定の理論に限定されることなく、その四量体構造においては、融合タンパク質の会合は、１つの二量体からの１つのｓＡＬＰドメインと別の二量体からの別の１つのｓＡＬＰドメインを含むと考えられている。同一Ｆｃ結合二量体からの２つのｓＡＬＰドメインが互いに相互作用をして最小の触媒的に活性な実体を構成するのをおそらく妨げている構造障害は、本明細書に示す実施例中に記載されるＦｃよりも長いスペーサーを、ｓＡＬＰフラグメントとポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸フラグメントの間に挿入することにより最終的に除去することができるのであろう。

骨標的ｓＡＬＰは、１）ポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸から下流に；及び／又は２）ポリアスパラギン酸とＦｃフラグメントの間に；及び／又は３）ＦｃフラグメントなどのスペーサーとｓＡＬＰフラグメントの間に、更に任意選択で１つ又は複数の追加のアミノ酸を含んでいてよい。これは、例えば、骨標的コンジュゲートを作製するために使われるクローニング戦略が外来性アミノ酸をこれらの位置に導入する場合である。しかし、外来性アミノ酸は、追加のＧＰＩアンカー付加シグナルを与えないように選択すべきである。宿主細胞のトランスアミダーゼにより切断されている設計配列の可能性は、Ｉｋｅｚａｗａにより記載されている通りに予測することができる（Ｉｋｅｚａｗａ、２００２）。

本発明は、本明細書に明示的に述べられているものを含むグリコリゼーション、アセチル化、アミド化、ブロッケージ、ホルミル化、γカルボキシグルタミン酸ヒドロキシル化、メチル化、リン酸化、ピロリドンカルボン酸、及び硫酸化によるなどの翻訳後修飾された融合タンパク質も包含している。

用語「組換えタンパク質」は、原核又は真核宿主細胞に挿入された遺伝子操作された核酸によりコードされているタンパク質に言及するために本明細書では使用されている。核酸は、通常、宿主細胞に適したプラスミド又はウイルスなどのベクター内に置かれている。チャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞は、本明細書に示される実施例において本発明のコンジュゲートを発現するための宿主として使用されてきたが、当業者であれば、当技術分野では常用である方法に従って組換えタンパク質を産生するのに他のいくつかの宿主を使用してもよいことは理解されるであろう。代表的な方法は、Ｍａｎｉａｔｉｓら、Ｃｏｌｄ Ｓｐｒｉｎｇ Ｈａｒｂｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ（１９８９）に開示されている。本明細書で使用される「切断可能な組換えタンパク質」は、分泌された／可溶性のタンパク質を産生するように宿主酵素により切断してもよい組換えタンパク質に言及することを意図している。そのように限定されることなく、ＨＥＫ２９３細胞、ＰｅｒＣ６、ベビーハムスター腎臓細胞も使用することができる。

本明細書で使用するように、用語「ポリペプチドの発現をもたらすのに適した条件」とは、本発明の融合タンパク質の産生を可能にするいかなる培地にも言及することを意図されている。そのように限定されることなく、この培地には、緩衝液、炭酸水素及び／又はＨＥＰＥＳ、塩素、リン酸、カルシウム、ナトリウム、カリウム、マグネシウム、鉄のようなイオン、単糖類のような炭素源、アミノ酸、潜在的な脂質、ヌクレオチド、ビタミン並びにインスリンのような増殖因子で調製した培地；２〜４ｍＭのＬ−グルタミンと５％ウシ胎仔血清を補充したαＭＥＭ、ＤＭＥＭ、Ｈａｍ’ｓ−Ｆ１２及びＩＭＤＭのような通常の市販の培地；２〜４ｍＭのＬ−グルタミンを補充したＨｙｃｌｏｎｅ（商標）、ＳＦＭ４ＣＨＯ、Ｓｉｇｍａ ＣＨＯ ＤＨＦＲ−、Ｃａｍｂｒｅｘ ＰＯＷＥＲ（商標）ＣＨＯ ＣＤのような通常の市販の動物タンパク質無添加培地が挙げられる。これらの培地は、安定なタンパク質産物発現を可能にする選択圧を維持するために、チミジン、ヒポキサンチン及びＬ−グリシンなしで調製されるのが望ましい。

そのように限定されることなく、本発明の融合物を発現するのに有用な宿主細胞には、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞が挙げられる。本発明の融合タンパク質を発現するための対象の特定のＣＨＯ細胞には、ＣＨＯ−ＤＧ４４及びＣＨＯｄｕｋ⁻とも呼ばれるＣＨＯ／ｄｈｆｒ⁻が挙げられる。この後者の細胞系はアメリカ培養細胞系統保存機関（ＡＴＣＣ番号ＣＲＬ−９０９６）を通じて入手可能である。

用語「骨組織」は、大部分がコラーゲンを含有する有機基質で構成された骨芽細胞により合成され、ヒドロキシアパタイト結晶の沈着によりミネラル化された組織に言及するために本明細書では使用されている。

本発明の骨送達コンジュゲートに含まれる融合タンパク質は、有効量の融合タンパク質を骨に与えることにより骨欠損状態の治療療法に有用である。融合タンパク質は、任意の標準的薬学的に許容可能な担体中の医薬組成物の形で提供され、任意の標準的手法により、例えば、静脈注射により投与される。

本明細書で使用するように、用語「ＨＰＰ表現型」は、くる病（成長軟骨板の欠損）、骨軟化症、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、若しくはピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）の上昇した血液及び／又は尿レベル、発作、骨痛、軟骨石灰化症をもたらす関節中のピロリン酸カルシウム二水和物結晶沈着（ＣＰＰＤ）並びに早死のうちのいずれか１つに言及するように意図されている。そのように限定されることなく、ＨＰＰ表現型は、（大腿骨、脛骨、上腕骨、橈骨、尺骨などの）長骨長の減少、全骨の平均密度の減少及び大腿骨、脛骨、肋骨と中足骨、及び指骨などの骨の骨ミネラル化の減少、歯ミネラル化の減少、乳歯の早期喪失（例えば、歯セメント質の形成不全、発育不全又は形成異常）を伴う発育遅延により実証することができる。そのように限定されることなく、骨ミネラル化欠損の改善又は予防は、長骨長の増加、骨及び／又は歯におけるミネラル化の増加、脚の湾曲の改善、骨痛の減少並びに関節中のＣＰＰＤ結晶沈着症の減少のうちの１つ又は複数により観察してよい。

本明細書で使用するように、語句「低ホスファターゼ血症表現型を改善する」中の用語「改善する」は、既存のＨＰＰ表現型のいかなる部分的又は完全な減少にも言及するように意図されている。同様に、語句「低ホスファターゼ血症表現型を予防する」中の用語「予防する」は、ＨＰＰ表現型の発生のいかなる遅延若しくは緩徐化にも、又はＨＰＰ表現型の発生のいかなる部分的若しくは完全な回避にも言及するように意図されている。

本明細書で使用するように、用語「対象」は、ヒト、マウス、ラット、イヌ、ネコ、ブタ、ウシ、サル、ウマ等を含むいかなる哺乳動物にも言及するように意図されている。特定の実施形態では、前記用語はヒトに言及している。

本明細書で使用するように、本発明の化合物を投与する方法における用語「それを必要とする対象」は、本発明の化合物を受けることから恩恵を受けると考えられる対象に言及するように意図されている。特定の実施形態では、前記用語は、既に少なくとも１つのＨＰＰ表現型を有する対象、又は少なくとも１つの若しくは少なくとももう１つのＨＰＰ表現型を発現する可能性がある対象に言及している。別の実施形態では、前記用語は、セメント質の形成不全、発育不全若しくは異形成を有する対象、又はセメント質の形成不全、発育不全若しくは異形成を発症しそうな対象に更に言及している。

本明細書で使用するように、「少なくとも１つのＨＰＰ表現型を発現する可能性がある対象」は、遺伝子（ＡＬＰＬ）に少なくとも１つの機能喪失突然変異を有する対象である。

本明細書で使用するように、「歯セメント質の形成不全、発育不全又は異形成を発症しそうな対象」は、ＨＰＰ又は細菌感染による歯周病を有する対象である。細菌感染による歯周病は、歯の剥離をもたらす可能性があるセメント質の変質を誘発することがある。

投与経路
本発明の骨標的ｓＡＬＰは、経口的に、経鼻的に、静脈内に、筋肉内に、皮下に、舌下に、髄腔内に、又は皮内になどの経路により投与することができる。投与経路は、環境及び治療目的などの種々の要因に依拠することがある。本明細書で使用するように、対象は、ＨＰＰ若しくはＨＰＰに付随する他の表現型を特徴づける骨ミネラル化欠損の予防若しくは改善、又は欠損セメント質の予防若しくは改善が望ましいヒトなどの動物に言及している。

例として、本発明の医薬組成物は、液体、溶液、懸濁液、丸薬、カプセル、錠剤、ジェルキャップ、粉末、ゲル、軟膏剤、クリーム、ネビュラ、ミスト、微粒化蒸気、エアロゾル、又はフィトソームの形状でよい。経口投与では、錠剤又はカプセルは、結合剤、充填剤、潤滑剤、崩壊剤、又は湿潤剤などの薬学的に許容可能な賦形剤を使用して従来の手段により調製することができる。前記錠剤は当技術分野で公知の方法によりコーティングすることができる。経口投与用の液体調製物は、例えば、溶液、シロップ若しくは懸濁液の形状を取ることができ、又は使用前に生理食塩水若しくは他の適切な液体媒体とともに構成するための乾燥製品として提示することができる。本発明の栄養補助食品は、懸濁化剤、乳化剤、非水溶媒、保存剤、緩衝塩、香料、発色、及び甘味剤などの薬学的に許容可能な添加剤も必要に応じて含有することができる。経口投与用調製物は、活性成分の制御された放出をするように適切に処方することもできる。

強酸性胃酸との長い接触に抵抗するが、弱酸性又は中性の腸環境では溶解するように、本発明の錠剤上に腸溶コーティングを更に使うことができる。そのように限定することなく、酢酸フタル酸セルロース、Ｅｕｄｒａｇｉｔ（商標）及びヒドロキシプロピルフタル酸メチルセルロース（ＨＰＭＣＰ）を、本発明の医薬組成物の腸溶コーティングに使用することができる。一般に使用される酢酸フタル酸セルロース濃度は、コア重量の０．５〜９．０％である。可塑剤を添加すればこのコーティング材の耐水性は改良され、そのような可塑剤を使った製剤は、酢酸フタル酸セルロースのみを使用する場合よりも効果的である。酢酸フタル酸セルロースは、アセチル化モノグリセリド、ブチルフタリブチルグリコール酸、酒石酸ジブチル、フタル酸ジエチル、フタル酸ジメチル、エチルフタリルエチルグリコール酸、グリセリン、プロピレングリコール、トリアセチン、クエン酸トリアセチン、及びトリプロピオニンを含む多くに可塑剤に適合性である。酢酸フタル酸セルロースは、薬物制御放出調製物においてエチルセルロースなどの他のコーティング剤と組み合わせても使用される。

投与量
いかなる量の医薬組成物も対象に投与することができる。その投与量は、投与方法及び対象の年齢を含む多くの要因に依拠することになる。典型的には、単回投与内に含有される本発明の骨標的ＡＬＰの量は、著しい毒性を誘導することなくＨＰＰにおける骨ミネラル化欠損を効果的に予防する、遅延させる又は改善する量になる。本明細書で使用するように、用語「治療的な有効量」は、目的の治療効果を達成し、有害な副作用は回避するのに有効な量に言及するように意図されている。典型的には、本発明による骨標的ｓＡＬＰは、０．００１〜５００ｍｇ／ｋｇ／日、更に特定の実施形態では、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、更に特定の実施形態では、約０．２〜約２０ｍｇ／ｋｇ／日の範囲の用量で対象に投与することができる。Ｍａｈｍｏｏｄらの相対成長率法（Ｍａｈｍｏｏｄら、２００３）を使用して、マウスからヒトへ用量を外挿することができる。投与量は、疾患の程度及び患者の異なるパラメータなどの従来の要因に従って臨床医が適合させることになる。

骨標的ｓＡＬＰの治療的な有効量は、直接測定してもよい。有効量は毎日又は毎週若しくはその一部分で与えてもよい。典型的には、本発明の医薬組成物は、１日当たり体重１ｋｇ当たり約０．００１ｍｇ〜約５００ｍｇまで（例えば、０．０５、０．０１、０．１、０．２、０．３、０．５、０．７、０．８、１ｍｇ、２ｍｇ、３ｍｇ、４ｍｇ、５ｍｇ、１０ｍｇ、１５ｍｇ、２０ｍｇ、３０ｍｇ、５０ｍｇ、１００ｍｇ、又は２５０ｍｇ）の量で投与することができる。投与量は、単回又は多数回投与計画のいずれで与えてもよい。例えば、いくつかの実施形態では、有効量は、約０．１〜約１００ｍｇ／ｋｇ／日、１日当たり約０．２ｍｇ〜約２０ｍｇの骨標的ｓＡＬＰ、１日当たり約１ｍｇ〜約１０ｍｇの骨標的ｓＡＬＰ、１週当たり約０．０７ｍｇ〜約２１０ｍｇの骨標的ｓＡＬＰ、１週当たり約１．４ｍｇ〜約１４０ｍｇの骨標的ｓＡＬＰ、３日毎に約０．３ｍｇ〜約３００ｍｇの骨標的ｓＡＬＰ、１日おきに約０．４ｍｇ〜約４０ｍｇの骨標的ｓＡＬＰ、及び１日おきに約２ｍｇ〜約２０ｍｇの骨標的ｓＡＬＰに及ぶ用量である。

実際の用量は、それぞれの患者特有の臨床学的要因に基づいて担当医によって、又は栄養士によって、慎重に選択され用量設定しなければならないので、これらの数字は指針に過ぎない。最適日用量は当技術分野で公知の方法によって決定され、上記の患者の年齢などの要因及び他の臨床的な関連要因などの要因により影響されることになる。更に、患者は他の疾患又は状態のための薬を服用していてもよい。その他の薬は、骨標的ｓＡＬＰが患者に与えられる期間中継続してもよいが、そのような場合には低用量から開始して有害な副作用が経験されるかどうかを判定するのが特に賢明である。

担体／溶媒
骨標的ｓＡＬＰを含有する調製物は、薬学的に許容可能な無菌水性若しくは非水溶媒、懸濁液又は乳濁液と組み合わせて患者に与えてもよい。非水溶媒の例は、プロピレングリコール、ポリエチレングリコール、植物油、魚油、及び注射用有機エステルである。水性担体には、水、水アルコール溶液、生理食塩水を含む乳濁液又は懸濁液、及び塩化ナトリウム溶液、リンゲルブドウ糖溶液、ブドウ糖プラス塩化ナトリウム溶液、乳糖を含有するリンゲル溶液又は固定油を含む緩衝医療用非経口溶媒が挙げられる。静脈内溶媒は、液体と栄養補填剤、リンゲルブドウ糖を主成分とする補填剤などの電解質補填剤などを含んでいてよい。

更に別の実施形態では、本発明の医薬組成物は、制御された放出システムで送達することができる。一実施形態では、ポリ乳酸、ポリオルトエステル、架橋両親媒性ブロック共重合体及びハイドロゲル、ポリヒドロキシブタン酸並びにポリジヒドロピランを含む高分子材料を使うことができ（ＳｍｏｌｅｎとＢａｌｌ、「制御された薬物バイオアベイラビリティ、薬物製品設計と性能（Ｃｏｎｔｒｏｌｌｅｄ Ｄｒｕｇ Ｂｉｏａｖａｉｌａｂｉｌｉｔｙ，Ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ ｄｅｓｉｇｎ ａｎｄ ｐｅｒｆｏｒｍａｎｃｅ）」、１９８４、Ｊｏｈｎ Ｗｉｌｅｙ＆Ｓｏｎｓ；ＲａｎａｄｅとＨｏｌｌｉｎｇｅｒ、「製剤送達システム、薬理学及び毒性学シリーズ（Ｄｒｕｇ ｐｒｏｄｕｃｔ Ｄｅｌｉｖｅｒｙ Ｓｙｓｔｅｍｓ，ｐｈａｒｍａｃｏｌｏｇｙ ａｎｄ ｔｏｘｉｃｏｌｏｇｙ ｓｅｒｉｅｓ）」、２００３、第２版、ＣＲＲＣ Ｐｒｅｓｓも参照）、別の実施形態では、ポンプを使用してもよい（Ｓａｕｄｅｋら、１９８９、Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３２１：５７４）。

本発明の融合タンパク質は、希釈剤として適した賦形剤溶液（例えば、ショ糖）を使った凍結乾燥した粉末の形であってもよい。

更に、本発明によるヌクレオチドセグメント又はタンパク質を、いくつかの形で個体に導入することができる。例えば、骨芽細胞を苦しんでいる個体から単離し、本発明によるヌクレオチド構築物で形質転換し、静脈内注射を含むいくつかの形で苦しんでいる個体に再導入することができる。代わりに、前記ヌクレオチド構築物を、例えば、注射により苦しんでいる個体に直接投与することができる。前記ヌクレオチド構築物は、特定の細胞型を標的にするように設計し、異なった経路を通じて投与されるように工学的に改変することができるリポソームなどの媒体を通じて送達することもできる。

本発明の融合タンパク質は、遺伝子治療により有利に送達することもできる。有用な遺伝子治療法には、例えば、治療タンパク質用にアデノウイルスベクターを使用してタンパク質産生細胞として肝細胞を標的にするジェンザイム社の国際公開第０６０６０６４１号Ａ２、米国特許第７１７９９０３号及び国際公開第０１３６６２０号Ａ２に記載されている治療法が挙げられる。

「遺伝子送達媒体」は、宿主細胞内に挿入されたポリヌクレオチドを運ぶことができる任意の分子として定義される。遺伝子送達媒体の例は、リポソーム、天然ポリマーと合成ポリマーを含む生体適合性ポリマー、リポタンパク質、ポリペプチド、多糖類、リポ多糖類、人工ウイルスエンベロープ、金属粒子、及び細菌、又はバキュロウイルス、アデノウイルス及びレトロウイルスなどのウイルス、バクテリオファージ、コスミド、プラスミド、真菌ベクター並びに、種々の真核生物及び原核生物宿主における発現のために記載されており、単純なタンパク質発現のためだけではなく遺伝子治療のためにも使用してよい当技術分野で典型的に使用される他の組換え媒体である。本明細書で使用される「遺伝子送達」、「遺伝子移入」などは、外来性ポリヌクレオチド（「トランス遺伝子」と呼ばれることもある）の宿主細胞への導入に言及する用語であり、導入のために使用される方法とは無関係である。そのような方法には、ベクター媒介遺伝子移入（例えば、ウイルス感染／トランスフェクション、又は種々の他のタンパク質ベース若しくは脂質ベース遺伝子送達複合体）並びに（エレクトロポレーション、「遺伝子銃」送達及びポリヌクレオチドの導入のために使用される種々の他の技術などの）「裸の」ポリヌクレオチドの送達を促進する技術などの種々の公知の技術が挙げられる。導入されたポリヌクレオチドは宿主細胞内で安定的に維持されても一過性に維持されてもよい。安定的維持には典型的に、導入されたポリヌクレオチドが、宿主細胞と適合性の複製起点を含有する、或いは染色体外レプリコン（例えば、プラスミド）などの宿主細胞のレプリコン又は核若しくはミトコンドリア染色体に組み込まれる必要がある。いくつかのベクターは、当技術分野で公知であり本明細書に記載するように、遺伝子の哺乳動物細胞への移入を媒介することができることが知られている。

「ウイルスベクター」は、インビバ、エキソビバ又はインビトロのいずれかで、宿主細胞内に送達されるポリヌクレオチドを含む組換え的に産生されたウイルス又はウイルス粒子として定義される。ウイルスベクターの例には、レトロウイルスベクター、アデノウイルスベクター、国際公開第０６００２２０３号Ａ２に記載されたウイルスベクターなどのアデノ随伴ウイルスベクター、アルファウイルスなどが挙げられる。セムリキ森林ウイルスベースベクター及びシンドビスウイルスベースベクターなどのアルファウイルスは、遺伝子治療及び免疫療法において使用するためにも開発された。

遺伝子移入がアデノウイルス（Ａｄ）又はアデノ随伴ウイルス（ＭＶ）などのＤＮＡウイルスベクターにより媒介される態様では、ベクター構築物は、ウイルスゲノム又はその一部を含むポリヌクレオチド、及びトランス遺伝子に言及する。アデノウイルス（Ａｄ）は、５０を超えるセロタイプを含む、相対的によく特徴づけられている同種グループのウイルスである。例えば、国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／２７０７１を参照されたい。Ａｄは増殖するのが容易で、宿主細胞ゲノムへの組込みを必要としない。組換えＡｄ由来ベクター、特に野生型ウイルスの組換え及び産生の可能性を減少させる組換えＡｄ由来ベクターも構築済みである。国際ＰＣＴ出願番号ＷＯ９５／００６５５及びＷＯ９５／１１９８４を参照されたい。プロモーター及びポリヌクレオチドを動作可能的に連結することができるクローニング部位の両方を含有するベクターは、当技術分野では公知である。そのようなベクターは、インビトロ又はインビボでＲＮＡを転写することができ、Ｓｔｒａｔａｇｅｎｅ社（ラホーヤ、カリフォルニア州）及びＰｒｏｍｅｇａ Ｂｉｏｔｅｃｈ社（マディソン、ウィスコンシン州）などの供給源から市販されている。発現及び／又はインビトロ転写を最適化するためには、転写又は翻訳レベルのいずれかで、発現を妨げる又は減少させる可能性にある余分な潜在的に不適切な代わりの翻訳開始コドン又は他の配列を除去するためにクローンの５’及び／又は３’非翻訳部分を取り除く、付加又は改変する必要がある可能性がある。

本発明の骨標的ｓＡＬＰは、骨ミネラル化欠損又はＨＰＰの別の有害な症状を改善する少なくとも１つの他の活性成分と組み合わせて使用してもよい。本発明の骨標的ｓＡＬＰは、セメント質欠損を改善する少なくとも１つの他の活性成分と組み合わせて使用してもよい。

用語「高度な厳密性の条件」は、高度に相同性の配列が結合するのを可能にする条件に言及するよう意図されている。そのように限定することなく、そのような条件の例は、ハンドブック「分子クローニング（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｃｌｏｎｉｎｇ）」、Ｌａｂｏｒａｔｏｒｙ ｍａｎｕａｌ、Ｓａｍｂｒｏｏｋらの１９８９年第２版に収載されており、３００〜１５００ヌクレオチドの核酸では、６×ＳＳＣ又は６×ＳＳＰＥ、デンハート試薬又はなし、０．５％ＳＤＳ及び高度な厳密性の条件を得るために使用される温度はほとんどの場合約６８℃（Ｓａｍｂｒｏｏｋの９．４７〜９．５５ページ参照）。特定の核酸プローブのために使用される最適温度は、経験的に計算してもよいが、選択される緩衝液条件には代案の余地があるが、これらのきわめて公知の条件範囲内で、捕獲される核酸は著しく変わることはないであろう。実際、Ｓａｍｂｒｏｏｋは、「選択はかなりの程度まで個人的好みに左右される」ことをはっきりと示している（９．４７ページ参照）。Ｓａｍｂｒｏｏｋは、核酸プローブ中のグアニンとシトシンの割合及びプローブの長さに従って変化する最適温度を計算する式（Ｔ_ｍよりも１０〜２０℃低く、Ｔ_ｍ＝８１．５℃＋１６．６（ｌｏｇ_１０［Ｎａ^＋］）＋０．４１（Ｇ＋Ｃの割合）−０．６３（ホルムアミド％−（６００／ｌ））と明記している（Ｓａｍｂｒｏｏｋの９．５０及び９．５１ページ参照）。

キット
本発明は、本発明による核酸、タンパク質又はリガンドを含む、ＨＰＰ表現型又はセメント質欠損を改善又は予防するためのキットにも関する。例えば、前記キットは、本発明の骨標的組成物又は同一物をコードするベクター、及びＨＰＰ表現型を改善又は予防するために対象に前記組成物又はベクターを投与するための使用説明書を含んでいてもよい。そのようなキットは、ＨＰＰ表現型を予防又は改善することができる少なくとも１つの他の活性薬剤を更に含んでいてもよい。前記キットを使用してＨＰＰ対象のＨＰＰ表現型を予防又は改善する場合、前記キットは、ＨＰＰの他のどんな有害な症状も予防又は改善することができる少なくとも１つの他の活性薬剤を更に含んでいてもよい。更に、本発明による区画化されたキットには、試薬が別々の容器に含有されるどんなキットも挙げられる。そのような容器には、小ガラス容器、プラスチック容器、又はプラスチック若しくは紙の条片が挙げられる。そのような容器は、試料及び試薬が相互汚染しないように、並びに各容器の薬剤又は溶液が定量的な形で区画から区画へと添加することができるように、区画から区画への試薬の効率的な移動を可能にする。

更に具体的には、本発明の第１の態様によれば、構造：Ｚ−ｓＡＬＰ−Ｙ−スペーサー−Ｘ−Ｗｎ−Ｖを有するポリペプチドを含む骨標的アルカリホスファターゼ（配列中、ｓＡＬＰはアルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、Ｖは不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｘは不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｙは不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｚは不在又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、Ｗｎはｎ＝１０〜１６のポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸である）が提供される。

特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１５のアミノ酸残基２３〜５０８を含む。別の特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１５のアミノ酸残基２３〜５１２からなる。別の特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１８のアミノ酸残基２３〜５０８を含む。別の特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１８のアミノ酸残基２３〜５１２からなる。別の特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１６のアミノ酸残基１８〜４９８を含む。別の特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１６のアミノ酸残基１８〜５０２からなる。別の特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１９のアミノ酸残基１８〜４９８を含む。別の特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１９のアミノ酸残基１８〜５０２からなる。別の特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１９のアミノ酸残基１８〜４９８を含む。別の特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号１９のアミノ酸残基１８〜５０２からなる。別の特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号８のアミノ酸残基１８〜４９８を含む。別の特定の実施形態では、ｓＡＬＰは、配列番号８のアミノ酸残基１８〜５０２からなる。

別の特定の実施形態では、スペーサーは、フラグメント結晶化可能領域（Ｆｃ）を含む。別の特定の実施形態では、Ｆｃは、ＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含む。別の特定の実施形態では、Ｆｃは、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである。別の特定の実施形態では、Ｆｃは、免疫グロブリンＩｇＧ−１の定常ドメインである。別の特定の実施形態では、Ｆｃは配列番号３に記載の通りである。別の特定の実施形態では、Ｗｎはポリアスパラギン酸である。別の特定の実施形態では、ｎ＝１０である。別の特定の実施形態では、Ｚは不在である。別の特定の実施形態では、Ｙは２つのアミノ酸残基である。別の特定の実施形態では、Ｙはロイシン−リシンである。別の特定の実施形態では、Ｘは２つのアミノ酸残基である。別の特定の実施形態では、Ｘはアスパラギン酸−イソロイシンである。別の特定の実施形態では、Ｖは不在である。別の特定の実施形態では、ポリペプチドは配列番号４に記載の通りである。

別の特定の実施形態では、骨標的アルカリホスファターゼは、ポリペプチドを二量体を含む形で含む。別の特定の実施形態では、骨標的アルカリホスファターゼは、ポリペプチドを四量体の形で含む。

別の特定の実施形態では、骨標的アルカリホスファターゼは、薬学的に許容可能な担体中に存在する。別の特定の実施形態では、薬学的に許容可能な担体は生理食塩水である。別の特定の実施形態では、骨標的アルカリホスファターゼは、凍結乾燥された形である。別の特定の実施形態では、骨標的アルカリホスファターゼは、約０．２〜約２０ｍｇ／ｋｇの１日投与量である。別の特定の実施形態では、骨標的アルカリホスファターゼは、３日毎に投与される約０．６〜約６０ｍｇ／ｋｇの投与量である。別の特定の実施形態では、骨標的アルカリホスファターゼは、約１．４〜約１４０ｍｇ／ｋｇの１週投与量である。別の特定の実施形態では、骨標的アルカリホスファターゼは、約０．５ｍｇ／ｋｇの１週投与量である。

更に具体的には、本発明の別の態様によれば、本発明のポリペプチドをコードする配列を含む単離された核酸が提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明のポリペプチドをコードする配列からなる単離された核酸が提供される。更に具体的には、本発明の別の態様によれば、配列番号１７に記載の配列を含む単離された核酸が提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明の核酸を含む組換え発現ベクターが提供される。更に具体的には、本発明の別の態様によれば、本発明の核酸を含む組換えアデノ随伴ウイルスベクターが提供される。更に具体的には、本発明の別の態様によれば、本発明のベクターで形質転換された又はトランスフェクトされた、単離された組換え宿主細胞が提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明の骨標的アルカリホスファターゼを作製する方法であって、骨標的アルカリホスファターゼの発現をもたらすのに適した条件下で、本発明の宿主細胞を培養することと、及び培地から骨標的アルカリホスファターゼを回収することを含む方法が提供される。

特定の実施形態では、宿主細胞は、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＣＨＯ細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。別の特定の実施形態では、宿主細胞はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である。特定の実施形態では、宿主細胞はＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である。

本発明の別の態様によれば、本発明の骨標的アルカリホスファターゼ、及び低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）表現型を改善又は予防するために対象に前記ポリペプチドを投与するための使用説明書を含むキットが提供される。

本発明の別の態様によれば、本発明の骨標的アルカリホスファターゼ、及び歯セメント質の形成不全、発育不全又は異形成を改善又は予防するために対象に前記ポリペプチドを投与するための使用説明書を含むキットが提供される。

本発明の別の態様によれば、少なくとも１つの低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）表現型を改善又は予防するために、本発明の骨標的アルカリホスファターゼを使用する方法であって、治療有効量の骨標的アルカリホスファターゼをそれを必要とする対象に投与することを含み、それによって対象において少なくとも１つのＨＰＰ表現型が改善又は予防される方法が提供される。

特定の実施形態では、対象は少なくとも１つのＨＰＰ表現型を有する。別の特定の実施形態では、対象は少なくとも１つのＨＰＰ表現型を発現する可能性がある。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＰＰ表現型はＨＰＰ関連発作を含む。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＰＰ表現型は、乳歯の早期喪失を含む。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＰＰ表現型は、不完全な骨ミネラル化を含む。別の特定の実施形態では、不完全な骨ミネラル化は、不完全な大腿骨ミネラル化である。別の特定の実施形態では、不完全な骨ミネラル化は、不完全な脛骨ミネラル化である。別の特定の実施形態では、不完全な骨ミネラル化は、不完全な中足骨ミネラル化である。別の特定の実施形態では、不完全な骨ミネラル化は、不完全な肋骨ミネラル化である。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＰＰ表現型は、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の血液及び／又は尿レベルの上昇を含む。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＰＰ表現型は、ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）の血液及び／又は尿レベルの上昇を含む。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＰＰ表現型は、ピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）の血液及び／又は尿レベルの上昇を含む。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＰＰ表現型は、不十分な体重増加を含む。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＰＰ表現型は、くる病を含む。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＰＰ表現型は、骨痛を含む。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＰＰ表現型は、ピロリン酸カルシウム二水和物結晶沈着を含む。別の特定の実施形態では、少なくとも１つのＨＰＰ表現型は、歯セメント質の形成不全、発育不全又は異形成を含む。別の特定の実施形態では、それを必要とする対象は乳児期ＨＰＰを有する。別の特定の実施形態では、それを必要とする対象は小児期ＨＰＰを有する。別の特定の実施形態では、それを必要とする対象は出生時ＨＰＰを有する。別の特定の実施形態では、それを必要とする対象は成人期ＨＰＰを有する。別の特定の実施形態では、それを必要とする対象は歯限局型低ホスファターゼ血症ＨＰＰを有する。

本発明の別の態様によれば、歯セメント質の形成不全、発育不全又は異形成を改善又は予防するために、本発明の骨標的アルカリホスファターゼを使用する方法であって、治療有効量の骨標的アルカリホスファターゼをそれを必要とする対象に投与することを含み、それによって対象において歯セメント質の形成不全、発育不全又は異形成が改善又は予防される方法が提供される。

特定の実施形態では、投与は、対象の細胞をアルカリホスファターゼをコードする核酸でトランスフェクトすることを含む。別の特定の実施形態では、細胞をトランスフェクトすることは、骨標的アルカリホスファターゼが発現され、活性型で分泌され、前記細胞を有する対象に投与されるように、インビトロで実施される。別の特定の実施形態では、投与は、対象への骨標的アルカリホスファターゼの皮下投与を含む。別の特定の実施形態では、投与は、対象への骨標的アルカリホスファターゼの静脈内投与を含む。

本発明の別の態様によれば、少なくとも１つのＨＰＰ表現型の改善又は予防に使用するための、本発明の骨標的アルカリホスファターゼが提供される。

本発明の別の態様によれば、歯セメント質の形成不全、発育不全又は異形成の改善又は予防に使用するための、本発明の骨標的アルカリホスファターゼが提供される。

本発明の別の態様によれば、医薬品の製造における、本発明の骨標的アルカリホスファターゼの使用が提供される。

本発明の別の態様によれば、少なくとも１つのＨＰＰ表現型を改善又は予防するための、本発明の骨標的アルカリホスファターゼの使用が提供される。

本発明の別の態様によれば、歯セメント質の形成不全、発育不全又は異形成を改善又は予防するための、本発明の骨標的アルカリホスファターゼの使用が提供される。

本発明の他の目的、利点及び特徴は、添付の図面を参照してほんの一例として示した、その特定の実施形態の以下の非限定的説明を読めば更に明らかになろう。

添付の図面については以下の通りである。

ｈｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０により例示される本発明の骨標的ＡＬＰの設計及び概略構造を示す図である。パネルＡは、Ｎ末端シグナルペプチドとＧＰＩ付加用一過性膜アンカー付加シグナルとを含むヒト組織非特異的アルカリ性ホスファターゼ遺伝子（ＴＮＡＬＰ）の完全一次翻訳産物の概略図を示す。パネルＢは、融合タンパク質の一次翻訳産物を示す。パネルＣは、切断可能ＴＮＡＬＰシグナルペプチドを欠く一次翻訳産物を示す。 ｈＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０のタンパク質配列（（配列番号１）、Ｎ末端ペプチドシグナル（最初の１７アミノ酸）を含む）を示す図であり、ｈＴＮＡＬＰの部分（配列番号２）は、イタリック体であり、イタリック体で下線付きのペプチドシグナル部分を含み、Ｆｃフラグメントは下線付きである（配列番号３）。 本明細書において示される実施例で使用されるｈｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０のタンパク質配列（配列番号４）（Ｎ末端ペプチドシグナルを有さない）を示す図であり、ｈｓＴＮＡＬＰ部分（配列番号５）はイタリック体であり、Ｆｃフラグメントは下線付きである（配列番号３）。二重下線付きのアスパラギン（Ｎ）残基は、推定上のＮグリコシル化部位に対応し、太字のアミノ酸残基（ＬＫ及びＤＩ）は、それぞれｈｓＴＮＡＬＰとＦｃの間、及びＦｃとＤ１０ドメインの間のリンカーに相当する。これらのリンカーは、ｃＤＮＡの工学的改変時に導入されるエンドヌクレアーゼ制限部位に由来する。 ＣＨＯ−ＤＧ４４細胞におけるｓＴＮＡＬＰ−Ｄ１０及びｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の発現の比較を示すグラフである。 Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）３−３００によるプロテインＡセファロース分子篩クロマトグラフィーにおけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の精製、並びに還元（ＤＴＴ＋）条件及び非還元（ＤＴＴ−）条件の下での精製ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す図である。ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の概略図も示す。Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）アフィニティークロマトグラフィーにより精製されたタンパク質をＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析し、Ｓｙｐｒｏ（商標）Ｒｕｂｙでバンドを染色した。ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の主要な種は、還元条件下で９０，０００Ｄａ、及び非還元条件下で２００，０００Ｄａの見かけの分子質量で移動した。 ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０におけるパパイン切断部位の位置を示す図である。 ＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ３０００ＷＸＬカラムにおけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の非変性ＳＥＣ−ＨＰＬＣ解析を示すグラフである。通常の曲線：パパイン消化試料。−Ｘ−曲線：パパインが非存在であること以外は同一の条件でインキュベートした同じ試料（対照）。 どのフラグメントがゲル上のどのバンドに対応するのかを示す、パパインの存在下又は非存在下でインキュベートされたｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０のＳＤＳ−ＰＡＧＥ解析を示す写真である。解析は、還元（＋ＤＴＴ）又は非還元（−ＤＴＴ）の条件下で行った。 インビトロ結合アッセイを示すグラフである。ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０及びウシ腎臓組織非特異的アルカリホスファターゼを例２に記載の再組成ミネラル結合アッセイで比較した。総活性は、遊離画分及び結合画分において回収された酵素活性の合計である。総活性は、それぞれウシ及びｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の形態の酵素についての各セットのアッセイにおいて導入された酵素活性の初期量の８４％及び９６％であることが分かった。結果は、２つの結合の平均である。 成体ＷＴマウスの血清、脛骨及び筋肉におけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の薬物動態プロファイル及び分布プロファイルを示すグラフである。血清、脛骨及び筋肉におけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の濃度は、成体ＷＴマウスにおける５ｍｇ／ｋｇの単回ボーラス静脈内注射の後のμｇ／組織１ｇ（湿重量）で表す。 新生児ＷＴマウスにおけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の血清中濃度の薬物動態プロファイルを示すグラフである。（１日齢）新生児ＷＴマウスにおける３．７ｍｇ／ｋｇの単回の腹腔内注射（パネルＡ）又は皮下注射（パネルＢ）の後の時間の関数としてのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の血清中濃度。 血清中のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の予測薬物動態プロファイルを示すグラフである。新生児マウスにおける１０ｍｇ／Ｋｇの反復皮下注射（２４時間毎）後のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の予測最大（Ｃｍａｘ）循環定常レベル及び予測最小（Ｃｍｉｎ）循環定常レベル。 新生児マウスの血清中のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の実験的に試験された薬物動態プロファイルを示すグラフである。新生児マウスにおける１０ｍｇ／Ｋｇの最終皮下注射の２４時間後のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の測定最小（Ｃｍｉｎ）循環定常レベル。ホモ：ホモ接合、ヘテロ：ヘテロ接合。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスにおけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の血清中濃度に関する、短期（１５日間）、低用量（１ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示すグラフである。１ｍｇ／ｋｇのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の皮下注射を毎日１５日間投与したマウスの１６日目におけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の血清中濃度。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスにおける血清中ＰＰｉ濃度に関する、短期（１５日間）、低用量（１ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示すグラフである。血清中ＰＰｉ濃度の測定。１ｍｇ／ｋｇの低用量は、ＥＲＴ投与マウスのＰＰｉレベルの正常化に十分だった。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスにおける骨端軟骨形態に関する、短期（１５日間）低用量（１ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示す写真である。未投与のＡｋｐ２^−／−マウス及び投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスにおけるＷＴの成長板のＧｏｌｄｎｅｒの三重染色。近位脛骨の成長板（骨端軟骨）は、Ａｋｐ２^−／−マウスに注射されたｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０及び媒体の両方において肥大領域の過度の拡大を示し、それは早期くる病と一致していた。しかしながら、骨端軟骨形態は、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０が投与された動物においてあまり支障を来たしていないと思われた。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスの骨端軟骨肥大面積の大きさに関する、短期（１５日間）、低用量（１ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示すグラフである。成長板の肥大面積の大きさは、総成長板面積の割合で表される。投与マウスにおける肥大面積の正常化を示す。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスの体重に関する、短期（１５日間）、高用量（８．２ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示すグラフである。体重に対するｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の効果。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスの長骨長に関する、短期（１５日間）、高用量（８．２ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示すグラフである。大腿骨及び脛骨の長さ（１６日目に行われた測定）に対するｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の効果。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスにおけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の血清中濃度に関する、短期（１５日間）、高用量（８．２ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示すグラフである。８．２ｍｇ／ｋｇのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の皮下注射を毎日１５日間投与したマウスの１６日目のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の血清中濃度。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスにおける骨のミネラル化に関する、短期（１５日間）、高用量（８．２ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示す写真である。Ａｋｐ２^−／−マウス（１６日齢）の足、胸郭及び後肢のＸ線解析及びＦａｘｉｔｒｏｎ（商標）画像分布表。骨ミネラル化の欠損の程度を考慮するために、足及び胸郭を重症、中等度又は健康に分類した。下腿は、単に異常（少なくとも１つの欠損）又は健康（目に見える欠損なし）に分類した。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスにおける歯の欠損に関する、短期（１５日間）、高用量（８．２ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示す写真である。媒体又はｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を注射したＡｋｐ２^−／−マウス並びに野生型マウスの歯の組織学的解析。Ｍｉｌｌａｎらに記載されるように、薄片を調製し、染色した。ＰＤＬ＝歯周靭帯。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスの生存期間に関する、長期（５２日間）、高用量（８．２ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示すグラフである。対照の媒体だけを投与したＡｋｐ２^−／−マウスの早期の死亡と比較した、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を投与したＡｋｐ２^−／−マウスの長期生存期間。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスの大きさ、移動性及び外観に関する、長期（５２日間）、高用量（８．２ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示す写真である。投与により、投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスの大きさ、移動性及び外観は正常化される。同腹仔の未投与マウスを比較のために示す。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスにおける骨のミネラル化及び長さに関する、長期（５２日間）、高用量（８．２ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示す写真である。ＷＴマウスと比較した、４６日齢及び５３日齢の投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスの中足骨のＸ線像。 投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスにおけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の血清中濃度に関する、長期（５２日間）、高用量（８．２ｍｇ／Ｋｇ）の有効性の結果を示すグラフである。８．２ｍｇ／ｋｇのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の皮下注射を毎日５２日間投与したマウスの５３日目でのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の血清中濃度。 Ａ）毎日４．３ｍｇ／ｋｇ（Ｔｘ−１）又は３日毎に１５．２ｍｇ／ｋｇ（Ｔｘ−３）又は１週毎に１５．２ｍｇ／ｋｇ（Ｔｘ−７）のいずれかの投与量でｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスの生存曲線、及びＢ）これらの投与計画の各々についての生存期間の中央値を示す図である。投与マウスの生存期間を、媒体注射マウスの生存期間と比較した。 Ａ）出生後１５日目に開始した毎日８．２ｍｇ／ｋｇの投与量（ＲＴｘ）でｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスの生存曲線、及びＢ）投与マウス及び媒体注射マウスについての生存期間の中央値を示す図である。投与マウスの生存期間を、媒体注射マウス（Ｒ媒体）の生存期間と比較する。 出生後１５日目から開始した、Ａｋｐ２^−／−マウス（ＲＴｘ）に注射された毎日８．２ｍｇ／ｋｇの投与量のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の、体重に対する効果を示すグラフである。毎日の体重は、媒体注射Ａｋｐ２^−／−マウス（Ｒ媒体）又は野生型同腹仔（ＷＴ）と比較される。 ＣＬＵＳＴＡＬ（商標）Ｗ（１．８２）多重配列アラインメントによって確立された種々のＡＬＰのアラインメント、即ち、ウシＴＮＡＬＰ配列（配列番号６）；ネコＴＮＡＬＰ配列（配列番号７）、ヒトＴＮＡＬＰ配列（配列番号８）、マウスＴＮＡＬＰ配列（配列番号９）、ラットＴＮＡＬＰ配列（配列番号１０）及び部分的イヌＴＮＡＬＰ配列（配列番号１１）（ここで最初の２２のアミノ酸残基の性質は不明である）；ヒトＩＡＬＰ（配列番号１２）（受入番号：ＮＰ＿００１６２２）、ヒトＧＣＡＬＰ（配列番号１３）（受託番号Ｐ１０６９６）及びヒトＰＬＡＬＰ（配列番号１４）（受託番号ＮＰ＿１１２６０３）を示す図である。「^＊」は、その列の残基がアラインメントの全ての配列において同一であることを示し、「：」は、保存された置換が認められたことを示し、「．」は、半保存された置換が認められたことを示す。このアラインメント（配列番号１５）から誘導されたコンセンサス配列も示されるが、ここでｘは任意のアミノ酸である。 ＣＬＵＳＴＡＬ（商標）Ｗ（１．８２）多重配列アラインメントによって確立された種々の種に由来するＴＮＡＬＰのアラインメント、即ち、ウシ配列（配列番号６）；ネコ配列（配列番号７）、ヒト配列（配列番号８）、マウス配列（配列番号９）、ラット配列（配列番号１０）及び部分的イヌ配列（配列番号１１）（ここで最初の２２のアミノ酸残基の性質は不明である）を示す図である。「^＊」は、その列の残基がアラインメントの全ての配列において同一であることを示し、「：」は、保存された置換が認められたことを示し、「．」は、半保存された置換が認められたことを示す。このアラインメント（配列番号１６）から誘導されたコンセンサス配列も示されるが、ここでｘは任意のアミノ酸である。 図１に記載したポリペプチド配列をコードする核酸配列（配列番号１７）を示す図である

以下に示す実施例は、組換え型のＡＬＰの皮下注射を使ったＴＮＡＬＰノックアウト（Ａｋｐ２−／−）マウスの最初の成功した治療を示している。Ａｋｐ２^−／−マウスは、重症の、致死することも多い、幼児期型の低ホスファターゼ血症を要約している。

幼児期ＨＰＰに付随する骨格の生化学的異常の多くを反映した、十分に報告されているＴＮＳＡＬＰホモ接合ヌルマウスモデルが使用された。１０連続アスパラギン酸（Ｄ１０）残基から構成された骨標的配列に融合されたヒトＩｇＧ−１の結晶性フラグメント（Ｆｃ）領域の形で両方のスペーサーを含有するようカルボキシ末端で工学的に改変された新規の可溶性組換え型のヒトＴＮＳＡＬＰでマウスを治療した。腎臓から精製された天然ＴＮＳＡＬＰと比べて、改変された組換え型の酵素は、その酵素活性を保持したまま、はるかに貪欲にヒドロキシアパタイトに結合することが明らかにされた。本発明の組換えＴＮＳＬＰで治療すると、媒体のみを受けたマウスと比べると、ホモ接合体のヌルマウスの血漿ＰＰｉレベルが驚くほど正常化され、足胸部、後肢及び歯列のミネラル化が改善された。前記治療は、骨格表現型のほぼＸ線検査正常化で、生存期間を延長することも明らかにされた。

その有益なインビボ治療効果に加えて、驚くべきことに、スペーサーを含有する組換え活性型の改変された酵素は、そのようなスペーサーを欠くその組換え対応物よりも高いレベルで発現されることが発見された。更に、前記酵素は四量体として機能することが実証された。

本発明は、以下の非限定的実施例により更に詳細に例示される。

（例１）
組換えｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の発現及び精製
組換えＴＮＡＬＰの発現及び精製を容易にするために、ＴＮＡＬＰにおけるＧＰＩアンカー付加を指定する疎水性Ｃ末端配列を除去して可溶性の分泌酵素とした（Ｄｉ Ｍａｕｒｏら、２００２）。また、ヒトＩｇＧ（γ１型（ＩｇＧ１）、Ｓｗｉｓｓ−Ｐｒｏｔ Ｐ０１８５７）のＦｃ領域でＴＮＡＬＰエクトドメインのコード配列を拡大させた。これにより、Ｐｒｏｔｅｉｎ Ａクロマトグラフィーにおける組換え酵素の精製を迅速に行うことが可能になり、驚くべきことにその発現を増大させることも可能になった。更に、組換えＴＮＡＬＰを骨組織にターゲティングするために、Ｆｃ領域のＣ末端にデカアスパルテート（Ｄ１０）配列を付加した。このキメラ型のＴＮＡＬＰ（ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０と呼ぶ）は、生理学的基質として、人工基質ｐ−ニトロフェニルリン酸を用いてｐＨ９．８でアッセイした場合と、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）を用いてｐＨ７．４でアッセイした場合との両方において、完全な酵素活性を保持する。天然型のＴＮＡＬＰのように、Ｎ末端シグナルペプチドは、粗面小胞体を横断するタンパク質の共翻訳的トランスロケーションの間に切断される。その設計及び構造を、図１に概略的に例示する。図２に、融合タンパク質（シグナルペプチドを含む）のアミノ酸配列を示す。図３に、分泌される融合タンパク質（即ちシグナルペプチドを有さない）のアミノ酸配列を示す。

この融合タンパク質を構築するために用いた方法は、以下の通りである。融合タンパク質コードするｃＤＮＡ（図３２参照）を、ＮｈｅＩ及びＢａｍＨＩエンドヌクレアーゼ制限部位を用いて、ｐＩＲＥＳベクター（Ｃｌｏｎｔｅｃｈ（商標））のＩＲＥＳの上流側に位置する第１のマルチクローニング部位に挿入した。ジヒドロ葉酸還元酵素（ＤＨＦＲ）遺伝子を、ＳｍａＩ及びＸｂａＩエンドヌクレアーゼ制限部位を用いて、ＩＲＥＳの下流側に位置する第２のマルチクローニング部位に挿入した。Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）トランスフェクションキット（Ｉｎｖｉｔｒｏｇｅｎ）を用いて、ＤＨＦＲ遺伝子の両対立遺伝子が欠失したチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ−ＤＧ４４）細胞（Ｕｒｌａｕｂら、１９８３、Ｄｒ Ｌａｗｒｅｎｃｅ Ａ．（Ｃｈａｓｉｎ、Ｃｏｌｕｍｂｉａ Ｕｎｉｖｅｒｓｉｔｙ）から得た）内に、得られたベクターをトランスフェクションした。トランスフェクションの２日後、培地を交換し、ヌクレオチド不含培地（５％透析ＦＢＳを補充したＩＭＤＭ）中に細胞を１５日間維持し、プラーククローニングのための安定なトランスフェクタントを単離した。

ヌクレオチド不含培地中で増殖した、３個の最良のクローン又は最初に選択された５個に由来する細胞をプールし、メトトレキサート（ＭＴＸ）を含有する培地（ＩＭＤＭ＋５％透析ＦＢＳ）中でその濃度を上昇させながら更に培養した。５％ＦＢＳが補充されたＩＭＤＭ培地を含有するＣｅｌｌｓｔａｃｋｓ（商標）（Ｃｏｒｎｉｎｇ）中で、５０ｎＭ ＭＴＸ耐性の培養物を更に増殖させた。コンフルエントに達した後、即座にリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）で細胞層をリンスし、タンパク質発現を増加させるために３．５ｍＭ酪酸ナトリウムを含有するＩＭＤＭで細胞のインキュベーションを更に３日間行った。培養の終了時、使用済みの培地中のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の濃度は、ＴＮＡＬＰ酵素活性を測定することによって評価したところ３．５ｍｇ／Ｌであった。

遊離したｐ−ニトロフェノールの吸光度が反応産物量に比例するＡＬＰ活性についての熱量アッセイを用いて使用済みの培地中のｓＡＬＰ−ＦｃＤ１０の濃度を定量した。反応は、１０μＬの希釈された使用済み培地及び１ｍＭ ｐＮＰＰを含有する１００μＬのＡＬＰ緩衝液（２０ｍＭビス−トリスプロパン（ＨＣｌ）ｐＨ９、５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２、及び５０μＭ ＺｎＣｌ_２）中で生じた。最後に後者の化合物を添加して反応を開始させた。分光光度プレートリーダを用いて２０分間に亘り４５秒毎に４０５ｎｍで吸光度を記録した。最も急な勾配を８つの連続値に合わせることによって、初速度として表されるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０触媒活性を評価した。ｓＡＬＰ−ＦｃＤ１０の濃度を変化させて標準液を調製し、先に記載したようにＡＬＰ活性を決定した。標準濃度のＬｏｇの関数としての初速度のＬｏｇをプロットすることによって標準曲線を作成した。異なる試料におけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０濃度を、それらのそれぞれのＡＬＰ吸光度を用いて標準曲線から読み取った。精製された組換え酵素の既知の濃度の活性をプロットすることにより得られた較正曲線を用いて、活性の測定値をｓＡＬＰ−ＦｃＤ１０の濃度に変換した。

次いでタンジェント流濾過を用いてＰＢＳに対して培養液上清の濃縮及び透析を行い、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（１０ｍＭ ＰＯ_４ナトリウム）で平衡化したＭａｂＳｅｌｅｃｔ ＳｕＲｅ（商標）カラム（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）にそれを添加した。結合したタンパク質を、５０ｍＭトリスｐＨ１１（ｐＨ１１．０緩衝液）で溶出した。回収した画分を、２００ｍＭトリス−ＨＣｌ ｐＨ５．５でｐＨ８〜９に調整した。溶出物質のほとんどを含む画分を、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ_２（２０μＭ ＺｎＣｌ_２）を含有する１５０ｍＭ ＮａＣｌ（２５ｍＭ ＰＯ_４ナトリウム）ｐＨ７．４緩衝液に対して透析し、無菌条件下で０．２２μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（商標））膜で濾過した。精製手順の全収率を、Ｓｙｐｒｏ（商標）ｒｕｂｙ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価したところ、９５％超の純度で５０％であった。精製したｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０調製物を、数カ月間４℃で保存し、安定したままとした。

また、以下の精製手法も試験したところ、成功であった。タンジェント流濾過を用いてＰＢＳに対して培養液上清の濃縮及び透析を行い、ＰＢＳで平衡化したＰｒｏｔｅｉｎ Ａ−Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）カラム（Ｈｉ−Ｔｒａｐ（商標）５ｍＬ、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）にそれを添加した。結合したタンパク質を、１００ｍＭクエン酸ｐＨ４．０緩衝液で溶出した。回収した画分を、直ちに１Ｍ トリスｐＨ９．０でｐＨ７．５に調整した。溶出物質のほとんどを含む画分を、０．１ｍＭ ＭｇＣｌ_２（２０μＭ ＺｎＣｌ_２）を含有する１５０ｍＭ ＮａＣｌ（２５ｍＭ ＰＯ_４ナトリウム）ｐＨ７．４緩衝液に対して透析し、無菌条件下で０．２２μｍ（Ｍｉｌｌｉｐｏｒｅ、Ｍｉｌｌｅｘ−ＧＰ（商標））膜で濾過した。精製手順の全収率を、Ｓｙｐｒｏ（商標）ｒｕｂｙ染色したＳＤＳ−ＰＡＧＥにより評価したところ、９５％超の純度で５０％であった。精製したｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０調製物を、数カ月間４℃で保存し、安定したままとした。

トランスフェクションしたＣＨＯ−ＤＧ４４１９４細胞をメトトレキサートの存在下でその濃度を上昇させながら培養することによって、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０遺伝子のコピー数を増加させた。１００ｎＭメトトレキサート耐性の細胞のクローンを単離し、高収率でｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を生成する能力について評価した。最も良い産生株を、ウシ胎仔血清を含まないＨｙｃｌｏｎｅ ｍｅｄｉａ（商標）ＳＦＭ４ＣＨＯ（商標）（カタログ番号ＳＨ３０５４９）の懸濁液中の培養に適応させた。それらの条件下で高産生収率を維持した培養物を使い捨て式Ｗａｖｅ（商標）バイオリアクタバッグに移した。１ｍＬ当たり０．４×１０^６個の細胞の密度で培地（総容積２５Ｌ）に播種した。細胞密度が２×１０^６個／ｍＬに達するまで、培養の温度を３７℃に維持した。次いで温度を３０℃に低下させ、培養物に、１２５ｍＬのＣＨＯ用一般的供給物（Ｓｉｇｍａ、Ｃ１６１５）を補充した。それらの条件により、培養培地中において、細胞分裂が遅くなり、産物分泌が増大することが分かった。これらの条件を６日間維持した後、分泌ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を含有する細胞培養上清を収集した。

（例２）
ｓＴＮＡＬＰ−Ｄ１０及びｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の発現の比較
ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０又はｓＴＮＡＬＰ−Ｄ１０のいずれかをコードするプラスミドベクターを、Ｌｉｐｏｆｅｃｔａｍｉｎｅ（商標）を使用してＣＨＯ−ＤＧ４４細胞においてトランスフェクションし、上記の例１に記載したようにＤＨＦＲ遺伝子を発現する細胞の生存を促進するように設計された選択培地（即ちヌクレオチドを含まない）中で増殖させた。安定したトランスフェクタントをプラーククローニングによって単離し、上記の例１にも記載したアルカリホスファターゼ酵素アッセイを使用してタンパク質発現のそれらのレベルの順に分類した。スクリーニングにより、ｓＴＮＡＬＰ−Ｄ１０についてのみ１個のクローン（０．１２０ｐｇ／細胞／日）、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０については５個のクローン（０．３７７、０．２５８、０．２０３、０．０９９及び０．０８８ｐｇ／細胞／日）を同定することができた。メトトレキサート（ＭＴＸ）遺伝子の増幅を、上記の例１に記載したように行い（０〜１００ｍＭの範囲のＭＴＸ）、それによりｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０については発現を８倍増大させることができたが、一方でｓＴＮＡＬＰ−Ｄ１０の培養物では増幅は認められなかった（図４参照）。細胞系の発達のための同様の方法を使用して、予想外にも、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０タンパク質は、ｓＴＮＡＬＰ−Ｄ１０よりも容易に発現することが分かった（図４参照）。

（例３）
ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の特性評価
ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を、まずＰｒｏｔｅｉｎ−Ａ Ｓｅｐｈａｒｏｓｅ（商標）で精製し、還元条件及び非還元条件の下でＳＤＳ−ＰＡＧＥで解析した。

それは、還元条件下で、約９０，０００Ｄａの見かけの分子質量で広いバンドとして移動した（図５のＤＴＴ＋）。ペプチドＮ−グリコシダーゼＦ（ＰＮＧＡｓｅ Ｆ）による消化により、タンパク質の見かけの分子質量は約８０，０００に減少したが、それは図１に示される非グリコシル化ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０単量体の８０，５００Ｄａの算出質量に非常に近いものである。血清中の可溶性ＴＮＡＬＰは、骨芽細胞の外表面にＧＰＩアンカータンパク質として存在するＴＮＡＬＰと同様に、酵素の総重量の２０％以下を含む炭水化物を有する高グリコシル化タンパク質である（Ｆａｒｌｅｙ及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ、２００５）。ＴＮＡＬＰに対する特異的な炭水化物構造は同定されなかったが、配列の試験により、酵素がＮ−結合型グリコシル化のための５つの推定上の部位を有することが示され、生化学試験により、Ｎ−結合型炭水化物及びＯ−結合型炭水化物の両方についての証拠が示された（Ｎｏｓｊｅａｎら、１９９７）。より以前のこれらの見解と一致して、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の電気泳動移動及びＰＮＧＡｓｅ Ｆに対するその感受性により、それもまた高Ｎ−グリコシル化タンパク質であることが示唆される。血清中の可溶性ＴＮＡＬＰは、骨芽細胞の外表面にＧＰＩアンカータンパク質として存在するＴＮＡＬＰと同様に、酵素の総重量の２０％以下を含む炭水化物を有する高グリコシル化タンパク質である（Ｆａｒｌｅｙ及びＭａｇｎｕｓｓｏｎ、２００５）。

非還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥを繰り返した際、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の見かけの分子質量が２００，０００であることが判明し（図５のＤＴＴ−）、それは、天然で未変性のＴＮＡＬＰ等のホモ二量体の見かけの分子質量と一致していた（Ｍｉｌｌａｎ、２００６）。このホモ二量体は、２つの単量体Ｆｃ領域の間の２つのジスルフィド架橋の形成から生じ得る（図５の右上のパネル）。

次に、１５０ｍＭ ＮａＣｌ（２０ｍＭトリスｐＨ７．５緩衝液）で平衡化したＳｅｐｈａｃｒｙｌ（商標）Ｓ−３００（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）のカラムでサイズ排除ＦＰＬＣクロマトグラフィーを用いて、天然条件下における精製ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の分子質量を評価した。事前に、標準タンパク質キット（ＨＭＷ較正キット、ＧＥ Ｈｅａｌｔｈ Ｃａｒｅ）でカラムを較正した（図５の左下のパネル）。

回収したクロマトグラフィー画分を、アルカリホスファターゼ酵素活性及び各ピークの物質についてアッセイした。驚くべきことに、前記物質の７８％は３７０ｋＤａのタンパク質に対応する位置で溶出しており（図５の左下のパネル）、それにより、ＣＨＯ細胞において産生される天然ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０組換え酵素についての四量体形態が示唆された。Ｓｅｐｈａｃｒｙｌ Ｓ−３００カラムからの画分を活性について試験した際、酵素活性の全てが３７０ｋＤａの画分と関連していた。残留物質の分子量は非常により高かったが、このことは、いくつかのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０凝集体の形成を示していた。後者が共に四量体を維持する非共有結合を破壊するためＳＤＳ−ｐａｇｅで観察することができない四量体形態と、凝集体形態との両方を、還元条件下でＳＤＳ−ＰＡＧＥにより見かけの分子量が９０，０００のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０単量体として分解し（ＤＴＴ＋、図５の右下のパネル）、非還元条件下で見かけの分子量が２００，０００の二量体として分解した（ＤＴＴ−、図５の右下のパネル）。組換えｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０は、２つのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０ジスルフィド結合二量体の非共有結合性会合によって形成される酵素的機能性ホモ四量体から主になると思われる。

限定されたパパイン消化により、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の四量体構造を更に試験した（図６〜８）。このプロテアーゼは、ヒンジ領域の近くにあり、且つ、ジスルフィド結合のＮ末端側のＩｇＧ重鎖を切断し、それにより単量体Ｆａｂフラグメント及び二量体ジスルフィド結合Ｆｃ二量体の全体を作製することが知られている。したがって、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の消化により、酵素的活性ｓＴＮＡＬＰ二量体は、無損傷Ｆｃドメインから遊離されることになる（図６参照）。

４００μｇのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を含むアリコートを、２５０μＭジチオトレイトールを含有する２０ｍＭリン酸緩衝液（ｐＨ７．０）中で２０８ｍＵのパパインアガロース（Ｓｉｇｍａ）により消化させた。緩やかな撹拌下で、３７℃で１時間消化を進行させた。遠心分離によりパパインアガロースビーズを除去させることによって、反応を停止させた。それらの条件では、インキュベーションの最初の４時間においてｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０酵素活性の著しい低下は認められなかった。次に、パパインアガロースの存在下又は非存在下で１時間インキュベーションしたｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を、非変性条件でＴＳＫ−Ｇｅｌ Ｇ３０００ＷＸＬ（Ｔｏｓｏｈ Ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ）によるＳＥＣ−ＨＰＬＣによって解析した。

図７は、見かけの分子量３７０ｋＤａで溶出する主な産物が、パパイン消化の１時間後には認められなかったことを示す。それらの条件において、パパイン消化により、それぞれ１３５ｋＤａ及び６２ｋＤａの２つの主要フラグメントが作製される。また、３５ｋＤａの分子量のマイナーピークも認められた。

還元ＳＤＳ−ＰＡＧＥ条件（ＤＴＴ＋、図８）の下で、パパインが投与されていない試料の産物を、単量体ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０に対応することが既に示された主要なバンドに分割した（１０２ｋＤａ）（ＤＴＴ＋、パパイン−）。ウェスタンブロットにおいて、このバンドを、ＴＮＡＬＰとＩｇＧ_１分子のＦｃドメインとの両方に対する抗体で実際染色することができる（図示せず）。パパイン消化の後、このバンドは、以下の２つの主要なフラグメントに切断される。１）抗Ｆｃ抗体に結合するが抗ＴＮＡＬＰ抗体には結合せず、ＦｃＤ１０フラグメントに対応することが提唱されている３２ｋＤａのバンド；及び、２）抗ＡＬＰ抗体で染色され得るが抗Ｆｃ抗体では染色され得ず、したがってＴＮＡＬＰエクトドメイン単量体に対応すると考えられる、幅広く、且つ、拡散したタンパク質バンド（６６〜９０ｋＤａ）。この物質の不均質性は、おそらくそのグリコシル化に起因するものであり、なぜならば、それがペプチド−Ｎ−グリコシダーゼＦによる消化によって還元され得るからであり、それはまたその見かけの分子質量を５２ｋＤａにまで減少させる（結果は示さず）。

非還元条件（ＤＴＴ−、図８）の下で、パパインを含まずにインキュベーションされたｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０は、ＳＤＳ−Ｐａｇｅにおいて２１６ｋＤａのタンパク質として移動することが分かった（ＤＴＴ−、パパイン−、図８）。また、ウェスタンブロット法により、このタンパク質がＴＮＡＬＰ部分及びＦｃ部分の両方のエピトープを含むことが示される。（結果は示されない）。この分子種は、ジスルフィド結合したｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０二量体からなることが既に提唱された。非還元条件（ＤＴＴ−、パパイン＋）の下でのパパイン切断によって、還元条件下の場合と同様に２つの主要フラグメントが作製される。ウェスタンブロットにおいて、５５ｋＤａのフラグメントは、抗Ｆｃ抗体で染色することができるが、抗ＴＮＡＬＰ抗体で染色することはできない。このフラグメントは、天然の条件でＳＥＣ−ＨＰＬＣにより観察された６２ｋＤａの種とほとんど同一であり、ジスルフィド結合したＦｃ二量体に対応することが提唱されている。他の主要な種は、還元条件下で観察される主要なタンパク質バンド（６６〜９０ｋＤａ）と共に移動する。このことは、それがＴＮＡＬＰエクトドメイン単量体から構成されることと一致している。非変性条件でＨＰＬＣにより解析する場合、これらの単量体は、１３５ｋＤａの種としてＳＥＣカラムから溶出する酵素的活性ＴＮＡＬＰ二量体において非共有結合的に会合する。

（例４）
ヒドロキシアパタイトに対するｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０タンパク質及びウシ腎臓ｓＡＬＰの親和性の比較
また、以下の手順を用いて、ヒドロキシアパタイトに対する精製ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０タンパク質の親和性を、ウシ腎臓（組織非特異性）可溶アルカリホスファターゼ（Ｃａｌｚｙｍｅ）と比較した。ウシ腎臓ＴＮＡＬＰが市販されていたので、それをヒト骨ＴＮＡＬＰの代わりに使用した。まず、１Ｍ ＨＣｌでヒドロキシアパタイトセラミックビーズ（Ｂｉｏｒａｄ）を可溶化し、その溶液を１０Ｎ ＮａＯＨでｐＨ７．４にすることによりミネラルを沈殿させた。１００μＬの１５０ｍＭ ＮａＣｌ（８０ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４）緩衝液において５μｇのタンパク質で７５０μｇのミネラルを含有するミネラル懸濁液のアリコートをインキュベーションすることによって、この再組成ミネラルへの結合を行った。試料を、回転輪上に３０分間２１±２℃で維持した。低速遠心分離によってミネラルを遠沈し、ミネラルペレット及び上清の両方において得られた総酵素活性を測定した。図９は、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０が、ウシ腎臓ＴＮＡＬＰよりも、再組成ヒドロキシアパタイトミネラルに効率的に結合することを明確に示している。更に、アッセイにおいて導入されたほとんどの組換えｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０タンパク質量を、結合画分及び非結合画分の両方において得られた酵素活性を合計することによって得た。このことは、再組成ミネラル相への組換えタンパク質の結合によってその酵素活性が著しく変化しないことを示す。

（例５）
マウスモデル
相同組換え（Ｎａｒｉｓａｗａら、１９９７；Ｆｅｄｄｅら、１９９９）によりＮｅｏカセットをマウスＴＮＡＬＰ遺伝子（Ａｋｐ２）のエクソンＶＩに挿入することによって、Ａｋｐ２^−／−マウスを作製した。この突然変異によってＡｋｐ２遺伝子の機能的不活性化が引き起こされ、これらのノックアウトマウスにおいてｍＲＮＡもＴＮＡＬＰタンパク質も検出され得なかった（Ｎａｒｉｓａｗａら、１９９７）。表現型的に、Ａｋｐ２^−／−マウスは、重症小児性ＨＰＰを模倣する。これらのマウスは、出生時には明らかな低ホスファターゼ血症の表現型を有さず、通常６日目又はその頃に骨格の欠損が発現し、その後悪化する。それらのマウスは、くる病により発育が阻害され、てんかん発作及び無呼吸を発現し、出生後１２〜１６日目の間に死亡することが報告された。ＨＰＰ患者と同様に、Ａｋｐ２^−／−マウスは、ＴＮＡＬＰ活性の全身的不足、ＡＬＰ基質（ＰＰｉ、ＰＬＰ及びＰＥＡ）の内因的蓄積、による低リン血症を特徴とし、くる病又は骨軟化症につながる骨格基質ミネラル化の欠損を患う（Ｆｅｄｄｅら、１９９９）。

どのようにしてアルカリホスファターゼの不足がヒト及びマウスにおける疾患の神経病学的発現を生じさせ得るのかについて理解するためには、ＣＮＳにおけるビタミンＢ６の役割及び代謝について検討する必要がある。ビタミンＢ６は、神経伝達物質（γ−アミノ酪酸（ＧＡＢＡ）、ドーパミン及びセロトニン）の生合成に関与するものを含む少なくとも１１０種の酵素の補因子としての役割を果たす重要な栄養素である。ビタミンＢ６は、３種の遊離型（又はビタマー）、即ち、ピリドキサール（ＰＬ）、ピリドキサミン（ＰＭ）及びピリドキシン（ＰＮ）に見出すことが可能であり、それらの全ては対応する５’−リン酸誘導体（ＰＬＰ、ＰＭＰ及びＰＮＰ）にリン酸化され得る（Ｊａｎｓｏｎｉｕｓ、１９９８）。リン酸基の除去は、ＡＬＰの機能であり、主にＴＮＡＬＰイソ酵素の機能である（Ｗｈｙｔｅ、２００１）。脱リン酸化ビタマーのみが細胞内に輸送され得ることから、低ホスファターゼ血症におけるＴＮＡＬＰ活性の低下により、血漿中ＰＬＰの著しい増加（Ｗｈｙｔｅら、１９８５；Ｗｈｙｔｅ、２００１）と、ＧＡＢＡの脳内濃度の減少につながる末梢組織及び中枢神経系におけるＰＬＰの細胞内の不足とが生じる。また、これらのマウスに認められたてんかん発作は、ＰＬＰの不足によるグルタミン酸脱炭酸酵素機能不全の結果として生じるという仮説が立てられている（Ｗａｙｍｉｒｅら、１９９５）。

ピリドキシンの補充により、Ａｋｐ２^−／−マウスのてんかん発作が抑制されるが、出生後１８〜２２日目まで数日間寿命が延びるだけである（Ｎａｒｉｓａｗａら、２００１）。故に、本研究における全ての動物（種畜、授乳雌、幼獣及び離乳子畜）には、ピリドキシンの濃度を増加（３２５ｐｐｍ）させた、改変された実験室用齧歯類食餌５００１を自由に供した。

ヘテロ接合体の交配によって、Ａｋｐ２^−／−マウス（１２．５％Ｃ５７ＢＬ／６〜８７．５％１２９Ｊハイブリッドバックグラウンド）を維持した。動物（その幼獣を伴う種畜対又は授乳雌）を、自動潅水システムを備えた、換気が行われる固形底のプラスチックケージに収容した。全ての動物には、３２５ｐｐｍのピリドキシンを有する改変された実験室用齧歯類食餌５００１（番号４８０５７、ＴｅｓｔＤｉｅｔ（商標））を自由に供した。食餌中の混入物（例えば、重金属、アフラトキシン、有機リン化合物、塩化炭化水素、ＰＣＢ）の最大許容濃度は、製造業者により保証された。治験薬の毒性に影響を及ぼす既知の混入物は、食餌材料中に存在しなかった。

（例６）
ＷＴマウスに注射されたｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の薬物動態及び組織分布
血液試料の採取
血液試料をヘパリンリチウムチューブ（ＶＷＲ、番号ＣＢＤ３６５９５８）内に採取し、最高で２０分間氷上に置き、その後室温で１０分間、２５００ｇで遠心分離した。少なくとも、１５μＬの血漿を０．５ｍＬチューブ（Ｓａｒｓｔｅｄｔ、番号７２．６９９）内に移し、液体窒素中で凍結し、アッセイするまで−８０℃で保持した。可能な場合、別の５０μＬ以下の血漿を０．５ｍＬチューブ内に移し、６５℃で１０分間不活化し、液体窒素中で凍結し、アッセイするまで−８０℃で保持した。いずれの残留血漿も１５μＬのアリコートにプールし、液体窒素中で凍結し、アッセイするまで−８０℃で保持した。

血漿中ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の決定
血漿試料中のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の存在について、比色酵素アッセイを用いて投与完了時に評価した。吸光度の増加が産物への基質転化率に比例する色素原基質を用いて、酵素活性を決定した。１０μＬの希釈血漿試料を添加した０．５ｍＭ ＭｇＣｌ_２及び５０μＭ ＺｎＣｌ_２を含有する１００μＬの５０ｍＭ ＮａＣｌ緩衝液（２０ｍＭビス−トリスプロパン（ＨＣｌ）ｐＨ９緩衝液）において反応を行った。反応を開始するために、ＡＬＰ基質のｐ−ニトロフェニルを、１ｍＭの終濃度で最後に添加した。Ｓｐｅｃｔｒａｍａｘ（商標）１９０（Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ ｄｅｖｉｃｅｓ）プレートリーダを用いて、２０分間に亘って４５秒毎に４０５ｎｍで吸光度を記録した。隣接する８つの読取値に最も急な勾配を適用することにより、初期反応速度として表したｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０酵素活性を評価した。治験薬の濃度を変化させて標準液を調製し、例１において先に記載したように酵素活性を決定した。標準液の量の対数の関数としての初期速度の対数をプロットすることによって標準曲線を作成した。異なる血漿試料のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０濃度を、それぞれの酵素活性を用いて標準曲線から直接読み取った。

血漿中ＰＰｉの決定
既に記載したように、６−ホスホ［６−^３Ｈ］グルコネートの反応生成物からのＵＤＰ−Ｄ−［６−^３Ｈ］グルコース（Ａｍｅｒｓｈａｍ Ｐｈａｒｍａｃｉａ）の活性炭上の示差吸着を用いて、心臓穿刺から得た血清中のＰＰｉの循環値を測定した（Ｊｏｈｎｓｏｎら、１９９９）。

ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の半減期及び組織分布
成体ＷＴマウスにおいて、マウスに注射したｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の半減期及び組織分布を決定した。図１０は、成体ＷＴマウスへの５ｍｇ／ｋｇの単回ボーラス静脈内注射の後の、その薬物動態及び組織分布をまとめたものである。

最高１μｇ／ｇ骨（湿重量）の骨において［^１２５Ｉ］標識ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０が蓄積した血液において、半減期は３４時間であった。この半減期は、報告された不成功の臨床試験において既に観察されたものと同等である。実験中に放射標識ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の有意な低下は認められなかったので、骨をターゲティングした物質の濃度は非常に安定的であると思われた。筋肉中の放射標識酵素の量が、血液中のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０酵素活性の量と平行して減少したことから、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の蓄積は筋肉中に認められなかった。

新生児マウスにおいて。Ａｋｐ２^−／−マウスが１２〜１６日目の間に死亡し、かかる若いマウスに静脈内注射は適当でないことから、３．７ｍｇ／Ｋｇの投与量を用いて、ＷＴ新生児マウスにおいて腹腔内経路及び皮下経路を用いて、血清中のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の薬物動態解析を繰り返した。注射部位における予測不可能な損失につながる腹腔内の高圧のため、腹腔内経路は適切でないことが分かった（図１１Ａ）。図１１ＢのＰＫ実験に示すように、皮下経路は、新生児マウスにおいて再現性がより大きかった。下記の表２に、新生児マウス及び成体マウスにおけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の薬物動態パラメータを報告する。
表２：新生児ＷＴマウスにおけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の薬物動態パラメータ

これらのＰＫデータを、ＷｉｎＮｏｎｌｉｎ（商標）ソフトウェア（Ｐｈａｒｓｉｇｈｔ Ｃｏｒｐｏｒａｔｉｏｎ、Ｍｏｕｎｔａｉｎ Ｖｉｅｗ、ＣＡ）によって解析し、それを、毎日の反復皮下注射の後に達成されるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の循環血中濃度を予測するために用いた。循環ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０は、それぞれ２６．４及び３６．６μｇ／ｍＬであるＣｍｉｎ値とＣｍａｘ値との間で変動する定常状態の血清中濃度に達した（図１２）。定常状態は、１日用量１０ｍｇ／ｋｇを５〜６回投与した後に達成された。

１日量１０ｍｇ／ｋｇのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の注射を５回行った後、予測妥当性を実験的に試験した。注射日にマウスの遺伝子型を識別することはできなかった。試験されたマウスの中で、どのマウスがヘテロ接合で、どのマウスがホモ接合であったのかは、後で決定した。全ての異なる遺伝子型の行動に差は認められなかった。最後の注射の２４時間後、即ち６日目（Ｃｍｉｎ）に、循環ＡＬＰ活性を測定した際、実験の濃度と予測濃度との間に良好な一致が認められた（図１３）。投与を受けなかったこれらの５日齢の動物において、血清中ＴＮＡＬＰ濃度は、０．５８μｇ／ｍＬであった。これらの濃度は、年齢と共に低下することになる。したがって、注射の投与計画によって、通常のＴＮＡＬＰ濃度よりも約５０倍高いｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の定常状態の血清中濃度への増加が可能になったことが算出された。

（例７）
ボーラス静脈内投与の後の成体ＷＴマウスの骨におけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の濃度
１２９Ｊ成体ＷＴマウスに、投与量５ｍｇ／ｋｇでｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を静脈内投与した。Ｔ＝２５時間での骨におけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０濃度は、以下の通りだった。頭頂骨：０．６４μｇ／ｇ；脛骨：１．３３μｇ／ｇ；及び大腿骨：１．３７μｇ／ｇ、平均濃度：１．１１μｇ／ｇ。ラットにおいて、骨組織は総質量の１６．３％である。この割合もまたマウスにおいて明らかにされることが期待される。この実験に使用するマウスの体重は１８．４ｇだった。したがって、これらのマウスの算出骨組織重量は、約１８．４ｇ×０．１６３＝３．００ｇだった。骨組織のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の算出量は３．３３μｇだった。したがって、骨組織における注射投与量の割合は、（３．３３μｇ／（５μｇ／ｇ^＊１８．４ｇ））^＊１００＝４％だった。

Ｔ＝９６時間での骨のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０濃度は、以下の通りだった。頭頂骨：０．８３μｇ／ｇ；脛骨：１．３３μｇ／ｇ；及び大腿骨：１．６３μｇ／ｇ、平均濃度：１１．２６μｇ／ｇ。この実験に使用するマウスの体重は１７．８ｇだった。したがって、これらのマウスの算出骨組織重量は、約１７．８ｇ×０．１６３＝２．９０ｇだった。したがって、マウス骨組織のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の量は約３．６６μｇだった。したがって、骨組織における注射投与量の割合は、（３．６６μｇ／（５μｇ／ｇ^＊１７．８ｇ））^＊１００＝４％だった。

（例８）
ボーラス皮下注射の１５日後の新生児ＷＴマウスの骨におけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の濃度
１２９Ｊ新生児のＷＴマウスに、投与量４．３ｍｇ／ｋｇでｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を、総投与量６５ｍｇ／ｋｇで１５日間毎日皮下投与した。Ｔ＝２４時間での骨のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０濃度は、以下の通りだった。頭頂骨：６．４５μｇ／ｇ；脛骨：３．０５μｇ／ｇ；及び大腿骨：３．７１μｇ／ｇ、平均濃度：４．４０μｇ／ｇ。この実験に使用するマウスの体重は９．８３ｇだった。したがって、これらのマウスの算出骨組織重量は、約９．８３ｇ×０．１６３＝１．６０ｇだった。したがって、その際のマウス骨組織のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の量は約７．０４μｇだった。したがって、骨組織における注射投与量の割合は、（７．０４μｇ／（６５μｇ／ｇ^＊９．８３ｇ））^＊１００＝１％だった。

Ｔ＝１６８時間での骨のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０濃度は、以下の通りだった。頭頂骨：５．３３μｇ／ｇ；脛骨：１．３７μｇ／ｇ；及び大腿骨：１．８８μｇ／ｇ、平均濃度：２．８６μｇ／ｇ。この実験に使用するマウスの体重は１４．０ｇだった。したがって、これらのマウスの算出骨組織重量は、約１４．０ｇ×０．１６３＝２．２８ｇだった。したがって、その際のマウス骨組織のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の量は約６．５２μｇだった。したがって、骨組織における注射投与量の割合は、（６．５２μｇ／（６５μｇ／ｇ^＊１４ｇ））^＊１００＝０．７％だった。下記の表３に、例７及び８の結果をまとめる。
表３：ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の平均濃度及び骨における注射投与量の割合

^（１）示された時間は、最後の注射からのものである。

（例９）
Ａｋｐ２^−／−マウスにおけるＨＰＰについての低用量（１ｍｇ／ｋｇ）のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の短期（１５日間）の有効性
ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ_１０の皮下注射を、１ｍｇ／ｋｇを用いてＡｋｐ２^−／−マウスにおいて１５日間毎日行った。投与群は、１９匹の同腹仔から構成された。Ａｋｐ２^−／−マウスには、媒体（Ｎ＝１３）又はｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０（Ｎ＝１２）を投与した。対照は、１５匹のＷＴマウス（１匹の同腹仔につき１匹）からなった。対照に対して注射を行わなかった。例６に記載したように、最後の注射の２４時間後に血液を採取した。

図１４は、１６日目の血清中の酵素活性が検出レベルをわずかに超えたに過ぎないことを示している。血清中のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の値は低かったが、血清中ＰＰｉ濃度を補正した（図１５）。未投与のＡｋｐ２^−／−マウスは、血清中ＰＰｉ濃度が１．９０±０．６４μｍｏｌ／ｍＬだったのに対して、投与されたＡｋｐ２^−／−マウスは、濃度が１．４１±０．３０μｍｏｌ／ｍＬであり、ＷＴマウス（１．５２±０．３５μｍｏｌ／ｍＬ）と同等だった。

Ａｋｐ２^−／−動物における近位脛骨の成長板は、ＷＴ動物と比較して肥大領域の若干の拡幅を示した（図１６の野生型との媒体の比較）。Ａｋｐ２^−／−マウスの株において以前になされた同じ観察（Ｈｅｓｓｌｅら、２００２）は、くる病と一致する。ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を１５日間投与した動物では、媒体（未投与）と比較して、骨端軟骨形態の正常化に向かう傾向が認められた（図１７）。

（例１０）
Ａｋｐ２^−／−マウスのＨＰＰについての高用量（８．２ｍｇ／ｋｇ）のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の短期（１５日間）の有効性
成長及び骨ミネラル化に対する、有意により高い用量のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０（８．２ｍｇ／ｋｇ）を用いた毎日１５日間の皮下注射を評価するために、２０匹の同腹仔からのマウス（合計で１４１匹のマウス）を用いた。それらを以下の２群に分けた。１）媒体が投与されたＡｋｐ２^−／−マウス（Ｎ＝１９）；２）ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０が投与されたＡｋｐ２^−／−マウス（Ｎ＝２０）；更に１匹の同腹仔につき１匹のＷＴマウス（投与なし）（Ｎ＝１８）がいた。

体重
Ａｋｐ２^−／−マウスの成長は、ＷＴマウスよりも遅かった。１日目において、媒体動物、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０動物及びＷＴ動物の間に体重の統計学的な差は認められなかった。しかしながら、１日平均体重は、６日目で相違した（図１８）。ＷＴ（４．２±０．６ｇ）及び媒体（３．７±０．７ｇ）の間の差は、６日目に統計学的有意性に達した（ｐ＝０．０２１７）が、媒体（５．９±１．０ｇ）及びｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を投与した場合の値（６．７±１．０ｇ）の間の差は、１１日目に統計学的有意性に達し（ｐ＝０．０４）、逆に投与群のほうがＷＴよりも重かった。１６日目において、投与動物（８．２±１．１ｇ）及びＷＴ（８．４±０．８ｇ）の平均体重に統計学的な差はなかった。ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０が投与された動物の体重は、媒体が投与された動物（６．６±１．４ｇ）よりも統計学的に大きかった（ｐ＝０．０２６）。体重について、ＥＲＴ群とＷＴ群との間に有意差はいずれの時点においても認められなかった。

骨長
この実験の終了時（１６日目）、脛骨の長さは、Ａｋｐ２^−／−マウスにとっての骨格の有益性を示す更なる測定値を提供した。ＥＲＴの脛骨長は、１２．６±０．７ｍｍであり、媒体が投与された動物（１１．７±１．１ｍｍ）より長かった（ｐ＝０．０１３５）（図１９）。また、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０（９．２±０．４ｍｍ）群と媒体（８．６±０．８ｍｍ）群との間で大腿骨長を比較した際においても、統計学的な差が得られた（ｐ＝０．０２６７）。ＷＴマウスと比較してＥＲＴの脛骨長又は大腿骨長に統計学的な差は示されなかった。脛骨及び大腿骨の成長の部分的維持（即ち、約２週齢で明らかに認められる骨成長の減少の部分的防止）は、剖検時に長さを測定することにより観察された（図１９）。

５匹以外の全ての動物において、１６日目での投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスの血漿中のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の濃度は、検出可能であるが非常に多様であることが分かった（図２０）。比較目的のために、正常動物の循環ＴＮＡＬＰ濃度を示す。

骨ミネラル化
足及び胸郭のＦａｘｉｔｒｏｎ（商標）画像のブラインド評価において、Ａｋｐ２^−／−マウスのミネラル化の欠損の重症度を２つの程度に区別した（図２１）。重症に罹患したマウス（重症）には、指の骨（指骨）及び二次骨化中心の欠如が認められた。中等度に罹患した（中程度）マウスには、異常な二次骨化中心があったが、指の骨は全て存在した。ＷＴマウス（健康）は、通常の構築物と共に存在する全ての骨構造を有した。後肢のＸ線画像も同様に、急性骨折又は慢性骨折のエビデンスが存在する場合には異常と、いずれの異常所見もない場合には健康と類別した（図２１）。ＥＲＴは、重症の欠損を有するＡｋｐ２^−／−マウスの数で記録された足のミネラル化の欠損をできる限り小さく抑え、それは、未投与群では５例だったが、ＥＲＴ群では０例だった（図２１の表）。カイ二乗は有意であったが（ｐ≦０．０５）、それは、ＥＲＴが後天性骨欠損の重症度を低下させたことを示している。重症に罹患した小児性ＨＰＰ患者は、多くの場合、呼吸の支持を不可能にする肋骨のミネラル低下及び骨折により死亡するため、胸部も綿密に検討した。また、ＥＲＴは、重症の異形胸郭の発現率を減少させた（図２１の表）。カイ二乗解析は、ｐ≦０．０２５で有意だった。同様に、後肢は、全投与動物で健康であると思われた（図２１の表）。カイ二乗解析は、ｐ≦０．０２５で有意だった。

歯の欠損
１６日齢マウスからの下顎骨を、カコジル酸ナトリウム緩衝アルデヒド溶液中に終夜浸漬固定し、第一大臼歯、根元の切歯及び周囲の歯槽骨を含むセグメントに切断した。試料を、等級分けされたエタノール系で脱水し、アクリル（ＬＲ Ｗｈｉｔｅ）樹脂又はエポキシ（Ｅｐｏｎ８１２）樹脂のいずれかで浸潤し、その後５５℃で２日間組織含有樹脂ブロックの重合を行った。薄切片（１μｍ）は、ダイヤモンドナイフを用いたウルトラミクロトームで切断し、ガラススライドに載置した切片を、１％の硝酸銀を用いてミネラルについて染色し（フォンコッサ染色、黒）、１％トルイジンブルーで対比染色した。比較組織学的解析のために、下顎骨までの（第一大臼歯の最も近心の根と同じレベルでの）前額面切片により、縦に切断された大臼歯と断面化された切歯とを得た。

Ａｋｐ２^−／−マウスからの歯の組織学的検査により、野生型動物と比較して、象牙質組織のミネラル化は不十分であり、歯周靭帯と象牙質との間のセメント質はごくわずかしかないことが示される（図２２、Ａｋｐ２^−／−媒体及びＷＴ−正常の比較）。また、図２２に、象牙質のミネラル化の修復及びセメント質の形成について示す（Ａｋｐ２^−／−投与ｖｓＷＴ−正常）。

（例１１）
Ａｋｐ２^−／−マウスのＨＰＰについての高用量（８．２ｍｇ／ｋｇ）のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の長期（５２日間）の有効性
最終的に、Ａｋｐ２^−／−マウスの長期の生存及び骨ミネラル化を評価するために、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０（８．２ｍｇ／ｋｇ）又は媒体のいずれかを５２日間毎日投与した（皮下注射）。

マウスの生存期間、活動性及び外観
未投与のマウスは、生存期間の中央値が１８．５日間だった（図２３）のに対して、ＥＲＴでは生存期間が非常に増加し、この投与によってもまた、投与を受けたマウスの正常な活動性及び健康な外観は維持された（図２４）。

骨ミネラル化
１６日齢のＡｋｐ２^−／−マウスの足のＸ線写真は、前記疾患の特質である二次的な骨形成の欠損を示した（図２５参照）。これらの欠損は、４６日間又は５３日間のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の１日用量によって、全投与マウスにおいて予防された（図２５）。

ＡＬＰ活性
５３日後に投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスにおいて血漿中ＡＬＰ活性レベルを測定した。図２６は、ほとんどの値が１〜４μｇ／ｍＬのＡＬＰ活性だったことを示している。しかしながら、３匹の動物のＡＬＰ濃度は検出することができなかった。

興味深いことに、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の定常状態の血清中濃度が達成可能なＷＴマウスと異なり、投与を受けたＡｋｐ２^−／−マウスにおいて測定されたＡＬＰの血清中濃度は、ばらつきが大きかった。

（例１２）
Ａｋｐ２^−／−マウスにおけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の異なる投与間隔の長期間の有効性
新生児Ａｋｐ２^−／−マウスに、毎日４．３ｍｇ／ｋｇ（Ｔｘ−１）、３日毎に１５．２ｍｇ／ｋｇ（Ｔｘ−３）又は７日毎に１５．２ｍｇ／ｋｇ（Ｔｘ−７）のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を注射した。投与を４３日間行い、４４日目、即ち最後の注射の２４時間後にマウスを屠殺した。それらのマウスの生存期間及び骨格のミネラル化のあらゆる向上を評価するために、それらのマウスのモニタリングを行った。

マウスの生存期間
投与を受けたマウスの生存期間は、媒体が注射されたマウスと比較して増加した（図２７）。この増加は、統計学的に有意だった（ｐ＜０．０００１）。投与群の生存曲線をそれら自身の間で比較した際、統計学的な有意差はなかった。

骨ミネラル化
Ａ）各投与について、足のＸ線写真を解析し、正常と異常とに区分した。下記の表４に、数及び割合（括弧内）を示す。２３日目及び試験終了時（２３〜４５日目）に骨ミネラル化の欠損について評価した。
表４：足のＸ線写真の区分

Ｂ）

試験の中間において、３日毎に１５．２ｍｇ／ｋｇで投与したｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０によって、７９％のマウスにおいて骨ミネラル化の欠損が正常化した。この正常化の率は、７日毎に１５．２ｍｇ／ｋｇを投与したマウスで評価した正規化の率５０％と比較した場合、統計学的有意性に近かった（カイ二乗；ｐ＝０．０５９６）。他のいかなる相互投与比較も、統計学的に有意でなかったか、若しくは有意性に近くなかった。

試験終了時、正常化のパーセントは、２３日目に評価した正常化のパーセントと比較して、全ての投与群において改善した。全てのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０投与の中の分布を比較するカイ二乗検定は、有意でなかった（ｐ＝０．１８４４）。３日毎に投与されたマウスで認められた正常化の１００％の率は、毎日投与されたマウス（８３％、ｐ＝０．０６３４）又は７日毎に投与されたマウス（８５％、ｐ＝０．０７８９）における率と比較した場合、統計学的有意性に近かった。

しかしながら、全投与群において、２３日目で異常と分類された動物の有意な比率は改善し、試験終了時には正常になった。毎日投与群において６匹の動物のうちの３匹が正常化し；３日毎に投与されたマウスにおいて４匹のうちの４匹が改善し、最後に、毎週投与群において１０匹のうちの７匹が正常になった。投与間隔を置くことによって満足な結果が提供されるが、最良の結果は、毎日投与した量が最も高かった場合に得られた。

（例１３）
１５日齢のＡｋｐ２^−／−マウスの高用量（８．２ｍｇ／ｋｇ）のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の長期間の有効性
１５日齢のマウスにおいて、例１１に記載された通りの有効性の試験を行ったが、それは、足のＸ線写真で観察した場合の骨格の欠損を明示するために開始したものであった（例１１、図２５参照）。試験終了時までｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を投与した。生存期間、体重及び骨格のミネラル化についてのあらゆる改善を評価するために、動物のモニタリングを行った。

マウスの生存期間
１５日目で開始した８．２ｍｇ／ｋｇのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０のＡｋｐ２^−／−マウスへの毎日の注射により、媒体が注射されたマウスと比較して、生存期間は増加した（図２８）。この増加は、統計学的に有意だった（ｐ＜０．０５）。

体重
試験開始時、体重の有意差は群間に認められなかった（図２９）。投与の初めは（１５日目）、Ａｋｐ２^−／−マウスの体重は野生型動物よりも小さかった。媒体が注射された動物の体重は減少し続けたが、一方で、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０が投与されたＡｋｐ２^−／−マウスは、投与開始の４〜５日後に体重の増加が始まり、試験終了時まで体重の増加が続いたが、野生型動物の値には達しなかった。この体重増加は、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０が投与された動物の健康の改善を示唆している。

骨ミネラル化
各投与について、足のＸ線写真を解析し、正常と異常とに区別した。表５に、数及び割合（括弧内）を示す。剖検時にＸ線写真を撮影した。

剖検時に撮影された足のＸ線写真から認められるように、出生後１５日目に開始したＡｋｐ２^−／−マウスへの毎日８．２ｍｇ／ｋｇのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の投与によって、ミネラル化は改善した。正常動物は、Ａｋｐ２^−／−マウスの媒体注射群において１２％であったのと比較して、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０投与群において４１％であった。この差は、ほとんど統計学的有意性（カイ二乗検定におけるｐ＝０．０６４５）に達した。
表５：足のＸ線写真の分布

（例１４）
Ａｋｐ２^−／−マウスの救出に対するｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の異なる投与間隔の長期の有効性
マウスに、１２日目において投与を開始し、８．２ｍｇ／Ｋｇの媒体（ＲＶ）を毎日４６／４７日目まで皮下注入（ＲＴｘ−１）した後、又は、８．２．ｍｇ／Ｋｇを毎日７日間注入した後、３日毎に２４．６ｍｇ／Ｋｇ（ＲＴｘ−３）又は７日毎に５７．４ｍｇ／Ｋｇ（ＲＴｘ−７）を注射した。生存期間の中央値は、ＲＶマウスについては１９．５日間、ＲＴｘ−７マウスについては２１．０日間、ＲＴｘ−３マウスについては３０．５日間、及びＲＴｘ−１マウスについては３７．５日間であった。全例において、媒体投与群と比較した場合、生存期間は統計学的に増加した。既知の低ホスファターゼ血症のＡｋｐ２^−／−マウスにおいて、ＥＲＴの明確な有益性が認められる。毎日よりも少ない投与によっても、生存期間を統計学的に増加させると思われる。

（例１５）
幼若Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットにおける最大耐量の静脈内注射の毒性試験
本試験の目的は、治験薬（ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０）の最大耐量（ＭＴＤ）及び毒性を決定した後、静脈内注射によって幼若Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットに反復投与を行うことであった。例１５〜１８において、使用するｓＡＬＰ−ＦｃＤ１０は、図３に具体的に記載されているものである。

下記の表６に記載されるように、静脈内注射によって４週間、１週間に１回、幼若Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラット（開始時に２２日齢〜２４日齢）にｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０を投与した。
表６：試験デザイン

試験の全体に亘って、死亡率、体重及び臨床状態について動物のモニタリングを行った。全ての動物において、血液学的検査、凝固系検査及び臨床化学検査の評価を行った。定期に、ラットを安楽死させ、剖検を行った。各動物について、選択された組織の試料を保持し、組織学的処理を行い、顕微鏡検査を行った。

本試験において死亡は認められず、治験薬に関連する凝固系パラメータ又は器官重量の変化は認められなかった。特に、高用量の雄の体重が低用量の場合よりも約１０％下回ったが、このことは、投与に関連する効果を示唆している。

１回目の投与の際、群１及び２の動物に臨床徴候は認められなかった。しかしながら、群３及び４の動物において、動物は投与後直ちに弱くなったように見え、群４の一部の動物は、軽度から中等度の活動性の低下を示した。また、その２つの群では、四肢の皮膚変色（赤色又は青色の外観）を伴う肢、耳介及び鼻口部の軽度な腫脹も認められた。群４の動物において認められた他の臨床徴候としては、過度の引掻き行動、立毛及び過呼吸が挙げられた。

２回目の投与の際（８日目）の群１及び２の動物について記録された臨床徴候は、四肢の皮膚変色（赤色又は青色の外観）を伴う肢、耳介及び鼻口部の腫脹だった。また、同じ群の動物については、３回目及び４回目の投与の際（１５及び２２日目）についても同様の皮膚腫脹の臨床徴候が記録された。４回目の投与の際（２２日目）、群１の雌に軽度の活動亢進が認められたのに対して、群２の雄に活動低下が認められた。群３及び４の動物については、１回目の投与の場合から４回目にかけて投与が進行するにつれて、運動活動性の低下、立毛、過呼吸、並びに皮膚着色を伴う肢、耳介及び鼻口部の腫脹の臨床徴候がよりはっきりと認められるようになった。これらの臨床徴候は、投与に関連するものであったと考えられる。１６〜１９日目及び２３日目において、軽度の腫脹及び耳介の皮膚着色（赤色の外観）が１匹の動物（群１）に認められた。同様の臨床徴候は、２３日目において別の動物（群２）に認められた。

前記臨床徴候は急性であり、投与が進行するにつれて重症度は大きくなったが、それらは一過性だった。全ての臨床徴候は、治験薬（ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０）の投与後５０分以内に出現し、一部の動物は約３０分間〜２時間以内に回復した。他の動物については、翌朝（次の予定の観察時）において完全に回復した。

バックグラウンド値と比較して、最後の投与量の後に測定された血小板数（ＰＬＴ）の投与に関連する低下が、全ての投与群からの雄及び雌について認められた。３つの最高の投与レベルが投与された動物においては、主にその割合だけでなく、網状赤血球の絶対数の増加も一般に認められた。

血清中のアルカリホスファターゼの濃度は、希釈後であっても、分析機器によって定量され得たものよりも高かった。低用量の雌について得ることができた結果は、バックグラウンドの範囲よりも非常に高かった。これは、治験薬が活性修飾ＡＬＰであることから期待されたものである。

群３の６匹の動物のうちの３匹（２匹の雄／１匹の雌）及び群４の６匹の動物のうちの４匹（２匹の雄／２匹の雌）に、腺胃の暗色の病巣／領域及び／又はへこみが肉眼で認められた。

全体の結果の相関を取ると、群３の６匹の動物のうちの３匹（２匹の雄／１匹の雌）及び群４の６匹の動物のうちの４匹（２匹の雄／２匹の雌）に、粘膜下浮腫に関連する場合がある軽微〜軽度の腺胃のびらん／潰瘍が顕微鏡によって認められた。

結論として、幼若Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットへの１週間に１回のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の４週間の静脈内注射は、試験された投与レベルのいずれにおいても死亡は引き起こさなかったが、有害な臨床徴候、軽度の血液学的検査値の変化、並びに９０及び１８０ｍｇ／ｋｇの投与レベルで粘膜下浮腫に関連する場合がある腺胃のびらん／潰瘍形成を引き起こした。

試験された２つの最低の投与レベル（１０及び３０ｍｇ／ｋｇ）での治験薬の投与に関連した変化は、投与日に明らかに認められた一過性の臨床徴候のみに限定された。臨床徴候は、９０ｍｇ／ｋｇの投与レベルでより重症だったが、それらも一過性だった。１８０ｍｇ／ｋｇが投与された動物に認められた臨床徴候はあまりに重症だったので、今後の試験におけるこの投与レベルの使用は阻止される。したがって、次のより長期の試験の最も高い推奨投与レベルは９０ｍｇ／ｋｇである。

（例１６）
幼若カニクイザルにおける静脈内注射及び注入の最大耐量の毒性試験
この試験の目的は、幼若カニクイザルへの静脈内注射又は注入により１回投与する際のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の最大耐量を決定することだった。下記の表７に示すように、治験薬の投与製剤を、漸増的に１回投与した。
表７：試験デザイン
^＊主要試験の動物にのみ４６日目に投与を行った。

最後の投与後、試験から動物を解放した。試験中にモニタリングを行ったパラメータは、死亡、臨床観察、体重、食欲、毒物動態、血液学的検査値及び臨床化学検査値だった。

死亡、有害な臨床徴候又は体重に対する影響は、試験中に認められなかった。

投与量に比例したアルカリホスファターゼの著しい増加が、試験全体に亘って全ての動物に認められた。治験薬が合成アルカリホスファターゼだったことから、この増加は、主に各投与後の動物の血流中の薬剤の存在によるものだった。

試験中にアラニンアミノトランスフェラーゼ及びアスパラギン酸アミノトランスフェラーゼの増加が３匹の動物に認められたが、剖検を行わなかったので、この所見の毒物学的な意義は不明である。

ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の薬物動態についての特性を、サルへの５、１５、４５、９０及び１８０ｍｇ／ｋｇの単回静脈内投与後に十分に評価した。静脈内注射については、平均ＡＵＣ∞値は、７９７〜２９５０ｍｇ・ｈ／Ｌの範囲であり、平均Ｃｍａｘ値は、６５〜３９６ｍｇ／Ｌの範囲であり、試験された投与範囲を超えていた。注入については、平均ＡＵＣ∞値は、９４１０〜４８４００ｍｇ・ｈ／Ｌの範囲であり、Ｃｍａｘ値は、１２３０〜７７２０ｍｇ／Ｌの範囲であり、試験された投与範囲を超えていた。

ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の平均ｔ１／２値は、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の投与レベルの増加と共に減少すると思われた。ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の全身クリアランスは投与レベルに亘って相対的に一貫していたが、９０ｍｇ／ｋｇ投与群は、他の投与レベルと比較した際に実質的により低いクリアランスを有し（約５倍）、薬物動態学的に異常値であると思われた。性別に関連する明らかな傾向は認められなかった。

要約すると、回復的な血液化学的検査値の変化が試験中にいくつか認められたが、最高で１８０ｍｇ／ｋｇのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の静脈内注射／注入の忍容性は、幼若カニクイザルにおいて良好だった。故に、この試験の条件下で、最大耐量は少なくとも１８０ｍｇ／ｋｇであると考えられた。

（例１７）
２８日間の回復期間を伴う、幼若アルビノラットにおけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の４週間（１週間に１回）の静脈内注射の毒性試験
この試験の目的は、２８日間の回復を伴う、少なくとも４週間連続で幼若ラットに静脈内注射することによって１週間に１回投与（合計４回の投与）されたｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の潜在的毒性を調査することだった。動物には、試験１、８、１５及び２２日目に投与を行い、回復期間は試験２９日目から開始した。下記の表８に試験デザインを詳述する。
表８：試験デザイン

以下の評価を行った。臨床徴候（１日２回）、体重（順化期間中に１回、産後２１日目から毎週）、摂食量（毎週）、眼科学的検査（投与終了時及び回復期間終了時）、血液学的検査（剖検時）、血清化学的検査（剖検時）、尿検査（２９日目及び回復期間終了時）、骨代謝の生化学的マーカー：オステオカルシン（骨形成マーカー）及びＣ−テロペプチド（骨吸収マーカー）（計画された剖検の前の朝）、抗体評価（１日目及び剖検時）、治験薬血中濃度評価（１６日目及び２３日目）、骨密度計測（ＤＸＡ、インビボで１日目の２８匹の主要試験及び回復試験動物並びに１４日目の５６匹の回復試験動物、エクスビボでｐＱＣＴによる）、剖検時のＸ線撮影及び肉眼での観察、器官重量、及び組織検査。

９０ｍｇ／ｋｇ／回が投与された１匹の雄が試験２５日目に死亡しているのが発見された。このラットについて重要な組織学的観察はなされていなかったため（それぞれ軽度及び軽微と類別された肺出血及び胸腺出血）、その死因についての病理学的調査に基づく決定はなされなかった。治験薬血中濃度評価のためにこの動物の採血を２３日目に行ったが、２２日目においては毒性についての証拠はなかったことから、この手順がその死亡に寄与した可能性があった。ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０に関連する死亡或いは眼科学的検査、尿検査、骨形成マーカー（オステオカルシン）、器官重量、総体的病状、Ｘ線検査又は顕微鏡検査に対する影響はなかった。

３、３０及び／又は９０ｍｇ／ｋｇ／回の群で認められたｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０関連の臨床徴候は、急性の注入反応であると考えられる。それらとしては、投与の５、１５、３０及び／又は６０分後でのケージの横での観察中における、部分的閉眼、筋緊張の低下、横臥、猫背姿勢、触診時の冷え、非協調運動、活動性の低下、異常歩行、及び／又は青色、赤色及び／又は後肢及び／又は前肢の硬い腫脹が挙げられた。これらの観察は、一過性のものであって、非投与日又は回復期間中には認められなかった。

一般に、軽度の体重減少及び体重増加の傾向は、回復期間中の３、３０及び／又は９０ｍｇ／ｋｇ／回の群の雄について認められた。付属肢骨格の２種の骨（大腿骨及び脛骨）の骨の大きさに対する影響は、体重減少と相関していた。一般に、摂食量の減少は、体重減少と一致していた。体重は、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０が投与された雌についての対照と同等だった。

一般に、９０ｍｇ／ｋｇ／回で投与したｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０は、対照群と比較した絶対好中球数、単球数及び／又は好酸球数の軽度減少に関連していた。更に、対照群と比較して、リンパ球数、血小板数及び絶対網状赤血球数の軽度上昇が認められた。回復期間終了時、これらの軽度の変化は、９０ｍｇ／ｋｇが投与された動物において依然として認められた。

一般に、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０は、対照と比較して、全ての投与群においてアルカリホスファターゼの統計学的に有意の用量関連増加との関連があった。治験薬（アルカリホスファターゼ）の性質（他の肝酵素のいかなる変化もなく、組織病理学的相関がないこと）を考慮すると、これらの増加は、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の循環値によるものである可能性がある。リンの軽度の統計学的に有意な増加が、４週目の間に９０ｍｇ／ｋｇ／回でｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０が投与された雄において認められたが、これは、血清中総カルシウムの有意でない増加と関連があった。回復終了時、これらの変化は、統計学的に有意なものを含めて、対照の値に戻った。

４週間連続で最高９０ｍｇ／ｋｇ／回で１週間に１回静脈内投与された幼若ラットにおいてｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０に関連した器官重量、Ｘ線、肉眼又は顕微鏡による変化はなかった。投与完了後、２８日間の回復を与えられたこれらの動物のサブセットにおいて同定される遅発性効果はなかった。

対照よりも軽度に低い平均ＣＴｘ値が、投与を受けた雌について認められた（９０ｍｇ／ｋｇ／回で統計学的有意性を達成）。これらのより低い値は、骨密度解析と一致しておらず、雄について得られた結果とも一致していなかったため、これらの低下について、偶発的性質を除外することはできない。

群間に認められた骨密度計測及び骨形状パラメータの大きなばらつきは、急激な成長相によるものであった。回復終了時、面積及びＢＭＣ（ＤＸＡ及びｐＱＣＴによって評価される）は、投与を受けた雄で一般により低かったが、このことは、これらの動物の骨がより小さいことを示唆している。骨の大きさに及ぼす影響は、２つの異なる手法によって付属肢骨格の２種の骨（大腿骨及び脛骨）において認められたが、一貫した影響は、中軸骨格については認められなかった（頭殿長に影響しないことを示唆している）。面積及びＢＭＣが減少したにもかかわらず、平均ＢＭＤ値は一般に対照と同等だったが、このことは、ＢＭＣ及び面積に及ぼす影響は、成長に及ぼす影響の次に大きいものであったことを示唆している。投与を受けた雄について、対照よりも体重が減少し、摂食量が減少したことは、これらのデータと一致している。しかしながら、回復時の小さな群の大きさ、性別に関する一貫性の欠如、並びにばらつきによって、これらの結果が複雑になったため、これらの減少について、偶発的性質を完全に除外することはできない。

結論として、２８日間の回復を伴う、幼若ラットへの３、３０及び９０ｍｇ／ｋｇ／回の投与量による少なくとも４週間連続での１週間に１回の静脈内注射によって、投与後最高６０分間に認められた非協調活動性及び活動性の低下並びに足腫脹を含む一過性の注射関連の影響に関連した臨床徴候が生じた。９０ｍｇ／ｋｇ／回で投与を受けた雄は、体重及び摂食量の軽度の減少を示したが、それらは、密度計測法によって評価した脛骨及び大腿骨が軽度により小さいことと相関していた。雌については、対照よりも軽度に低いＣ−テロペプチド濃度の平均値が得られた。血清中リン濃度は、軽度に、但し有意に、９０ｍｇ／ｋｇ／回の群において増加した。血清中アルカリ性ホスファターゼ濃度の上昇は、ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の循環値によるものである可能性があった。ｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０は、投与期間中又は回復期間中、雌についての骨密度計測及び骨形状に対して有意味な影響も一貫性のある影響も及ぼさなかった。投与期間中、雄について、骨密度計測又は骨形状に対する生物学的に有意な影響は認められなかった。一般に、対照に対して、平均体重の低下に対応する骨密度計測（骨ミネラル含量及び／又はＤＸＡ及びｐＱＣＴによって評価される面積）及び骨形状パラメータの軽度の減少が、回復期間終了時に雄について認められた。全ての所見は、高用量の雄について継続した体重及び骨の大きさに対する効果を除いて、２８日間の投与を行わない期間の後に回復した。投与終了時又は回復期間終了時に異所性石灰化のエビデンスはなかった。あらゆる投与レベルでのｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の投与に関連した、Ｘ線、肉眼又は顕微鏡による所見並びに器官重量の変化はなかった。注射反応は、一過性のものであり、３及び３０ｍｇ／ｋｇ／回の群において毒性を評価するために用いられたいかなるパラメータに対するいかなる影響も生じさせなかったため、それは有害であるとは考えられなかった。９０ｍｇ／ｋｇ／回の群において、この反応は、より重症であり、体重増加の低下、摂食量の減少、及び場合によっては骨成長の低下を伴ったため、この群における影響は有害であると考えられた。したがって、無毒性量（ＮＯＡＥＬ）は、この試験において３０ｍｇ／ｋｇ／回であると考えられた。

（例１８）
２８日間の回復期間を伴う、幼若カニクイザルにおける４週間の静脈内注射の毒性試験
この試験の目的は、４週間の緩やかなボーラス静脈内注射によって１週間に１回投与した際の幼若カニクイザルにおけるｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の毒性及び毒物動態を決定すること、及び２８日間の回復期間後のあらゆる変化の回復能を評価することだった。

下記の表９に示すように、２８日間の回復期間を伴う、１週間に１回、４週間、緩やかな静脈内ボーラス注射によって幼若カニクイザルに対照及び治験薬投与製剤を投与した。
表９：試験デザイン

^＊群１の動物に、媒体／対照薬（２５ｍＭリン酸ナトリウムｐＨ７．４（１５０ｍＭ ＮａＣｌ））を投与した。

最後の投与（２２日目）の後、主要試験の動物を２９日目に安楽死させたが、一方で残りの回復試験の動物を更に２８日間観察し、その後５７日目に安楽死させた。主要試験及び回復試験の全ての動物の剖検検査を行った。

試験中又はその終結時に行った評価としては、死亡、臨床状態、体重、食欲、身体測定値、骨発育のＸ線撮影評価、眼科学的検査、心電図検査、毒物動態、免疫原性、血液学的検査、凝固系検査、臨床化学検査、尿検査、骨代謝のバイオマーカー、器官重量、エクスビボでの骨ミネラル密度解析、総体及び組織検査が挙げられた。

試験中に、死亡も、投与に関連する有害な臨床観察も認められなかった。

投与終了時及び回復期間終了時に記録された身体測定値に基づいて、頭蓋外周或いは上腕骨、前腕、脛骨又は骨盤肢の長さに顕著な群間差はなかった。

いずれの投与レベルにおいても、治験薬の投与に関連した体重の変化も摂食量の変化もなかった。いずれの投与レベルにおいても、治験薬に関連した眼科的所見又は心電図グラフ的所見はなかった。いずれの投与レベルにおいても、治験薬の投与に関連した血液学的検査、赤血球形態検査、凝固系検査又は尿検査の変化はなかった。投与期間中又は回復期間中、臨床生化学パラメータにおいて毒性学的に有意な変化はなかった。アルカリホスファターゼの軽度〜顕著な用量関連増加が、投与期間全体に亘るほとんどの評価の場合において、全ての治験薬投与動物において認められた。一般に、アルカリホスファターゼ濃度は、回復期間の終了までに対照値とほとんど同等になった。治験薬が合成アルカリホスファターゼであることから、この増加は、主に各投与後の動物の血流中の薬剤の存在によるものであり、したがってこれらの増加は有害でないと考えられた。

投与期間及び回復期間の終了時、絶対的又は相対的な器官重量に顕著な群間差は認められず、肉眼による又は顕微鏡による治験薬関連の所見もなかった。認められた組織学的変化は、偶発的所見、この種の共通のバックグラウンドの所見、又は実験的な操作のなんらかの側面に関連する所見のいずれかであると考えられた。生殖器官は、一般に未成熟であったが、この年齢のサルについて正常であると考えられた。

結論として、４週間の回復期間を伴う、０、５、１５及び４５ｍｇ／ｋｇの投与レベルでの雄及び雌のカニクイザルへの４週間のｓＴＮＡＬＰ−ＦｃＤ１０の毎週の静脈内注射は、いずれの投与レベルでも毒性の証拠はなかった。故に、高投与レベル（４５ｍｇ／ｋｇ）は、この試験において無毒性量（ＮＯＡＥＬ）であると考えられた。

（例１９）
ヒトについての最大推奨初回用量の決定
無毒性量（ＮＯＡＥＬ、Ｇｕｉｄａｎｃｅ ｆｏｒ Ｉｎｄｕｓｔｒｙ ａｎｄ Ｒｅｖｉｅｗｅｒｓ、２００２年１２月を参照すること）を確立することによって、ヒトについての最大推奨初回用量（ＭＲＳＤ）を算出する。皮下に毎日１ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ及び８．２ｍｇ／ｋｇ；３ｍｇ／ｋｇ、５ｍｇ／ｋｇ、１０ｍｇ／ｋｇ、３０ｍｇ／ｋｇ、４５ｍｇ／ｋｇ、９０ｍｇ／ｋｇ及び１８０ｍｇ／ｋｇを含む上記の製剤の各種濃度を、マウス、ラット及びサルで試験した。最も感受性が高い種（即ちラット）のＮＯＡＥＬは、３０ｍｇ／ｋｇだった。

ラットからヒトへの変換係数６を提供する公表された変換表を使用して、この用量をヒト等価用量（ＨＥＤ）に拡大した。その種についての３０ｍｇ／ｋｇのＮＯＡＥＬは、ヒトについての５ｍｇ／ｋｇと同等である。

この値（５ｍｇ／ｋｇ）を安全係数１０で割った。したがって、算出されたＭＲＳＤは０．５ｍｇ／ｋｇである。したがって、６０ｋｇの平均的な体重のヒトについては、１週間に３０ｍｇの用量、又は毎日４．２８ｍｇの１日用量を、臨床試験を開始するために注射することが可能であった。

本発明は、その特定の実施形態によって以上に記載されたが、本発明は、添付の特許請求の範囲に定義されている主題発明の精神及び本質から逸脱することなく改変することができる。

（参考文献）

Claims (52)

1. 構造：
   Ｚ−ｓＡＬＰ−Ｙ−スペーサー−Ｘ−Ｗｎ−Ｖ
   を有するポリペプチドを含む骨標的アルカリホスファターゼ
   ［配列中、ｓＡＬＰはアルカリホスファターゼの細胞外ドメインであり、
   Ｖは不在である又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
   Ｘは不在である又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
   Ｙは不在である又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
   Ｚは不在である又は少なくとも１つのアミノ酸のアミノ酸配列であり、
   Ｗｎはｎ＝１０〜１６のポリアスパラギン酸又はポリグルタミン酸であり、及び、
   スペーサーはフラグメント結晶化可能領域（Ｆｃ）を含む］であって、ｓＡＬＰは生理学的に活性である、上記アルカリホスファターゼ。
2. 前記ｓＡＬＰは組織非特異的アルカリホスファターゼ（ＴＮＡＬＰ）の細胞外ドメインである、請求項１に記載のアルカリホスファターゼ。
3. ａ）前記ＴＮＡＬＰは配列番号２１、２２、２３、２４、２５、又は２６に記載の配列を有するヒトＴＮＡＬＰであるか；
   ｂ）前記ＴＮＡＬＰは配列番号２７に記載の配列を有するアカゲザルＴＮＡＬＰであるか；
   ｃ）前記ＴＮＡＬＰは配列番号２８に記載の配列を有するラットＴＮＡＬＰであるか；
   ｄ）前記ＴＮＡＬＰは配列番号２９に記載の配列を有するイヌＴＮＡＬＰであるか；
   ｅ）前記ＴＮＡＬＰは配列番号３０に記載の配列を有するブタＴＮＡＬＰであるか；
   ｆ）前記ＴＮＡＬＰは配列番号３１に記載の配列を有するマウスＴＮＡＬＰであるか；
   ｇ）前記ＴＮＡＬＰは配列番号３２、３３又は３４に記載の配列を有するウシＴＮＡＬＰであるか；又は、
   ｈ）前記ＴＮＡＬＰは配列番号３５に記載の配列を有するネコＴＮＡＬＰである；
   請求項２に記載のアルカリホスファターゼ。
4. ａ）ｓＡＬＰが配列番号１５のアミノ酸残基２３〜５０８を含むか、若しくは、
   ｓＡＬＰが配列番号１５のアミノ酸残基２３〜５１２からなるか、又は、
   ｂ）ｓＡＬＰが配列番号１８のアミノ酸残基２３〜５０８を含むか、若しくは、
   ｓＡＬＰが配列番号１８のアミノ酸残基２３〜５１２からなるか、又は、
   ｃ）ｓＡＬＰが配列番号１６のアミノ酸残基１８〜４９８を含むか、若しくは、ｓＡＬＰが配列番号１６のアミノ酸残基１８〜５０２からなるか、又は、
   ｄ）ｓＡＬＰが配列番号１９のアミノ酸残基１８〜４９８を含むか、若しくは、ｓＡＬＰが配列番号１９のアミノ酸残基１８〜５０２からなるか、又は、
   ｅ）ｓＡＬＰが配列番号８のアミノ酸残基１８〜４９８を含むか、若しくは、
   ｓＡＬＰが配列番号８のアミノ酸残基１８〜５０２からなる、請求項１に記載のアルカリホスファターゼ。
5. 前記ｓＡＬＰは配列番号８のアミノ酸残基１８〜５０２からなる、請求項４に記載のアルカリホスファターゼ。
6. ａ）前記アルカリホスファターゼは胎盤アルカリホスファターゼ（ＰＡＬ）由来のものであるか、若しくは、配列番号３６又は３７に記載の配列を有する胎盤アルカリホスファターゼ由来のものであるか；
   ｂ）前記アルカリホスファターゼは生殖細胞アルカリホスファターゼ（ＧＣＡＬ）由来のものであるか、若しくは、配列番号３８に記載の配列を有する生殖細胞アルカリホスファターゼ由来のものであるか；又は、
   ｃ）前記アルカリホスファターゼは腸アルカリホスファターゼ（ＩＡＬＰ）由来のものであるか、若しくは、配列番号３９に記載の配列を有する腸アルカリホスファターゼ由来のものである；
   請求項１に記載のアルカリホスファターゼ。
7. Ｗｎがポリアスパラギン酸であるか、又は、ここで、ｎ＝１０である、請求項１から６までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼ。
8. Ｚが不在である、及び／又は、Ｖが不在である、請求項１から７までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼ。
9. Ｙが２つのアミノ酸残基である、請求項１から８までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼ。
10. Ｙがロイシン−リシンである、請求項９に記載のアルカリホスファターゼ。
11. Ｘが２つのアミノ酸残基である、請求項１から１０までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼ。
12. Ｘがアスパラギン酸−イソロイシンである、請求項１１に記載のアルカリホスファターゼ。
13. ａ）ｓＡＬＰが配列番号８のアミノ酸残基１８〜５０２からなり、
    ｂ）Ｗｎがポリアスパラギン酸であって、ｎ＝１０であり、
    ｃ）Ｚ及びＶが不在であり、
    ｄ）Ｙがロイシン−リシンであり、及び、
    ｅ）Ｘがアスパラギン酸−イソロイシンである、請求項１に記載のアルカリホスファターゼ。
14. ＦｃがＣＨ２ドメイン、ＣＨ３ドメイン及びヒンジ領域を含むか、又は、Ｆｃが、ＩｇＧ−１、ＩｇＧ−２、ＩｇＧ−３及びＩｇＧ−４からなる群から選択される免疫グロブリンの定常ドメインである、請求項１から１３までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼ。
15. Ｆｃが免疫グロブリンＩｇＧ−１の定常ドメインである、請求項１４に記載のアルカリホスファターゼ。
16. Ｆｃが配列番号３に記載の通りである、請求項１５に記載のアルカリホスファターゼ。
17. 前記ポリペプチドが配列番号４に記載の通りである、請求項１に記載のアルカリホスファターゼ。
18. 前記ポリペプチドを二量体又は四量体を含む形で含む、請求項１から１７までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼであって、ここで、該二量体は２つのジスルフィド架橋により結合しているか結合していないものである、上記アルカリホスファターゼ。
19. 前記アルカリホスファターゼが前記ポリペプチドからなり、Ｚ及びＶが不在である、請求項１から１８までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼ。
20. 前記アルカリホスファターゼがグリコシル化されたものである、請求項１から１９までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼ。
21. 前記ｓＡＬＰがホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）、無機ピロリン酸（ＰＰｉ）及びピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）に対して生理学的に活性である、請求項１から２０までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼ。
22. 請求項１から２１までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼと薬学的に許容可能な担体を含む、医薬組成物。
23. 薬学的に許容可能な担体が生理食塩水である、請求項２２に記載の医薬組成物。
24. 前記薬学的に許容可能な担体が塩化ナトリウム及び／又はリン酸ナトリウムを含むか、又は、組成物が１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４を含む、請求項２３に記載の医薬組成物。
25. 前記アルカリホスファターゼが凍結乾燥された形の、請求項２２から２４までのいずれか一項に記載の医薬組成物。
26. 医薬として使用するための、請求項１から２２までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼ。
27. ０．２〜２０ｍｇ／ｋｇの１日投与量であるか、又は、１．４〜１４０ｍｇ／ｋｇの１週投与量である、請求項２６に記載のアルカリホスファターゼ。
28. 請求項１から２１までのいずれか一項に定義のポリペプチドをコードする配列を含むか、又は、からなる、単離された核酸分子。
29. 請求項２８に記載の核酸分子を含む、組換え発現ベクター。
30. 請求項２８に記載の核酸分子を含む、組換えアデノ随伴ウイルスベクター。
31. 請求項２９又は３０に記載のベクターで形質転換された又はトランスフェクトされた、単離された組換え宿主細胞。
32. 請求項１から２１までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼを作製する方法であって、アルカリホスファターゼの発現をもたらすのに適した条件下で、請求項３１に記載の宿主細胞を培養すること、及び培地からアルカリホスファターゼを回収することを含む、上記方法。
33. 宿主細胞が、Ｌ細胞、Ｃ１２７細胞、３Ｔ３細胞、ＢＨＫ細胞、ＣＯＳ−７細胞又はチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３２に記載の方法。
34. 宿主細胞がチャイニーズハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞である、請求項３３に記載の方法。
35. 宿主細胞がＣＨＯ−ＤＧ４４細胞である、請求項３４に記載の方法。
36. 請求項１から２１までのいずれか一項に定義のアルカリホスファターゼ又は請求項２２から２５までのいずれか一項に記載の医薬組成物、及び低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）表現型を改善又は予防する方法における該アルカリホスファターゼ又は該組成物の使用のための使用説明書を含む、キット。
37. それを必要とする対象における少なくとも1つの低ホスファターゼ血症（ＨＰＰ）表現型を改善又は予防するための方法の使用のための、請求項１から２１までのいずれか一項に記載のアルカリホスファターゼ。
38. 対象が少なくとも１つのＨＰＰ表現型を有する、請求項３７に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
39. 前記少なくとも１つのＨＰＰ表現型が、
    ｉ）ＨＰＰ関連発作、
    ｉｉ）乳歯の早期喪失、
    ｉｉｉ）不完全な骨ミネラル化、
    ｉｖ）無機ピロリン酸（ＰＰｉ）の血液及び／又は尿レベルの上昇、
    ｖ）ホスホエタノールアミン（ＰＥＡ）の血液及び／又は尿レベルの上昇、
    ｖｉ）ピリドキサール５’−リン酸（ＰＬＰ）の血液及び／又は尿レベルの上昇、
    ｖｉｉ）不十分な体重増加、
    ｖｉｉｉ）くる病、
    ｉｘ）骨痛、
    ｘ）ピロリン酸カルシウム二水和物結晶沈着、又は、
    ｘｉ）歯セメント質の形成不全、発育不全若しくは異形成、又は
    ｘｉｉ）骨軟化症
    を含む、請求項３７又は３８に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
40. 前記不完全な骨ミネラル化が不完全な大腿骨ミネラル化、不完全な脛骨ミネラル化、不完全な中足骨ミネラル化、又は、不完全な肋骨ミネラル化である、請求項３９に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
41. それを必要とする対象が、
    ａ）幼児期ＨＰＰ、又は
    ｂ）小児期ＨＰＰ、又は
    ｃ）出生時ＨＰＰ、又は
    ｄ）成人期ＨＰＰ、又は
    ｅ）歯限局型低ホスファターゼ血症ＨＰＰ
    を有する、請求項３７から４０までのいずれか一項に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
42. 対象がヒトである、請求項３７から４１までのいずれか一項に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
43. 前記アルカリホスファターゼが下記の組成物中：
    ａ）０．２〜２０ｍｇ／ｋｇの１日投与量であるか、又は、１．４〜１４０ｍｇ／ｋｇの１週投与量であるように処方された組成物；
    ｂ）１日に投与されるか１週間に投与されるか若しくはその画分で投与されるように処方された組成物であるか、又は、毎日、１日おき、３日毎、若しくは７日毎に投与されるように処方された組成物；
    ｃ）皮下に、静脈内に、経口的に、経鼻的に、筋肉内に、舌下に、髄腔内に、又は皮内に投与されるように処方された組成物；
    ｄ）液体、溶液、懸濁液、丸薬、カプセル、錠剤、ジェルキャップ、粉末、ゲル、軟膏剤、クリーム、ネビュラ、ミスト、微粒化蒸気、エアロゾル、又はフィトソームの形状の組成物；
    ｅ）５ｍｇ／ｋｇ以下の１日投与量であるように処方された組成物であるか、又は、１又は２ｍｇ／ｋｇの１日投与量であるように処方された組成物；
    ｆ）前記ポリペプチドが６５ｍｇ／Ｌ以上、３９６ｍｇ／Ｌ以下の間の最大循環レベル（Ｃｍａｘ）を満たすように処方された組成物；又は、
    ｇ）前記ポリペプチドが１２３０ｍｇ／Ｌ以上、７７２０ｍｇ／Ｌ以下の間の最大循環レベル（Ｃｍａｘ）を満たすように処方された組成物；
    に存在するものである、請求項３７から４２までのいずれか一項に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
44. 前記ポリペプチドが骨に蓄積するが、筋肉中には蓄積しないものである、請求項３７から４３までのいずれか一項に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
45. 前記アルカリホスファターゼが薬学的に許容可能な担体と混合されるものである、請求項３７から４４までのいずれか一項に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
46. 前記薬学的に許容可能な担体が塩化ナトリウム及び／又はリン酸ナトリウムを含むか、又は、組成物が１５０ｍＭ塩化ナトリウム及び２５ｍＭリン酸ナトリウム、ｐＨ７．４を含む、請求項４５に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
47. 前記アルカリホスファターゼが凍結乾燥された形の、請求項３７から４５までのいずれか一項に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
48. 前記使用が、アルカリホスファターゼをコードする核酸分子で対象の細胞をトランスフェクトすることを含む、請求項３７から４２までのいずれか一項に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
49. 細胞をトランスフェクトすることが、アルカリホスファターゼが発現され、及び活性型で分泌されるようにインビトロで行われ、及び該細胞によって対象に投与される、請求項４８に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
50. アルカリホスファターゼが皮下投与、又は静脈内投与のために処方された、請求項３７から４７までのいずれか一項に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
51. 前記アルカリホスファターゼが皮下投与のために処方された、請求項５０に記載の使用のためのアルカリホスファターゼ。
52. それを必要とする対象又はヒトにおける、少なくとも１つの低アルカリホスファターゼ症（ＨＰＰ）表現型を改善又は予防する方法の使用のための、請求項２２から２５までのいずれか一項に記載の医薬組成物。

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