JP5711218B2 - 新規インジケータ系 - Google Patents
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Description
生物学で使用されるインジケータは、多くの場合、酵素活性に反応する。酵素インジケータは、多くのアッセイフォーマットで使用される。そのようなアッセイは、可溶性インジケータ系を必要とする溶液相で実施することができる。
1H−インドクス−3−イル(「インドクス」(Indox)とも表示)インジケータは、細菌学、免疫学、生化学および遺伝学で酵素活性を視覚化するために広く使われている周知の発色性インジケータである。
例えば、インドクスインジケータ系は、所望のインディゴシグナロフォアを発現するために、酸素分子または他の酸化性補助試薬に依存する。その要件のために、インドキシル基質は、嫌気性条件での使用が限定されるかまたは使用できない。酸素の非存在下で実施される酵素アッセイの部分を考慮すると、この制限は重大である。
しかし、発色性または蛍光発生インジケータ系を使用する場合、色の選択を利用できるようにすることが望ましい。このことは、並列検出を必要とする二重または多重の酵素アッセイで、または灰白色のバックグラウンドに対して光学的コントラストを必要とする用途で特に重要である。
さらに、一般的な酵素インジケータは、本来、発色性または蛍光発生性のいずれかである。例えば、7−ヒドロキシクマリン(可溶性蛍光発生インジケータ)またはキナゾリン(沈降性蛍光発生インジケータ、例えば特許文献1を参照)などのフルオロフォアに基づく一般的な市販の酵素インジケータは、可視電磁帯で有意な吸収がなく、したがって調査用の光学的装置の利用なしでは人間の肉眼による検出から逃れてしまう。対照的に、3−インドキシルに由来するものなどの一般的な発色性インジケータには蛍光が存在しない。固体状態における蛍光は珍しい現象(緊密な格子中に配置された励起状態の分子の自己消光の周知の効果による)であるため、このことは特に沈降性インジケータに当てはまる。
ジアゾニウム染色
組織学においては、別の種類のインジケータが周知であり、しばしば酵素活性を限局するために使用される。この重要な方法は、Seligmanら(非特許文献1)、Burstoneら(非特許文献2)およびRutenburgら(非特許文献3)によって創始された。これは、安定化ジアゾニウム塩と電子リッチな芳香族アミンおよびフェノールとが反応して、アゾ色素を形成することに基づく。多くのアゾ色素は強烈な色を有し、いくつかは蛍光性である。
別の種類の沈降性基質は、金属イオンと不溶性錯体を形成する金属キレート化分子に基づく。キレート化分子は、金属イオンに配位結合する2つ以上の官能基を含む。これらの官能基を不安定基によってマスクして、インジケータの比較的一般的なデザインである金属錯体の形成を防止することができる。
・酸素、酸化剤、金属イオン、厳格なpH条件または有毒なジアゾニウム塩などの補助染色試薬を必要とすること、
・アッセイに潜在的に影響を与え得る有毒な試薬、中間体または生成物の存在、
・沈降性発色性インジケータの色が、緑−青−紫の範囲に限定されていること(黄〜赤がない)、
・蛍光発生特性を示す沈降性酵素インジケータの選択の余地がないこと、
・発色性および蛍光発生特性を組み入れた沈降性酵素インジケータがないこと、
などの現行のインジケータの重大な制約を克服することを目的とする。
・RaおよびRbは、水素またはC1〜4アルキルを表し、
・R1、R2、R3、R4、R6、R7、R8、R9およびR10は、独立して、水素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択され、
・R5は、水素、R11またはR12のいずれかを表し
(ここでR11は、
・Xは、O、NHおよびSから選択され、
・MDABは2−メトキシ−4−(N,N−ジメチルアミノ)ベンズアルデヒドを示す。
式中、
XはO、NHまたはSであり、
LGは、外部刺激の作用による変換に対して感受性であるX−LG部分を有する不安定基であり、
R1、R2、R3およびR4は、独立して、水素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、および任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択され、
R5は、水素またはR12のいずれかであり、ここでR12は、
Zは、O、NHまたはSであり、
R6、R7、R8、R9およびR10は、独立して、水素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される)であり、
ここで、R5が水素である場合、インジケータ系は一般式
式中、RaおよびRbは、独立して水素およびC1〜C4アルキルから選択される。
ここで、
・上記に定義されたインジケータ系を対象の領域に提供するステップ、および
・外部刺激の結果として形成されたシグナロフォア種からのシグナルについてモニタリングするステップ
を含む。
の受容体化合物を用いることによって提供され、これにより、シグナロフォアが以下に示す2−ベンジリデンインドリン(C)の一般構造に由来するインジケータ系が得られる。
を有する10H−インドロ[1,2−a]インドールである。
式中、
XはO、NHまたはSであり、
LGは不安定基であり、X−LG部分は外部刺激の作用による変換に対して感受性であり、
R1、R2、R3およびR4は、独立して水素、C1〜4アルキル、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択され、
R12は
R6、R7、R8、R9およびR10は、独立して水素、C1〜4アルキル、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される)である。当該方法は、一般式
のベンゼン誘導体でN−アリール化するステップを含む。
R1、R2、R3、R4、R6、R7、R8、R9およびR13は、独立して水素、C1〜4アルキル、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルから選択される)
の化合物が提供される。これらの化合物(G)は、一般的に、インドロ[1,2−a]インドール(以下、「IO」とも表示)と分類される。
一実施形態によれば、本発明のIOインジケータを使った染色または表示を、旧来のインドクス染色または表示と組み合わせて使用する。
本発明の前記の特徴や他の特徴および目的ならびにそれらを達成する方法は、本発明の様々な実施形態の以下の記載を添付の図面とあわせて参照することによって、さらに明らかになり、本発明自体をよりよく理解できるであろう。
この最初の章では、MDABアルドール染色と称する新規方法を開示する。当該方法は、ある一定の1H−インドクス−3−イル活性化シグナロゲンおよび2−メトキシ−4−(N,N−ジメチルアミノ)ベンズアルデヒド(MDAB)補助試薬が効率的に分子間アルドール縮合を経て、表示目的に適した暗赤色から褐色の沈殿を生じ、これにより現行の技術よりも大幅に拡大された新規インジケータ系が得られるという発見に基づく。
さらなる詳細から、インドクス/MDAB表示を使用して、外部刺激として特徴的なバイオマーカー酵素を使用することにより微生物コロニーを染色できることが明らかになった。重要なことに、MDABはこれら研究では微生物細胞成長に関して毒性を示さなかった。結果を表IIIにまとめる。
開示のMDAB染色は、アルドール供与体とMDABアルドール受容体の対の独自の適合に基づく。以下で、アルドール供与体と受容体を化学的に結合することによって同様の効果を達成できることを開示する。
・R1、R2、R3、R4は、水素、C1〜4アルキル、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、チオシアノ、ニトロ、ニトロソ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシル、メルカプトおよびスルホニルからなる群より選択され、
・Xは、O、NHおよびSから選択される。
供与体構造と受容体構造との間に所望の結合を得るために検討された多くの合成経路のうち、N−アリール化が、好ましい方法であることが判明した。
・Xは、O、NHおよびSから選択される。
ケトン類(内部受容体として作用する)は、黄色、橙、赤色から褐色の色を有する、色鮮やかな不溶性色素を広く生成した。場合により、aS種に代表されるような3−インドキシル種に特徴的な一時的性質の強力な緑色蛍光が観察されることもあったが、これは、想定されるアルドール縮合のプロセスにおいても同様に一時的性質のものである。
IO染色および旧来のインディゴ(IN)染色を有用に組み合わせることができ、これによってカラースキームを拡大することができる点に留意すべきである(表IVd)。例えば、インジケータI4hを二重平板培地アッセイでI21aと組み合わせて使用して、ベータ−D−グルコシダーゼおよびベータ−D−ガラクトシダーゼ菌種を同時に染色した。前者のバイオマーカーについて陽性の株は青色に着色され、後者について陽性の株は黄色に着色されたのに対し、両方の酵素に対して陽性の株は緑色(青色と黄色の混合)に着色された。
(実施例1)
I1〜I4のN−アリール化によるインジケータI8〜I31の調製(表Ia)
注:芳香族ヨード化合物は市販されているか、またはオルト−ヨード安息香酸を用いた標準的フリーデル・クラフツアシル化によって調製されるかのいずれかであった。2−(2−ヨードベンゾイル)−N−メチルピロールを、Carsonら(国際公開第2000048584号)と同様にして調製し、2−(2−ヨードベンゾイル)フランおよび2−(2−ヨードベンゾイル)−5−カルボキシフランをGarlandら(独国特許出願公開第2557956号明細書)と同様にして調製し、4−クロロ−2−ヨードベンゾフェノンをGabbuttら(Tetrahedron 2006,62,737−745)にしたがって調製した。1−アセチル−2−ヨード−4−メトキシベンゼンおよび1−ベンゾイル−2−ヨード−4−メトキシベンゼンを、塩化アルミニウムの存在下で3−ヨードアニソールのフリーデル・クラフツ反応により得た。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.73−7.71(m,1H)、7.56−7.54(m,5H)、7.42(s,1H)、7.37−7.32(m,1H)、7.23−7.19(m,1H)、7.14−7.10(m,1H)、5.30−5.28(d,1H)、4.89−4.87(d,1H)、4.74−4.72(d,1H,J=7.8Hz)、4.71−4.69(d,1H)、4.54−4.53(d,1H)、3.72−3.66(m,1H)、3.61−3.56(m,3H)、3.48−3.41(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:139.18、139.01、132.28、129.73、125.73、123.33、122.99、121.42、119.60、118.19、113.35、110.17、104.22、75.71、73.33、70.39、68.23、60.54。
収量:560mg(28%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.43。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.72−7.70(m,1H)、7.58−7.56(m,4H)、7.52−7.51(m,1H)、7.45(s,1H)、7.41−7.37(m,1H)、7.16−7.13(m,1H)、5.30−5.29(d,1H)、4.89−4.87(d,1H)、4.72−4.71(d,J=7.8Hz,1H)、4.69−4.67(m,1H)、4.54−4.53(d,1H)、3.71−3.63(m,2H)、3.59−3.55(m,3H)、3.43−3.39(m,1H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:138.75、138.55、132.48、129.85、127.82、126.29、123.56、120.11、119.99、119.65、114.43、109.81、104.18、75.73、73.23、70.30、68.18、60.50。
収量:496mg(23%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.41。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.89−7.87(m,1H)、7.77−7.69(m,2H)、7.56−7.52(m,2H)、7.25−7.02(m,4H)、5.27−5.26(br.d,1H)、4.87(br.s,1H)、4.67−4.65(d,J=7.8Hz,1H)、4.65−4.64(br.d,1H)、4.53−4.52(br.d,1H)、3.71−3.63(m,2H)、3.58−3.49(m,3H)、3.44−3.39(m,1H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:166.38、138.94、137.68、133.77、133.16、130.73、128.21、128.04、127.41、122.79、120.96、119.41、118.16、114.62、109.39、104.54、75.65、73.34、70.50、68.16、60.43、52.24。
収量:526mg(23%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.41。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.91−7.89(m,1H)、7.78−7.74(m,1H)、7.70−7.68(m,1H)、7.60−7.55(m,2H)、7.19(s,1H)、7.10−7.08(m,1H)、6.98(d,1H)、4.65−4.63(d,J=7.8Hz,1H)、3.66−3.61(m,2H)、3.56−3.51(m,3H)、3.48(s,3H)、3.42−3.39(m,1H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:165.94、138.58、136.99、134.01、133.29、130.77、128.25、128.14、127.94、127.52、119.68、119.62、119.58、115.73、109.12、104.46、75.64、73.19、70.35、68.05、60.34、52.23。
収量:572mg(21%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.41。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.93−7.91(m,1H)、7.81−7.74(m,1H)、7.62−7.58(m,1H)、7.54−7.52(m,1H)、7.37−7.34(m,1H)、7.27(s,1H)、6.87−6.84(m,1H)、4.70−4.68(d,J=7.8Hz,1H)、3.70−3.63(m,2H)、3.54−3.52(m,3H)、3.49(s,3H)、3.43−3.39(m,1H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:165.56、139.53、137.85、136.76、133.66、133.40、130.88、128.63、128.38、128.20、126.60、123.67、116.21、112.73、110.12、103.91、75.59、73.46、70.31、68.05、60.30、52.33。
収量:443mg(22%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.42。
1H−NMR[DMSO−d6]:9.64(s,CHO)、8.01−7.99(m,1H)、7.89−7.85(m,1H)、7.75−7.73(m,1H)、7.66−7.59(m,2H)、7.45(s,1H)、7.26−7.09(m,3H)、5.29−5.27(br.d,1H)、4.89−4.88(br.d,1H)、4.75−4.73(d,J=7.8Hz,1H)、4.63−4.61(br.d,1H)、4.54−4.53(br.d,1H)、3.71−3.65(m,2H)、3.54(br.s,3H)、3.43−3.36(m,1H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:189.40、141.07、139.27、135.46、135.02、131.03、128.37、127.99、127.91、123.37、120.92、119.88、118.24、115.60、109.66、104.13、75.61、73.26、70.36、68.09、60.35。
収量:1.20g(60%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.38。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.75−7.70(m,3H)、7.59−7.54(m,2H)、7.21(s,1H)、7.18−7.09(m,2H)、7.05−7.03(m,1H)、5.29−5.27(br.d,1H)、4.87−4.85(br.d,1H)、4.69−4.67(d,J=7.8Hz,1H)、4.63−4.61(br.s,1H)、4.52−4.51(br.d,1H)、3.71−3.62(m,2H)、3.58−3.50(m,3H)、3.46−3.39(m,1H)、1.82(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:200.12、139.13、137.09、136.59、133.75、132.61、129.14、127.86、127.69、123.10、120.72、119.64、118.16、114.58、109.56、104.24、75.56、73.23、70.38、68.05、60.28、28.28。
収量:1.09g(49%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.41。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.79−7.72(m,2H)、7.62−7.58(m,1H)、7.54−7.53(m,1H)、7.29(s,1H)、7.12−7.07(m,2H)、6.97−6.92(m,1H)、5.02−5.01(br.d,1H)、4.86−4.85(br.d,1H)、4.77−4.75(d,J=7.8Hz,1H)、4.63(br.s,1H)、4.55−4.54(br.d,1H)、3.72−3.65(m,2H)、3.55(br.s,3H)、3.46−3.40(m,1H)、1.92(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:199.75、138.48、137.14、136.00、135.01、132.72、129.27、128.24、128.07、124.21、123.63、120.41、117.24、114.95、108.65、103.51、75.53、73.54、70.39、68.07、60.27、28.40。
収量:0.96g(44%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.46。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.78−7.70(m,3H)、7.62−7.57(m,2H)、7.25(s,1H)、7.17−7.12(m,1H)、7.05−7.04(m,1H)、5.30−5.29(br.d,1H)、4.88−4.86(br.d,1H)、4.68−4.66(d,J=7.7Hz.1H)、4.63−4.61(br.s,1H)、4.52−4.51(br.d,1H)、3.70−3.62(m,2H)、3.56−3.50(m,3H)、3.42−3.39(m,1H)、1.91(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:199.95、138.83、137.06、135.83、133.97、132.71、129.29、128.18、127.85、125.23、120.04、119.70、119.49、115.73、109.38、104.25、75.62、73.17、70.33、68.04、60.29、28.45。
収量:0.61g(23%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.42。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.83−7.80(m,1H)、7.77−7.73(m,1H)、7.64−7.60(m,1H)、7.56−7.53(m,1H)、7.41−7.39(m,1H)、7.35(s,1H)、6.92−6.90(m,1H)、5.07−5.06(br.d,1H)、4.87−4.86(br.d,1H)、4.74−4.72(d,J=7.7Hz,1H)、4.62(br.s,1H)、4.55−4.53(br.d,1H)、3.71−3.64(m,1H)、3.55(br.s,3H)、3.47−3.39(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:199.56、138.04、137.03、135.44、133.60、132.77、129.38、128.54、128.33、126.96、123.77、118.55、116.27、113.05、110.39、103.72、75.57、73.44、70.32、68.06、60.27、28.50。
収量:1.6g(65%)、TLC[トルエン/エタノール(4:1)]:R10.36。
FT−IR:3459m、2964w、2927w、2867w、1665s、1601s、1569m、1497m、1471s、1451s、1372s、1267s、1220s、1140s、1081s、1053s、1020s、975m、945m、880m、800m、735m、696m。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.80(d,J=8.7,1arom.H)、7.71(d,J=8.5,1arom.H)、7.28(s,1arom.H)、7.17−7.11(m,2arom.H)、7.07(d,J=2.5,1arom.H)、7.06(d,J=1.7,1arom.H)、5.30(d,J=5.0,OH)、4.87(d,J=5.8,OH)、4.68(d,J=7.8,H−C(I)Gal)、4.64(t,J=5.2,OH)、4.52(d,J=4.7,OH)、3.88(s,OCH3)、3.70(t,J=4.0,H−C(4)Gal)、3.65(mc,1H−CGal)、3.58−3.51(m,3H−CGal)、3.48−3.39(m,1H−CGal)、1.86(s,CH3)。
13C−NMR[DMSO−d6]:197.86(s,C=O)、162.54(s,C−OCH3)、138.79、138.18、134.01(3s)、131.68(d)、129.00(s)、128.82、128.12(2d)、127.85(s)、125.23、120.01、119.66(3d)、119.53(s)、115.67、113.92、113.27、109.44(4d)、104.22(d,C(1)Gal)、75.68、73.22、70.36、68.11(4d,C(2−5)Gal)、60.38(t,C(6)Gal)、55.90(q,OCH3)、28.03(q,CH3−C=O)。
収量:1.09g(46%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.41。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.82−7.81(m,1H)、7.80−7.79(m,1H)、7.78−7.77(m,2H)、7.70−7.69(m,1H)、7.68−7.67(m,3H)、7.64−7.13(m,4H)、7.03(s,1H)、6.99−6.95(m,1H)、5.23−5.22(br.d,1H)、4.85−4.83(br.d,1H)、4.68−4.65(br.s,1H)、4.51−4.50(br.d,1H)、4.29−4.27(d,J=7.7Hz,1H)、3.72−3.70(m,1H)、3.63−3.52(m,3H)、3.42−3.32(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:195.54、138.83、136.97、135.68、135.48、133.41、132.92、132.21、129.92、128.30、128.14、127.86、127.48、127.18、125.24、122.63、120.61、119.38、117.80、115.27、109.87、104.49、75.40、73.19、70.31、67.91、60.17。
収量:0.87g(34%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.52。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.82−7.78(m,1H)、7.70−7.60(m,3H)、7.45−7.41(m,3H)、7.26−7.22(m,2H)、7.10(s,1H)、7.05−6.94(m,3H)、4.89−4.87(d,1H)、4.83−4.81(d,1H)、4.66−4.64(br.s,1H)、4.53−4.52(d,J=4.7Hz,1H)、4.43−4.41(br.s,1H)、3.72−3.70(m,1H)、3.61−3.51(m,3H)、3.48−3.41(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:195.25、138.20、136.41、135.87、135.58、134.70、133.14、132.23、129.84、128.48、128.02、127.62、123.76、123.15、120.19、117.01、115.40、108.94、103.68、75.36、73.46、70.26、67.91、60.10。
収量:1.30g(51%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.21。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.83−7.79(m,1H)、7.71−7.64(m,3H)、7.48−7.46(m,1H)、7.41−7.37(m,3H)、7.26−7.13(m,3H)、7.07(s,1H)、7.01−6.98(m,1H)、5.24−5.23(br.d,1H)、4.86−4.84(br.d,1H)、4.68−4.65(br.s,1H)、4.52−4.50(br.d,1H)、4.29−4.27(d,J=7.5Hz,1H)、3.71−3.69(m,1H)、3.59−3.53(m,3H)、3.44−3.33(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:195.45、138.60、136.32、135.66、135.63、133.66、133.04、132.35、129.93、128.82、128.41、128.12、127.96、127.49、127.34、125.23、119.78、119.35、119.28、116.30、109.69、104.49、75.46、73.13、70.26、67.91、60.18。
収量:1.57g(61%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.28。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.83−7.79(m,1H)、7.72−7.62(m,3H)、7.46−7.44(m,1H)、7.39(s,1H)、7.38−7.35(m,2H)、7.21−7.17(m,3H)、7.12(m,1H)、7.00−6.98(m,1H)、5.08−5.06(d,1H)、5.00−4.99(d,1H)、4.96−4.95(d,1H)、4.91−4.90(d,J=2.2Hz,1H)、4.59−4.57(m,1H)、3.68−3.58(m,2H)、3.54−3.31(m,3H)、3.21−3.15(m,1H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:195.53、137.91、136.42、135.63、135.45、133.59、133.00、132.45、130.06、128.34、127.97、127.88、127.56、127.32、119.70、119.36、119.20、115.82、109.70、100.63、73.53、73.00、71.70、70.01、60.83。
収量:1.79g(69%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.07。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.82−7.79(m,1H)、7.69−7.63(m,3H)、7.57−7.54(m,1H)、7.40−7.38(m,3H)、7.24−7.20(m,2H)、7.11(m,2H)、6.99−6.97(m,1H)、6.66(br.s,1H)、5.45(br.s,1H)、5.21(br.s,1H)、4.30(br.s,1H)、3.47−3.40(m,1H)、3.27−3.22(m,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:195.39、172.84、138.69、136.30、135.61、133.73、133.09、132.41、129.94、128.43、128.02、127.45、127.40、119.79、119.62、119.38、118.31、116.62、116.57、109.64、103.96、76.43、73.93、73.04、71.92。
収量:1.46g(53%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.28。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.82−7.74(m,2H)、7.70−7.64(m,2H)、7.62(d,NH)、7.43−7.35(m,3H)、7.24−7.17(m,3H)、7.09(d,1H)、7.02(s,1H)、6.98(dd,1H)、4.73(d,1H)、4.63(t,1H)、4.60(d,1H)、4.42(d,1H)、3.93(q,1H)、3.70(t,1H)、3.60−3.48(m,3H)、3.40−3.32(m,1H)、1.83(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:195.5、169.6、162.3、138.7、136.34、135.72、133.70、133.15、132.45、129.95、128.5、128.0、127.55、127.5、120.0、119.3、118.8、116.2、109.8、103.0、75.55、70.8、67.3、60.25、52.0、23.2。
収量:1.14g(39%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.48。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.83−7.79(m,1H)、7.71−7.61(m,3H)、7.46−7.42(m,3H)、7.34−7.32(m,1H)、7.28−7.24(m,2H)、7.16(s,1H)、7.00−6.98(m,1H)、4.96−4.95(br.d,1H)、4.84−4.82(br.d,1H)、4.66−4.65(br.s,1H)、4.53−4.52(d,J=4.7Hz,1H)、4.38−4.35(br.s,1H)、3.72−3.70(m,1H)、3.61−3.54(m,3H)、3.48−3.43(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:195.12、137.81、135.92、135.55、133.32、133.23、132.30、129.88、128.51、128.35、128.08、127.69、126.55、123.38、118.34、116.70、112.84、110.64、103.89、75.41、73.37、70.18、67.90、60.10、55.98。
収量:1.28g(47%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.49。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.79(s,1H)、7.72(m,2H)、7.45−7.39(m,4H)、7.22−7.17(m,3H)、7.12(s,1H)、7.02−6.99(m,1H)、5.23−5.22(d,1H)、4.85−4.84(d,1H)、4.68−4.65(m,1H)、4.51−4.50(d,1H)、4.29(br.s,1H)、3.71−3.69(m,1H)、3.57−3.52(m,3H)、3.44−3.33(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:194.51、138.89、137.74、136.51、135.38、134.28、133.64、133.15、131.65、128.41、128.05、127.93、127.66、127.32、120.05、119.49、119.24、116.06、109.84、104.36、75.49、73.12、70.23、67.90、60.19。
収量:2.4g(76%)、TLC[トルエン/エタノール(4:1)]:Rf0.23。
FT−IR:3367m、2911w、2853w、1654s、1600s、1579m、1499m、1470m、1448m、1365m、1264s、1239s、1118s、1075s、1022s、975m、923m、872s、750m、703s。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.66(d,J=8.6,1arom.H)、7.44(d,J=8.5,1arom.H)、6.36−7.32(m,1arom.H)、7.34(s,1arom.H)、7.32(s,1arom.H)、7.21−7.14(m,6arom.H)、6.98(dd,J=8.5,1.8,1arom.H)、5.23(d,J=4.9,OH)、4.85(d,J=5.7,OH)、4.69(t,J=5.5,OH)、4.51(d,J=4.7,OH)、4.29(br.s,H−C(I)Gal)、3.92(s,OCH3)、3.71(t,J=4.0,H−C(4)Gal)、3.60−3.53(m,3H−CGal)、3.46(t,J=6.2,1H−Gal)、3.39−3.34(m,1H−CGal)。
収量:1.28g(48%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.45。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.70−7.65(m,1H)、7.55−7.47(m,4H)、7.09−6.95(m,5H)、6.26−6.23(m,2H)、5.25−5.23(d,1H)、4.86−4.84(d,1H)、4.69−4.66(br.s,1H)、4.51−4.50(d,1H)、4.33−4.31(d,J=7.7Hz,1H)、3.69(s,3H)、3.61−3.54(m,4H)、3.44(s,3H)、3.48−3.41(m,1H)、3.39−3.34(m,1H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:193.05、163.77、159.66、138.91、138.70、136.42、133.78、131.89、131.33、128.95、127.21、126.78、122.30、120.45、119.50、119.02、117.73、115.10、109.65、105.23、104.75、97.55、75.50、73.18、70.35、68.01、60.32、55.41、55.38。
収量:0.92g(68%)、TLC[酢酸エチル/ピリジン/酢酸/水(30:25:5:15)]:Rf0.46。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.68−7.62(m,1H)、7.48(m,2H)、7.43(2d,2H)、7.20(d,1H)、7.10(s,1H)、7.05(t,1H)、7.02(t,1H)、6.94(t,1H)、6.35(d,1H)、6.32(dd,1H)、4.05(m,2H)、3.72(s,3H)、3.53(s,3H)、3.46(t,3J[H,P]=4.6Hz,2H)、3.03(s,9H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:193.0、164.1、160.0、157.0、138.8、136.7、134.0(d,J[C,P]=7.4Hz)、133.6、132.3、131.3、129.0、127.0(J[C,P]=2.4Hz)、122.0、121.6(J[C,P]=6.3Hz)、119.5、118.9、117.6、116.1、109.7、105.7、97.9、65.4(J[C,P]=4.8Hz)、59.0(J[C,P]=5.36Hz)、55.5(2 OCH3)、53.0。
収量:1.76g(62%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.54。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.70−7.66(m,1H)、7.58−7.53(m,2H)、7.49−7.47(m,1H)、7.12−7.10(m,1H)、7.02(s,1H)、7.01−6.99(m,1H)、6.96−6.93(m,2H)、6.34−6.29(m,2H)、4.85−4.83(br.s,2H)、4.67−4.64(br.s,1H)、4.53−4.52(d,1H)、4.48−4.46(d,J=5.9Hz,1H)、3.73(s,3H)、3.72−3.70(m,1H)、3.64−3.55(m,3H)、3.48(s,3H)、3.46−3.38(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:192.84、163.99、159.72、139.25、138.17、135.77、135.07、131.92、131.33、128.91、127.18、123.74、122.88、119.84、119.36、116.86、115.14、108.77、105.40、103.94、97.59、75.50、73.44、70.32、68.00、60.24、55.48、55.40。
収量:1.88g(66%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.45。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.72−7.67(m,1H)、7.57−7.56(m,2H)、7.52−7.50(m,2H)、7.12−7.10(m,1H)、7.02(s,1H)、7.00−6.98(m,2H)、6.31−6.26(m,2H)、5.27−5.26(d,1H)、4.87−4.86(d,1H)、4.69−4.66(br.s,1H)、4.52−4.51(d,J=4.6Hz,1H)、4.38−4.35(br.s,1H)、3.71(s,3H)、3.70−3.68(m,1H)、3.60−3.55(m,3H)、3.48(s,3H)、3.48−3.43(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:192.89、163.89、159.54、138.89、138.52、135.69、133.98、131.92、131.54、129.06、127.77、127.21、127.03、119.36、119.21、119.18、116.09、109.42、105.38、104.68、97.41、75.59、73.13、70.30、68.03、60.36、55.44、55.32。
収量:2.17g(67%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.58。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.72−7.67(m,1H)、7.61−7.49(m,3H)、7.34−7.31(m,1H)、7.12−7.10(m,1H)、7.06(s,1H)、6.88−6.86(m,1H)、6.34−6.31(m,1H)、6.28−6.27(m,1H)、4.95−4.94(d,1H)、4.85−4.84(d,1H)、4.67−4.64(br.s,1H)、4.53−4.52(d,J=4.6Hz,1H)、4.45(br.s,1H)、3.73(s,3H)、3.72−3.70(m,1H)、3.64−3.51(m,3H)、3.47(s,3H)、3.46−3.37(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:192.76、163.98、159.63、139.30、137.84、135.27、133.68、131.82、131.42、128.97、128.14、127.24、126.32、123.33、119.28、118.17、116.38、112.51、110.45、105.40、104.06、97.48、75.53、73.36、70.24、67.99、60.24、55.48、55.39。
収量:0.99g(36%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0。
1H−NMR[CD3COOD]:7.82−7.74(m,2H)、7.69−7.67(m,1H)、7.63−7.59(m,1H)、7.55−7.49(m,1H)、7.33−7.32(m,1H)、7.12(s,1H)、7.04−7.02(m,1H)、6.97−6.96(d,1H)、6.88−6.87(d,1H)、4.69−4.67(d,J=7.2Hz,1H)、4.14−4.13(d,1H)、4.04−3.94(m,3H)、3.86−3.82(m,2H)。
13C−NMR[CD3COOD]:184.9、154.0、147.7、139.6、138.2、135.2、135.1、133.6、130.9、129.8、128.4、127.8、121.3、120.6、119.8、119.5、119.1、116.6、110.9、104.3、75.5、73.9、71.9、69.8、62.1。
収量:1.65g(66%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.38。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.84(m,1H),7.80−7.76(m,1H)、7.72−7.70(m,1H)、7.64−7.57(m,3H)、7.18(s,1H)、7.10−7.03(m,3H)、6.54−6.53(m,1H)、5.28−5.27(d,1H)、4.87−4.85(d,1H)、4.66−4.63(m,1H)、4.52−4.51(d,1H)、4.47−4.45(d,J=7.7Hz,1H)、3.71−3.69(m,1H)、3.63−3.53(m,3H)、3.48−3.41(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:181.55、151.01、148.81、138.58、136.06、135.24、133.78、132.32、129.62、127.83、127.62、127.56、120.83、119.85、119.48、119.42、116.24、112.61、109.64、104.50、75.54、73.16、70.32、68.00、60.27。
収量:1.76g(69%)、TLC[トルエン/エタノール(5:3)]:Rf0.36。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.95(m,1H)、7.73−7.69(m,1H)、7.63−7.55(m,3H)、7.17(m,1H)、7.10(s,1H)、7.05−7.02(m,2H)、6.35−6.34(m,1H)、5.91−5.90(m,1H)、5.27−5.26(d,1H)、4.86−4.84(d,1H)、4.63−4.60(br.s,1H)、4.51−4.50(d,1H)、4.45−4.43(d,J=7.7Hz,1H)、3.71−3.68(m,1H)、3.61−3.33(m,5H)、2.88(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:183.78、162.23、138.49、137.27、135.67、133.72、132.73、131.16、129.86、129.41、127.44、127.34、127.18、121.99、119.62、119.34、116.07、109.87、108.05、104.62、75.42、73.14、70.29、67.86、60.08、36.40。
I1cのN−アリール化によるI19cおよびI25cの調製(表Ia)
25mlの乾燥ジメチルアセトアミド中5.0mmolのヨウ化アリール、1.31g(7.48mmol)のI1cおよび0.67g(5.47mmol)の酢酸銅(I)を窒素雰囲気下で2時間、150℃まで加熱した。生成混合物を室温まで冷却し、25mlの酢酸エチルで希釈した。懸濁液を50mlの飽和塩化アンモニウム水溶液上に注ぎ、30分間攪拌した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、蒸発乾固させた。得られた油状物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより精製した[トルエン、トルエン/アセトン(10:1)]。
収量:590mg(33%)、TLC(トルエン):Rf0.15。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.83−7.79(m,1H)、7.71−7.64(m,3H)、7.42−7.36(m,3H)、7.32−7.30(m,1H)、7.26−7.25(m,1H)、7.23−7.11(m,4H)、7.05−7.01(m,1H)、2.27(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:195.27、168.03、136.36、135.78、135.63、133.41、133.08、132.23、130.69、129.91、128.49、128.11、127.94、127.61、122.89、120.24、120.04、118.37、117.35、110.27、20.46。
収量:1.23g(59%)、TLC[トルエン/アセトン(10:1)]:Rf0.66。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.71−7.67(m,1H)、7.56−7.52(m,3H)、7.37−7.35(m,1H)、7.31(s,1H)、7.18−7.16(m,1H)、7.14−7.10(m,3H)、7.06−7.02(m,1H)、6.30(s,1H)、3.70(s,3H)、3.49(s,3H)、2.30(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:192.77、167.99、163.99、139.07、135.72、133.60、131.92、131.31、130.42、128.92、128.79、128.09、127.65、127.13、125.21、122.64、119.75、118.24、117.16、110.09、105.52、97.58、55.38、55.33、20.51。
I6のN−アリール化によるI32の調製(表Ia)
1−(2−ベンゾイルフェニル)−1H−インドール−3−イルエチルカーバメート(I32):
25mlの乾燥ジメチルアセトアミド中1.30g(4.22mmol)の2−ヨードベンゾフェノン、1.29g(6.32mmol)の3−アミノインドール−3−エチルカーバメートおよび0.57g(4.65mmol)の酢酸銅(I)を窒素雰囲気下で2時間、150℃まで加熱した。生成混合物を室温まで冷却し、25mlの酢酸エチルで希釈した。懸濁液を50mlの飽和塩化アンモニウム水溶液上に注ぎ、30分間攪拌した。有機相を食塩水で洗浄し、硫酸ナトリウムで乾燥し、ろ過し、蒸発乾固させた。得られた油状物をシリカゲル上カラムクロマトグラフィーにより精製した[トルエン、トルエン/アセトン(10:1)]。
収量:100mg(6%)、TLC[トルエン]:Rf0.10。
1H−NMR[DMSO−d6]:9.50(s,NH)、7.81−7.77(m,1H)、7.71−7.60(m,4H)、7.41−7.36(m,4H)、7.20−7.16(m,3H)、7.11−7.07(m,1H)、6.99−6.95(m,1H)、4.13(q,2H)、1.24(t,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:195.42、153.57、136.98、135.73、135.43、133.92、132.95、132.15、129.89、128.42、127.86、127.43、127.13、122.59、121.06、119.21、118.44、117.53、117.08、109.78、60.15、14.53。
ビス[1−(2−アセチルフェニル)−1H−インドール−3−イル]−ジスルファンの調製(I33、表Ia)
1−(2−アセチルフェニル)−1H−インドール−3−イル−イソチウロニウムヨージド:
1.80g(7.65mmol)の1−(2−アセチルフェニル)−1H−インドール(実施例1の方法により調製)および1.17gのチオ尿素(15.4mmol)を35mlのメタノール(35ml)と4mlの水との混合液中に溶解させた。3.90gのヨウ素(15.4mmol)をヨウ化カリウム(3.82g、23mmol)の水(7.7ml)中の溶液中に溶解させた。このヨウ素溶液を、周囲温度で前記の溶液に1時間かけて滴加し、35℃で3時間温めた。蒸発により溶媒を除去した。残留油状物を酢酸エチル(40ml)中に溶解させた。溶液を水で3回抽出した(3×10ml)。有機層を乾燥し、木炭(1g)で処理した。濾液を蒸発させた後に粗生成物を得、シリカゲル上クロマトグラフィーにより精製した(100g、酢酸エチル)。
収量:1.27g(38%)。
1H−NMR[DMSO−d6]:9.06(s,NH2)、8.62(s,NH2)、8.18(s,1H)、7.98(d,1H)、7.84(t,1H)、7.70(2t,2×1H)、7.61(m,1H)、7.30(m,2H)、7.12(m,1H)、2.18(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:199.4、170.2、139.3、137.8、136.2、135.0、133.1、129.9、129.3、129.0、128.5、123.9、122.0、118.2、111.0、92.6、29.0
ビス[1−(2−アセチルフェニル)−1H−インドール−3−イル]−ジスルファン(I33):
1−(2−アセチルフェニル)−1H−インドール−3−イル−イソチウロニウムヨージド(0.47g、1.07mmol)を、脱気オキサン(2.7ml)と脱気水(1.57ml)との混合液中に窒素雰囲気下で溶解させた。水酸化ナトリウムの脱気した5%水溶液(0.8ml、1.22mmol)を周囲温度で滴加すると、溶液は暗褐色になった。溶液を48時間45℃で攪拌した。生成混合物を蒸発させ、水(5ml)中に溶解させ、酢酸エチルで抽出した。有機層を硫酸ナトリウム上で乾燥し、蒸発させると、粗生成物が粘稠性油状物として残り、これをシリカゲルフラッシュクロマトグラフィーにより精製した。
収量:70mg(24%)。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.84(dd,1H)、7.66(dt,1H)、7.62(dt,1H)、7.60(d,1H)、7.55(s,1H)、7.38(d,1H)、7.19(2t,2×1H)、7.03(d,1H)、1.94(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:199.1、137.5、136.4、135.3、132.8、129.6、128.8、128.7、128.5、123.5、121.3、119.3、110.4、108.0、28.4。
10H−インドロ[1,2−a]インドールの調製(表Ic)
pH7.3、1mMのMgCl2および670mg/lの酵素基質を含む100mMのNa2PO4緩衝液中で酵素反応を実施した。大腸菌ベータ−ガラクトシダーゼまたはK.ラクチス(K.lactis)ラクターゼを、それぞれ1000U/lまたは1500U/lの最終濃度になるように添加した。30mlの反応体積を穏やかに振盪しながら5〜18時間、37℃でインキュベートした。反応生成物を遠心分離(4400g、15分)により回収し、ペレットを10mlのH2Oで洗浄し、再度遠心分離した(4400g、15分)。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.73(d,J=8.2Hz,2arom.H)、7.69(d,J=7.7Hz,2arom.H)、7.50(t,J=7.3Hz,2arom.H)、7.07(t,J=7.5Hz,2arom.H)、5.79(br.s)。
13C−NMR[DMSO−d6]:160.75(s,C=O)、138.32(s,arom.C)、132.10(d,arom.C−H)、127.15(s,arom.C)、123.27、121.52(2d,arom.C−H)、118.65(s,C(10a)、111.72(d,arom.C−H)。
10H−インドロ[1,2−a]インドール−10−オン(IO13):
1H−NMR[DMSO−d6]:7.94(m,1H)、7.84(m,1H)、7.74(m,1H)、7.67(m,1H)、7.62(m,1H)、7.48(m,1H)、7.35(m,1H)、7.18(m,1H)、7.17(m,1H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:180.7、144.8、136.3、135.0、133.7、132.0、128.5、128.4、124.9、124.7、124.3、122.2、112.2、112.0、108.1。
MS(Cl):220.2([M+H]+)。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.85(m,1H)、7.77(m,1H)、7.71(m,1H)、7.62(m,1H)、7.59(m,1H)、7.47(m,1H)、7.16(m,1H)、7.13(m,1H)、2.50(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:180.8、144.0、135.8、133.3、132.6、131.7、128.6、128.5、124.1、123.4、122.8、121.5、121.3、111.7、111.6、8.8。
UV:λmax=255、355、435nm。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.88−7.86(m,1H)、7.76−7.72(m,2H)、7.60−7.56(m,1H)、7.51−7.47(m,1H)、7.21−7.17(m,1H)、7.12−7.10(m,1H)、2.49(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:178.3、145.6、136.8、133.2、133.0、132.3、130.8、128.8、124.8、124.3、123.0、122.2、121.9、112.0、110.8、8.9。
UV:λmax=245、365、440nm。
1H−NMR[DMSO−d6]:8.00−7.98(m,1H)、7.92(m,1H)、7.73−7.71(m,1H)、7.58−7.56(m,1H)、7.50−7.46(m,1H)、7.20−7.15(m,2H)、2.48(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:179.9、144.8、140.4、133.4、132.9、132.1、128.9、127.7、125.6、123.5、123.0、122.6、122.0、112.24、112.21、9.00。
UV:λmax=245、360、430nm。
1H−NMR[DMSO−d6]:7.96−7.94(m,1H)、7.90−7.87(m,1H)、7.76−7.72(m,2H)、7.53−7.48(m,1H)、7.22−7.18(m,1H)、2.50(s,3H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:177.3、144.6、139.5、133.2、132.9、131.9、130.7、129.2、126.0、123.2、123.1、122.2、116.9、112.2、112.1、9.0。
UV:λmax=245、365、450nm。
1H−NMR[DMSO−d6]:8.07(d,J=1.6,1H)、7.61(d,J=8.8,1H)、7.56(d,J=8.0,1H)、7.39(d,J=2.1,1H)、7.17(dd,J=8.0,1.6,1H)、6.80(dd,J=8.8,2.2,1H)、3.94(s,OCH3)、2.46(s,CH3)。
1H−NMR[DMSO−d6]:8.04−8.02(m,1H)、7.99−7.92(m,4H)、7.71−7.65(m,2H)、7.59−7.55(m,3H)、7.51−7.47(m,1H)、7.29−7.19(m,2H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:180.1、144.0、136.0、133.9、130.7、130.2、128.9、128.8、124.6、124.5、124.3、123.7、122.7、112.4、112.3。
UV:λmax=245、370、460nm。
1H−NMR[DMSO−d6]:8.05−8.03(m,1H)、7.97−7.90(m,4H)、7.67−7.63(m,1H)、7.59−7.55(m,3H)、7.51−7.49(m,1H)、7.31−7.27(m,1H)、7.20−7.18(m,1H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:145.5、137.0、133.7、131.0、130.5、129.0、128.8、125.4、124.9、124.4、123.8、123.1、112.6、111.1。
1H−NMR[DMSO−d6]:8.04−8.00(m,2H)、7.98−7.92(m,3H)、7.89−7.86(m,1H)、7.60−7.48(m,4H)、7.31−7.28(m,1H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:144.3、139.5、133.7、131.0、130.4、130.2、129.0、128.9、128.7、126.2、125.4、123.9、123.1、117.5、112.6、112.5。
1H−NMR[DMSO−d6]:8.13(d,J=1.6,1H)、7.94、7.92(2 br.s,2H)、7.77(d,J=9.0,1H)、7.59(d,J=8.0,1H)、7.54(br.t,J=8.0,2H)、7.48−7.44(m,2H)、7.21(dd,J=8.0,1.6,1H)、6.87(dd,J=9.0,2.2,1H)、3.37(s,OCH3)。
1H−NMR[DMSO−d6]:8.57−8.54(m,1H)、8.08−8.06(m,1H)、8.00(m,1H)、7.84(m,1H)、7.71−7.69(m,1H)、7.61−7.57(m,1H)、7.36−7.33(m,1H)、7.26−7.24(m,1H)、6.85−6.84(m,1H)。
1H−NMR[DMSO−d6]:8.33−8.30(m,1H)、8.16−8.14(m,1H)、8.09(m,1H)、8.03(m,1H)、7.86−7.83(m,1H)、7.70−7.68(m,1H)、7.60−7.56(m,1H)、7.34−7.31(m,1H)、7.27−7.25(m,1H)、6.82−6.81(m,1H)。
13C−NMR[DMSO−d6]:177.7、148.0、145.0、144.2、140.2、133.9、129.4、128.3、127.4、125.8、125.2、124.0、123.1、114.0、113.2、112.7、112.6、112.4。
(実施例6)
10H−インドロ[1,2−a]インドールの光吸収(図1)
実施例5の手順から得られる乾燥10H−インドロ[1,2−a]インドールペレットを、2.5mMでエタノール/DMF(1:1)中に溶解させた。このストック溶液を100%EtOH中で0.22mMまで希釈し、スペクトルスキャンをSpectramax M5(Molecular Devices社)で記録した。対応するインジケータのスペクトルを比較のために記録した。データを図1に示す。
結論:IO染色により強力かつ容易に検出可能なシグナルが生じる。
インジケータ系I4b/MDABおよびI4c/MDABでのフッ化物および水酸化物イオンのインビトロ表示
I4b(0.4g、1.11mmoll)およびMDAB(0.25g、1.39mmol)をエタノール(8ml)中に溶解させた。得られたインジケータ溶液を、窒素ガス雰囲気下で維持した。テトラブチルアンモニウムフルオリドのTHF中1mM溶液(1.6ml)を室温でインジケータ溶液に添加した。10分後にBI4は強い紫色の重い固体として沈殿し、これを回収して、乾燥した(0.19g、42%)。
1H−NMR[DMSO−d6]:9.84(s,H1)、7.68(d,J=8.6Hz,H6)、7.61(d,J=8.8Hz,H6’)、7.07(s,=CH−)、7.02(d,J=8.6Hz,H7)、6.38(dd,J=8.8Hz,H5’)、6.24(d,H3’)、3.88(s,OCH3)、3.02(s,N(CH3)2)。
13C−NMR[DMSO−d6]:181.0(C=O)、160.0、152.8、152.5、138.3、130.74、130.71、129.9、118.3、113.0、111.4、110.0、109.1、104.9、94.6(OCH3)、55.5(N(CH3)2)。
MDABとインドール−3−アミン(aS6)およびインドール−3−チオール(aS7)との反応
活性シグナロゲンaS6(対応するニトロソ化合物の還元により調製)を大気酸素に曝露すると、ビス−イミノ−インディゴ誘導体ではなく、ポリマーの褐色の沈殿が生じた。MDABの存在下および酸素の非存在下で、aS6は黄色の恐らくシッフ塩基を生じたが、これは単離されなかった。予想されたヘテロアルドール生成物の形成は観察されなかった。
(実施例9a)
インジケータI4aおよびI5aでの細菌コロニーのMDAB染色(表III、エントリー1〜25)
酵母エキス(0.6%)を含むトリプシン大豆寒天(TSA)を基礎平板培地として使用した。培地を121℃で15分間オートクレーブ処理し、50℃の水浴中に入れて冷却した。インジケータを基礎培地に40mg/100mlの最終濃度で添加した(80mg/mlのDMF中ストック溶液から)。ブレインハートインフュージョンブロス中の腸内細菌細胞の一晩培養物をプレート上に画線し、好気性条件下および嫌気性条件下、35℃で24時間インキュベートした。インキュベーション後、プレート上のコロニーの形態を記録した(表III)。
注:4−(N,N−ジメチル)アミノベンズアルデヒド(DAB)および芳香族カルボニル化合物から選択される多数の他の潜在的に好適なアドール(Adol)受容体は、MDABを置換するために使用した場合、試験したすべての条件下でBI染色剤を生じなかった。
インジケータI9a、I10a、I11aおよびI12aのインジケータでの細菌コロニーのMDAB染色(表III、エントリー26〜37)
栄養寒天プレート上で生きた培養菌を用いてインジケータを試験した。栄養寒天(5g/lのペプトン、5g/lのNaCl、2g/lの酵母エキス、1g/lの牛肉エキス、13g/lの寒天、pH7.4)をオートクレーブ処理し、50℃まで冷却した。次いで基質を150mg/lの最終濃度になるまで添加した(20mg/mlのDMF中ストック溶液から)。任意に、MDABを1mMの濃度まで添加し(200mMのDMF中ストック溶液から)、プレートに注いだ。寒天プレートに大腸菌(Escherichia coli)(NM1)または腸炎菌(Salmonella enteritidis)(RKI05/07992)の培養物(栄養ブロス中で8〜18時間前もって成長させておく)を播種し、37℃で好気的にインキュベートした。インキュベーションの48時間後に結果を記録し、表IIIに示す。
(実施例10)
細菌コロニーの10H−インドロ[1,2−a]インドール(IO)染色(表IVa〜c)
栄養寒天(5g/lのペプトン、5g/lのNaCl、2g/lの酵母エキス、1g/lの牛肉エキス、13g/lの寒天、pH7.4)をオートクレーブ処理し、50℃まで冷却させた。次いでインジケータを150mg/lの最終濃度まで添加した(20mg/mlのDMF中ストック溶液から)。
インディゴ(IN)および10H−インドロ[1,2−a]インドール(IO)同時染色(表IVd)
150mg/lの1−(2−ベンゾイルフェニル)−6−クロロ−1H−インドール−3−イル−ベータ−D−ガラクトピラノシド(I21a)、100mg/lのIPTGおよび75mg/lの5−ブロモ−4−クロロ−1H−インドール−3−イル−ベータ−D−グルコピラノシド(I4h)を含む栄養寒天に、大腸菌、肺炎桿菌(Klebsiella pneumoniae)、大便連鎖球菌(Enterococcus faecalis)およびエンテロバクター・エロゲネス(Enterobacter aerogenes)を播種した。37℃で24時間インキュベートした後に回収したデータを表IVdに示す。ベータ−D−ガラクトシダーゼおよびベータ−D−グルコシダーゼの両方を産生する微生物コロニーは、青色INおよび黄色IO染色が並行して形成されるために緑色を呈した。
(実施例12)
嫌気性条件下での細菌コロニーのINおよびIO染色(表IVe)
150mg/lの様々な基質および100mg/lのIPTGを含む栄養寒天プレートに大腸菌を播種した。プレートを嫌気性ジャー(Anaerojar、Oxoid社)中に入れ、AnaeroGen(登録商標)サシェ(Oxoid社)を添加し、ジャーを閉じ、24時間、37℃でインキュベートした。データを記録し、表IVeに示す。
IN染色は嫌気性条件下では使用できない。コロニー成長が遅いために、一部のIO染色剤の拡散は嫌気性条件下で増大するが、インジケータI22aから生成されるIO22などの他の染色剤は完全な局在化をもたらす。
(実施例13)
血液寒天プレート上での細菌コロニーのIO染色(表IVf)
標準的な市販の血液寒天プレートを150mg/lの1−(2−ベンゾイルフェニル)−6−クロロ−1H−インドール−3−イル−ベータ−D−ガラクトピラノシド(I21a)および100mg/lのIPTGで含浸させた。プレートに肺炎桿菌を播種した。37℃で24時間インキュベートした後の結果を表IVfに示す。
結論:IO染色は、微生物血液培養において使用するために潜在的に有用である。
実施例14:真菌コロニーのIO染色(表IVg)
寒天ベース(6g/lのソイトン、1.5g/lの酵母エキス、1g/lのグルコース、10mMのリン酸塩ナトリウム緩衝液、13g/lの寒天、pH7.0)をオートクレーブ処理し、50℃まで冷却させた。次いで、1mMのMnSO4、1g/lのN−アセチル−D−ガラクトサミンおよび1−(2−ベンゾイルフェニル)−6−クロロ−1H−インドール−3−イル−N−アセチル−ベータ−D−ガラクトサミニド(I21g)を0.64mMの最終濃度になるように添加し(50mMのDMF中ストック溶液から)、プレートに注いだ。プレートにカンジダ・アルビカンス(Candida albicans)、カンジダ・クルゼイ(Candida krusei)および出芽酵母(Saccharomyces cerevisiae)を播種し、37℃で48時間インキュベートした。結果を記録し、表IVgに示す。
10H−インドロ[1,2−a]インドール染色された微生物細胞の蛍光(図2)
実施例10からの平板培地を、366nmのUV照射下、16、20、24および48時間後の蛍光についてDigistore2Imageドキュメンテーションシステム(CAMAG)を用いて調べた。データを表IVa、IVbおよびIVcに示す。150mg/lのベータ−D−ガラクトシダーゼインジケータおよび100mg/lのIPTGを含む栄養寒天プレート上で48時間成長させた細菌細胞のループを、黒色透明底のマイクロタイタープレートのウェル中に直接画線した。蛍光スキャンをSpectramax M5(Molecular Devices社)で記録した。データを図2に示す。染色された細胞は標準的蛍光顕微鏡下で検出可能であることが示された。
カーバメート加水分解の表示
1−(2−ベンゾイルフェニル)−1H−インドール−3−イルエチルカーバメート(I32)を1NのNaOH水溶液で短時間処理するか、またはブタ肝臓エステラーゼに長時間曝露すると、黄色の沈殿が生じ、これは参照試料とのTLC比較により、11−フェニル−10H−インドロ[1,2−a]インドール−10−オン(IO19)として同定された。
ジスルフィド還元の表示
ビス[1−(2−アセチルフェニル)−1H−インドール−3−イル]−ジスルファン(I33、2mg)をメタノール(0.5ml)中に溶解させた。トリス(2−カルボキシエチル)ホスフィン塩酸塩(TCEP、20mg)をほぼ無色の溶液に添加した。続いて1Nの水酸化ナトリウム水溶液を添加すると、溶液は黄色になった。
Claims (14)
- 外部刺激を検出するためのインジケータ系であって、一般式
XはO、NHまたはSであり、
LGは不安定基であって、X−LG部分は、前記外部刺激の作用による変換に対して感受性であり、
R1、R2、R3およびR4は、独立して、水素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、および任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択され、
R5は、水素またはR12のいずれかであり、ここでR12は、
Zは、O、NHまたはSであり、
R6、R7、R8、R9およびR10は、独立して、水素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される)であるインジケータ化合物を含み、かつ、
R5が水素である場合、インジケータ系はさらに一般式
RaおよびRbは独立して水素およびC1〜4アルキルから選択される)の受容体化合物を含む、インジケータ系。 - R5が水素であり、前記受容体化合物(B)が2−メトキシ−4−(N,N−ジメチルアミノ)ベンズアルデヒドである、請求項1記載のインジケータ系。
- LGが、ベータ−D−ガラクトピラノシド、tert−ブチルジメチルシリルオキシ(TBDMS)、アセテート、コリンホスフェート、アルファ−D−グルコピラノシド、ベータ−D−グルクロニドナトリウム塩、N−アセチル−ベータ−D−ガラクトサミニドおよびベータ−D−グルコピラノシドからなる群より選択される、請求項1記載のインジケータ系。
- R10が水素、メチル、メトキシ、フェニル、DMP、CFur、Fur、NPyr(ここで、
からなる群より選択される、請求項1記載のインジケータ系。 - 対象の領域における外部刺激を検出する方法であって、
対象の領域にインジケータ系を提供するステップ、および
前記外部刺激の結果として形成されるシグナロフォア種からのシグナルについてモニタリングするステップ
を含み、
前記インジケータ系が請求項1で定義した通りであり、X−LG部分が前記外部刺激の作用による変換に対して感受性であり、前記変換が、エノール部分(前記エノール部分において、XHは、二重結合によってさらなる炭素原子に結合した炭素原子と結合している)を含むシグナロゲン種の形成をもたらし、前記シグナロフォア種が前記エノール部分と、カルボニル、イミノおよびチオカルボニルから選択される受容体部分との反応により形成されることを特徴とする方法。 - 前記受容体部分がカルボニル部分である、請求項5記載の方法。
- 前記カルボニル部分が、一般式
RaおよびRbは、独立して水素およびC1〜4アルキルから選択される)
の受容体化合物を添加することによって提供される、請求項6記載の方法。 - 受容体化合物(B)が2−メトキシ−4−(N,N−ジメチルアミノ)ベンズアルデヒドである、請求項7記載の方法。
- 前記受容体部分がインジケータ分子の一部である、請求項5記載の方法。
- インジケータ系が請求項1で定義された通りであり、R5が水素である場合、シグナロフォア種は、構造式
- 酸素が枯渇した条件下で実施される、請求項5記載の方法。
- 一般式
XはO、NHまたはSであり、
LGは不安定基であって、X−LG部分は、前記外部刺激の作用による変換に対して感受性であり、
R1、R2、R3およびR4は、独立して、水素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、および任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択され、
R5がR12
Zは、O、NHまたはSであり、
R6、R7、R8、R9およびR10は、独立して、水素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される)である)
のインジケータ化合物を調製する方法であって、
一般式
のベンゼン誘導体でN−アリール化するステップを含むことを特徴とする方法。 - 構造式
R1、R2、R3、R4、R6、R7、R8、R9およびR13は、独立して、水素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される)
の化合物であって、以下の化合物:
- 外部刺激を検出するためのインジケータ系におけるシグナロフォアとしての、構造式
R1、R2、R3、R4、R6、R7、R8、R9およびR13は、独立して、水素、C1〜4アルキル、C1〜4アルコキシ、縮合アリールもしくは直鎖状に結合したアリール、縮合ヘテロアリールもしくは直鎖状に結合したヘテロアリール、ハロゲン、シアノ、ニトロ、ホルミル、ならびに任意に置換されたアミノ、カルボキシ、カルボニル、ヒドロキシおよびスルホニルからなる群より選択される)
の化合物の使用方法。
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