JP5700386B2 - 血液細胞に発現する特異分子を指標とした動物の超早期妊娠診断法 - Google Patents
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Description
牛の妊娠診断は、産肉、乳生産、次世代子牛生産性の効率化に欠かせない、畜産経営の基盤を左右する技術である。畜産農家での牛の生産では1年1産をいかに達成するかが課題である。そのため、授精後如何に早く妊娠の正否を判定し、受胎までのロスを防ぐかが鍵である。近年、遺伝子発現検出技術の向上により妊娠初期のウシ末梢血白血球(PBL)における特異分子の検出が可能となってきている。その遺伝子発現を指標に妊娠状態に関連する分子を特定する試みがなされているが、未だ不明の部分が多く特異分子の特定には至っていない。生体内での各白血球画分の機能は様々であり、遺伝子発現レベルでも異なる特徴を有していると考えられる。
妊娠牛血液における遺伝子発現動態をリアルタイムPCRで解析し、低レベルISG15 mRNAは、非妊娠牛であることを示すとの報告もある〔Han H, Austin KJ, Rempel LA, Hansen TR., Low blood ISG15 mRNA and progesterone levels are predictive of non-pregnant dairy cows., J Endocrinol. 2006 Nov;191(2):505-12: 非特許文献3〕。しかしながら、実験毎の変異および個体差が大きいことから、妊娠早期の段階では、更なる検証が必要と考えられる。
妊娠早期の段階で、迅速且つ高感度で、さらに高い精度で妊娠を診断できる技術の開発が求められている。
末梢血球中の白血球に発現する遺伝子群をウシオリゴマイクロアレイおよび定量的RT-PCRにより検出することで、精度よく妊娠診断を行うことに成功し、さらに、フィコールコンレイにより分画した白血球群を用い、検出対象とする主な遺伝子(例えば、ISG15, Mx1, Mx2, OAS-1など)発現量を解析することで、超早期に妊娠診断することに成功した。本発明技術では、特定の白血球細胞画分に発現する遺伝子量を指標とすることも特徴である。
〔1〕
動物より血液を採取し、採血された血液より血球を分離した後、得られた各血球画分における妊娠特異分子の発現を測定し、前記血球画分に発現する特異分子を妊娠指標とすることを特徴とする動物の超早期妊娠診断法。
〔2〕
前記血液は、末梢血であり、前記血球は、末梢血球であることを特徴とする上記〔1〕に記載の動物の超早期妊娠診断法。
〔3〕
前記血球は、白血球であることを特徴とする上記〔1〕又は〔2〕に記載の動物の超早期妊娠診断法。
〔4〕
前記血球は、白血球であり、得られた白血球を全白血球、顆粒球、単球、リンパ球の各分画にわけた後、前記各画分における妊娠特異遺伝子の発現を定量測定し、前記画分に発現する特異分子を妊娠指標とすることを特徴とする上記〔1〕〜〔3〕のいずれか一に記載の動物の超早期妊娠診断法。
〔5〕
前記各血球画分への分離を、フィコールコンレイ法で行い、前記血球たる白血球を全白血球、顆粒球、単球、リンパ球の各分画にわけることを特徴とする上記〔1〕〜〔4〕のいずれか一に記載の動物の超早期妊娠診断法。
〔6〕
顆粒球に発現する妊娠特異分子を妊娠指標とすることを特徴とする上記〔1〕〜〔5〕のいずれか一に記載の動物の超早期妊娠診断法。
〔7〕
前記各血球画分における妊娠特異分子の発現の測定が、当該血球からmRNAを抽出し、cDNAマイクロアレイ及び/又はRT-PCR、例えば、定量的リアルタイムRT-PCRに付して行うものであることを特徴とする上記〔1〕〜〔6〕のいずれか一に記載の動物の超早期妊娠診断法。
〔8〕
前記妊娠特異分子は、妊娠特異遺伝子又はその発現産物であることを特徴とする上記〔1〕〜〔7〕のいずれか一に記載の動物の超早期妊娠診断法。
〔9〕
前記妊娠特異分子は、遺伝子ISG15、Mx1、Mx2及びOAS-1からなる群から選択されたものあるいはその発現産物であることを特徴とする上記〔1〕〜〔8〕のいずれか一に記載の動物の超早期妊娠診断法。
〔10〕前記動物が、牛、馬、羊、山羊、豚、水牛、鹿、犬、ネコ、その他のヒトを除く哺乳動物からなる群から選択されたものであることを特徴とする上記〔1〕〜〔9〕のいずれか一に記載の動物の超早期妊娠診断法。
〔11〕前記動物が、雌牛であることを特徴とする上記〔1〕〜〔10〕のいずれか一に記載の動物の超早期妊娠診断法。
本発明のその他の目的、特徴、優秀性及びその有する観点は、以下の記載より当業者にとっては明白であろう。しかしながら、以下の記載及び具体的な実施例等の記載を含めた本件明細書の記載は本発明の好ましい態様を示すものであり、説明のためにのみ示されているものであることを理解されたい。本明細書に開示した本発明の意図及び範囲内で、種々の変化及び/又は改変(あるいは修飾)をなすことは、以下の記載及び本明細書のその他の部分からの知識により、当業者には容易に明らかであろう。本明細書で引用されている全ての特許文献及び参考文献は、説明の目的で引用されているもので、それらは本明細書の一部としてその内容はここに含めて解釈されるべきものである。
本発明の動物の超早期妊娠診断技術は、動物より血液を採取し、採血された血液より血球、例えば、白血球、あるいは、各血球分画、例えば、全白血球、顆粒球、単球、リンパ球の各分画に分離した後、次にその得られた各血球分画、例えば、全白血球、顆粒球、単球、リンパ球の各分画における妊娠特異分子の発現を測定し、前記血球画分に発現する特異分子を妊娠指標とすることを特徴とする。上記各血球分画への分離は、採取血液から直接行っても、あるいは、採血された血液より血球、例えば、白血球を分離し、次にその得られた血球を各血球分画にわけてもよい。
mRNA量の測定は、例えば、上述の方法で検出したmRNAまたはcDNAに対してデンシトメーター等を用いて得られるシグナル強度を確認することにより実施することができる。すなわち、シグナル強度が強いほどmRNAまたはcDNAの量が高いと判断できる。本発明において妊娠診断における判定は、複数の特異分子の発現についてのデータを指標とすることができる。例えば、本発明では、ISG15とMx1との組合せ、Mx2とOAS-1との組合せ、ISG15とMx2との組合せ、ISG15とOAS-1との組合せ、Mx1とMx2との組合せ、Mx1とOAS-1の組合せ、Mx2とOAS-1の組合せ、ISG15とMx1とMx2との組合せ、ISG15とMx1とOAS-1との組合せ、ISG15とMx2とOAS-1との組合せ、Mx1とMx2とOAS-1の組合せ、及び/又は、ISG15とMx1とMx2とOAS-1との組合せ、についてデータを全て利用して妊娠診断をしてよい。また、そうすることが、ある場合には好ましい。
上記境界値は、用いられる試料によって変動し得るために限定されるものではないが、例えば、後述する実施例における特異分子濃度測定値を参考にその境界値を設定することをしてもよい。
本発明の妊娠診断薬及び/又は妊娠診断キットには、ELISA法やウェスタンブロット法を行うための構成、例えば、標識された二次抗体、発色用試薬、洗浄用緩衝液などが含まれていてもよい。
以下に実施例を掲げ、本発明を具体的に説明するが、この実施例は単に本発明の説明のため、その具体的な態様の参考のために提供されているものである。これらの例示は本発明の特定の具体的な態様を説明するためのものであるが、本願で開示する発明の範囲を限定したり、あるいは制限することを表すものではない。本発明では、本明細書の思想に基づく様々な実施形態が可能であることは理解されるべきである。
全ての実施例は、他に詳細に記載するもの以外は、標準的な技術を用いて実施したもの、又は実施することのできるものであり、これは当業者にとり周知で慣用的なものである。
1)ウシ血液細胞の総mRNA中に発現する遺伝子を網羅的に解析(microarray)し、妊娠に関連して変動する遺伝子群を検索する。
2)妊娠に伴い特異的に変動する遺伝子群の発現細胞を特定する(セルソータでの細胞分離、遺伝子発現解析)。
3)妊娠に関連して変動する遺伝子群を発現する細胞を効率的に収集し、妊娠診断へ適用する(フィコールコンレイによる収集と診断)。
その材料と方法について個々にそれぞれ以下に対応して記載した。
〔材料および方法(全白血球)〕
〔供試動物〕
黒毛和種牛を用い、プロスタグランジン(ダルマジン、川崎三鷹製薬、0.15 mg)を投与し発情同期化した。発情が確認された個体に人工授精し、授精日をday 0とし、day 0、7、14、17、21、28にヘパリン真空採血管を用いて採血した。day 30頃に超音波画像診断を行い、妊娠を確認した。また同様に発情同期化した個体から、発情の翌日をday 0とし、day 0、7、14、17、21に採血を行い、発情周期のサンプルとして用いた。血液は解析まで氷上で保存した。
Histopaque 1119(SIGMA)6 mlに9 mlの血液を重層し、遠心分離器(05PR-2,HITACHI,半径17.5cm)を用い、室温で45分間780 xgで遠心した。血漿を1mlプロジェステロン測定用に分取し、−30℃で保存した。残りの血漿は丁寧に取り除き、バフィーコート部分を500 μl分取し、37 ℃に温めたLysing buffer(155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、1 mM EDTA)を3 ml加え、3分間溶血させた。その後1 x PBSを約50 ml加え、転倒混和し、4℃で10分間1300 xgで遠心した。上清を取り除き、得られた沈殿に10 mM HEPES、2 % FBSを含むHBSS(-)(SIGMA)を1.5 ml加え、攪拌後セルストレーナー付チューブに移し、氷上に保存した。
または、上記と同様に分離したバフィーコート部分500 μlをTRIzol LS(Invitrogen)に溶解し、−80 ℃に保存した。
HBSS(-)に懸濁した血球は、4℃、3800 xgで3分間遠心し、上清を取り除き、60 μlのメルカプトエタノールを加えたBuffer RLT(QIAGEN)600 μl、またはTRIzol(Invitrogen)1 mlに溶解した。抽出はそれぞれ付属の説明書に従って行った。TRIzol LSに溶解したサンプルも付属の説明書に従って抽出した。
抽出したRNAは吸光度計(ND-1000,NanoDrop)を用い、260 nmの吸光度を測定し濃度を算出し、バイオアナライザー(Agilent)にてクオリティを確認した。
TRIzolまたはTRIzol LSを用いて抽出したサンプルはTURBO DNA-free Kit(Applied Biosystems)にてDNase処理した。
Low RNA Fluorescent Linear Amplification kit(Agilent)を用いてcDNAを合成後、in vitro transcription法によりCyanine-3標識cRNAを調製した。マイクロアレイは、60 merから成る約15,000のウシ遺伝子を搭載した自家開発のウシ・オリゴDNAマイクロアレイを使用した。標識cRNAをオリゴDNAマイクロアレイに添加し17時間ハイブリダイゼーション後に洗浄して、DNAマイクロアレイスキャナー(Agilent)を用いてマイクロアレイスライドをスキャニングした。スキャニングした画像をもとにAgilent Feature Extraction Ver.9.5にて各スポットのシグナル強度を数値化した。
cDNAはHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems)を用い、付属の説明書に従った逆転写反応により合成した。
リアルタイムRT-PCRのスタンダードにはプラスミドを使用した。AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)を用いてPCRを行い、pGEM-T Easy Vector Systems(Promega)を用いて増幅産物をTAクローニングし、Competent high DH5α(TOYOBO)にトランスフォーメーションし、培養後QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を用いて付属の説明書に従ってプラスミドを抽出した。オートシークエンサー(ABI PRISMTM 3100-Avant genetic Analyzer; Applied Biosystems)にて配列を確認後、プラスミドを段階希釈してスタンダードとした。Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)を用いて、ABI7300(Applied Biosystems)にてリアルタイムRT-PCRを行い、発現量を測定した。内在性コントロールとしてGAPDHを用いた。次にクローニング(Cloning)及びリアルタイムPCR(Real-time PCR)に用いたプライマーのリストをしめす〔表1:リアルタイムPCRで検証した遺伝子、表2:クローニングプライマー、表3:リアルタイムPCRプライマー(Real-time PCR primers)〕。
ARVO MX(Perkin Elmer)を用い、時間分解蛍光法により血漿プロジェステロン値を測定した。チャコール処理ウシ血清を用いて検量線を作成し、血漿中のプロジェステロン濃度を算出した。
〔材料および方法(ソーティングしたもの)〕
〔供試動物〕
黒毛和種牛を用い、プロスタグランジン(ダルマジン、川崎三鷹製薬、0.15 mg)を投与し発情同期化した。発情が確認された個体に人工授精し、授精日をday 0とし、day 0、7、14、21、28にヘパリン真空採血管を用いて採血した。day 30頃に超音波画像診断を行い、妊娠を確認した。また同様に発情同期化した個体から、発情の翌日をday 0とし、day 0、7、14、21に採血を行い、発情周期のサンプルとして用いた。血液は解析まで氷上で保存した。
Histopaque 1119(SIGMA)6 mlに9 mlの血液を重層し、45分間、室温、780 xgで遠心した。血漿を1 mlプロジェステロン測定用に分取し、−30 ℃で保存した。残りの血清は丁寧に取り除き、バフィーコートおよびその下層の赤血球から1500 μl分取し、37 ℃に温めたLysing buffer(155 mM NH4Cl、10 mM KHCO3、1 mM EDTA)を3 ml加え、3分間溶血させた。その後1 xPBSを約50 ml加え、転倒混和し、1300 xg、10分、4℃で遠心した。上清を取り除き、得られた沈殿に10 mM HEPES、2 % FBSを含むHBSS(-)を1.5 ml加え、攪拌後セルストレーナー付チューブに移し、氷上に保存した。
HBSS(-)に懸濁した試料にヨウ化プロピジウムを1 μl/ml加え、セルソーター(BeckmanCoulter、EPICS ALTRA)にてスキャッター解析を行った。死細胞を除くすべての血球、顆粒球、単球、リンパ球を約2 x 105個ずつ分取し、3分間、4 ℃、3800 xgで遠心後、上清を除き、得られた沈殿に10 % メルカプトエタノールと50 ng yeast tRNAを含むBuffer RLT(QIAGEN)100 μlに溶解し、−80 ℃で保存した。
抽出はRNeasy Micro kit(QIAGEN)の付属の説明書に従って行った。つまり、ライセートに70 %エタノール100 μlを加え、ボルテックス後スピンカラムに入れ、1分間、室温、10000 xgで遠心した。カラムにBuffer RW1を350 μl加え、同様に遠心した。メンブレンにDNase I 10 μl とBuffer RDD 70 μlを加え、15分室温でインキュベートした。カラムにBuffer RW1 350 μlを加え、同様に遠心した。カラムにBuffer RPE 500 μlを加え、同様に遠心した。カラムに80 %エタノール500 μlを加え10000 xgで2分間遠心した。空チューブで、最高スピード、5分間遠心した。以上の操作はすべての遠心後にスピンカラムを新しいチューブに移して行った。1.5 mlチューブにスピンカラムを移し、RNase-free water 17 μlをメンブレンに加え、最高スピード、1分間遠心し、RNA溶液を得た。
抽出したRNAはバイオアナライザー(Agilent)にて測定し、濃度およびクオリティを確認した。
cDNAはHigh-Capacity cDNA Reverse Transcription Kits(Applied Biosystems)を用い、付属の説明書に従った逆転写反応により合成した。
リアルタイムRT-PCRのスタンダードにはプラスミドを使用した。AmpliTaq Gold(Applied Biosystems)を用いてPCRを行い、pGEM-T Easy Vector Systems(Promega)を用いて増幅産物をTAクローニングし、Competent high DH5α(TOYOBO)にトランスフォーメーションし、培養後QIAprep Spin Miniprep Kit(QIAGEN)を用いて付属の説明書に従ってプラスミドを抽出した。オートシークエンサー(ABI PRISMTM 3100-Avant genetic Analyzer; Applied Biosystems)にて配列を確認後、プラスミドを段階希釈してスタンダードとした。Power SYBR Green PCR Master Mix(Applied Biosystems)を用いて、ABI7300(Applied Biosystems)にてリアルタイムRT-PCRを行い、発現量を測定した。内在性コントロールとしてGAPDHを用いた。
ARVO MX(Perkin Elmer)を用い、時間分解蛍光法により血漿プロジェステロン値を測定した。チャコール処理ウシ血清を用いて検量線を作成し、血漿中のプロジェステロン濃度を算出した。
〔フィコールコンレイ法〕
Ficoll-Conray 液(9 %Ficoll、Conray 400(第一製薬))10 mlに、等量のHBSS(-)で希釈したヘパリン加血液を重層し、30分間、室温1,000 xgで遠心した。上層、中間層を吸引除去し、冷HBSS(-)を約2ml加え、ピペッティング後冷0.7 %NH4Clを約50 ml 加え、静かに転倒混和し、氷中で5分間静置して溶血させた。5分間1,800 xgで遠心し、上清を除き、沈殿に冷0.7 %NH4Clを1ml 加え、攪拌し氷中で5分間静置した。5分間1,800 xgで遠心し、上清を除き、1 mlの冷HBSS(-)に攪拌し、同様に再度遠心して上清を除き、1 mlの冷HBSS(-)に攪拌し、氷中に保存した。0.5 %トリパンブルーにて染色して生存率を確認後、細胞浮遊液を5分間1,000 xgで遠心し、上清を除き、TRIzol1 mlに溶解し、−80 ℃で保存した。
収集した細胞からmRNAを抽出し、遺伝子発現動態を検証した。
黒毛和種牛を用い、人工授精日を妊娠0日(D0)としてD0、7、14、21に頚静脈より採血した。比重遠心により分離したバフィーコート部分より白血球を採取、溶血処理したものを解析試料とした。セルソーターを用い、死細胞を除くすべての細胞(all)、顆粒球(G)、単球(M)、リンパ球(L)を分取し、RNAを抽出した。ISG15、Mx1、Mx2、OAS-1についてリアルタイムRT-PCRを行い、各画分における遺伝子発現量の変化を調べた。また血漿プロジェステロン濃度を時間分解蛍光法により確認した。対象として、発情周期を通じて同様に採血したものを解析した。
次に、分離血球中の各種特異遺伝子の発現について調べた結果を、図2に示す。図2では、特異遺伝子、すなわち、ISG15 (A)、Mx1 (B)、Mx2 (C)、OAS-1 (D)についての結果が示されている。
妊娠牛(pregnant)と発情周期にある牛(cyclic)について分離血球中の各種特異遺伝子の発現について調べた結果を、図6〜9に示す。図6は、各白血球分画におけるISG15 mRNA発現の変化を示し、図7は、各白血球分画におけるMx1 mRNA発現の変化を示し、図8は、各白血球分画におけるMx2 mRNA発現の変化を示し、図9は、各白血球分画におけるOAS-1 mRNA発現の変化を示す。図中、all:全白血球、G:顆粒球、M:単球、L:リンパ球を示す。
本発明は、前述の説明及び実施例に特に記載した以外も、実行できることは明らかである。上述の教示に鑑みて、本発明の多くの改変及び変形が可能であり、従ってそれらも本件添付の請求の範囲の範囲内のものである。
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Claims (5)
- 非ヒト動物より採取された顆粒球における、ISG15、Mx1、Mx2及びOAS-1からなる群から選択される少なくとも一つのmRNAまたはタンパク質の発現を指標とすることを特徴とする、非ヒト動物の超早期妊娠検出方法。
- 動物が、牛、馬、羊、山羊、豚、水牛、鹿、犬、ネコ、その他のヒトを除く哺乳動物からなる群から選択されたものであることを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- ヒトより採取された顆粒球における、ISG15、Mx1、Mx2及びOAS-1からなる群から選択される少なくとも一つのmRNAまたはタンパク質の発現を指標とすることを特徴とする、ヒトの超早期妊娠の検出を補助する方法。
- 顆粒球が、フィコールコンレイ法による分離を経たものであることを特徴とする、請求項1〜3のいずれか1項に記載の方法。
- 顆粒球から抽出したmRNAをcDNAマイクロアレイ及び/又はRT-PCRに付して発現を検出することを特徴とする、請求項1〜4のいずれか1項に記載の方法。
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