JP5730519B2 - ゲル型電気培養装置 - Google Patents

Description

本発明は、ゲル型電気培養装置に関する。さらに詳述すると、本発明は、電気培養により増殖が促進され得る微生物を１種類以上含む微生物群からの微生物の単離に用いて好適なゲル型電気培養装置に関する。

現在様々な分野で利用されている微生物は自然界に存在する全微生物の１％に満たないと言われている。そこで、残り９９％の膨大な微生物資源を有効利用するため、新しい概念に基づく微生物の培養技術が各種提案されている。

例えば、本件出願人は、新しい概念に基づく微生物の培養技術として電気を利用した培養方法を特許文献１において提案している。具体的には、培養対象微生物を培養液中で培養する際に、培養液中に浸した電極に電位を与えることによって、培養液の酸化還元電位を培養対象微生物の至適範囲に制御しながら培養を行うようにしている。この培養方法を利用することで、複数種の微生物を含む微生物群や試料中に存在するある特定の微生物のみを培養対象微生物として選択的に増殖させることができる。

特開２００８−５４６４６号公報

しかしながら、特許文献１に記載の培養方法では、培養対象微生物を選択的に増殖させることはできるものの、これを単離（純粋培養）することが困難であった。

即ち、特許文献１に記載の培養方法では、培養対象微生物を選択的に増殖させることはできるものの、培養液中には培養対象微生物以外の微生物が懸濁している場合がある。このような場合には、培養液に培養対象微生物と共にそれ以外の複数種の微生物が懸濁していることになり、培養対象微生物のみを単離することは困難であった。

また、培養対象微生物の酸化還元電位の至適範囲と培養対象微生物以外の微生物の酸化還元電位の至適範囲が重複している場合がある。このうような場合にも、培養液に培養対象微生物と共にそれ以外の複数種の微生物が懸濁していることになり、培養対象微生物のみを単離することは困難であった。

そこで、本発明は、電気培養により増殖させ得る微生物を単離することのできる電気培養装置を提供することを目的とする。

また、本発明は、電気培養により増殖させ得る微生物を単離する方法を提供することを目的とする。

かかる課題を解決するため、本願発明者等は、微生物の単離を行う場合に一般的に用いられるゲル培地に着目して鋭意検討を行った。その結果、本願発明者等は、ゲル培地の特定の領域のみの電位を制御し得る構成を知見し、本願発明を完成するに至った。

即ち、請求項１に記載のゲル型電気培養装置は、微生物培養用のゲル培地と、ゲル培地の内部またはゲル培地の表面のうちの培養面に対向する対向面に配置された作用電極と、ゲル培地の内部またはゲル培地の表面に配置された対電極と、ゲル培地の内部またはゲル培地の表面であって作用電極と対電極との間に電圧を印加したときに電気力線が形成され得る位置に配置された参照電極と、作用電極と対電極と参照電極とを結線して作用電極の電位を３電極方式で制御する定電位設定装置と、ゲル培地に含ませた酸化還元物質と、ゲル培地の少なくとも参照電極の周囲に含ませた、参照電極の構成元素に対応し且つ参照電極を機能させるための陰イオンとを有し、作用電極の電位を制御することにより、作用電極からゲル培地の培養面の作用電極と対向している部分までを電位制御領域として電位制御可能としている。

ここで、請求項１に記載のゲル型電気培養装置において、請求項２に記載のように、ゲル培地の対向面を支持する支持体がさらに備えられていることが好ましい。

また、請求項２に記載のゲル型電気培養装置において、請求項３に記載のように、支持体のゲル培地の対向面との接触面に作用電極と対電極と参照電極が並べて接着されて、作用電極と対電極と参照電極がゲル培地の対向面に配置されていることが好ましい。

さらに、請求項３に記載のゲル型電気培養装置において、請求項４に記載のように、作用電極を透明電極とし、支持体を透明材料からなるものとすることが好ましい。

また、請求項１に記載のゲル型電気培養装置において、請求項５に記載のように、対電極が炭素電極であることが好ましい。また、請求項６に記載のように、酸化還元物質は鉄イオン錯体であることが好ましい。

さらに、請求項１〜６のいずれか１つに記載のゲル型電気培養装置において、請求項７に記載のように、作用電極を複数配置すると共に定電位設定装置を多チャンネル式として複数の作用電極の電位を独立に制御可能とすることにより、独立した複数の電位制御領域を形成可能とすることが好ましい。

次に、請求項８に記載の微生物の単離方法は、請求項１〜７のいずれか１つに記載のゲル型電気培養装置を用い、電気培養により増殖が可能な微生物を複数種含む微生物群または微生物群を含む試料をゲル培地の培養面の作用電極と対向している部分に塗抹し、作用電極の電位を制御しながら培養を行って微生物のコロニーを発生させるようにしている。

請求項１に記載の発明によれば、作用電極の電位を制御することにより、作用電極からゲル培地の培養面の作用電極と対向している部分までを電位制御領域として電位制御可能としているので、ゲル培地の培養面の作用電極と対向している部分に電気培養により増殖させ得る微生物を塗抹等することで、この微生物を増殖させて同一種類の微生物からなるコロニーを形成させることができる。したがって、電気培養により増殖させ得る微生物を単離することが可能となる。

請求項２に記載の発明によれば、柔らかいゲル培地を支持体で支持できるので、ゲル培地を安定に保持して、取り扱いやすいものとすることができる。

請求項３に記載の発明によれば、支持体に各電極が接着されているので、各電極を極めて安定に保持することができ、さらに取り扱いやすいものとすることができる。

請求項４に記載の発明によれば、ゲル培地の培養面の作用電極と対向している部分において発生するコロニーを、ゲル培地の培養面だけでなく、支持体の裏面（ゲル培地と接触していない面）からも目視で観察することが可能となる。

請求項５に記載の発明によれば、作用電極の電位制御に伴い、対電極の電位がプラス側またはマイナス側に大きくなった場合でも、対電極自体の溶出や対電極からのガス発生等が殆ど起こらず、微生物の生育に悪影響を及ぼすことなく、長期に亘り安定して作用電極の電位を制御し続けることができる。

請求項６に記載の発明によれば、ゲル培地の電位制御領域における電位制御時の酸化還元物質起因のｐＨ変化を、リン酸緩衝液などのｐＨ調整剤を用いることなく抑えることができる。したがって、ｐＨの影響を除外して培養を行うことができる。

請求項７に記載の発明によれば、独立した複数の電位制御領域を形成可能としているので、複数種の微生物を同時に塗抹等し、これら複数の電位制御領域の電位をそれぞれ異なる値に制御して、複数種の微生物のコロニーの発生状況を様々な電位について同時に観察することが可能となる。

請求項８に記載の発明によれば、電気培養により増殖させ得る微生物のコロニーを発生させることができるので、この微生物を単離することが可能となる。

本発明のゲル型電気培養装置の実施の形態の一例を示す図である。 本発明のゲル型電気培養装置の電位制御領域を示す斜視図である。 本発明のゲル型電気培養装置の電位制御領域を示す断面図である。 参照電極の配置位置の概念を示す図である。 本発明のゲル型電気培養装置の実施の形態の一例であって、支持体を備えた場合の構成を示す図である。 本発明のゲル型電気培養装置における各電極の配置の仕方の一例について示す図である。 本発明のゲル型電気培養装置における各電極の配置の仕方の他の例について示す図である。 本発明のゲル型電気培養装置の作製手順の一例を示す図である。 多チャンネル式の定電位設定装置により複数の作用電極の電位を同時に制御することの可能な本発明のゲル型電気培養装置の概念を示す図である。 図９に示すゲル型電気培養装置により形成される複数の電位制御領域を示す図である。 酸化還元物質としてメチルビオロゲンを用いた第一実験結果を示す写真である。 酸化還元物質としてメチルビオロゲンを用いた第二実験結果を示す写真である。 酸化還元物質の違いによるゲル培地の電位制御領域のｐＨ変動を示す図である。 実施例３において、作用電極を各種設定電位とした場合の培養試験結果（コロニー密度）を示す図である。 実施例３において、作用電極の設定電位を＋０．６Ｖとした場合の培養試験結果を示す写真である。 実施例３において、作用電極の設定電位を−０．６Ｖとした場合の培養試験結果を示す写真である。 実施例４において、作用電極の設定電位を＋０．６Ｖとした場合の培養試験結果を示す写真である。 実施例４において、作用電極の設定電位を−０．６Ｖとした場合の培養試験結果を示す写真である。

以下、本発明を実施するための形態について、図面に基づいて詳細に説明する。

図１に本発明のゲル型電気培養装置の実施形態の一例を示す。図１に示すゲル型電気培養装置１は、微生物培養用のゲル培地２と、ゲル培地２の表面のうちの培養面２ａに対向する対向面２ｂに配置された作用電極９と、ゲル培地２の表面に配置された対電極１０と、ゲル培地２の表面であって作用電極９と対電極１０との間に電圧を印加したときに電気力線７が形成され得る位置に配置された参照電極１１と、作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを結線して作用電極９の電位を３電極方式で制御する定電位設定装置１２と、ゲル培地２に含ませた酸化還元物質３と、ゲル培地２の少なくとも参照電極１１の周囲に含ませた、参照電極１１の構成元素に対応し且つ参照電極１１を機能させるための陰イオン４とを有している。尚、図１において、符号９ａは作用電極９と定電位設定装置１２とを結ぶリード線であり、符号１０ａは対電極１０と定電位設定装置１２とを結ぶリード線であり、符号１１ａは参照電極９と定電位設定装置１２とを結ぶリード線である。また、符号２０は作用電極９にリード線９ａを、対電極１０にリード線１０ａを、参照電極１１にリード線１１ａをそれぞれ固定するための導電性ペースト（例えば銀ペースト等）である。以降の説明では、ゲル培地２の培養面２ａに対向する対向面２ｂを単にゲル培地２の対向面２ｂと呼ぶこともある。

本発明のゲル型電気培養装置１では、作用電極９と対電極１０と参照電極１１とを定電位設定装置１２に結線して、作用電極９の電位を３電極方式で制御するようにしている。したがって、作用電極９の電位を厳密に設定電位に制御することができる。詳細には、定電位設定装置（ポテンシオスタット）１２により、作用電極９と参照電極１１との間の電位差を測定し、この電位差が設定電位に達するように作用電極９と対電極１０との間に電流を流し、基準となる参照電極１１には一切電流が流れないようにしている。尚、３電極方式による電位制御については、例えば、電気化学測定法（上）、技報動出版株式会社、第１版１５刷、２００４年６月発行の６〜９ページにその詳細が記載されている。

そして、本発明のゲル型電気培養装置１では、作用電極９の電位を厳密に制御することで、図２及び図３に示すように、作用電極９からゲル培地２の培養面２ａの作用電極９と対向している部分２ｃまでを電位制御領域Ｘとして電位制御可能としている。したがって、ゲル培地２の培養面２ａの作用電極９と対向している部分２ｃに塗抹等された微生物の培養環境の電位を制御して、電気培養により増殖が促進され得る微生物のコロニーを発生させることができる。以降の説明では、ゲル培地２の培養面２ａの作用電極９と対向している部分２ｃを電位制御表面２ｃと呼ぶこともある。尚、図２と図３では、ゲル培地２と作用電極９以外の構成については省略している。また、電位制御領域Ｘには電位制御表面２ｃも含まれている。

以下、本発明のゲル型電気培養装置１の構成についてさらに詳細に説明する。

＜作用電極、対電極及び参照電極の配置＞
図１に示すゲル型電気培養装置１では、作用電極９と対電極１０と参照電極１１は、ゲル培地２の対向面２ｂに接触して配置されている。各電極のゲル培地２への固定方法としては、例えばゲル培地２を固める際に各電極をその表面に接触させておいて、ゲル培地２が固まる際に各電極をゲル培地２の表面に固定する方法が挙げられるがこの方法に限定されるものではない。例えば接着剤等により各電極をゲル培地２の表面に貼り付けるようにしてもよい。

また、作用電極９と対電極１０と参照電極１１の配置位置は、ゲル培地２の対向面２ｂには限定されない。即ち、作用電極９は、ゲル培地２の対向面２ｂではなく、ゲル培地２の内部に配置（内包）するようにしてもよい。この場合には、作用電極９をゲル培地２の内部に固定することができる。また、対電極１０と参照電極１１についても、電位制御領域Ｘの電位制御性が完全に失われることのない位置、例えば電位制御表面２ｃを完全に覆ったり、作用電極９から電位制御表面２ｃまでの間を完全に遮って電位制御表面２ｃにおける電位制御を不可能とすることのない位置にゲル培地２の内部に配置（内包）するようにしてもよいし、ゲル培地２の表面に配置するようにしてもよい。

尚、図１に示すゲル型電気培養装置１では、参照電極１１が作用電極９と対電極１０との間に配置されているが、参照電極１１の配置位置はこれに限定されず、例えば、図４に示すように、作用電極９と対電極１０の間に電圧を印加したときに電気力線７が生じ得る位置に配置すればよい。

＜支持体を備えた構成＞
本発明のゲル型電気培養装置１においては、図５に示すように、ゲル培地２の対向面２ｂを支持する支持体６がさらに備えられていることが好ましい。この場合には、柔らかいゲル培地２を支持体６上に安定に保持して、ゲル型電気培養装置１を取り扱い易いものとすることができる。

支持体６としては、例えば、各種材質の板状部材等を適宜用いることができるが、作用電極９、対電極１０及び参照電極１１のうちのいずれか２つあるいは３つ全てをゲル培地２の対向面２ｂに配置する場合には、非導電性の材質からなる板状部材を用いて各電極間の導通を防ぐことが好ましい。ここで、支持体６として、図５に示すように、シャーレ（ペトリ皿）を用いることが好ましい。この場合には、ゲル培地２の対向面２ｂだけでなく、側面も支持体６に支持されるので、柔らかいゲル培地２をより取り扱い易いものとすることができる。また、シャーレを重ねたり、立てたり、反転させたりしても培養することができるので、複数のシャーレを用いて同時に培養を行う場合にも、広いスペースを必要とすることなく実施することができる。

また、支持体６によりゲル培地２の対向面２ｂが支持される場合には、支持体６のゲル培地２との接触面に作用電極９と対電極１０と参照電極１１を並べて接着することにより、作用電極９と対電極１０と参照電極１１をゲル培地２の対向面２ｂに接触させることが好ましい。この場合には、柔らかいゲル培地２を安定に保持する支持体６の上記効果に加えて、各電極を支持体６に安定に固定して、ゲル型電気培養装置１をさらに取り扱い易いものとすることができる。

ここで、支持体６のゲル培地２との接触面への各電極の配置例としては、例えば、図６や図７に示すような配置が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

＜ゲル培地の構成＞
本発明のゲル型電気培養装置１のゲル培地２としては、培養対象微生物に適したゲル培地２を適宜用いることができる。例えば、ＬＢ培地、ＮＢ培地等の各種寒天培地、ゲランガム、シリカゲル等のゲル培地を用いることができるが、これらに限定されるものではない。

本発明のゲル型電気培養装置１において、ゲル培地２には酸化還元物質３を含ませるようにしている。酸化還元物質３をゲル培地に含ませることで、作用電極９の電位を制御したときに、電位制御領域Ｘにおける酸化還元物質３の酸化体と還元体の比が一定に制御され、電位制御領域Ｘの電位制御性が確保される。したがって、培養液の酸化還元電位を制御する電気培養方法（特開２００８−５４６５６号公報参照）により増殖し得る微生物を増殖させてこの微生物のコロニーを発生させることができる。

酸化還元物質３としては、作用電極９の電位を制御することにより、電位制御領域Ｘにおいて酸化還元反応を生じ得る物質であって、培養対象微生物に対して毒性を呈することのない物質を適宜用いることができる。例えば、鉄イオン、フェロシアン化カリウム、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物、ビオロゲン、ビオロゲン誘導体（メチルビオロゲン、エチルビオロゲン、ベンジルビオロゲンなど）を用いることができるが、これらに限定されるものではない。尚、鉄イオンを用いる場合、ゲル培地２中で安定に存在させるためにはキレート剤に配位させて鉄イオン錯体とすることが好ましい。キレート剤としては、鉄イオン錯体を配位しうるものであれば任意のキレート剤を用いることができるが、例えば、ジエチレントリアミンペンタ酢酸（ＤＴＰＡ）、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）、テトラエチレントリアミン（ＴＥＴ）、エチレンジアミン（ＥＤＡ）、ジエチレントリアミン（ＤＥＴＡ）、クエン酸、シュウ酸、クラウンエーテル、ニトリロテトラ酢酸、エデト酸二ナトリウム、エデト酸ナトリウム、エデト酸三ナトリウム、ペニシラミン、ペンテテートカルシウム三ナトリウム、ペンテト酸、スクシメルおよびエデト酸トリエンチンを挙げることができ、エチレンジアミンテトラ酢酸（ＥＤＴＡ）を用いることが好適である。

ここで、酸化還元物質３として、鉄イオン錯体を用いることが好ましい。鉄イオン錯体は、酸化還元反応に伴う電位制御領域ＸのｐＨ変化が生じないので、培養対象微生物の培養の際にｐＨ変化の影響を排除しながら培養を行うことができる。但し、酸化還元物質３は鉄イオン錯体に限定されるものではない。例えば、メチルビオロゲンやアントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物を用いると電位制御領域ＸのｐＨ変化が生じるが、培養対象微生物によっては、培養環境のｐＨ変化に影響されることなく培養可能な場合もある。また、ｐＨを酸性側やアルカリ性側に敢えて偏らせて培養対象微生物に好ましい環境を形成したい場合もある。さらには、ｐＨに対する微生物の生育への影響を観察したい場合もある。このような場合には、電位制御領域ＸのｐＨ変化が生じ得る酸化還元物質３を用いる利点がある。尚、ビオロゲンやビオロゲン誘導体、アントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物を酸化還元物質３として使用する場合であっても、ゲル培地２中にリン酸緩衝液などのｐＨ緩衝剤を共存させることで、ゲル培地２のｐＨ変動を抑えることが可能である。

尚、酸化還元物質３のゲル培地２中の含有量は、電位制御領域Ｘの電位制御性を確保できる量であれば特に限定されるものではないが、概ね０．１ｍＭ〜１００ｍＭ、好適には ２ｍＭである。

ここで、上記とは別の目的で酸化還元物質３を添加するようにしてもよい。即ち、培養液に添加された酸化還元物質を還元する微生物を培養する際に、還元された酸化還元物質を作用電極の電位を制御して酸化して再生しながら培養を行う電気培養方法も知られている（特開２００６−５５１３４号公報）。この電気培養方法で増殖させ得る微生物についても、本発明のゲル型電気培養装置１で培養してコロニーを発生させ得る。この場合には、酸化還元物質３として、培養対象微生物により還元され得る物質、例えば六価クロム、銀、銅、水銀、ヨウ素、亜ヒ酸、マンガン、ニッケル、亜セレン酸、硝酸、鉄を用いることができる。特に硝酸を用いた場合には、硝酸呼吸能を有する微生物によって硝酸が亜硝酸に還元されるが、作用電極９の電位を制御してこれを硝酸に酸化して再生することで、微生物全般に対して毒性を呈する亜硝酸の影響を排除しながら培養を行うことができる。また、逆に、培養液に添加された酸化還元物質を酸化する微生物を培養する際に、酸化された酸化還元物質を作用電極の電位を制御して還元して再生しながら培養を行う電気培養方法で増殖させ得る微生物についても、本発明のゲル型電気培養装置１で培養してコロニーを発生させ得る

また、本発明のゲル型電気培養装置１のゲル培地２には、参照電極１１の構成元素に対応する陰イオン４が含まれている。陰イオン４は、ゲル培地２の全体に含まれていてもよいが、少なくとも参照電極１１の周囲に含まれていれば、参照電極１１を機能させて作用電極９の電位を厳密に制御することができる。

参照電極１１の構成元素に対応する陰イオン４としては、例えば、参照電極１１をＡｇ／ＡｇＣｌとしたときにはＣｌ⁻、Ａｇ／ＡｇＢｒとしたときにはＢｒ⁻、Ａｇ／ＡｇＩとしたときにはＩ⁻、Ｈｇ／Ｈｇ_２Ｃｌ_２としたときにはＣｌ⁻、Ｈｇ／ＨｇＯとしたときにはＯＨ⁻、Ｈｇ／Ｈｇ_２ＳＯ_４としたときにはＳＯ_４ ^２−等が挙げられるが、これらに限定されるものではない。

尚、陰イオン４は、上記陰イオンを含む塩をゲル培地２に添加することで、ゲル培地２に含ませることができる。陰イオン４のゲル培地２中の含有量は、参照電極１１を機能させ得る量であれば特に限定されるものではないが、概ね１ｍＭ〜１Ｍ、好適には１０ｍＭである。

尚、参照電極１１の構成元素に対応する陰イオン４が、ゲル培地２に元々含まれている場合には、陰イオン４を敢えて添加しなくともよい。例えば、ＬＢ培地にはＮａＣｌが含まれているので、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極やＨｇ／Ｈｇ_２Ｃｌ_２電極を用いる場合には、陰イオンとしてＣｌ⁻を別途添加せずとも、参照電極１１を機能させることができる。

＜作用電極、対電極及び参照電極の材質＞
本発明のゲル型電気培養装置１の対電極１０としては、作用電極９における酸化還元反応に対して電子の授受を補完する反応を進行させることが可能な材質、つまり、作用電極９において酸化反応が生じる際に還元反応を進行させることが可能な材質、または作用電極９において還元反応が生じる際に酸化反応を進行させることが可能な材質とすればよい。具体的には、例えば、ステンレス鋼電極、白金電極、炭素電極等が挙げられるが、炭素電極が好適である。この場合には、電極自体のゲル培地２への溶出や電極からのガス発生によるゲル培地２への悪影響等を防いで、長期に亘り作用電極９の電位を制御し易い。

本発明のゲル型電気培養装置１の作用電極９としては、対電極１０と同様、ステンレス鋼電極、白金電極、炭素電極等が挙げられるが、炭素電極が好適である。

ここで、作用電極９として、透明電極を用いることが好適である。例えば、図１に示すゲル型電気培養装置１の作用電極９として透明電極を使用すれば、ゲル培地２の電位制御表面２ｃにおけるコロニーの発生状況を、ゲル培地２の対向面２ｂから目視で観察することが可能になる。また、図５に示すゲル型電気培養装置１の作用電極９として透明電極を使用し、支持体６を透明材料からなるものとすれば、ゲル培地２の電位制御表面２ｃにおけるコロニーの発生状況を、支持体６の裏側（ゲル培地２の対向面と接触していない面）から目視で観察することが可能になる。特に支持体６としてシャーレを用いた場合、シャーレは一般的には透明であることから、作用電極６を透明電極とするだけで、シャーレを反転させた場合にも、ゲル培地２の電位制御表面２ｃにおけるコロニーの発生状況を目視で観察することができる。

透明電極としては、公知あるいは新規の材質のものを適宜用いることができる。例えば、ガラス電極やＩＴＯ（Ｉｎｄｉｕｍ Ｔｉｎ Ｏｘｉｄｅ）電極等を用いることができるが、これらに限定されるものではない。

参照電極としては、例えば、Ａｇ／ＡｇＣｌ電極、Ａｇ／ＡｇＢｒ電極、Ａｇ／ＡｇＩ電極、Ｈｇ／Ｈｇ_２Ｃｌ_２電極、Ｈｇ／ＨｇＯ電極、Ｈｇ／Ｈｇ_２ＳＯ_４電極等が挙げられ、銀表面がＡｇＣｌ処理されたＡｇ／ＡｇＣｌ電極が好適であるが、これに限定されるものではない。

＜本発明のゲル型電気培養装置の作製方法＞

以下に、図５に示すゲル型電気培養装置１の作製方法の一例を説明する。

まず、作用電極９、対電極１０、参照電極１１にそれぞれリード線９ａ、１０ａ、１１ａを、例えば銀ペースト等の導電性ペースト４０を用いて取り付ける。ここで、ゲルに接触する導電性ペースト４０及びリード線９ａ、１０ａ、１１ａのむき出し部分が電極として作用するのを防ぐために、これらを絶縁性接着剤等の絶縁性素材、例えばエポキシ系接着剤で絶縁被覆することが好ましい。

参照電極１１としてＡｇ／ＡｇＣｌ電極を用いる場合には、例えばＡｇリボンをＡｇＣｌ処理してＡｇ／ＡｇＣｌ電極を作製する。

次に、リード線が取り付けられた各電極をシャーレ６の底面に並べて接着し、各電極をシャーレ６に固定する。

次に、各電極が固定されたシャーレ６を滅菌処理する。滅菌処理法としては、例えばＨ_２Ｏ_２プラズマ低温滅菌等の低温プラズマ滅菌処理やエチレンオキサイドガス等を用いたガス滅菌処理が挙げられるが、これらに限定されるものではない。尚、Ｈ₂Ｏ₂プラズマ低温滅菌あるいはエチレンオキサイドガス等のガス滅菌は、ガス透過性のある素材で各電極が固定されたシャーレ６を梱包してから実施することが好適である。

次に、滅菌処理したシャーレ６に寒天等を無菌的に流し込んで固める。これにより、シャーレ６内にゲル培地２が形成される。

以上の工程により、本発明のゲル型電気培養装置１のユニットが完成する。そして、このユニットのリード線９ａ、１０ａ、１１ａを定電位設定装置１２に結線することで、３電極方式による作用電極９の電位制御が可能となり、これにより、ゲル培地２に電位制御領域Ｘが形成される。

尚、上記作製方法は、あくまでも一例であり、この方法には限定されない。例えば、リード線が取り付けられた各電極をシャーレ６の底面に接着することなく低温滅菌処理し、無菌的に寒天等を流し込んだ型に各電極を差し込んでゲル培地２に各電極を内包させるようにしてもよい。

＜微生物の単離方法＞

本発明のゲル型電気培養装置１を用いた微生物の単離方法について説明する。

電気培養により増殖させ得る微生物を含む微生物群、またはこの微生物群を含む試料を、本発明のゲル型電気培養装置１のゲル培地２の電位制御表面２ｃに塗抹等して添加する。その後、作用電極９の電位を所望の電位に制御して電位制御表面２ｃを含む電位制御領域Ｘの電位を制御する。これにより、電気培養により増殖させ得る微生物が電位制御表面上で増殖しながらコロニーを形成する。このコロニーは同一種の微生物の塊であることから、これを採取することで、微生物を単離することができる。

上述の形態は本発明の好適な形態の一例ではあるがこれに限定されるものではなく本発明の要旨を逸脱しない範囲において種々変形実施可能である。

例えば、上述の実施形態では、作用電極９を１つとしていたが、図９に示すように、作用電極９を複数設けて、多チャンネル式の定電位設定装置１２により、複数の作用電極９の電位をそれぞれ異なる電位に制御するようにしてもよい。この場合には、図１０に示すように複数の独立した電位制御表面２ｃ_１、２ｃ_２、２ｃ_３、２ｃ_４、２ｃ_５、２ｃ_６を含む電位制御領域Ｘ_１、Ｘ_２、Ｘ_３、Ｘ_４、Ｘ_５、Ｘ_６が形成される。したがって、それぞれの電位制御領域の電位を異なる値に制御して、様々な電位によるコロニーの発生状態を目視で同時に確認することができ、非常に便利であると共に、微生物群や微生物群を含む試料から同時に複数のコロニーを得て、複数種の微生物を同時に単離することも可能となる。

以下に本発明の実施例を説明するが、本発明はこれら実施例に限られるものではない。

（実施例１）
作用電極９の電位を制御することによるゲル培地２の電位の制御性について検討した。

シャーレ（購入元：Ｉｗａｋｉ、商品名：Ｃｏｄｅ１０２０−１００）６を２つ準備し、図６及び図７と同じように各電極を設置・固定して各電極に導電性ペースト２０（購入元：藤倉化成（株）、商品名：ドータイトＤ−５５０）を用いてリード線９ａ、１０ａ、１１ａを接続し、導電性ペースト２０とリード線９ａ、１０ａ、１１ａのむき出し部分が電極として作用しないように、エポキシ樹脂接着剤（ニチバン（株）、アラルダイド）で絶縁被覆した。各電極を固定したシャーレ６は、ステラッド滅菌ロール（Ｗ75ｍｍ×L150ｍ）により梱包した後、プラズマ低温滅菌装置（ＳＴＥＲＲＡＤ ５０：ジョンソン・エンド・ジョンソン（株））によりプラズマ滅菌処理（滅菌条件：４５℃、約４８０ｔｏｒｒのＨ_２Ｏ_２ガス雰囲気（減圧）にて、４分間のプラズマ滅菌を２回実施）した。寒天溶液に陰イオン４としてＮａＣｌを１０ｍＭ、酸化還元物質３としてメチルビオロゲンを５ｍＭ添加してオートクレーブ滅菌処理（滅菌条件：１２０℃、１５分）した後、クリーンベンチ内でこれを各シャーレに分注して固化させた。そして、各電極に接続されたリード線を定電位設定装置１２（ポテンシオスタット、購入元：（株）東方技研、商品名：Ｍｏｄｅｌ ＰＳ−０８）に接続した。

作用電極９には、ガラス電極（購入元：村中医療器（株）、ＩＴＯコートスライドガラス、特注品）を用いた。対電極１０にはステンレス鋼製のメッシュ状電極（購入元：（株）ニラコ、商品名：ＳＵＳ３１６金網；（７８８１５０））を用いた。参照電極１１にはＡｇリボン（購入元：（株）ニラコ、商品名：銀リボン（４００３２５））をＡｇＣｌ処理した銀・塩化銀電極（自作）を用いた。尚、ＡｇＣｌ処理は、３Ｍの塩化鉄（ＩＩＩ）水溶液にＡｇリボンを１０秒間浸漬することにより行った。

作用電極９の電位を銀・塩化銀電極電位基準で−０．８Ｖに設定した。この電位は、メチルビオロゲンが、還元体となって青色を呈する電位である。

通電開始前と通電開始後１時間の写真をそれぞれ図１１及び図１２に示す。尚、作用電極９が透明電極であることから、図１１と図１２では作用電極９が存在している領域を点線にて示してある。通電開始後１時間で、図１１及び図１２のいずれの作用電極９においても、作用電極９からゲル培地２の電位制御表面２ｃまでの領域において、メチルビオロゲンが還元体となって青色を呈していることが確認でき、作用電極９からゲル培地２の電位制御表面２ｃまでの領域を電位制御領域Ｘとして電位制御可能であることが明らかとなった。

１時間通電した後、さらに作用電極９の電位を銀・塩化銀電極電位基準で−０．６Ｖに設定し、２４時間維持した。実験中はシャーレ６に蓋をして密閉状態とした。その結果、ステンレス鋼が溶解・拡散し、参照電極１１付近で析出した。この結果から、ステンレス鋼については、作用電極９の電位をマイナス側に大きくし過ぎると、対電極１０側でそれを補完する酸化反応が強く生じてしまい、微生物の生育に悪影響を及ぼす場合があることが考えられた。

上記と同様の実験を、対電極１０の材質を替えて実験した。具体的には、対電極１０を白金電極（購入元：（株）ニラコ、商品名：Ｐｔ金網、１８０ｍｅｓｈ（ＰＴ−３５８０８０））または炭素電極（購入元：フジビジネス（株）、商品名：ＩＧ−１１）として同様の実験を行った。

その結果、対電極１０を白金電極とした場合には、塩素ガスが発生して作用電極９付近で次亜塩素酸となり、黄色に変色することが確認された。この結果から、白金電極については、作用電極９の電位をマイナス側に大きくし過ぎると、対電極１０側でそれを補完する酸化反応が強く生じてしまい、微生物の生育に悪影響を及ぼす場合があることが考えられた。その一方で、対電極１０を炭素電極とした場合には、２４時間経過後も電位制御が問題なく行われることが確認された。

以上の結果から、対電極１０としては、炭素電極を用いることが好適ではあるが、白金電極やステンレス鋼製の電極についても、作用電極９の電位をマイナス側に大きい値に制御しない限り、十分に使用可能であると考えられた。

（実施例２）
酸化還元物質３について検討した。

まず、実施例１で炭素電極を対電極１０として用いた場合、通電開始前の電位制御領域のｐＨは７であったのに対し、通電開始２４時間経過後にはｐＨが１１付近まで上昇した（図１３の◆）。これに対し、酸化還元物質３をＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡとして同様の実験を行ったところ、通電開始前の電位制御領域のｐＨは７であったのに対し、通電開始２４時間経過後にはｐＨが８付近までしか上昇しなかった（図１３の■）。

メチルビオロゲンなどのビオロゲン誘導体やアントラキノンジスルホン酸ナトリウムなどのキノン化合物は、酸化還元反応に伴ってプロトンが放出されたり消費されたりする。このような物質を酸化還元物質３とし、作用電極９の電位を制御すると、ｐＨの変動が生じやすいものと考えられる。一方、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡのように、酸化還元物質に伴ってプロトンが放出されたり消費されたりすることのない物質を酸化還元物質３とし、作用電極９の電位を制御すると、ｐＨの変動が生じ難いものと考えられる。以上の結果から、微生物の生育に対するｐＨ変動の影響を排除する上では、酸化還元反応に伴うプロトンの出入りの無い物質、例えば鉄イオン錯体を用いることが好適であることが明らかとなった。但し、微生物によっては、至適ｐＨが酸性側やアルカリ性側に偏っている場合もあるので、このような場合には、酸化還元反応に伴いプロトンが出入りし得る物質を酸化還元物質３として用いればよいことも明らかとなった。さらには、電位制御領域の電位と共にｐＨを制御して微生物の生育に対する影響を観察したい場合もあるので、そのような場合にも、酸化還元反応に伴いプロトンが出入りし得る物質を酸化還元物質３として用いればよいことが明らかとなった。

また、実施例１で炭素電極を対電極１０として用いた場合について、寒天溶液に０．１Ｍのリン酸緩衝液（ｐＨ＝７）を混合し、酸化還元物質３としてメチルビオロゲンまたはアントラキノンジスルホン酸ナトリウム（アントラキノン−２，６−ジスルホン酸ナトリウム）を２ｍＭ添加してゲルのｐＨ変動について検討した結果、作用電極９の設定電位を銀・塩化銀電極電位基準で−０．８Ｖ〜＋０．８Ｖ（−０．８Ｖ、−０．６Ｖ、−０．４Ｖ、＋０．４Ｖ、＋０．６Ｖ、＋０．８Ｖ）として２４時間通電しても、ｐＨの変動が生じないことが確認できた。この結果から、ゲル内にリン酸緩衝液などのｐＨ緩衝剤を共存させることで、ゲルのｐＨを変動させ得る酸化還元物質を、ゲルのｐＨを変動させることなく使用できることが明らかとなった。

（実施例３）
大腸菌（E.coli）を培養対象微生物として、培養試験を行った。

ゲル型電気培養装置１は、酸化還元物質３をＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡとし、ゲル培地２をＬＢ培地（１％Bacto Tripton、０．５％酵母エキス、１％ＮａＣｌ）とした以外は実施例１と同様のものを用いた。対電極１０は炭素電極とした。また、各電極の配置については図６と同様とした。尚、陰イオン４については、ＬＢ培地に含まれているＮａＣｌのＣｌ⁻を利用した。また、寒天は、２０ｇ／Ｌとして０．１Ｍのリン酸緩衝液に含ませ、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡの濃度を２ｍＭとして、無菌状態でシャーレ６に流し込んで固め、ゲル培地２とした。

大腸菌を約３５０個／ｃｍ^２の密度で植菌した後、３７℃の嫌気条件（窒素）で、作用電極９の設定電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．８Ｖ、＋０．６Ｖ、−０．６Ｖ、−０．８Ｖに設定しながら、３日間培養を行った。コロニー密度を計測した結果を図１４に示す。尚、図１４の各項目の左側が電位制御表面２ｃの周辺のコロニー密度であり、右側が電位制御表面２ｃ上のコロニー密度である。図１４に示される結果から、＋０．８Ｖ、＋０．６Ｖ、−０．６Ｖ、−０．８Ｖの順で、電位制御表面２ｃ上のコロニー密度が減少する傾向が見られた。この結果から、作用電極９の電位を制御することにより、電位制御表面２ｃ上でのコロニーの発生状態をコントロールできることが明らかとなった。

次に、作用電極９の設定電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．６Ｖ、−０．６Ｖとして同様の条件で６日間培養した際のゲル型電気培養装置の写真を図１５と図１６に示す。図１５が作用電極９の設定電位を＋０．６Ｖで培養した際の写真であり、図１６が作用電極９の設定電位を−０．６Ｖで培養した際の写真である。尚、作用電極９が透明電極であることから、図１５と図１６では作用電極９が存在している領域を点線にて示してある。図１５と図１６に示されるように、作用電極９の設定電位を＋０．６Ｖとした場合の方が、−０．６Ｖとした場合よりも電位制御表面２ｃ上のコロニー密度が増加する傾向が見られた。この結果からも、作用電極９の電位を制御することにより、電位制御表面２ｃ上でのコロニーの発生状態をコントロールできることが示された。

（実施例４）
偏性嫌気性菌であり、アセトン・ブタノール発酵（ＡＢＥ発酵）を行うクロストリジウム属細菌（Clostridium saccharoperbutylacetonicum）を培養対象微生物として、培養試験を行った。

ゲル型電気培養装置１は、酸化還元物質３をＦｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡとし、ゲル培地２をＴＧＡ培地（１％Ｂａｃｔｏ Ｔｒｉｐｔｏｎ、０．５％ＮａＣｌ、０．２％グルコース）とした以外は実施例１と同様のものを用いた。作用電極９及び対電極１０は炭素電極とした。また、各電極の配置については図６と同様とした。尚、陰イオン４についてはＴＧＡ培地に含まれているＮａＣｌのＣｌ⁻を利用した。また、寒天は、２０ｇ／Ｌとして０．１Ｍのリン酸緩衝液に含ませ、Ｆｅ（ＩＩＩ）−ＥＤＴＡの濃度を２ｍＭとして、無菌状態でシャーレ６に流し込んで固め、ゲル培地２とした。

Clostridium saccharoperbutylacetonicumをシャーレ（直径９ｃｍ）当たり１×１０^３ｃｅｌｌｓの密度で植菌（シャーレ１枚当たり１×１０^４ｃｅｌｌｓ／ｍＬを０．１ｍＬ植菌）した後、３７℃の嫌気条件（窒素）で、作用電極９の設定電位を銀・塩化銀電極電位基準で＋０．６Ｖ、−０．６Ｖに設定しながら、５日間培養を行った。

上記の条件で培養した際のゲル型電気培養装置の写真を図１７と図１８に示す。図１７が作用電極９の設定電位を＋０．６Ｖで培養した際の写真であり、図１８が作用電極９の設定電位を−０．６Ｖで培養した際の写真である。図中の点線は、作用電極９が存在している領域を示している。図１７と図１８に示されるように、作用電極９の設定電位を＋０．６Ｖとした場合の方が、−０．６Ｖとした場合よりも電位制御表面２ｃ上のコロニー密度が増加する傾向が見られた。また、同様の培養試験を２回行った結果、作用電極９の設定電位を−０．６Ｖで培養した際の電位制御表面２ｃ上のコロニー数の平均値は５個であったのに対し、作用電極９の設定電位を＋０．６Ｖで培養した際の電位制御表面２ｃ上のコロニー数の平均値は２１個となり、＋０．６Ｖで培養した場合の方が、電位制御表面２ｃ上のコロニー数が圧倒的に増加していた。以上、実施例４の結果からも、作用電極９の電位を制御することにより、電位制御表面２ｃ上でのコロニーの発生状態をコントロールできることが示された。

１ ゲル型電気培養装置
２ ゲル培地
２ａ ゲル培地の培養面
２ｂ ゲル培地の培養面に対向する対向面
２ｃ ゲル培地の培養面の作用電極と対向している部分
３ 酸化還元物質
４ 陰イオン
６ 支持体
７ 電気力線
９ 作用電極
１０ 対電極
１１ 参照電極
１２ 定電位設定装置
Ｘ 電位制御領域

Claims (8)

1. 微生物培養用のゲル培地と、
   前記ゲル培地の内部または前記ゲル培地の表面のうちの培養面に対向する対向面に配置された作用電極と、
   前記ゲル培地の内部または前記ゲル培地の表面に配置された対電極と、
   前記ゲル培地の内部または前記ゲル培地の表面であって前記作用電極と前記対電極との間に電圧を印加したときに電気力線が形成され得る位置に配置された参照電極と、
   前記作用電極と前記対電極と前記参照電極とを結線して前記作用電極の電位を３電極方式で制御する定電位設定装置と、
   前記ゲル培地に含ませた酸化還元物質と、
   前記ゲル培地の少なくとも前記参照電極の周囲に含ませた、前記参照電極の構成元素に対応し且つ前記参照電極を機能させるための陰イオンとを有し、
   前記作用電極の電位を制御することにより、前記作用電極から前記ゲル培地の培養面の前記作用電極と対向している部分までを電位制御領域として電位制御可能としたことを特徴とするゲル型電気培養装置。
2. 前記ゲル培地の対向面を支持する支持体がさらに備えられている請求項１に記載のゲル型電気培養装置。
3. 前記支持体の前記ゲル培地の対向面との接触面に前記作用電極と前記対電極と前記参照電極が並べて接着されて、前記作用電極と前記対電極と前記参照電極が前記ゲル培地の対向面に配置されている請求項２に記載のゲル型電気培養装置。
4. 前記作用電極を透明電極とし、前記支持体を透明材料からなるものとしている請求項３に記載のゲル型電気培養装置。
5. 前記対電極が炭素電極である請求項１に記載のゲル型電気培養装置。
6. 前記酸化還元物質が鉄イオン錯体である請求項１に記載のゲル型電気培養装置。
7. 前記作用電極を複数配置すると共に前記定電位設定装置を多チャンネル式として前記複数の作用電極の電位を独立に制御可能とすることにより、独立した複数の前記電位制御領域を形成可能としている請求項１〜６のいずれか一つに記載のゲル型電気培養装置。
8. 請求項１〜７のいずれか１つに記載のゲル型電気培養装置を用い、電気培養により増殖が可能な微生物を複数種含む微生物群または前記微生物群を含む試料をゲル培地の培養面の作用電極と対向している部分に塗抹し、前記作用電極の電位を制御しながら培養を行って前記微生物のコロニーを発生させることを特徴とする微生物の単離方法。