JP5717625B2 - アンギオゲニン濃縮ミルク分画 - Google Patents

Description

本発明はミルク試料からアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法、及びそのような生成物の食品添加物、栄養補助食品、医薬品又は獣医学品としての使用若しくは治療用組成物調製のための使用に関する。

アンギオゲニンは、血管内皮細胞、大動脈平滑筋細胞、フィブロブラスト等の増殖細胞及び直腸ガン、卵巣ガン、乳ガン等の腫瘍によって生産される分子量１４ｋＤａの非グリコシル化ポリペプチドである。アンギオゲニンは、正常ヒト血漿、ウシ血漿、ウシ乳（bovine milk）、マウス、ウサギ及びブタの血清等の種々の原料から単離されている。各原料においてアンギオゲニンは低濃度（ウシ乳中１２ｍｇ／Ｌ未満、ヒト血漿中１５０μＬ／Ｌ未満）で存在する。

アンギオゲニンは強力な血管新生刺激剤としてのみならず、他の種々の活性を有する。これらにはシミ等の皮膚トラブルの除去能、免疫応答の調節、多形核白血球の自己分解防止及び全身の細菌・真菌性病原体に対する殺菌活性等の能力が含まれる。このタンパク質の知られている生理機能に基づいて、医薬品、ダイエタリー食品サプリメント、化粧品におけるアンギオゲニンの種々の応用が考えられている。

これらの応用におけるアンギオゲニンの使用には、このタンパク質を適切な原料から商業スケールで調製するための効率的な方法が必要である。従って、本発明の好ましい形態の目的は、このような方法を提供することにある。

ウシ乳は大変豊富に得られるものである一方、ウシ乳にはアンギオゲニンが低濃度でしか存在せず、ミルク中に存在するイムノグロブリン、ラクトフェリン、ラクトペルオキシダーゼ等のある種のタンパク質がアンギオゲニンをマスクしてしまい、精製が阻害されるため、アンギオゲニンの原料としての使用は好ましくない。本発明者らは、次の第一〜第五の態様及び国際特許出願公報（ＷＯ２００８／０５５３１０に公開）に記載する、ミルク分画をアンギオゲニンに関して濃縮するための数種の方法を見出した。これら方法のそれぞれによってミルクからアンギオゲニン濃縮生成物を得ることができる。

本発明はその第一の態様において、ミルク試料からアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法であって、
（ａ）ミルク試料に存在するアンギオゲニンが捕捉剤と相互作用してアンギオゲニン−捕捉剤複合体を生成するように、ミルク試料をアンギオゲニンと相互作用する捕捉剤に接触させる工程、
（ｂ）前記複合体をミルク試料から分離する工程、
（ｃ）前記複合体中の捕捉剤からアンギオゲニンを遊離させる工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）からアンギオゲニンを回収し、アンギオゲニン濃縮生成物を得る工程を含む方法を提供する。
第一の態様の一実施形態においては、前記捕捉剤は支持体に固定化されている。
第一の態様の更なる実施形態においては、前記捕捉剤は抗体である。

本発明はその第二の態様において、ミルク試料からアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法であって、
（ａ）アンギオゲニンと相互作用する抗体を固定化した支持体にミルク試料を添加し、ここでミルク試料に存在するアンギオゲニンが支持体上の抗体と相互作用してアンギオゲニン−抗体複合体を生成する工程、
（ｂ）前記抗体と相互作用しないミルク試料に存在する成分を前記支持体から洗い落すことにより、ミルク試料から前記複合体を分離する工程、
（ｃ）前記複合体中の抗体からアンギオゲニンを遊離させる工程、及び
（ｄ）工程（ｃ）からアンギオゲニンを回収し、アンギオゲニン濃縮生成物を得る工程を含む方法を提供する。
第一又は第二の態様の一実施形態においては、前記方法はイムノアフィニティークロマトグラフィーを含む。

本発明はその第三の態様において、ミルク試料からアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法であって、
（ａ）液相のミルク試料を、前記ミルク試料の成分をそのサイズに基づいて分離可能な第二の相に添加する工程、及び
（ｂ）前記ミルク試料の他の成分から分離されたアンギオゲニンを回収することによりアンギオゲニン濃縮生成物を得る工程を含み、
工程（ａ）に先立ち、前記ミルク試料をレンネット処理又は酸沈澱に付さないか、或いは前記ミルク試料がホエイ又はホエイ分画でない方法を提供する。

第三の態様の一実施形態においては、前記第二の相は半透過性相である。

第三の態様の他の実施形態においては、前記半透過性相は２０ｋＤａ未満のサイズ、或いは５０ｋＤａ未満のサイズの成分をパーミエートとして前記半透過性相を通過させることができる。好ましい一実施形態においては、前記半透過性相は３０ｋＤａ未満のサイズの成分をパーミエートとして前記半透過性相を通過させることができる。このような各種実施形態においては、アンギオゲニンは前記半透過性相をパーミエートとして通過する。

第三の態様の更に他の実施形態においては、前記半透過性相は１０ｋＤａ未満のサイズの成分をパーミエートとして前記半透過性相を通過させることができる。このような実施形態においては、アンギオゲニンは前記半透過性相に残余分として保持される。

第三の態様の更に他の実施形態においては、前記ミルク試料は半透過性相を強制透過させられる。

第三の態様の一実施形態においては、前記ミルク試料はシリンジ、圧縮ガス、ポンプ、遠心力又はそれらの組み合わせによって加えられる力によって、半透過性相を強制透過させられる。

第三の態様の一実施形態においては、前記第二の相は半透過性膜である。

第三の態様の他の実施形態においては、前記方法は限外濾過を含む。

本発明はその第四の態様において、ミルク試料からアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法であって、
（ａ）液相のミルク試料を、前記ミルク試料の成分をそのサイズに基づいて分画に分離可能な第二の相に添加する工程、及び
（ｂ）これらのアンギオゲニンを含む分画を同定し、該分画を回収することによってアンギオゲニン濃縮生成物を得る工程を含む方法を提供する。

第四の態様の一実施形態においては、前記方法はサイズ排除クロマトグラフィーを含む。

第四の態様の更なる実施形態においては、前記第二の相はサイズ排除樹脂である。

第四の態様の一実施形態においては、前記樹脂は分子量約１０〜２０ｋＤａのタンパク質を分離する。

本発明はその第五の態様において、ミルク試料からアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法であって、
（ａ）流動する水性ミルク試料にミルク流を横断する方向に電場を印加する工程、
（ｂ）電場が印加されたミルク流の分画を回収する工程、
（ｃ）これらのアンギオゲニンに関して濃縮された分画を同定し、該分画を回収することによってアンギオゲニン濃縮生成物を得る工程を含む方法を提供する。

第五の態様の一実施形態においては、前記方法はフリーフロー電気泳動を含む。このフリーフロー電気泳動は、等電点電気泳動、ゾーン電気泳動、等速電気泳動、フィールドステップ電気泳動及びフィールドフロー分画からなる群から選択することができる。更に、このフリーフロー電気泳動は、連続フリーフロー電気泳動であってもインターバルフリーフロー電気泳動であってもよい。

更なる実施形態においては、前記方法は変性条件下で行う。

第四の態様の更なる実施形態においては、前記水性ミルク流はｐＨ勾配をもたらす緩衝液媒体中で行う。一実施形態においては、前記勾配はｐＨ８〜１１の範囲である。

第一〜第五の態様のいずれか一つの更なる実施形態においては、前記アンギオゲニン濃縮生成物は一以上のアンギオゲニン濃縮工程に付される。一以上のアンギオゲニン濃縮工程は、カチオン交換クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動を含む電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー及び限外濾過からなる群から選択することができる。これは、アンギオゲニン分画の純度が問題とされる場合、例えばアンギオゲニンの医薬的使用に関して特にである。しかしながら、第一及び第二の態様の方法は、捕捉剤の特異性に依存して比較的高純度のアンギオゲニン濃縮生成物を提供し得ることが期待される。前記捕捉剤がアンギオゲニン特異的抗体である場合、高純度が見込まれる。

本発明はその第六の態様において、第一〜第五の態様のいずれか一つの態様に従う方法によって調製されるアンギオゲニン濃縮生成物を提供する。

本発明はその第七の態様において、本発明の第六の態様に従うアンギオゲニン濃縮生成物の食品用物質、栄養補助食品、医薬品又は獣医学品の調製における使用を提供する。

本発明はその第八の態様において、本発明の第六の態様に従うアンギオゲニン濃縮生成物を含む食品用物質、栄養補助食品、医薬品又は獣医学品を提供する。

第七又は第八の態様の一実施形態においては、前記食品用物質はスポーツ栄養サプリメント又は食品サプリメント、特に幼児、アスリート（特に優れたアスリート）、高齢者又は虚弱者用の食品サプリメントである。

本発明はその第九の態様において、本発明の第六の態様に従うアンギオゲニン濃縮生成物を含む医薬組成物又は獣医学組成物を提供する。

本発明はその第十の態様において、本発明の第六の態様に従うアンギオゲニン濃縮生成物のウイルス、バクテリア又は真菌及びそれらの毒素によって起こされる疾病、或いは血管新生の刺激が必要とされる疾病の治療及び／又は予防のための医薬品の調製における使用を提供する。

本発明はその第十一の態様において、本発明の第六の態様に従うアンギオゲニン濃縮分画の、粘膜表面の感染を引き起こす病原体を標的とする栄養補助食品、医薬品又は獣医学品の成分としての使用を提供する。

本発明はその第十二の態様において、粘膜表面の感染を引き起こす病原体を標的とする方法であって、本発明の第八の態様に従う栄養補助食品、医薬品又は獣医学品、又は本発明の第九の態様に従う組成物の有効量を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

本発明の第十一又は第十二の態様の一実施形態においては、粘膜表面は鼻、目、耳、肺、乳房及び膣の粘膜を含むことができる。

本発明はその第十三の態様において、ウイルス、バクテリア又は真菌及びそれらの毒素によって起こされる疾病、或いは血管新生の刺激が必要とされる疾病の治療及び／又は予防の方法であって、本発明の第八の態様に従う栄養補助食品、医薬品又は獣医学品、又は本発明の第九の態様に従う組成物の有効量を被験体に投与する工程を含む方法を提供する。

図１は、シプロルビー（Sypro Ruby、モレキュラープローブズ社）で染色し、プロＸプレス（Proxpress、パーキンエルマー社）イメージングシステム上で５秒露光してイメージ化した一次元ＳＤＳポリアクリルアミドゲルを示す。レーン１、２及び３は、１）分子量標準、２）ミルク誘導分画、３）ミルク分画とのインキュベーション後、抗アンギオゲニンＩｇＧ標識プロテインＧダイナビーズからの溶離液である。 図２は、イムノアフィニティ精製後のアンギオゲニンのウエスタンブロット解析を示す。アンギオゲニンは０．５μｇの抗ウシマウスモノクローナル（クローン１Ｂ１４Ｄ４）で検出し、二次抗体はＩＲＤｙｅ ８００ＣＷヤギ抗マウスＩｇＧ（リコール社）であり、オデッセイ赤外線画像装置（リコール社）上で撮影した。レーンは、１）分子量標準、２）ミルク誘導分画、３）ミルク分画とのインキュベーション後、抗アンギオゲニンＩｇＧ標識プロテインＧダイナビーズからの溶離液である。 図３は、アンギオゲニン欠乏残余分と３０−ｋＤａ膜を用いた限外濾過により調製されたアンギオゲニン濃縮パーミエートとを比較した電気泳動による分離を示す。レーンは、１、分子量標準；２、残余分の２Ｄ ＰＡＧＥ分析；３、残余分の１Ｄ ＰＡＧＥ分析；４、アンギオゲニン濃縮パーミエートの１Ｄ ＰＡＧＥ分析；５、分子量標準；６、アンギオゲニン濃縮パーミエートの２Ｄ ＰＡＧＥ分析である。アンギオゲニンの位置を丸で囲んで示す。 図４は、トリス−トリシンＰＡＧＥゲルを示す。ＷＧＦＥの分離、及びＷＧＦＥのＵＦ分離又はＷＧＦＥの熱沈澱によって得られた分画を示す。（レーンは、１、分子量標準；２、熱処理ＷＧＦＥ；３、熱処理ＷＧＦＥ；４、空；５、１００ｋＤａパーミエート；６、５０ｋＤａパーミエート；７、３０ｋＤａパーミエート；８、１０ｋＤａパーミエート；９、空；１０、未分画ＷＧＦＥ）。アンギオゲニンの位置を黒三角で示す。 図５は、アンギオゲニン単離のためのセファクリルＳ−１００ＨＲによるＷＧＦＥの分離を示す（−２８０ｎｍシグナルにおける吸光度、−フラクションコレクターシグナル、｜プールスタート／エンド）。 図６は、アンギオゲニン単離のためのセファクリルＳ−３００ＨＲによるＷＧＦＥの分離を示す（−２８０ｎｍシグナルにおける吸光度、−フラクションコレクターシグナル、｜プールスタート／エンド）。 図７は、アンギオゲニン単離のためのスーパローズ１２によるＷＧＦＥの分離を示す（−２８０ｎｍシグナルにおける吸光度、−フラクションコレクターシグナル、｜プールスタート／エンド）。 図８は、ＷＧＦＥの分離及びＷＧＦＥのＳＥＣ分離によって得られた分画を示すトリス−トリシンＰＡＧＥゲルである（レーンは、１、未分画ＷＧＦＥ；２、空；３、Ｓ−１００ＨＲプールＡ；４、Ｓ−１００ＨＲプールＢ；５、Ｓ−１００ＨＲプールＣ；６、Ｓ−１００ＨＲプールＤ；７、空；８、Ｓ−１００ＨＲプールＥ；９、空；１０、分子量標準である）。アンギオゲニンの位置を黒三角で示す。 図９は、ＷＧＦＥの分離及びＷＧＦＥのＳＥＣ分離によって得られた分画を示すトリス−トリシンＰＡＧＥゲルである（レーンは、１、空；２、Ｓ−３００ＨＲプールＡ；２、Ｓ−３００ＨＲプールＡ；３、Ｓ−３００ＨＲプールＢ；４、Ｓ−３００ＨＲプールＣ；５、空；６、スーパローズ１２プールＡ；７、スーパローズ１２プールＢ；８、空；９、未分画ＷＧＦＥ；１０、分子量標準である）。アンギオゲニンの位置を黒三角で示す。 図１０は、ミルク誘導タンパク質溶液をｐＨ３〜５、ｐＨ５〜６．５、ｐＨ６．５〜８及びｐＨ８〜１１の各分画に分画して行った溶液内等電点電気泳動実験におけるタンパク質分離の二次元ゲル電気泳動分析を示す。ｐＨ８〜１１の分画中約８０％のタンパク質がアンギオゲニンとして同定される。

本発明者らは、入手容易な出発物質、ミルク、特にウシ乳から効率的な方法でアンギオゲニンを濃縮及び単離可能ならしめる方法の必要性を認識してきた。これらの方法には高度に精製されたアンギオゲニン分画を研究スケールで提供するものもあり、また、商業的に実施可能なプロセスを提供するものもある。

本発明の第一及び第二の態様においては、アンギオゲニンタンパク質と相互作用する捕捉剤を用いて、ミルク試料に存在するアンギオゲニンタンパク質を、試料中に存在する他のタンパク質や物質から分離する方法が提供される。

本発明の第一又は第二の態様の更なる実施形態においては、ミルク試料を前記捕捉剤又は抗体と接触させる前に、前記捕捉剤又は抗体の非存在下において前記ミルク試料を前処理用支持体及び分離支持体に添加することによって、ミルク試料中に存在し前記支持体と非特異的に相互作用する物質がミルク試料から除去される。

本発明の第一又は第二の態様の一実施形態においては、前記支持体はポリマー系及び／又はアガロース系である。例えば、前記支持体はダイナビーズプロテインＧであってもよい。

本発明の第一又は第二の態様の更なる実施形態においては、前記抗体はポリクローナル抗体又はモノクローナル抗体であるが、モノクローナル抗体であることが好ましい。適切な抗ウシアンギオゲニン抗体としては、忠北大学校（大韓民国、忠北道、清洲）の生化学科より得られるモノクローナル抗体クローン番号１Ｂ１４Ｄ４が挙げられる。

本発明の第一又は第二の態様のより更なる実施形態においては、前記捕捉剤又は抗体は共有結合によって支持体に固定化されている。

本明細書において「捕捉剤」とは、アンギオゲニンタンパク質と「相互作用」できてアンギオゲニン−捕捉剤複合体を生成するものを言う。好ましくは、この相互作用によりアンギオゲニンタンパク質を固定化せしめる。理想的には、この捕捉剤はミルク試料に存在するアンギオゲニンタンパク質のみに特異的であるが、当業者であればミルク試料の他の成分も捕捉剤と非特異的に相互作用し得ることが理解されよう。従って、最小限の非特異的結合性を示す捕捉剤が選ばれる。

適切な捕捉剤は特に限定されないが、アンギオゲニンに対する抗体、ぺプチド又はタンパク質（アンギオゲニンに結合するもの、例えばフォリスタチンを含む）、化学物質、レセプター、リガンド、アプタマー、多糖類、脂質、ホルモン等が挙げられる。捕捉剤は抗体又はそれらの機能フラグメントであることが好ましい。

一実施形態においては、前記捕捉剤は、配列の同一性が３０％であるにもかかわらずリボヌクレアーゼ４とアンギオゲニンとを区別できる。

前記捕捉剤とアンギオゲニンとの相互作用は、アンギオゲニンが最終的に捕捉剤から単離できるよう可逆的である必要がある。この相互作用は直接的であり得るが、捕捉剤のアンギオゲニンへの相互作用が、例えば捕捉剤とアンギオゲニンを結合させるリンカー分子、ペプチド等の第三（又はそれ以上）の剤によって媒介されるよう間接的であってもよい。

一実施形態においては、前記捕捉剤は支持体に結合するか「固定化」される。本明細書において「支持体」とは、捕捉剤が結合する物質のことを意味する。この支持体は固体の支持体であってもよい。適切な支持体の例としては、セファロース、ニトロセルロース、ナイロン、ポリビニリデンジフルオライド（ＰＶＤＦ）、ガラス、プラスチック、ゲル、ゾル、セラミック、金属及びこれらの誘導体等のポリマー系及び／又はアガロース系マトリックス支持体が挙げられる。

捕捉剤は支持体に直接的に或いは間接的に結合することができる。捕捉剤は支持体上に高密度で直接的に或いは間接的に付着することができる。例えば、プロテインＡ又はＧは支持体にプリントすることができる。次いで、アンギオゲニンに対する抗体等の捕捉剤は、プロテインＡ又はＧとの相互作用によって支持体とカップリングすることができる。この方法は、抗体の定常領域をプロテインＡ又はＧと結合させることにより、抗体の可変領域（アンギオゲニン結合ドメイン）をアンギオゲニンと相互作用するように完全に露出させることができる点で有利である。

また、捕捉剤は、ポリマー、エラストマー或いは他の適切な膜材料からなる膜である支持体に結合することもできる。このような材料の例としては、限定されないが、ＰＶＤＦ、ニトロセルロース、ナイロン及びこれらの変性体が挙げられる。本発明は、ノーザンブロット解析、サザンブロット解析又はウエスタンブロット解析で用いる当業者に知られているようないずれの材料の使用も意図している。本発明の目的に望ましい膜の特別な特徴としては、大量のアンギオゲニンタンパク質の結合する能力、アンギオゲニンタンパク質を最小の変性で結合する能力、及びミルク試料中に存在する非アンギオゲニン成分の結合を最小限とする能力が挙げられる。

第一及び第二の態様は、アンギオゲニンと捕捉剤として作用するアンギオゲニン抗体との間の可逆的親和性相互作用に依存する。

このように抗体を用いる本発明の方法は、通常、イムノアフィニティークロマトグラフィーと呼ばれる。この際、アンギオゲニン特異的抗体は支持体上に固定化されて、活性免疫吸着剤が得られる。次いで、この活性免疫吸着剤を、精製すべき不均一なタンパク質試料を受け入れる準備の整ったカラムに充填する。タンパク質の複合体混合物を含むミルク試料をこの免疫吸着剤に添加するか、免疫吸着剤に通過させるかすると、試料中に存在するアンギオゲニンタンパク質は抗体と相互作用して、アンギオゲニン−抗体複合体を形成し、試料中に存在する他のタンパク質及び物質はカラムを通って洗いおとされる。次いで、抗体とアンギオゲニンとの可逆的な相互作用を中断して、高度精製生成物をアンギオゲニンが濃縮されたカラムからの溶出液として得る。

本明細書において、「アンギオゲニン抗体」或いは「抗体」とは、ポリクローナル及びモノクローナル抗体の両タイプを含む。更に「抗体」は、未処理のイムノグロブリン分子、キメラなイムノグロブリン分子又はＦａｂ又はＦ（ａｂ'）₂フラグメントである。本明細書において定義される抗体は単鎖抗体（ＳｃＦｖ）も含むが、これは結合Ｖ_Hドメイン及びＶ_Lドメインを含み、抗体の未変性イディオトープの構造と特異的結合活性を保持している。このような単鎖抗体は当技術分野でよく知られており、標準的な方法によって製造することができる。この抗体は、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＤ、ＩｇＥ及びＩｇＭのいずれのアイソタイプであり得る。この抗体又は抗体フラグメントは、現在知られているもの又は今後知られるであろうものを包含することは明白に理解されよう。

アンギオゲニンに対するポリクローナル抗体は、当技術分野で知られた技法によって得ることができる。例えば、ポリクローナルアンギオゲニン抗体は、ウサギ又はヤギを免疫化し、得られた血清からイムノグロブリン分画を精製することによって得ることができる。得られた抗体は、免疫源として用いたアンギオゲニンタンパク質の様々な部分と結合することができる種々の特異性を有する抗体の混合物を呈する。

アンギオゲニンに対するポリクローナル抗体は、商品として購入することもできる（例えばカルビオケム（米国）、ライフスパンバオイオサイエンス（米国）、Ｒ＆Ｄシステムズ（米国））。

ポリクローナル抗体は容易に製造することができるが、イムノアフィニティークロマトグラフィーに供するには幾つか不都合がある。例えば、ポリクローナル抗体はエピトープ特異性及び結合性に関して不均一であり、タンパク製造中に不要な抗体が微量の不純物に変化することを回避するには、高純度の抗原を用いなければならない。更に、抗体の調製は、ある免疫化動物から他への動物へ完全に再現性があるとは言えず、これにより一貫性のある物質を大量に得ることが困難となる。従って、本発明においてアンギオゲニンポリクローナル抗体は使用可能であるとはいえ、第一の選択肢とはならない。

アンギオゲニンモノクローナル抗体を使用することができる。アンギオゲニンに対するモノクローナル抗体は、培養における連続的株細胞による抗体分子の製造に提供されるいかなる技法を用いても調製することができる。これら技法は限定されないが、ハイブリドーマ法、ヒトＢ細胞ハイブリドーマ法及びＥＢＶ−ハイブリドーマ法が当業者に知られているであろう例として挙げられる。アンギオゲニンに対するモノクローナル抗体は、商品として購入することもできる（例えばアビーム（英国）、ジーンテックス（米国）、ＢＡＣＨＥＭ（米国））。

モノクローナル抗体は少量のアンギオゲニンを免疫原として用いて製造することができるが、このアンギオゲニンは高純度である必要はない。一旦ハイブリドーマ株細胞が確立すると、その株細胞を用いて、再現可能な特性を有する抗体を限りなく可能な供給量で製造することができる。更に、モノクローナル抗体は単一エピトープに結合し、均一な結合及び溶出性を有するであろう。

免疫吸着剤の性能は、抗体が固定化される支持体の種類に依存する。当業者には、効率的な免疫吸着剤は、力学的物理的安定性、適切なフロー特性、許容できる圧力低下、最小限の非特異的結合性、タンパク質-抗体相互作用のための広表面積、及び化学的安定性を有することが理想的であることが理解されよう。

この点で、通常、セファローズ等のポリマー系及び／又はアガロース系マトリックス支持体が用いられ、また、商品として入手可能である。本発明におけるイムノアフィニティークロマトグラフィー法において用いられる支持体用の適切なマトリックスの例としては、ＣＮＢｒ−活性化セファロース（ＧＥヘルスケア）、エンファーゼ（登録商標）活性化クロマトグラフィー樹脂（ピアースケミカル）、ＣＭ Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａゲル（バイオラッド）、ＥＣＨセファロース４Ｂ（ＧＥヘルスケア）、リアクティ−ゲル６Ｘ（ピアースケミカル）、プロテインＡ及びＧセファロースＣＬ ４Ｂビーズ（ピアースケミカル）、ハイトラップＮＨＳ−活性化（ＧＥヘルスケア）及びアフィプレプ１０（バイオラッド）が挙げられる。

免疫吸着剤カラムの効率的な機能は、抗体をマトリックスにカップリングさせて抗体を固定化するために利用する活性化化学に依存する。通常、共有結合が用いられる。当業者に知られているように、抗体を固相マトリックスに共有結合させるためのプロトコルは種々あるが、抗体のプロテインＡ又はＧのビーズへのカップリングが最も容易である。プロテインＡ又はＧマトリックスは抗体のＦ_cドメインに特異的に結合する。抗体が結合した後、二官能性カップリング剤による抗体のプロテインＡ又はＧへの架橋結合によって、相互作用が安定化する。

他の方法としては、活性基を含むように化学変性されたマトリックスビーズに抗体をカップリングさせる方法である。活性化されたビーズを抗体と混合すると、抗体は活性部位と相互作用して、共有結合を形成する。この方法がプロテインＡ又はＧマトリックスの使用よりも有利であるのは、タンパク質が耐えられる条件よりも過酷な条件においてビーズを活性化できるので、当技術分野で知られている一連の活性化プロトコルが利用できることにある（ポラース及びアクセン、１９７６年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．４４：p１９〜４５；スコウテンＷ．Ｈ．、１９８７年、Ｍｅｔｈｏｄｓ Ｅｎｚｙｍｏｌ．１３５：p３０〜６５も参照）。このアプローチの更なる利点には、上に明示されたような商品として入手可能な一連の活性化ビーズと、これらカップリング方法の多くが広範な変性条件に対して安定な結合をもたらすという事実とが含まれる。

活性基を生ずるためのマトリックスビーズの化学変性は、種々の方法で達成することができ、これにはカルボニルジイミダゾール、シアノゲンブロミド、Ｎ−ヒドロキシスクシンイミド（ＮＨＳ）、ヨードアセチル及びトレシルクロリドとの処理が含まれる。

活性化ビーズとアンギオゲニン抗体とのカップリングは、主に抗体上に存在する第一級アミノ基又はスルフヒドリル基によって媒介される。一例として、アフィプレプ（AffiPrep）のようなＮＨＳ−活性化マトリックスへの抗体のカップリング（アミノ基を介して）で官能化免疫吸着剤を生成させることは、次の手順にて達成することができる。エタノールに懸濁させたビーズのスラリー（５０％ｖ／ｖ）として提供される適量の活性化アフィプレプマトリックスをシンターガラス漏斗に注ぎ、液体を低真空で吸引する。漏斗に残る懸濁液をガラス棒で攪拌し、常に湿潤を維持する。活性化ビーズは氷冷の蒸留水で洗ってエタノールを完全に除去する。低真空での吸引でビーズから水を排出させ、３〜５ｍｇ／ｍＬアンギオゲニン抗体のカップリング緩衝液溶液（０．１Ｍ ４−モルスリンプロパネルスルホン酸（ＭＯＰＳ）、０．１ＭＮａＣｌ、ｐＨ７．２）を含むフラスコに、湿潤ビーズを移す。次いで、フラスコの内容物を冷室で一晩又は室温で４時間ゆっくりと混合する。このカップリングはビーズ上の活性化エステルと抗体上の反応性アミンとの反応を含み、この反応は最終的に安定なアミド（共有）結合を形成する。このカップリング工程が終了した後、ビーズを室温で静置し、次いで上澄みをアスピレーション又はデカンテーションで取り除く。次に、ブロッキング溶液（１Ｍエタノールアミン、ｐＨ８．０）を免疫吸着剤に添加し、室温で１時間ゆっくりと混合する。ブロッキング工程の終了に際し、再度ビーズを静置し、上澄みを除去する。未利用の活性化部位のブロッキングを確実とするために、ブロッキング工程を更に二度繰り返す。

次に、リガンドカップリング緩衝液（１０ｍＭ トリス ＨＣｌ、５０ｍＭ ＮａＣｌ、ｐＨ６．８）を抗体カップリングビーズに添加し、室温で１時間ゆっくりと混合する。ビーズからブロッキング溶液を確実に除去するために、この工程をもう４〜５回繰り返すことが好ましい。次いで、免疫吸着剤を適量のリガンドカップリング緩衝液に懸濁させ、必要となるまで４℃に保存する。その後、免疫吸着剤の使用の準備が整い、アンギオゲニンの結合のために重力にてカラムに充填することができる。

ミルク試料を調製したビーズのカラムに添加するに先立ち、前記カラムを適切な洗浄緩衝液にて「平衡化」することができる。適切な洗浄緩衝液の例としては、限定されず、１０ｍＭ トリスＨＣｌ及び５０ｍＭ ＮａＣｌを含むｐＨ７．０の緩衝液、１０ｍＭ トリスＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ、０．５％トリトンＸ−１００及び０．５％デオキシコール酸ナトリウムを含むｐＨ８．０の緩衝液、１０ｍＭ トリスＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５％トリトンＸ−１００を含むｐＨ８．０の緩衝液、１０ｍＭ トリスＨＣｌ、１４０ｍＭ ＮａＣｌ及び０．５％トリトンＸ−１００を含むｐＨ９．０の緩衝液、並びに１５０ｍＭ ＮａＣｌ、０．１％トリトンＸ−１００及び５０ｍＭ トリエタノールアミンを含む緩衝液が挙げられる。カラムは上述した緩衝液の一種以上で平衡化することができる。

ミルク試料を平衡化された免疫吸着剤（抗体を含む）カラムに添加するに先立ち、試料をまず別個のプレカラム（pre-column）に通すことはよく行われるが、必須ではない。プレカラムは免疫吸着剤カラムと同様の支持体を含むが、支持体に結合する抗体を有さない。この操作によって、免疫吸着剤カラムに非特異的に結合しやすい物質を試料から確実に取り除く。ミルク試料の添加に先立ち、上述の洗浄緩衝液を用いて免疫吸着剤カラムを処理したのと同様の方法によりプレカラムを平衡化する。

平衡化された免疫吸着剤カラム及びプレカラム（利用していた場合）にミルク試料を添加するに先立ち、ミルク試料から脂肪を取り除く（脱脂と呼ばれる）のが更に好ましいが、必須ではない。脂肪は、当技術分野において知られているいかなる通常手段によっても除去することができ、この手段には低速遠心分離、分離、マイクロ濾過が含まれる。必要に応じ、イムノアフィニティークロマトグラフィーに先立ち、例えば１μｍ膜を介したマイクロ濾過、レンネット処理又は酸沈澱によってカゼインを取り除くことができる。マイクロ濾過を選択する場合、カゼインは膜に残り、アンギオゲニンを含むホエイタンパク質がパーミエートに移行するであろう。

カゼインがマイクロ濾過又は他の膜プロセスによって除去される場合、パーミエートは直接的に平衡化免疫吸着剤及びプレカラム（利用していた場合）に適用され、或いは必要に応じ、パーミエートを適用前に濃縮することもできる。適切な濃縮方法としては、濾過（０．５〜１０ｋＤａ膜を用いた限外濾過、１５０〜５００Ｄａ膜を用いたナノ濾過、又は水のみ膜を浸透させる逆浸透法等）や、上述の洗浄緩衝液に再懸濁させることができる凍結乾燥法が挙げられる。

ミルク試料（未処理又は前処理済み）は、通常、プレカラム及び／又は前処理済みの免疫吸着剤カラム（即ち、固体支持体）に流速０．２〜２カラム体積／ｈで添加される。しかしながら、流速は５カラム体積／ｈまででも適切である。一旦試料全部が添加されると、上述の洗浄緩衝液の任意の一種以上を用いて一連の洗浄工程が行われる。洗浄緩衝液の添加は、カラムを通過した洗浄液の２８０ｎｍにおける吸光度がベースラインの値となるまで行う。これは、カラムから洗いおとすべき非結合タンパク質がもはや存在しないことを意味する。

抗体（捕捉剤）を介して固体支持体に結合させたアンギオゲニンは、用いた固体支持体の種類に応じて様々な方法で分離することができる。アンギオゲニンを変性する可能性がある分離条件を回避することが肝要である。当業者には理解されるように、適切な分離プロトコルを選択する際には一連の分離方略を考慮することができる。これには、酸分離、塩基分離及びカオトロピック剤の使用が含まれ得る。

酸分離は最も広範に利用される方法であり、且つ非常に効果的である。一般に使用される酸としては、グリシン−ＨＣｌ（ｐＨ２．５）及び０．０２Ｍ ＨＣｌとクエン酸ナトリウム（ｐＨ２．５）が挙げられる。しかしながら、酸に誘発された変性を回避するためには、分離の際に、分離試料を２Ｍトリスを用いて直ちに中和してｐＨ７．０、更にｐＨ８．５としなければならない。塩基分離は、通常、１Ｍ ＮＨ₄ＯＨと５０ｍＭジメチルアミンとからなる分離剤（ｐＨ１１．５）、又は１５０ｍＭ ＮａＣｌと０．１％トリトンＸ−１００とを含む５０ｍＭトリエタノールアミン溶液の分離剤による。

カオトロピック剤はタンパク質の三次構造を崩壊させるので、アンギオゲニン−抗体複合体を崩壊させるのに用いることができる。カオトロピック塩はイオン性相互作用、水素結合、場合によっては疎水性相互作用を破壊するので有用である。効果的なカオトロピックアニオンとしては、ＳＣＮ^-、ＣｌＯ₄ ^-、Ｉ^-、Ｂｒ^-及びＣｌ^-が挙げられる。効果的なカオトロピックカチオンとしてはＭｇ、Ｋ及びＮａが挙げられる。８Ｍウレア、６Ｍグアニジン−ＨＣｌ、４Ｍ ＮａＳＣＮ等の分離剤は、多くの抗体−抗原相互作用の崩壊に有効である。しかしながら、カオトロピック塩に誘導されるタンパク質の変性を最小限とするためには、素早い脱塩又は分離剤の透析が推奨される。

固体支持体から分離された試料は回収され、アンギオゲニンの存在に関して、またアンギオゲニンの濃縮度を決定するために分析される。適切な分析工程としては、存在するいずれかの汚染タンパク質に対するアンギオゲニン特異的タンパク質結合の大きさを比較するための染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリー分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ等のマススペクトロメトリー、ウエスタンブロット法やＥＬＩＳＡ等のイムノアフィニティ検出、アミノ酸分析及び配列決定、カチオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーが挙げられる。これら技法のそれぞれが当業者に知られているであろう。

本発明はその第三の態様において、ミルク試料（液相として提供される）の成分（アンギオゲニンを含む）は、前記ミルク試料の成分をそのサイズに基づいて互いに分離可能である第二の相に添加する方法を提供する。続いて、分離されたアンギオゲニンは回収することができ、実質的にアンギオゲニン濃縮生成物を提供する。

本明細書において、アンギオゲニンを含むミルクの成分における「サイズ」とは、成分の「流体力学的直径」又は「流体力学的体積」を意味するものとも解釈されるべきである。この成分の「流体力学的直径」又は「流体力学的体積」とは、液体において運動中であると仮定したときの成分の直径或いは体積を意味する。

本発明において「第二の相」とは、ミルク試料の成分のそれぞれをそのサイズに基づいて分離することができるいずれのメカニズムをも意味するものと解釈される。

一実施形態においては、第二の相は半透過性相である。「半透過性相」とは、非水相であって、ミルク試料の成分が相互作用でき、その相を通過するか或いはその相に保持される相を意味する。

「パーミエート」とは、第二の相を通過又は透過したミルク試料の成分を意味する。

「残余分」とは、第二の相に保持されたミルク試料の成分を意味する。

例えば、半透過性相は、膜又はフィルター等であってもよく、相の相対孔隙率に応じて、ミルク成分をサイズに従って分離することによる分子篩として作用する。

本発明の文脈において第二の相に「保持」される成分は、本質的に第二の相に捕捉されているか、第二の相の通過を妨げられている。第二の相に保持されている成分は、第二の相から取り除くことができる残余分の一部であろうし、それ故に第二の相を通過できない。第二の相を通過する成分はパーミエートとして回収される。

一実施形態においては、第二の相は半透過性膜である。本発明の文脈において「膜」とは「メッシュ」及び「フィルター」等と同義語である。この膜は、膜を半透過性又は「多孔性」とするいかなる物質、即ち、膜における細孔又は空隙等のサイズに応じ、物質を介した分子の通過を許容したり妨げたりできるいかなる材料からも形成することができる。適切な物質の例としては、限定されないが、ポリスルホン（ＰＳＵ）、ポリエーテルスルホン（ＰＥＳ）、セルロースアセテート、ナイロン、ポリビニリデンフルオリド（ＰＶＤＦ）、ポリテトラフルオロエチレン（ＰＴＦＥ）、ポリカーボネート、ポリエーテルイミド、及びポリアクリロニトリル等の熱可塑性物質が挙げられる。このような膜は、ミリポア、ザルトリウス、ＧＥヘルスケア（オスモニクス）、コッホメンブランシステムズ等の供給先から商品として購入することができる。

本発明の第三の態様の方法に関して、アンギオゲニンの第二の相の通過を許容するが、アンギオゲニンより大きい分子の通過は妨げる第二の相が選択されるであろう。例えば、分子量カットオフが２０ｋＤａ〜５０ｋＤａの第二の相であればいずれも使用できるであろう。

「分子量カットオフ」とは、第二の相を通過できる成分の最大分子サイズを示すと解釈される。好ましい実施形態においては、最適な第二の相の分子量カットオフは３０ｋＤａであろう。

本発明の方法を利用して、一回以上の更なる精製を行うことができることが理解されよう。この一回以上の精製の目的は、初回の精製により得られたアンギオゲニンを更に濃縮し、望まない汚染物の濃度を下げることである。これに関して、一回以上の更なる精製には、分子量カットオフがアンギオゲニンのサイズより小さい第二の相を用いることができ、例えば分子量カットオフ５ｋＤａ又は１０ｋＤａの第二の相を用いることができる。このようにして、アンギオゲニンが第二の相を通過することが防止され、第二の相に保持されることになる。次いで、必要に応じて、第二の相に保持された精製アンギオゲニンを凍結乾燥やスプレードライ等の方法を用いて乾燥させることができる。

ミルク試料を第二の相に添加した後、第二の相を強制透過させるために該試料に圧力を加えることができる。力は２９０ｐｓｉ（２０Ｂａｒ）以下、より好ましくは２１８ｐｓｉ（１５Ｂａｒ）、更に好ましくは１４５ｐｓｉ（１０Ｂａｒ）をもたらすいずれかの機構によって負荷することができる。

例えば、前記の力は、シリンジ、圧縮ガス（即ち、攪拌セル）、ポンプ、遠心又はそれらの実用的な組み合わせのいずれかによって負荷することができる。理想的には、圧力７０ｐｓｉ（５Ｂａｒ）の圧縮窒素のシリンダーによって前記の力を負荷する。

また、本発明の第三の態様の方法の変形例には、アンギオゲニンタンパク質に特異的な結合剤を用いることもできる。この原理は、アンギオゲニンと結合剤とを組み合わせると、その複合体はアンギオゲニン単独よりも大きなサイズになることにある。従って、アンギオゲニンを結合剤と共に複合体とすれば、第三の態様の方法を用いて同サイズのミルク成分から分離することができる。この点で、アンギオゲニン−結合剤複合体を保持し、且つその複合体よりサイズの小さいミルク試料の他の成分を第二の相を通過せしめる第二の相が選択されよう。

結合剤とアンギオゲニンとの相互作用は、本発明の方法を用いてアンギオゲニンを最終的に結合剤から分離させることができるよう可逆的でなければならない。この場合、結合剤及びアンギオゲニンの相対的なサイズを考慮した、この分離法を可能とする第二の相が選択されよう。従って、アンギオゲニンは第二の相に保持されてもよいし、第二の相を通過させてもよく、結合剤についてはその逆である。

本発明の範囲において、本発明の第三の態様の方法の他の変形例も考えられる。例えば、結合剤の非存在下で、最初に第三の態様の方法を行うことができる。しかしながら、アンギオゲニン−結合剤複合体を形成するように、アンギオゲニンを含む生成物を結合剤と結合させることができる。この生成物は、生成物中の非アンギオゲニン成分を除去するために、続いて更なる第二の相に添加することができる。その後、更なる第二の相に適用することにより、結合剤とアンギオゲニンとの相互作用を逆転させ、前記成分を分離することができる。

本明細書において、第三の態様に関し、「結合剤」とは、複合体と相互作用することができるか、或いは複合体を生成することができ、且つアンギオゲニンタンパク質を保持することができる物質である。この文脈において「保持」又は「保持する」とは、アンギオゲニンタンパク質を抱え込む又は結合することを意味すると解釈される。理想的には、結合剤はミルク試料に存在するアンギオゲニンタンパク質にのみ特異的であるが、当業者であればミルク試料中の他の成分も非特異的に結合剤と相互作用可能であることが理解されよう。従って、選択すべき結合剤は、最小限の非特異的結合性を示すものである。

適切な結合剤としては、限定されないが、アンギオゲニンに対する抗体、ぺプチド又はタンパク質（アンギオゲニンに結合するもの、例えばフォリスタチンを含む）、化学物質、レセプター、リガンド、多糖類、脂質、ＤＥＡＥデキストラン等のポリマー、ホルモン等が挙げられる。好ましくは、結合剤は、抗体又はその機能性フラグメントである。

この相互作用は直接的であってもよいが、捕捉剤のアンギオゲニンへの相互作用が、例えば捕捉剤とアンギオゲニンを結合させるリンカー分子、ペプチド等の第三（又はそれ以上）の剤によって媒介されるよう間接的であってもよい。

「アンギオゲニンに対する抗体」或いは「抗体」とはポリクローナル抗体及びモノクローナル抗体の両タイプを含み、第三の態様に関連した意味は第一及び第二の態様に関して上述した意味と同様である。

第三の態様の方法の分離工程に従って回収したパーミエート又は残余分は、アンギオゲニンの存在に関して、またアンギオゲニンの濃縮度を決定するために分析される。

本発明の第四の態様においては、ミルク試料の成分（アンギオゲニンを含む）をそれらのサイズに基づいて分離する他の方法が提供される。第四の態様に従って記載される方法は、通常、サイズ排除クロマトグラフィーと称される。

本発明の第四の態様において、「サイズ」とは、第三の態様に関して上述した意味と同義である。

「サイズ排除クロマトグラフィー」とは、ゲルパーミエーション、ゲルパーミエーションクロマトグラフィー、ゲル濾過又はゲル濾過クロマトグラフィーと称される各種方法を含む。以降、「サイズ排除クロマトグラフィー」とは、いかなる場合も、上に示した用語の全て、或いは他のタンパク質又は他の生体分子からサイズに基づいて目的タンパク質を分離するための同様のクロマトグラフィープロセスを意味すると解釈されるべきである。

第四の態様の方法の原理は、ミルク試料の溶液中の成分が第二の相に接触し、第二の相は、成分がそれらのサイズに基づいて第二の相と相互作用するように、及び／又は第二の相を通過するように、生成物の成分の流速に影響を及ぼすプロセスを提供することにある。試料中に存在する各種成分の運動は、これらの成分が「捕捉」された結果遅くなり、続いて第二の相から遊離されるため、生成物の成分が分離されるようになる。

本発明の文脈において「第二の相」とは、個々のミルク試料の成分の運動を成分それぞれのサイズに基づいて操作することのできるいずれかの機構を意味するものと解釈される。

第四の態様に関連して、第二の相は固相であることができる。「固相」とは、ミルク試料の成分が相互作用でき、及び／又は通過できる非水性マトリックスを意味する。この固相は、精製用カラム、個別粒子の不連続相、樹脂、膜、又はフィルター等であってもよい。固相を形成する物質の例としては、多糖類（アガロース及びセルロース等）；並びに、シリカ（例えば孔が制御されたガラス）、ポリ（スチレンジビニル）ベンゼン、ポリアクリルアミド、セラミック粒子、及びこれらのいずれかの誘導体等の他の力学的に安定なマトッリックスが挙げられる。

第四の態様の一実施形態においては、第二の相はクロマトグラフィーのカラムに充填することができる樹脂であってもよい。この際、捕捉は、成分が樹脂中の孔に進入することにより発生させることができる。孔直径より大きな分子はその孔に進入できず、素早くカラムから出てくるが、より小さな分子は樹脂の孔に進入し、カラムを通過する経路が長くなる。捕捉率及びその後の遊離率は成分によって異なり、サイズ排除による分離現象を引きおこす。

第二の相が多孔性樹脂からなる場合、理想的には多孔性構造は明確に定義され、且つバッチ間の再現性を有していなければならず、孔サイズ分布と形状はできる限り狭くなくてはならない。更に、樹脂を含むカラムのボイド体積に対する全孔体積の比は、分離のための窓口を広げるのに可能な限り高くなければならず、それによってピークキャパシティが向上する。分離の効率は、樹脂のサイズが小さく（例えば、５μｍ以下）、且つ整っていれば更に向上させることができる。そして、樹脂カラムは理想的には５ｍｍ超の直径を有し、長く（１００ｍｍ超の任意の長さ）なければならず、樹脂が高密度で充填されていなければならない。

前記樹脂は、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロース、シリカ又は架橋ポリスチレンからなっていてもよい。サイズ排除クロマトグラフィーに適切な樹脂の例としては、限定されないが、スーパローズ（ＧＥヘルスケア）、セファデックス（ＧＥヘルスケア）、セファクリル（ＧＥヘルスケア）、ＴＳＫ−ＧＥＬ（登録商標）Ｈ_HR（東ソーバイオサイエンス）、トヨパールＨＷ（東ソーバイオサイエンス）、ＴＳＫ−ＧＥＬ ＰＷ（東ソーバイオサイエンス）、ウルトロゲル（登録商標）ＡｃＡ（ＩＢＦバイオテクニクス）、Ｂｉｏ−ＧｅｌＡ（バイオラッド）が挙げられる。最も適切な樹脂は、分子量１０ｋＤａ〜２０ｋＤａのタンパク質を良好に分離できる樹脂であろう。適切な樹脂の例としては、スーパローズ１２、セファデックス７５、セファクリルＳ−１００ＨＲ、トヨパールＨＷ−５０、ＴＳＫ−ＧＥＬ ＰＷ−５０、ウルトロゲル（登録商標）ＡｃＡ５４、Ｂｉｏ−Ｇｅｌ Ａ１．５Ｍが挙げられる。前記樹脂としては、セファクリルＳ−１００ＨＲが最も好ましい。

分離用樹脂の調製（「平衡化」）と分離プロセスそれ自身に関しては、使用される緩衝液は、理想的には低い浸透圧モル濃度と中性のｐＨを有する。理想的には、適切な緩衝液の例としては、水、リン酸緩衝液、リン酸緩衝生理食塩水が挙げられるが、同様の性質を有する他の緩衝液も用いることができる。

しかしながら、アンギオゲニンは非常に安定なタンパク質であり、変性の後でリフォールドできるので、適切な緩衝液は非常に低い又は非常に高いｐＨを有することもでき、高い浸透圧モル濃度を有することもでき、また、アンギオゲニンのバイオ活性に影響を及ぼさずに後で除去することが可能な変性剤（例えばドデシル硫酸ナトリウム、ウレア又はグアニジン）を含むこともできるであろう。

クロマトグラフィーカラムは、理想的には、ミルク試料の適用に先立ち、２カラム体積（ＣＶ）超の緩衝液をカラムに通過させることにより平衡化する。平衡化の際の流速は、０．１〜３ＣＶ／ｈであろう。圧力が樹脂の許容限界を超えない場合、１ＣＶ／ｈが許容されるが、流速は０．６６ＣＶ／ｈが好ましい。また、分離の際の流速も０．１〜３ＣＶ／ｈである。０．６６ＣＶ／ｈまでのフローで十分な分離が可能であるが、流速０．３７５ＣＶ／ｈが好ましい。

平衡化カラムに適用される試料の体積は、０．００５〜０．２ＣＶ、理想的には０．０１５ＣＶ〜０．０５ＣＶまでとすることができる。適用した試料中に存在するタンパク質の量は、０．００１〜０．２ｇタンパク／ｍＬ ＣＶ、理想的には０．００１６ｇタンパク／ｍＬ ＣＶ〜０．０５ｇタンパク／ｍＬ ＣＶまでとすることができる。

通常、分離は、上述の条件下で約１〜２時間かけて起こる。理想的には、カラムを出た分離分画をＵＶ分光光度計にて２８０ｎｍでモニターする。イムノグロブリン、ラクトフェリン及びラクトペルオキシダーゼに続き、アンギオゲニンが溶出するが、多くの成長因子よりは先に溶出する。各分画を回収して、アンギオゲニンが捕捉されていることを確認する必要がある。ラクトフェリンとラクトペルオキシダーゼの重なり合うピークは緑褐色のバンドとして可視化されるはずであり、この緑褐色のバンドが無くなるまでは分取を開始する必要はない。カラムを通して全てのβ−ラクトグロブリンが除去されると、次のピークがアンギオゲニンとなる。

本発明の第五の態様においては、ミルクからアンギオゲニン濃縮生成物を提供するための方法であって、ミルク試料の流れが電場を通り抜けることにより、ミルク試料に存在するアンギオゲニンタンパク質がその試料に存在する他のタンパク質から、アンギオゲニンの電荷と電気泳動の移動度に従って分離又は分画される方法が提供される。従って、ミルク試料は「水性ミルク流」として提供される。

電場が印加されたミルク流の分画を回収し、アンギオゲニンが濃縮されたこれら分画を同定する。

本発明の第五の態様に係る方法は、不均一なタンパク質群を電気泳動移動度又は等電点に従って分離するための電場の使用に基づく。この技法は、キャリアフリーの媒体、即ち固定相（即ち固体支持材料）を含まない液体（水性）媒体においてタンパク質を分離することによって、吸着による試料損失を最小限とすることに基づく。この種の技法は、通常、フリーフロー電気泳動と呼ばれる。

本発明の第五の態様における一方法は、互いに平衡に位置される二枚の近接するプレートからなる電気泳動チャンバーにおいて行うことができる。これらのプレートの側部には、プレート間に高電位の電場を発生させる二個の電極（アノードとカソード）が配設されている。緩衝液媒体は、通常「分離緩衝液」と呼ばれ、定速で前記チャンバーを流れ、緩衝液媒体及び精製対象のミルク試料の両者の流れを横断する方向に電場が印加される。

第五の態様の文脈において「横断する」とは、緩衝液媒体とミルク試料の流れに対して、ある角度で（即ち平衡でない）或いは異なる平面において電流を印加することを言う。

分析対象の試料は荷電場に適用され、層流条件下、試料は二枚のプレート間の緩衝液媒体内に移送される。荷電粒子はその電荷特性に依存して偏向し、後続の分離を可能とする。各タンパク質は異なる電荷を有するために、その電場中での電気泳動移動度も異なる。従って、各タンパク質は、電気泳動チャンバーの分離緩衝液を流れる間に分離緩衝液の流速に応じて偏向し分離する。この方法は、タンパク質の連続的な分離に利用することができるため、工業的スケールのアンギオゲニンの分離及び精製に有効である。

多数のフリーフロー電気泳動の技法が当技術分野において知られており、種の分離の方式によりそれぞれ区別される。例えば、分離種は、それらのｐＩ（等電点電気泳動）、全電荷密度（ゾーン電気泳動）及び電気泳動移動度（等速電気泳動、フィールドステップ電気泳動及びフィールドフロー分画）に従って分離することができる。

フリーフロー電気泳動技法は、例えば、連続モード又は一時停止（インターバル）モード等の各種方式にて行うことができる。連続モード適用の場合、ミルク試料を連続的にチャンバーに適用することにより、試料中の他の成分からアンギオゲニンを分離する。この際、分離プロセス全体を通して、緩衝液媒体（分離緩衝液）の連続フロー及び電場の無制限印加の条件下で行う。インターバルモードにおいては、ミルク試料及び分離緩衝液はチャンバーの分離スペース又は「ゾーン」に導入され、続いて分離を達成するための電場が印加されながら、前記試料を含む媒体のバルクフローが停止する分離プロセスが行われる。試料を分離／分画した後、電場をオフにするか無効となるように弱めるかして、バルクフローを再開し、分画試料をチャンバーから移動させた後に回収する。

フリーフロー電気泳動技法は、変性条件下、例えばウレア又は当技術分野で知られている洗浄剤を添加することにより行うこともできる。当業者であればアンギオゲニンのｐＩがその天然状態のｐＩと類似することが理解されよう。

第五の態様における一方法は、上述の各種フリーフロー電気泳動技法のそれぞれを包含することができる。好ましくは、連続モードによってｐＩに従い、ミルク試料からアンギオゲニンを分離する。

これに関して、当業者には理解されるように、適切な緩衝液媒体、即ち分離緩衝液の例としては、限定されないが、二元緩衝液システム（Ａ／Ｂ媒体）、セルバライト（登録商標）（セルバ、ドイツ）等の市販の両性電解質、プロライトセパレーション緩衝液Ｉ及びＩＩ（ベクトンディッキンソンダイアグノスティックス、ドイツ）等の相補的マルチペア緩衝液システム及び揮発性緩衝液システムが挙げられる。更に、フリーフロー電気泳動に適した分離媒体のリストが「フリーフロー電気泳動」、Ｋ．ハンニング及びＫ．Ｈ．ハイドリッヒ著（ＩＳＢＮ：３−９２１９５６−８８−９）に提供されている。

ｐＩに従ってアンギオゲニンを分離するためには、前記緩衝液媒体として、チャンバーの分離スペースにｐＨ勾配を形成するのに適切な媒体が選択されるであろう。これに関しては、プロライトセパレーション緩衝液Ｉ及びＩＩが好ましい。セパレーション緩衝液Ｉは２９％のＩＥＦプロライト緩衝液２を含み、セパレーション緩衝液ＩＩは１７％のプロライト緩衝液２、５０ｍＭ ＨＥＰＥＳ及び４２ｍＭ ６−アミノヘキサン酸を含む。

「ｐＨ勾配」とは、ｐＨに関して観察される急峻な境界がないことを意味する。この定義によれば、等電点電気泳動装置におけるｐＨ勾配のグラフは、所定の部分にシャープな遷移のない、比較的なめらかなカーブとして表わされるであろう。アンギオゲニン分離のためには、この勾配はｐＨ８〜１１の範囲であることが好ましい。

第五の態様に係る方法は、安定化媒体及びカウンターフロー媒体を添加することによって改善することができる。例えば、カウンターフロー媒体は、電極間を移動するバルク分離緩衝液及び試料の連続フロー方向と対峙する分離スペースに導入することができる。

安定化媒体は、例えば、適切な二元緩衝液システムによって作られる分離スペース内の条件を安定化するために用いることができる。従って、適切な安定化媒体は、分離ゾーン内のイオンを供給又は置換する「リザーバー」としても作用する。

本明細書において「安定化媒体」とは、二成分からなる媒体を言う。第一成分はカソード安定化媒体であり、第二成分はアノード安定化媒体である。カソード又はアノード安定化媒体は、一塩基酸及び／又は単一タイプの塩基を含むことができる。当業者は、安定化媒体中に生成するイオンが十分に低い電気泳動移動度を有する必要があることを理解するであろう。

アンギオゲニンの効率的な分離と精製のために適切なアノード安定化媒体は１００ｍＭ硫酸、５０ｍＭ酢酸、１００ｍＭ ＤＬ−２−アミノ酪酸及び３０ｍＭグリシルグリシンからなり、適切なカソード安定化媒体は１００ｍＭ水酸化ナトリウム、３０ｍＭエタノールアミン及び３００ｍＭβ−アラニンからなる。

本発明のフリーフロー電気泳動法を行うのに適切な装置は、商品として入手可能である。例えば、ベクトンディッキンソンＦＦＥシステム（ＢＤダイアグノスティックス、ドイツ）である。

ミルク試料を電場に投入する前にミルク試料から脂肪を除くこと（脱脂と呼ばれることが多い）が好ましいが、これは必須ではない。脱脂方法は当技術分野において知られており、次にそのような方法の例を挙げる。また、フリーフロー電気泳動法に先立ち、当技術分野において知られた方法でカゼインを除去することもできる。次にそのような方法の例を挙げる。

カゼインがマイクロ濾過又は他の膜プロセスにより除去される場合、パーミエートはフリーフロー電気泳動装置に直接適用することも、或いは任意的に適用前に前記パーミエートを濃縮することもできる。適切な濃縮方法としては、濾過（０．５〜１０ｋＤａ膜を用いた限外濾過、１５０〜５００Ｄａ膜によるナノ濾過、水のみ膜を浸透させる逆浸透法等）、及び凍結乾燥とそれに続くフリーフロー電気泳動に適う緩衝液中への再懸濁が挙げられる。

第三、第四、第五の態様の方法を行う前に、ミルク試料から脂肪を除くこと（脱脂と呼ばれることが多い）が好ましいが、これは必須ではない。脂肪は当技術分野において知られたいずれの手段によっても除去することができ、この手段には低速遠心分離、分離、マイクロ濾過が含まれる。

脱脂されたミルク試料は、第三、第四、第五の態様の方法を行う前に任意的に更なる「コンデショニング」工程に付すことができる。このような工程は、試料をアニオン交換カラムに通すことを含むことができる。このような方法は当技術分野において知られている。例えば、アニオン交換カラムには官能基を有する樹脂を充填することができる。官能基としては、ＤＥＡＥ（ジエチルアミノエチル）、Ｑ（第四級アンモニウム）、ＱＡＥ（ジエチル−（２−ヒドロキシプロピル）アミノエチル）が挙げられ、これらはセルロース、ポリアクリルアミド、デキストラン、アガロース、シリカ、又は架橋ポリスチレン等の適切な支持体に結合する。脱脂されたミルク試料を、前記カラムに流速１０ＣＶ／ｈ（１０００ＣＶ／ｈまで可能であるが）で通過させるが、前記カラムに１０ＣＶの脱脂ミルクが適用される（０．１ＣＶ〜５０ＣＶまで可能であるが）まで行う。β−ラクトグロブリン、α−ラクトアルブミン、及びウシ血清アルブミン等のタンパク質が除去されることが期待されるであろう。クロマト処理後の試料に残存するタンパク質は、主にラクトフェリン（ＬＦ）、ラクトペルオキシダーゼ（ＬＰ）、及びイムノグロブリンであろうが、アンギオゲニンも濃度＜１％ｗ／ｗタンパクで存在するであろうし、これは更に精製することが可能であろう。

第一〜第五の態様のそれぞれについての他の実施形態においては、前記ミルク試料は該方法の実施に先立ち加熱される。ミルク試料の加熱により、試料中でアンギオゲニンよりも低い温度で変性する他のタンパク質とラクトペルオキシダーゼの量を低減させることができ、これによってアンギオゲニンの量が増加する。

第一〜第五の態様の方法によって得られた分画は、アンギオゲニンの存在に関して、またアンギオゲニンの濃縮度を決定するために分析することができる。適切な分析工程としては、存在するいずれかの汚染タンパク質に対するアンギオゲニン特異的タンパク質バンドの大きさを比較するための染色ＳＤＳ−ＰＡＧＥのデンシトメトリー分析、ＭＡＬＤＩ−ＴＯＦ／ＴＯＦ ＭＳ等のマススペクトロメトリー、ウエスタンブロット解析やＥＬＩＳＡ等のイムノアフィニティ検出、アミノ酸分析及び配列決定、カチオン交換クロマトグラフィー及び逆相クロマトグラフィーが挙げられる。これら技法のそれぞれが当業者に知られているであろう。

第一〜第五の態様に係る方法は、アンギオゲニン濃縮生成物を得るための単離において行われるか、或いは他の望ましいミルク製品成分が分画される統合分画プロセスの一部として組み入れられることができる。

第一〜第五の態様の方法によって得られたアンギオゲニン濃縮生成物は更に処理されて、残存する非アンギオゲニンタンパク質及び／又は塩類を除去することができる。これは、標準化された食品用物質又は栄養補助食品の製造及び医薬品級のアンギオゲニンの調製にとって重要であると考えられる。これらの工程は、カチオン交換クロマトグラフィー、一以上の更なるフリーフロー電気泳動工程、イムノアフィニティークロマトグラフィー、膜濾過、理想的な限外濾過、或いは透析、例えば、電気透析、サイズ排除クロマトグラフィー、固相抽出、ナノ濾過又は他の知られた手段等の当技術分野において知られているような同様の方法によって達成することができる。当業者には、アンギオゲニンを食品用物質又は栄養補助食品の製造に使用する場合、その純度は医薬組成物又は獣医学組成物の製造に要求されるほど高い必要はないことが理解されよう。例えば、６０％レベルに精製されたアンギオゲニンは許容されると考えられる。

アンギオゲニンは多くの生理的機能に関与するので、本発明の方法により本タンパク質を濃縮すると、これらの機能を発揮するのが可能なタンパク質の理想的、且つ経済的な原料となる。例えば、この精製タンパク質は食品用物質、栄養補助食品、医薬品又は獣医学品の調製に用いることができる。

第一〜第五の態様のいずれかのより更なる実施形態においては、本方法の前又は最中に前記ミルク試料からカゼインを除去する。ミルク試料のタンパク質を本方法の前又は最中に濃縮することができる。

適切なミルク試料としては、全乳、スキムミルク、バターミルク、ホエイ（酸又はチーズ／レンネット処理ホエイ、或いはミルク若しくはスキムミルクのマイクロ濾過より得られるパーミエート等）、ホエイ分画（濃縮ホエイタンパク又はホエイタンパク単離フロースルー等）及び初乳が挙げられる。

ミルク試料は雌ウシ（cows）、ヒツジ、水牛、ヤギ、ヤク、シカ等の反芻動物、ウマ及びロバを含む非反芻動物、ヒト等の霊長類及びブタ等の単胃動物等の泌乳動物から得られることは当業者には明らかであろう。この動物は、遺伝子組換え動物、特に同じ野生型動物に比べ、ミルク中により大量のアンギオゲニンを発現するよう改変された動物であってもよい。

第一〜第五の態様の方法のいずれかにおいては、牛全乳、任意的にはミルク中にアンギオゲニンを過剰発現する遺伝子組換え雌ウシから誘導されるスキムミルクをミルク試料として用いることが好ましい。

更に、ウシ乳中のアンギオゲニンは、泌乳の最初の１〜１４日目までが最も高濃度（１２ｍｇ／Ｌまで）に存在することが分かっている。その後、この濃度はベースレベルの約１〜２ｍｇ／Ｌに落ちる。従って、本発明の方法においては泌乳の最初の１４日目以内に得られる牛乳を用いることが好ましい。最後の泌乳からアンギオゲニン濃度が変わらなければ、引き続きアンギオゲニン濃縮用の原料として用いることができる。

「アンギオゲニン濃縮生成物」とは、産物中のアンギオゲニンタンパク質対全タンパク質の比が、本発明の方法を実施する前のミルク試料に存在する比に対して増加したことを意味すると解釈される。アンギオゲニンが濃縮されたと考えられるためには、生成物のアンギオゲニン含有量が、少なくとも２％ｗ／ｗ、少なくとも１０％ｗ／ｗ、少なくとも２０％ｗ／ｗ、少なくとも３０％ｗ／ｗ、少なくとも４０％ｗ／ｗ、少なくとも５０％ｗ／ｗ、少なくとも６０％ｗ／ｗ、少なくとも７０％ｗ／ｗ、少なくとも８０％ｗ／ｗ、少なくとも９０％ｗ／ｗ、少なくとも９５％ｗ／ｗ、又は少なくとも９９％ｗ／ｗでなければならない。

第一〜第五の態様の方法の文脈において「生成物」とは、本発明をアンギオゲニン濃縮最終製品に限定すること意図する用語ではない。本発明の方法により製造されたアンギオゲニン濃縮生成物は、他の製品の製造における出発品又は中間品として使用することができる。

本明細書において「分画」とは、ミルク試料の部分的精製部分を意味する。

「効率的及び商業的に実施可能」という表現の使用は、アンギオゲニンの濃縮に現在利用されている方法に比べて安価で迅速な方法を意味すると解釈される。

アンギオゲニンが存在することにより利益を生み出す典型的な食品用物質には、虚弱者、病人又は高齢者用のスポーツ栄養サプリメント、幼児食サプリメント及び食品サプリメントが含まれる。

本明細書において「栄養補助食品」とは、食品から単離・精製される可食製品を意味し、ミルク試料から得られる場合、経口投与した際に生理的利点を示し、また急性・慢性の疾患又は障害の、防止又は軽減を提供することを示す製品である。従って、栄養補助食品は、単独或いは食品・飲料に混合して、食物製剤又はサプリメントの形態とすることができる。

食品組成物又は栄養補助食品組成物は、溶解性粉末、液体又は即席飲料の形態とすることができる。或いは、手軽に食べられるバーや朝食シリアル等の固形物とすることができる。この組成物は、種々のフレーバー、ファイバー、甘味料、他の添加物等を含むことができる。

前記食品又は栄養補助食品は、好ましくは許容される官能的特性（許容される香り、味、風味等）を有し、ビタミンＡ、Ｂ１、Ｂ２、Ｂ３、Ｂ５、Ｂ６、Ｂ１１、Ｂ１２、ビオチン、Ｃ、Ｄ、Ｅ、Ｈ及びＫ、カルシウム、マグネシウム、カリウム、亜鉛及び鉄から選択される一以上のビタミン及び／又はミネラルを更に含むことができる。

食品組成物又は栄養補助食品組成物は、従来通り、例えばタンパク質と他の添加物をブレンドして製造することができる。必要であれば、乳化剤を含ませることもできる。この時点でビタミン及びミネラルを追加することもできるが、通常は、熱による変性を避けるために後で加える。

粉末状の食品組成物又は栄養補助食品組成物を製造したい場合、タンパク質を粉末状の追加成分と混和することができる。この粉末は、水分量約５質量％未満でなければならない。水、好ましくは逆浸透処理済の水を更に混合して、混合液体としてもよい。

食品組成物又は栄養補助食品組成物を即席液体として提供する場合、バクテリアを低減するために組成物を加熱することができる。液状の食品組成物又は栄養補助食品組成物を製造したい場合、液体混合物を好ましくは無菌状態で適切な容器に充填する。容器への無菌充填は、当業界で通常可能な技法により行うことができる。この種の無菌充填に好適な装置は市販されている。

本発明の方法により得られるアンギオゲニン濃縮生成物は、被験体への投与に適した医薬組成物又は獣医学組成物として調製することもできる。

好ましくは、本組成物は、一以上の医薬的に許容される担体、希釈剤又は賦形剤を含むこともできる。このような組成物は、中性緩衝生理食塩水、リン酸緩衝生理食塩水等の緩衝液；グルコース、マンノース、スクロース又はデキストラン等の炭水化物；マンニトール；タンパク質；ポリペプチド又はグリシン等のアミノ酸；酸化防止剤；ＥＤＴＡ等のキレート剤；補助剤及び保存剤を含むことができる。本発明の組成物は、経静脈投与用、局所適用用、経口摂取用に調製することができる。

本明細書において「被験体」とは、医薬的に活性な剤により治療又は予防を必要とする障害を有するいずれかの動物を意味する。この被験体は哺乳類、好ましくはヒトであってもよく、或いはヒト以外の霊長類又は動物モデル試験に用いられるような非霊長類動物であってもよい。

アンギオゲニン濃縮生成物は、ヒトの医学的治療に好適に用いられることが特に期待されるが、獣医学的治療にも適用でき、これにはイヌ、ネコ等のペット動物、及びウマ、ポニー、ロバ、ラバ、リャマ、アルパカ、ブタ、畜牛及びヒツジ等の家畜、或いはヒト以外霊長類、ネコ類、イヌ類、ウシ類及び有蹄類等の動物園飼育動物の治療が含まれる。

アンギオゲニン濃縮生成物は、治療及び／又は予防される疾病に対する適切な方法で被験体に投与することができる。投与の量及び回数は、被験体の状態、被験体の疾病の種類及び／又は重度等の因子によって決定される。適切な用量は、臨床試験によって決定してもよい。本組成物の有効量は、被験体個々に差がある年齢、体重、疾病の重度、被験体の状態、投与経路、被験体の治療に関する他の因子全てを考慮して、医師によって決定することができる。本質的に、組成物の「有効量」とは、所望の治療効果を得るのに十分な量である。

本発明は他の態様において、疾病の治療及び／又は予防の方法を提供する。このような治療方法は、上述の栄養補助食品、医薬組成物又は獣医学的組成物の有効量を被験体に投与することを含む。好ましくは、このような疾病はウイルス、バクテリア又は真菌及びそれらの毒素によって起こされる疾病を含む。しかしながら、アンギオゲニンは血管新生の役割を担うため、血管新生刺激が必要とされる疾病も、本発明のアンギオゲニン含有組成物を用いて治療することができる。これら疾患としては、冠動脈疾患、卒中、虚血性肢疾患、障害治癒の遅延等が挙げられる。

本明細書において「治療する」及び「治療」とは、症状の重度及び／又は頻度の低減、症状及び／又はその原因の除去、症状発生及び／又はその原因の予防、及び障害の改善及び治療を意味する。従って、例えば、本発明の障害の「治療」方法は、障害に罹りやすい個体における障害の予防と、臨床的に症状がある個体における障害の治療との両者を含む。

本明細書において「治療する」とは、脊椎動物や哺乳類（特にヒト）における症状の治療又は予防のいずれもにも亘り、且つ症状の阻止、即ちその進展を止めること、或いは症状の影響の緩和又は改善、即ち症状の影響を後退させることを含む。

本明細書において「予防」又は「予防的」治療とは、症状に罹りやすい可能性はあるが、未だその症状を有するとは診断されていない被験体において、症状の発生を予防すること、或いは症状のその後の進展を改善することを含む。

本明細書において、特に断りのない限り、「含む、からなる」とは、述べられている一構成要素や一完全体、或いは構成要素群や完全体群を含むが、その他の一構成要素や一完全体、或いは構成要素群や完全体群を排除するものではないことを意味すると解釈されたい。

本明細書においては、文脈上明確に断らない限り単数表現（一、一の、一つの、その）は複数概念も含むことを付記する。

本発明について、明確さ及び理解のために、ある種の詳細な説明をしているが、本明細書に開示される発明概念の範囲を逸脱しない限り、記載される実施形態及び方法の変形や改変が可能なことは当業者には明白であろう。

以下、実施例を参照して本発明を更に詳細に説明するが、これは単に説明の目的に提供されるものであって、特に断りのない限り、本発明は実施例に限定されない。従って、本発明は、ここに提供される教示の結果として明らかとなる全てのいかなる変形例をも包含する。

[実施例１]：第一及び第二の態様の方法(イムノアフィニティークロマトグラフィー)を用いてスキムミルクからアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法

イムノアフィニティークロマトグラフィー法の概説は既に為されているが、アンギオゲニン精製については言及していない（例えば、スブラマニアンＡ、２００２年、モレキュラーバイオテクノロジー、２０：ｐ４１〜４７を参照）。

本出願人らは、本明細書に開示する方法を用いることにより、ミルク試料からアンギオゲニンを抽出できることを示す。

本実施例に利用されるイムノアフィニティークロマトグラフィー法は、適切な原料、例えば、モナシュ抗体テクノロジーファシリティ（オーストラリア）から得られるアンギオゲニンに対するモノクローナル抗体を用いて行う。

１０ｃｍ長のカラムにＳＰセファロースビッグビーズ（ＧＥヘルスケア）をカラム中の全ベッド体積が２９．７Ｌとなるように充填した。ウシスキムミルクを線流量３３１ｃｍ／ｈ（１時間あたり、樹脂１Ｌに対してスキムミルク３４Ｌ）で２時間カラムに流通させ、適用したスキムミルクの体積がカラムに充填した樹脂の６８倍となるようにした。

２．５カラム体積（ＣＶ）の水を線流量１４７ｃｍ／ｈ（１時間あたり樹脂１Ｌに対して緩衝液１５Ｌ）、或いは０．２５ＣＶ／ｍｉｎで１０分間加えることにより、カラムに残存するミルクを除去した。

本実施例に利用されるイムノアフィニティークロマトグラフィー法は、アンギオゲニンに対するモノクローナル抗体を用いて行った。抗ウシアンギオゲニン抗体としては、忠北大学校（大韓民国、忠北道、清洲）の生化学科から得たモノクローナル抗体クローン番号１Ｂ１４Ｄ４を用いた。抗ヒトアンギオゲニン抗体としては、モノクローナル抗体クローン番号１４０１７（Ｒ＆Ｄシステムインコーポレーテッド）を用いた。

ダイナビーズプロテインＧ（インビトロゲン）を固体支持体として用いた。アンギオゲニン抗体は、次のプロトコルを利用してビーズに共有結合させた。アフィニティー精製用のプロテインＧダイナビーズは、２０秒間の短いボルテックスにより調製した。ボルテックスを行った後、５０μＬの再懸濁させたＩｇＧダイナビーズを保存溶液（インビトロゲン）から移した。マグネットスタンドを用い、プロテインＧダイナビーズに１分間の沈降処理を施した。上澄みを取り除き、続いてプロテインＧダイナビーズを２００μＬのＷ＆Ｂ緩衝液（０．１Ｍリン酸ナトリウム緩衝液、０．０１％Ｔｗｅｅｎ２０含有、ｐＨ８．２）で洗浄した。このプロセスを繰り返した。約５μｇのウシ又はヒト抗アンギオゲニンマウスモノクローナル抗体を含むＷ＆Ｂ緩衝液（２００μＬ）をプロテインＧダイナビーズに添加した。この溶液を室温で１０分間回転させながらインキュベートした。プロテインＧダイナビーズを沈降させ、上澄みを取り除いた。このＩｇＧ標識プロテインＧダイナビーズを２００μＬのＷ＆Ｂ緩衝液で洗浄した。このＩｇＧ標識プロテインＧダイナビーズを沈降処理に付し、上澄みの洗浄緩衝液を除いた。この洗浄工程を繰り返した。ウシアンギオゲニンの溶出には、変性条件を採用した。ＩｇＧ標識プロテインＧダイナビーズに吸着されたウシアンギオゲニンを２０μＬの１ｘＮｕＰＡＧＥＬＤＳサンプル緩衝液（インビトロゲン、２％ドデシル硫酸リチウム及び２−メルカプトエタノール含有）に再懸濁し、７０℃で１０分間加熱した。このダイナビーズをマグネット上に置き、試料を除いてタンパク染色（図１）及びウエスタンブロット解析（図２）のための１−Ｄゲルにロードした。

[実施例２ａ]：第三の態様の方法（限外濾過）を用いてスキムミルクからアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法

ＳＰ（スルフプロピル）セファロースを充填したカラムにウシスキムミルクを適用した。適用したミルクの体積がカラムに充填した樹脂の７０倍となるまで、ミルクを適用した（１０００ＣＶまで適用可能）。カラムに残存するミルクを６ＣＶの水（低イオン強度緩衝液、＜０．００８Ｍ ＮａＣｌ又は当量物）を用いて１０分間かけて取り除いた。ホエイ成長因子を含む分画を、０．４〜０．５ＭのＮａＣｌ（最も好ましくは０．４Ｍ ＮａＣｌ）に相当するナトリウムイオン（他のカチオンも適切ではあるが）を含む６ＣＶの緩衝液を用いてカラムから溶出させた。ｐＨ５．５〜７．５の範囲において、ＷＧＦＥの収率は最も高い。ＷＧＦＥを５ｋＤａ膜に適合した限外濾過プラントにおいて透析濾過により脱塩し、凍結乾燥させた。

ＷＧＦＥ（１ｇ）を、０．２％トリトンＸ−１００を含む５０ｍＬの水に溶解した。この溶液を３０ｋＤａの分子量カットオフの膜（ビバスピン）に適用し、２０℃、８，０００ｘｇで１．５時間遠心した。

パーミエート及び残余分のタンパク質濃度を２Ｄ−クオントキット（ＧＥヘルスケア）を用いて測定した。タンパク質は５体積の氷冷アセトンで沈澱させ、沈殿物を１０，０００ｘｇで２０分遠心することによりパーミエート及び残余分として回収した。この沈殿物は、７Ｍウレア、２Ｍチオウレア、１．２％ＣＨＡＰＳ、０．４％ＡＳＢ−１４、１０ｍＭトリスＨＣｌ及び０．０５％キャリアー両性電解質を含む２Ｄ−電気泳動緩衝液に再懸濁させた。タンパク質はトリブチルホスフィンで還元し、アクリルアミドモノマーでアルキル化した。タンパク質（１００μｇ）を２４ｃｍ、ｐＨ３〜１１の非線形ＩＰＧストリップ（ＧＥヘルスケア）にロードして、一晩再水和させた。

等電点電気泳動は、１００Ｖで２時間、５００Ｖで２時間、１０００Ｖで２時間、４時間かけて直線的に８０００Ｖに上昇させ、最終的に８０００Ｖで８時間行った。ＩＰＧストリップは、ＳＤＳ ＰＡＧＥ（５０Ｖで１時間、後に１５０Ｖで１２時間）を行う前に、８Ｍウレア及び２％ＳＤＳを含む平衡化緩衝液中で１５分間平衡化した。ゲルを酢酸／メタノール／水（１：３：６）中で固定し、シプロルビー（インビトロゲン）で一晩染色した。プロＸプレスイメージングシステム（パーキンエルマー社）を用いて撮影した（図３）。図３の丸に含まれるバンドに示されるように、パーミエートはアンギオゲニンに関して濃縮されており、汚染タンパク質は著しく低レベルであることが観察された。

[実施例２ｂ]：第三の態様の方法（限外濾過）を用いてスキムミルクからアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法

実施例２ａと同様の方法で、成長因子を含むホエイ分画を調製した。

成長因子を含むホエイ分画（２．５ｇ）を９５ｇの水に添加し、２５０ｒｐｍで３０分間振とうすることにより、２．５％ｗ／ｗ溶液を製造した。この溶液（１５ｇ）を４台のビバスピン２０遠心駆動式限外濾過装置（ＧＥヘルスケア）（１０ｋＤａ、３０ｋＤａ、５０ｋＤａ及び１００ｋＤａ）に投入した。遠心管を４，０００ｘｇで１０分間遠心すると、膜通過により約２ｍＬのパーミエートが得られた。

前記溶液と限外濾過パーミエートをＳＤＳＰＡＧＥにて分析した。各試料（１００μＬ）は１００μＬのトリス−トリシンサンプルバッファー（ＮｕＳｅｐ、フレンチフォレスト、オーストラリア）と混合した。各試料からのタンパク質（１０μＬ）をトリス−トリシンＰＡＧＥゲル（１６％アクリルアミド、ＮｕＳｅｐ）に適用し、１５０Ｖで９０分間分離し、クマシーブルー（ＮｕＳｅｐ）で染色した。図４に結果を示す。未分画ＷＧＦＥに存在する１４ｋＤａのピークがアンギオゲニン由来であることは、既にマススペクトロスコピーに示されている（ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１７１９号、「アンギオゲニンの調製方法」、図２）。アンギオゲニンと同じサイズのバンドは、５０ｋＤａのパーミエート及び１００ｋＤａのパーミエートに存在する主なタンパク質を表わすことが分かった。１０ｋＤａのパーミエート及び３０ｋＤａのパーミエートにアンギオゲニンは存在しなかった。アンギオゲニンが３０ｋＤａ膜を突き抜けることは既に示されていることから、上の結果は驚くべきことであり、おそらく異常なことである。

[実施例３]：第四の態様の方法（サイズ排除クロマトグラフィー）に従ってスキムミルクからアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法

実施例２ａと同様の方法で、成長因子を含むホエイ分画を調製した。

ホエイ成長因子（５ｇ）を４５ｇの水に添加し、２５０ｒｐｍで３０分間振とうすることにより、１０％ｗ／ｗ溶液を製造した。このＷＧＦＥ溶液を遠心（１５，０００ｘｇで６分間）及び濾過（０．４５μｍシリンジ圧入フィルター）することにより清澄した。３本のサイズ排除クロマトグラフィーカラム（セファクリルＳ−１００ＨＲ ２６／６０、セファクリルＳ−３００ＨＲ ２６／６０及びスーパローズ１２（２６ｍｍＤ×６００ｍｍＬ）（全てＧＥヘルスケア製品）を５０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．０）を流速３．５ｍＬ／ｍｉｎで用いて平衡化した。タンパク質溶液を５０ｍＬのスーパーループ（ＧＥヘルスケア）に入れ、次いで５ｍＬのＷＧＦＥ溶液を各カラムにポンプ導入した。ＷＧＦＥ溶液は、５０ｍＭ Ｎａ₂ＨＰＯ₄（ｐＨ７．０）を流速３．５ｍＬ／ｍｉｎでカラムにポンプ導入して通過させることにより分離した。図５〜７に示すように、溶出液を２８０ｎｍ（ブルーライン）でモニターし、１０ｍＬの各分画を回収した（グレーラインは各分画にスタートを示す）。

タンパク質様の試料はプールし、タンパク質濃度をＢＣＡアッセイ（ピアース、ロックフォード、ＩＬ）で推定した。タンパク質濃度が不十分（＜１ｍｇ／ｍＬ）な試料は、５ｋＤａのビバスピン２０遠心駆動式限外濾過装置（ＧＥヘルスケア）にてタンパク質濃度が１ｍｇ／ｍＬを超えるまで濃縮した。各試料（１００μＬ）を１００μＬのトリス−トリシンサンプル緩衝液（ＮｕＳｅｐ）と混合した。各試料からタンパク質（０．０２ｍｇ）をトリス−トリシンＰＡＧＥゲル（１６％アクリルアミド、ＮｕＳｅｐ）に適用し、１５０Ｖで９０分間分離し、クマシーブルー（ＮｕＳｅｐ）で染色した。未分画ＷＧＦＥに存在する１４ｋＤａのピークがアンギオゲニン由来であることは、既にマススペクトロスコピーに示されている（ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１７１９号、「アンギオゲニンの調製方法」、図２）。アンギオゲニンと同じサイズのバンドは、Ｓ−１００ＨＲプールＤ（図８）、Ｓ−３００ＨＲプールＣ及びスーパローズ１２プールＢ（図９）に見出された。

試料はカチオン交換ＨＰＬＣによっても分析した。試料（１００μＬ）を、予め緩衝液Ａ（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ及び５％［ｖ／ｖ］アセトニトリル［ｐＨ７．０］）で平衡化されたモノＳ５／５０ＧＬカラム（ＧＥヘルスケア）に適用した。続いて試料を、緩衝液Ｂ（５０ｍＭ ＮａＨ₂ＰＯ₄・Ｈ₂Ｏ及び２Ｍ ＮａＣｌ［ｐＨ７．０］）の量を増加させつつ溶出させた（表１）。溶出液を２２０ｎｍ、２８０ｎｍ及び４５０ｎｍでモニターした。アンギオゲニンはＨＰＬＣ及び後続のマススペクトロスコピーにより、この方法で分析したときの保持時間５．８±０．１分に現れることが既に示されており、同じ保持時間のピークはアンギオゲニン由来のピークと推定し、定量を行った（表２）。

サイズ排除クロマトグラフィーは、ホエイ成長因子抽出物からアンギオゲニンを単離するための適切な方法であることが示されている。セファクリルＳ−１００ＨＲ、セファクリルＳ−３００ＨＲ及びスーパローズ１２は適切であることが示され、多くのＳＥＣ樹脂が適切であることがわかった。５５％超のアンギオゲニンを含むアンギオゲニン濃縮分画はＳＥＣによって得ることができる。この純度は、精製工程を追加することによって更に改善することができる。

[実施例４]：第五の態様の方法（溶液内等電点電気泳動）に従ってスキムミルクからアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法

溶液内等電点電気泳動法の概説は既に為されているが、アンギオゲニン精製については言及していない（例えば、マイケルＰら、２００３年、エレクトロフォレシス；２４、ｐ３〜１１参照）。

本出願人らは、本明細書に開示する方法を用いることにより、ミルク試料からアンギオゲニンを抽出できることを示す。

本実施例で用いる溶液内等電点電気泳動（ＩＳＩＥＦ）法は、イソエレクトルＩＱ²（プロテオムシステムリミテッド、オーストラリア）を用いて行われる。分画操作は未変性条件（水性）又は変性条件（ウレア等の変性剤を含む）で行う。

プロライト（ＢＤダイアグノスティックス、ドイツ）又は他の電解質（酸又は塩基）も添加して、ｐＨ勾配を創出する。分離勾配の例を次に示す。
試料可溶化溶液（ＳＳＳ）：７Ｍウレア、２Ｍチオウレア及び１％３−（４−ヘプチル）フェニル３−ヒドロキシプロピルジメチルアンモニオプロパンスルホネ−ト（Ｃ７ＢｚＯ）。

ＩＳＩＥＦ分離の直前に、ミルクタンパク質は１０体積のＳＳＳと５ｍＭトリブチルホスフィンで希釈し、５ｍＭ ＥＤＴＡを添加した。ｐＨ３．０、５．０、６．５、８．０及び１１．０の膜（プロテオムシステムリミテッド、オーストラリア）を用いて、試料分離チャンバーを次のごとく創出した：ｐＨ３．０〜５．０、ｐＨ５．０〜６．５、ｐＨ６．５〜８．０及びｐＨ８．０〜１１。電極溶液（５ｍＬ、ベンダーより供給）をアノード及びカソードの両端に適用し、ＳＳＳに再懸濁した５ｍＬのミルクタンパク質をｐＨ５．０〜６．５のチャンバーに添加した。他のチャンバーにはＳＳＳ（５ｍＬ）を添加した。電気泳動は１４℃、１００Ｖの定電圧で２時間行い、電圧は６時間かけて１５００Ｖまでとし、最後に１５００Ｖの定電圧で８時間行った。各チャンバーの溶液を回収した。アンギオゲニンが濃縮された分画を分離チャンバーのカソード端部から回収した（ｐＨ８．０〜１１）。

アンギオゲニンの存在は二次元ＳＤＳ−ＰＡＧＥと、製造者の手引きに従ってシプロルビーによる染色にて確認した。例えば、各タンパク質分画の４０μｇに相当する一部を、追加のＳＳＳによって１２８μＬに希釈した。両性電解質溶液（０．６μＬ、ｐＨ３〜１１）及びデストリーク溶液（ＧＥヘルスケア）を各試料に添加した。希釈試料をピペットにて７ｃｍ、ｐＨ３〜１１のＮＬ ＩＰＧストリップ（ＧＥヘルスケア）の下に移し、このＩＰＧストリップを一晩かけて再水和した。等電点電気泳動には、５００Ｖで１時間、１０００Ｖで１時間、１時間かけて５０００Ｖに上昇及び５０００Ｖで２時間のプロトコルを用いる。ＩＰＧストリップを等電点電気泳動装置から取り除き、平衡化緩衝液（ＥＢ；６Ｍウレア、２％ドデシル硫酸ナトリウム、２０％グリセロール、５０ｍＭトリスＨＣＬ（ｐＨ８．８）、０．０１％ブロモフェノールブルー）であって、ＥＢ１０ｍＬあたり１００ｍｇのジチオスレイトールを含む緩衝液中で１５分インキュベートし、続いてＥＢ１０ｍＬあたり２５０ｍｇのヨードアセトアミドを含むＥＢ中で１５分２回目のインキュベートを行った。還元及びアルキル化されたＩＰＧストリップをＳＤＳ ＰＡＧＥゲル（プロバイダーから得られる。例えば、インビトロゲンノベックスプレキャストトリスＨＣｌゲル）上にロードし、高温のランニング緩衝液（トリス塩基３．０３ｇ／Ｌ、グリシン１４．４ｇ／Ｌ及びＳＤＳ１．０ｇ／Ｌ）であって、１．０％アガロースを含む緩衝液を用いてこのＩＰＧストリップをゲル上にシールした後、冷却した。このゲルをＳＤＳ ＰＡＧＥ装置に入れ、ランニング緩衝液を装置の上部と下部のウェルに入れた。電気泳動は２００Ｖで１時間行った。電気泳動に続き、固定／脱染溶液（１０％メタノール及び７％酢酸）を用いてタンパク質をゲルに固定し、続いてシプロルビー（インビトロゲン）で最低１時間染色した。ゲルを少なくとも１時間固定／脱染溶液で脱染し、ゲルスキャンニングシステム上でイメジー化した。各分画の純度をイメージの視覚分析によって決定することにより、分画中での各スポットの強度と体積を評価した。

図１０はｐＨ８〜１１分画が低分子量（約１５ｋＤａ）の塩基性タンパク質（約ｐＩ：１０．０）を含むことを示す。このタンパク質は、当該分画中の全タンパク質の約８０％を占める。このタンパク質は、アンギオゲニン由来であることが既に同定されている（ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１７１９号、「アンギオゲニンの調製方法」、図２）。図１０は、ミルク分画中の他のタンパク質からのｐＨ８〜１１分画中の塩基性タンパク質の分離を示す。

[実施例５]：アンギオゲニン濃縮生成物を得る方法に及ぼす熱の影響

実施例２ａと同様の方法で、成長因子を含むホエイ分画を調製した。

成長因子（２．５ｇ）を含むホエイ分画を９５ｇの水に添加し、２５０ｒｐｍで３０分間振とうすることにより、２．５％ｗ／ｗ溶液を製造した。この溶液（１０ｇ）を１５ｍＬのガラス試験管に入れ、その試験管を８０℃に加熱したウオーターバスに入れた。試験管内の液体温度を温度プローブでモニターした。溶液は直ちに７０℃に達し、ウオーターバス中で１分間保持した（最高温度７５℃）。試験管を高温のウオーターバスから取り出し、ビーカー一杯の水道水で冷却した。

この溶液を１０ｍＬの遠心管に移し、３，０００ｘｇで７分間遠心し、上澄みを濾取した（０．４５μｍ）。濾液をＳＤＳ ＰＡＧＥで分析した。各試料からのタンパク質（０．００１ｍｇのＷＧＦＥ、加熱での沈澱が少ない濾液０．０２５ｍｇ）をトリス−トリシンＰＡＧＥゲル（１６％アクリルアミド、ＮｕＳｅｐ）に適用し、１５０Ｖで９０分間分離し、クマシーブルー（ＮｕＳｅｐ）で染色した。未分画ＷＧＦＥに存在する１４ｋＤａのピークがアンギオゲニン由来であることが既にマススペクトロスコピーに示されている（ＰＣＴ／ＡＵ２００７／００１７１９、アンギオゲニンの調製方法、図２）。アンギオゲニンと同じサイズのバンドは、加熱されたＷＧＦＥの濾液に存在していた。加熱によりアンギオゲニンが濃縮された。ＷＧＦＥ（レーン１０）においてラクトペルオキシダーゼが主たるタンパク質であるが、ＷＧＦＥを加熱すると試料中のアンギオゲニン及びラクトペルオキシダーゼが等しい比で存在する（レーン２、３）（図４参照）。当業者には、第一〜第五の態様の方法、特に第三〜第五の態様の方法のいずれかを実施する前の加熱工程により、濃縮生成物中のアンギオゲニンの純度が上がることが理解されよう。

各実施例に記載したアンギオゲニンの調製方法は商業目的でスケールアップでき、更にアンギオゲニンを医薬グレードに純度で得るために第一〜第五の態様のいずれかの一態様の方法を実施する前又は後に、追加的な精製工程と組み合わせることが可能であることは、当業者には明らかであろう。

Claims (10)

1. ミルク試料からアンギオゲニン濃縮生成物を得る方法であって、
   （III）
   （ａ）液相のミルク試料を、前記ミルク試料の成分をそのサイズに基づいて分離可能な第二の相に添加する工程、及び
   （ｂ）前記ミルク試料の他の成分から分離されたアンギオゲニンを回収することにより、アンギオゲニン濃縮生成物を得る工程を含む方法；
   （IV）
   （ａ）液相のミルク試料を、前記ミルク試料の成分をそのサイズに基づいて分画に分離可能な第二の相に添加する工程、及び
   （ｂ）これらアンギオゲニンを含む分画を同定し、該分画を回収することによってアンギオゲニン富化産物を得る工程を含む方法；又は、
   （V）
   （ａ）流れている水性ミルク試料にミルク流を横断する方向に電場を印加する工程、
   （ｂ）電場が印加されたミルク流の分画を回収する工程、及び
   （ｃ）これらアンギオゲニンに関して富化された分画を同定し、該分画を回収することによってアンギオゲニン富化産物を得る工程を含む方法であり、
   （III）、（IV）及び（V）の方法中の工程（ａ）に先立ち、前記ミルク試料を少なくとも１分間７０℃超〜７５℃に加熱して、試料中でアンギオゲニンよりも低い温度で変性する他のタンパク質とラクトペルオキシダーゼの量を低減させる方法。
2. 方法（III）において、前記第二の相は半透過性相である、請求項１に記載の方法。
3. 方法（III）において、前記ミルク試料はシリンジ、圧縮ガス、ポンプ、遠心力又はそれらの組み合わせによって加えられる力によって前記半透過性相を強制透過させられる、請求項１に記載の方法。
4. 方法（III）において、前記第二の相は半透過性膜である、請求項１に記載の方法。
5. 方法（IV）において、前記第二の相はサイズ排除樹脂である、請求項１に記載の方法。
6. 方法（V）において、前記方法は変性条件下で行い、及び又は前記水性ミルク流はｐＨ勾配をもたらす緩衝液媒体中で行う、請求項１に記載の方法。
7. 前記勾配はｐＨ８〜１１の範囲である、請求項６に記載の方法。
8. さらに前記アンギオゲニン濃縮生成物を一以上のアンギオゲニン濃縮工程に付す工程を含む、請求項１〜７のいずれかに記載の方法。
9. 前記一以上のアンギオゲニン濃縮工程は、カチオン交換クロマトグラフィー、フリーフロー電気泳動を含む電気泳動、サイズ排除クロマトグラフィー及び限外濾過からなる群から選択される、請求項８に記載の方法。
10. 前記ミルク試料は全乳、スキムミルク、バターミルク、ホエイ、ホエイ分画及び初乳から選択される、請求項１〜９のいずれかに記載の方法。