JP5678397B2 - プロテオグリカンの新規な医薬用途 - Google Patents

Description

本発明は、プロテオグリカンの新規な医薬用途に関する。

プロテオグリカンは複合糖質のひとつで、コアタンパクとそれに結合するグリコサミノグリカン（酸性ムコ多糖）からなり、細胞外マトリックスの主な構成要素として、皮膚、軟骨、骨、血管壁などに存在する。近年、プロテオグリカンの研究開発が精力的に行われていることは周知の通りであり、本発明者らも、プロテオグリカンがＴＮＦ−α産生抑制作用、ＩＦＮ−γ産生抑制作用、ＩＬ−１０産生促進作用などのヘルパーＴ細胞のサブセットの１つである細胞性免疫を司るＴｈ１細胞に関連する分子に対する各種作用を有することをこれまでに報告している（特許文献１）。しかしながら、プロテオグリカンが有する薬理作用の全容はいまだ明らかでない。

特開２００７−１３１５４８号公報

そこで本発明は、プロテオグリカンの新規な医薬用途を提供することを目的とする。

本発明者らは上記の点に鑑みて鋭意研究を進めた結果、プロテオグリカンがＴｈ１細胞とは異なるヘルパーＴ細胞のサブセットの１つであるＴｈ１７細胞の分化誘導を抑制する作用を有することを見出した。

上記の知見に基づいてなされた本発明は、請求項１記載の通り、プロテオグリカンを有効成分とするＴｈ１７細胞の分化誘導抑制剤である（但し炎症性腸疾患に対する用途と機能性食品としての用途は除く）。

本発明によれば、プロテオグリカンの新規な医薬用途として、Ｔｈ１７細胞の分化誘導抑制剤を提供することができる。

実施例１における多発性硬化症モデルマウスでのプロテオグリカンのＩＬ−１７産生抑制作用を示すグラフである。 同、ＲＯＲγｔ、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３Ｒのそれぞれに対するプロテオグリカンの遺伝子発現抑制作用を示すグラフである。 同、実験的自己免疫性脳脊髄炎の臨床症状に対するプロテオグリカンの有効性を示すグラフである。 実施例２における炎症性腸疾患モデルマウスでのＩＬ−１７ＡとＩＬ−２３ｐ１９のそれぞれに対するプロテオグリカンの遺伝子発現抑制作用を示すグラフである。 同、Ｆｏｘｐ３に対するプロテオグリカンの遺伝子発現促進作用を示すグラフである。

本発明において有効成分とするプロテオグリカンは、例えば、サケ、サメ、ウシ、クジラなどの軟骨を原材料にして精製されたものが挙げられる。プロテオグリカンの精製方法としては、特開２００２−６９０９７号公報に記載の酢酸を用いた方法を好適に採用することができる。この方法は、例えばミンチにしたサケの鼻軟骨から溶出溶媒として酢酸を用いて粗プロテオグリカンを溶出した後、得られる溶出液を濾過してから遠心分離し、その上澄液に食塩飽和エタノールを加えて遠心分離することにより得られる粗プロテオグリカンを含む半固形沈殿物を酢酸に溶解し、次いで透析することにより行うものであり、この方法によれば、例えばサケの鼻軟骨から約１００〜４００ｋＤａの分子量を有するプロテオグリカンを得ることができる。なお、本発明において有効成分とするプロテオグリカンは高度に精製されたものである必要は必ずしもなく、異なる分子量を有する複数のプロテオグリカンの混合組成物やプロテオグリカンの作用に悪影響を及ぼさない他の成分を含むものであってもよい。

プロテオグリカンは、経口投与によってＴｈ１７細胞の分化誘導抑制作用を発揮し、多発性硬化症や炎症性腸疾患（クローン病、潰瘍性大腸炎）などのＴｈ１７細胞が病態形成に関与する疾患に対して有効に作用するが、プロテオグリカンの投与方法は経口投与に限定されるものでなく、静脈注射、筋肉注射、皮下投与、直腸投与などの非経口投与であってもよい。投与に際してはそれぞれの投与方法に適した剤型に製剤化すればよい。製剤形態としては、例えば、錠剤、カプセル剤、顆粒剤、散剤、細粒剤、丸剤、トローチ剤、舌下錠、坐剤、軟膏、注射剤、乳剤、懸濁剤、シロップなどが挙げられ、これら製剤の調製は、無毒性の賦形剤、結合剤、滑沢剤、崩壊剤、防腐剤、等張化剤、安定化剤、分散剤、酸化防止剤、着色剤、矯味剤、緩衝剤などの添加剤を使用して自体公知の方法にて行うことができる。無毒性の添加剤としては、例えば、でんぷん、ゼラチン、ブドウ糖、乳糖、果糖、マルトース、炭酸マグネシウム、タルク、ステアリン酸マグネシウム、メチルセルロース、カルボキシメチルセルロース、アラビアゴム、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、ペトロラタム、グリセリン、エタノール、シロップ、塩化ナトリウム、亜硫酸ナトリウム、リン酸ナトリウム、クエン酸、ポリビニルピロリドン、水などが挙げられる。なお、製剤中には、本発明の有用性を補強したり増強したりするために、他の薬剤を含有させてもよい。

製剤中における有効成分であるプロテオグリカンの含有量は、その剤型に応じて異なるが、一般に０．１〜１００重量％の濃度であることが望ましい。製剤の投与量は、投与対象者の性別や年齢や体重の他、症状の軽重、医師の診断などにより広範に調整することができるが、一般に１日当り０．０１〜３００ｍｇ／Ｋｇとすることができる。上記の投与量は、１日１回または数回に分けて投与すればよい。

また、プロテオグリカンは、種々の形態の食品（サプリメントを含む）に、所望する薬理作用を発揮するに足る有効量を添加することで、機能性食品として食してもよい。

以下、本発明を実施例によって詳細に説明するが、本発明は以下の記載に限定して解釈されるものではない。

実施例１：プロテオグリカンのＴｈ１７細胞の分化誘導抑制作用（その１：多発性硬化症モデルマウスを用いた検討）
（実験方法）
Ｂａｔｔｅｎ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｉｍｍｕｎｏｌ．９２９−９３６（２００６）の記述に従い、フロイント完全アジュバント（ＣＦＡ）とミエリンオリゴ糖タンパク（ＭＯＥ）を用いてＣ５７ＢＬ／６マウス（雌雄、８〜１０週齢）に多発性硬化症モデルである実験的自己免疫性脳脊髄炎（ＥＡＥ）を誘導した。同時に、分子量が約１００〜２００ｋＤａのサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカン（ＰＧ：特開２００２−６９０９７号公報に記載の方法により精製）および異なる分子量を有する複数のプロテオグリカンの混合組成物（Ｃｒｕｄｅ）を１０ｍｇ／ｍＬの濃度でリン酸緩衝生理食塩水（ＰＢＳ）に溶解し、ＥＡＥ誘導マウスに対して４週間、毎日ゾンデで午前９時〜１２時の時間帯に胃内に投与した（ＰＧの投与量は０．０８，０．４，２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ、Ｃｒｕｄｅの投与量は２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ）。４週間の間、毎日ＥＡＥの臨床スコアをＣｕａ，ＤＪ ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４２１，７４４−７４８（２００３）の記述に従って計測した。また、４週間後に脾臓（Ｓｐｌｅｅｎ）と鼠径リンパ節（Ｄｒａｉｎｉｎｇ ＬＮ）を採取し、常法に従って単細胞浮遊液を作製し、ＭＯＧによる再刺激を行った後か行うことなしに（ｕｎｓｔｉｍｕｌａｔｅｄ）、ＩＬ−１７の産生量をＥＬＩＳＡにて測定した。また、採取した脾臓と鼠径リンパ節からｍＲＮＡを精製し、ＩＬ−２１、ＩＬ−２３Ｒ、ＲＯＲγｔの遺伝子発現量を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した（内部標準遺伝子であるＧＡＰＤＨの遺伝子発現量との相対値として算出）。なお、異なる分子量を有する複数のプロテオグリカンの混合組成物は、凍結させたサケの鼻軟骨を破砕し、水を加えて十分に混ぜ合わせてから遠心分離を行い、最上部の脂質層と中間部の水層を除去して最下部に残留する沈殿物を回収し、回収した沈殿物を凍結乾燥してから粉砕した後、有機溶媒（エタノール）を加えて残存する脂質を抽出除去し、最後に有機溶媒を除去することで調製したものを用いた。

（実験結果）
Ｔｈ１７細胞が産生する能力を有しているＩＬ−１７の産生量に対するプロテオグリカンの作用を図１に示す（ｎ＝６）。また、Ｔｈ１７細胞の分化誘導の主要な転写因子であるＲＯＲγｔ、ＲＯＲγｔの産生を促進するＩＬ−２１、ＩＬ−１７の産生を促進するＩＬ−２３受容体（ＩＬ−２３Ｒ）のそれぞれの遺伝子発現量に対するプロテオグリカンの作用を図２に示す（ｎ＝６）。図１と図２から明らかなように、プロテオグリカンは多発性硬化症モデルマウスでのＴｈ１７細胞関連分子の産生と遺伝子発現を用量依存的に抑制したことから、Ｔｈ１７細胞の分化誘導を抑制する作用を有することがわかった。また、ＥＡＥの臨床症状に対するプロテオグリカンの作用を図３に示す。図３から明らかなように、プロテオグリカンはＥＡＥの臨床症状を用量依存的に軽減したことから、多発性硬化症の予防や治療に有効であることがわかった（この効果は脳の病理組織学的評価においても組織への単核炎症細胞の浸潤が抑制されたことによって確認することができた）。

実施例２：プロテオグリカンのＴｈ１７細胞の分化誘導抑制作用（その２：炎症性腸疾患モデルマウスを用いた検討）
（実験方法）
Ｉｋｅｎｏｕｅ，Ｙ．ｅｔ ａｌ．Ｉｎｔ．Ｉｍｍｕｎｏｐｈａｒｍａｃｏｌ．５：９９３−１００６（２００５）の記述に従い、ＩＬ−１０ＫＯマウス（雌、１２〜１５週齢）より脾臓と腸間膜リンパ節（ＭＬＮ）を採取し、常法に従って調製した両者の細胞浮遊液をＳＣＩＤマウス（雌、８〜１０週齢）の腹腔内に移入し、炎症性腸炎を誘導した。同時に、実施例１と同様にして分子量が約１００〜２００ｋＤａのサケの鼻軟骨由来のプロテオグリカンを１０ｍｇ／ｍＬの濃度でＰＢＳに溶解し、炎症性腸炎誘導マウスに対して４週間、毎日ゾンデで午前９時〜１２時の時間帯に胃内に２ｍｇ／ｍｏｕｓｅ投与した。４週間後に脾臓と腸間膜リンパ節を採取し、ｍＲＮＡを精製してＩＬ−１７Ａ、ＩＬ−２３ｐ１９、Ｆｏｘｐ３の遺伝子発現量を定量的リアルタイムＲＴ−ＰＣＲにて測定した（内部標準遺伝子であるＧＡＰＤＨの遺伝子発現量との相対値として算出）。

（実験結果）
ＩＬ−１７ＡとＩＬ−２３ｐ１９のそれぞれの遺伝子発現量に対するプロテオグリカンの作用を図４に示す（ｎ＝９）。図４から明らかなように、プロテオグリカンは炎症性腸疾患モデルマウスでのＴｈ１７細胞関連分子の遺伝子発現を抑制したことから、Ｔｈ１７細胞の分化誘導を抑制する作用を有することがわかった。また、制御性Ｔ細胞に特異的に発現するＦｏｘｐ３の遺伝子発現量に対するプロテオグリカンの作用を図５に示す（ｎ＝９）。図５から明らかなように、プロテオグリカンはＦｏｘｐ３の遺伝子発現を促進したことから、Ｔｈ１７細胞の分化誘導を抑制する一方で、制御性Ｔ細胞の分化誘導を促進することがわかった。なお、プロテオグリカンの炎症性腸疾患に対する臨床的な有効性（予防効果と治療効果）は、体重減少の阻止と病理組織学的評価（腸管肥厚の抑制と組織への単核炎症細胞の浸潤の抑制）によって確認することができた。

製剤例１：錠剤
１錠当たり５ｍｇのプロテオグリカンを含む以下の成分組成からなる２００ｍｇ錠剤を、各成分をよく混合してから打錠することで製造した。
プロテオグリカン ５ｍｇ
乳糖 １３７〃
でんぷん ４５〃
カルボキシメチルセルロース １０〃
タルク ２〃
ステアリン酸マグネシウム １〃
合計２００ｍｇ／錠

製剤例２：カプセル剤
１カプセル当たり２０ｍｇのプロテオグリカンを含む以下の成分組成からなる１００ｍｇカプセル剤を、各成分をよく混合してからカプセルに充填することで製造した。
プロテオグリカン ２０ｍｇ
乳糖 ５３〃
でんぷん ２５〃
ステアリン酸マグネシウム ２〃
合計１００ｍｇ／カプセル

本発明は、プロテオグリカンの新規な医薬用途として、Ｔｈ１７細胞の分化誘導抑制剤を提供することができる点において産業上の利用可能性を有する。

Claims (1)

1. プロテオグリカンを有効成分とするＴｈ１７細胞の分化誘導抑制剤（但し炎症性腸疾患に対する用途と機能性食品としての用途は除く）。