JP5677741B2 - 生体物質成分の測定 - Google Patents

Description

本発明は、生体物質から成分を濃縮することを含む、生体物質の成分（特に脂質及び／又はビタミン）を分析する方法に関し、前記成分を抽出する少なくとも一の有機溶媒で前記生体物質が処理され、この点での有機溶媒若しくは有機溶媒混合物の使用のための、及び生体物質の成分を測定する分光光度計のための方法に関する。

生体物質を分析する従来の方法は、生体物質の構成要素及び成分の除去、抽出、分離、及び／又は濃縮の工程をしばしば含んでなる。そのような方法の工程は、干渉し若しくは結果を偽る物質を取り除く定性的な及び定量的な分析において不可欠なものである。加えて、チップカードのサイズで減少された全機能性を提供する、いわゆる高処理能力方法若しくはマイクロ流体システムは、一般に分析の分野で適用されている。そのような方法若しくはシステムは、ベストポケットラボ、チップ上のラボ若しくはケアポイントシステム（患者の隣で直接使用され得る診断システム）等の言葉に口語的に含められる。実質的な小型化は、そのような分析形態にとって必要である。そのようなシステムの小型化は、妨害し得る不純物に対する感受性を引き起こし、その結果、表面及び毛細管システムを使用できないものにする。従って、そのようなシステム若しくは方法は、最終分析前に、時間がかかり且つ装置が集中される中間工程ととともに、面倒な試料の準備をしばしば要求する。そのような問題は、特に、血液若しくは食物製品の分析に関係する。人間及び動物の医学ラボで行われるもっとも共通する調査は、診断のための血液分析である。たいてい、その調査は、全血液試料の細胞がない部分において、特に、血清若しくは血漿において実施される。全血液の調査は、仕方ない場合のみ行われるが、それは、血液細胞の溶解のリスク、特に、赤血球の溶血のリスクのためである。血液における細胞の構成要素を分析前に取り除くのに適した従来技術は、遠心分離及び／又は濾過である。そのような微粒子の構成要素の除去は、特にチップ上のラボ分析に於いて、細胞から、及び細胞断片から、並びに溶解物質からの干渉の影響を避けるのに役立つ。通常、チップ上のラボ分析でさえ、除去は、遠心分離若しくは濾過の工程の手段によって従来行われる。チップ上のラボにおける濾過は、細胞の直接的な除去とって好まれる。このつながりで生じる主な問題は、各ケースで用いられるフィルターシステムに関係ない毛細管の急速な妨害である。このため、数マイクロリッターの容量だけが、限界量としてたいてい適用され得る。また、同様な問題は、食物製品の分析にも関係する。

遠心分離若しくは濾過による必要な除去は、分析に於いて、増加された実施時間及び試薬、装置、及び生体物質、特に、血液に対して増加された要求を導く。このように、フィルターにかけられず若しくは遠心分離されない試料に実施できる、生体物質（特に血液）の成分の分析方法に対して、大きな必要性がある。

従って、本発明によって対応される課題は、分析前に生体物質の試料の遠心分離若しくは濾過をしないですむ、生体物質の構成要素を分析する方法を提供することにあり、その方法によって得られる構成要素の分析のための装置を提供することにある。

本発明は、そのもとに置かれた技術問題を、生体物質の構成要素、特に、脂質及び／又はビタミンを分析するための手始めに述べられた方法であって、前記生体物質が、前記構成要素を抽出する有機溶媒の少なくとも一つで処理され、前記生体物質が、濃縮された形態に抽出で転換され、濃縮された沈殿物及び液体有機相の浮遊物が、形成され、前記浮遊物で抽出された構成要素が調べられる方法によって解決する。

本発明の状況では、“生体物質”は、植物、動物、人間及び／又は微生物由来の物質、特に内因性物質、好ましくは、内因性物質試料を意味することが意図されている。

加えて、“微生物”は、本発明の状況では、例えば、真核生物（例えば、藻類等）、原核生物、及び／又は菌類（例えば、酵母、ウイルス等）を含むことが意図されている。特に、“生体物質”は、培養及び培養浮遊物から得られるオーガニズムを含むことが意図されている。

前記生体物質は、本発明の方法では、前記生体物質の試料、好ましくは、人間又は動物のオーガニズムから得られる試料を用いることによって供給される。また、排出され若しくは分泌された生体物質を用いることは都合良く可能性がある。さらに、前記生体物質を、本発明の方法でのその使用前に、特に人間の若しくは動物の体の外で培養することは、可能性がある。

“濃縮”は、本発明の状況においては、粘度における増加、特に、前記生体物質の粘度における増加を意味し、その結果、濃縮された沈殿物は形成される。また、その上、液体の粘度と固体の粘度との間の粘度に到達することは可能である。特に、これにより、軟膏、クリーム、サイクリストのためのゲルサドルのフィリング、ヘアスタイルを整えるためのヘアゲル、好ましくは、ゼラチンの天然のゲル、ゼリー又はゲル状物質の性質の生体物質の濃縮された形態若しくは濃縮された沈殿物を意味することが意図される。前記濃縮は、例えば、沈殿若しくは樹脂化によって、特に、酸、又は樹脂を含有する組成物での処理によって到達され得る。

ゲル若しくはゲル状態は、濃縮された形態若しくは濃縮として本発明に従って適している。ゲル若しくはゲル状態を技術の観点から述べることは比較的簡単である。しかしながら、一般的に受け入れられる広範なゲルの定義は、まだ考えられている。

ゲルは、通常、少なくとも一つの固相と一つの液相とが備えられるコロイド系として記載される。いくつかのゲルにおける固相は、前記液相に含まれるスポンジ状の３次元ネットワークの形態であろう。それらのメカニズムの特徴に関しては、ゲルは、固体のような状態である。そのような状態は、完全体系に均一に分配される構成要素によって特徴づけられる。前記ゲルは、均一構造、特に整った構造と、整ってない構造、特に塊状のポリマーのネットワークの場合における整ってない構造との間で特徴づけられ得る。その上、前記ゲルは、それらの結合力の、及びそれらの液相の物理的及び化学的性質に従って特徴づけられ得る。水媒体が前記液相を構成するところでは、前記ゲルは、“ヒドロゲル”として参照される。有機媒体の場合には、前記ゲルは、“オルガノゲル”として参照される。液相として表面活性物質を含有するゲルは、“アンフィフィロゲル”として参照される。

ゲルは、通常、加熱された溶媒中でゲル化剤を溶解することにより生成される。前記溶液のゲルは、冷却し始める。ゲル生成は、前記溶媒中のゲル化剤若しくはゲル化物質の溶解度が減少されたときに始まる。これは、ゲル化剤分子のクラスタリング（自己会合）を導く。前記溶媒の部分は、前記ゲル化剤で結合される。結果、前記溶媒は、その容積、特にその全体の容積で濃縮され、そして、それは、それ自体の重さを有し得る。

適切なゲル化剤若しくはゲル化物質は、様々な低分子であり、それは、前記ゲルの性質に依存する。水溶液中でヒドロゲルを形成する多数の分子は、性質的に見つかり得る。特に食物製品における添加物が水と結合し若しくは水中で膨らんだ時にゲル化の原因となり、且つ述べられるべきゲル化物質は、特に、寒天、アルギン酸、カラギーナン、ゼラチン、グアーガム、ゴム糊、ローカストビーンガム、ペクチン（特に、アミド化されたペクチン）、及び改質されたでんぷんである。

述べられるべきオルガノゲルのためのゲル化剤の例は、脂肪酸、脂肪酸派生物、特に脂肪酸の金属塩、ステロイド派生物、特にコレステロール派生物、アミノ酸含有ゲル化剤、芳香族ゲル化剤、特にアントラキノン派生物、例えばアントリル派生物、カリックスアレーン、同様にソルビトール派生物、及びポリオール派生物である。よく知られたオルガノゲルは、レシチンによって形成される。

また、当業者に知られるさらなる技術、及びまだ知られていない技術は、前記ゲル生成に加えて前記生体試料の濃縮に適している。

本発明に従った方法は、構成要素、好ましくは脂質及び／又はビタミン、並びに生体物質の分析に対して意図される。前記方法は、脂溶性の構成要素を抽出するのに特に役立つ。前記生体物質は、前記抽出の間に前記構成要素が移される有機溶媒で処理される。前記生体物質は、好ましくは、前記水媒体に存在する。

前記生体物質は、本発明の方法によって抽出の間濃縮された形態に意外にも転換される。有機溶媒、特に溶媒混合物での処理は、多相系、特に２層を有する系での生成の結果となる。濃縮が進む一方で、好ましくは、同時に、前記生体物質、特に前記生体物質の試料は、抽出される。

前記生体物質は、前記生体物質が前記溶媒に加えられる方法で前記溶媒により処理されるが、前記生体物質に前記溶媒を加えることも可能である。

前記生体物質の濃縮は、前記生体物質から分離される、前記抽出に対して意図された溶媒の結果となる。濃縮された沈殿物及び浮遊物は、形成される。前記浮遊物は、前記抽出に対して意図された溶媒、及び前記構成要素、特に、前記有機溶媒に移される脂溶性の構成要素を含有する。このように、前記生体物質は、前記濃縮された形態を通じて、前記浮遊物に存在し抽出された構成要素から有利に分離される。前記生体物質は、前記濃縮された沈殿物を形成し、前記構成要素は、有機溶媒においてその上方に配され、その後、知られた分析技術で調べられ得る。

牛の血清由来のベータカロチンの紫外線可視領域（ＵＶ−vis スペクトル）における溶血によって汚染されたスペクトル。 牛の血清由来であり溶血のないベータカロチンの、図１と比較できる紫外線可視スペクトル。 人間の全血液由来のカロチノイドの、本発明に従った抽出後におけるＨＰＬＣクロマトグラム。 加えられた界面活性剤の影響のもとでのベータカロチンの本発明に従った抽出の表の比較。 二つの混合物を有する溶媒混合物、及びベータカロチン、レチノール及びトコフェロールの回収率Ｉでのそれらの影響。 三つの混合物を有する溶媒混合物、及びベータカロチン、レチノール及びトコフェロールの回収率ＩＩでのそれらの影響。 血清抽出と、本発明に従って実施された全血液抽出との比較。 抽出における様々なエタノール：イソプロパノール溶媒混合物での様々な構成要素の回収率ＩＩＩ。 疎水性化されていない表面を有する容器及び疎水性化された表面を有する容器での血液の濃縮。

生体物質（例えば血液）と、例えば極性及び非極性溶媒の溶媒混合物の形態における本発明の方法で用いられる有機溶媒との混合は、相分離を導く。極性溶媒は、本質的に、その分配係数に従って、水相を示す生体物質に入る。構成要素、好ましくは脂溶性の構成要素は、例えば膜の構成要素及びリポ蛋白という形態で、水相に存在するので、極性溶媒は、これらの構造で濃縮される。また、前記極性溶媒は、細胞膜（例えば、全血液における赤血球の細胞膜等）の中に浸透し、脂質部分に相互に作用することができる。二つの効果が生じる：脂溶性の構成要素は、それらの融和したシステムから溶解され、浮遊物の中へ抽出され得る。前記極性溶媒は、細胞膜若しくは脂質を含有する構造におけるより少ない脂溶性の構成要素に相互に作用する。ゲル生成を導く効果のための適切な脂質は、細胞壁に生じるリン脂質及びリポ蛋白である。生体膜は、化学組成で異なるリン脂質を多く含有する。

リン脂質との相互作用と、細胞膜からのコレステロールの除去とは、細胞膜の架橋結合（互いに入り込むこと）及びゲル生成に導く。コレステロールの存在は、いわゆるＬ_O 相（“順序付けられた液体”）の生成を介した細胞膜の流体の振る舞い（流動性）を高め、架橋結合を妨げる。モデル膜におけるコレステロールの含有量は増加するので、アルコール（メタノール、エタノール、プロパノール、ブタノール）等の極性有機溶媒による膜架橋結合の減少がある。コレステロール濃縮がある時の比較できる効果を達成するために、高濃度のアルコールが必要である。また、サブ溶解濃度における表面活性物質、及び様々な短鎖アルコールは、膜からのコレステロールの枯渇の原因となるまた、膜に関連するリン脂質に相互作用するアルコールの可能性は、アルコールがリン脂質よりもコレステロールを抽出することの観察によってサポートされる。リン脂質の抽出可能性は、一般に比較的低い。

きれいな溶液は、本発明の方法によって有利に浮遊物として形成され、さらなる分析を、好ましくはさらなる処理なしで受け得る。溶媒若しくは溶媒混合物は、好ましくは、水よりも低い特定の密度を有する。このように、液体の浮遊物が形成されることが確かにされる。これに加えて、濃縮された生体物質をクリーム状に到達させるために水よりも高密度である溶媒を用いることは、都合がよいであろう。これは、使用される試料容器に特に依存するが、さらなる分光学調査にとって有利であろう。水よりも低い特定の密度を有する溶媒は、好ましくは、本発明の方法で用いられる。

本発明の方法で用いられる生体物質は、好ましくは、その方法が実施される一方で望まれる濃縮を示す。また、望ましい濃縮を引き起こす物質で処理を実施することが可能である。上記のゲル化剤若しくはゲル化物質を用いることが特に可能である。

さらなる実施形態に於いては、前記生体物質は、特に細胞培養から由来される、植物、動物、人間及び／又は微生物の物質を含有する。

抽出を受け得るすべての生体物質を使用することは、本発明に従って可能である。

前記方法のさらに好ましい実施形態では、前記生体物質は、前処理のその使用前に、特に浄化プロセスを受ける。

適した前処理の例はパルプ化である。適したパルプ化は、ホモジナイザーを用いる処理である。述べられるべきホモジナイザーは、例えば、カッター、ウルトラトラックス装置、ミル等である。従って、前記生体物質は、それらの表面積を増加するためにサイズの減少を受ける。サイズの減少は、抽出効率を増加する。また、これに加えて、低温での処理、特に液体窒素を用いた低温での処理は、適している。パルプ化は、前記生体物質から構成要素を放出し、このようにして抽出を可能にするのに役立つ。また、前記生体物質は、不純物及び／又は干渉物質を除去する前処理として、特に例えばバッファー溶液を用いた洗浄プロセスを受け得る。

前記方法のさらに好ましい実施形態では、細胞、器官及び／又は体の流体物は、生体物質として用いられる。

好ましく用いられる生体物質は、診断及び／又は治療観察のための医療分野で用いられるものである。

前記方法のさらに好ましい実施形態では、使用される体の流体物は、血液、血漿、血清、尿、羊膜の流体物、子宮の流体物、小胞の流体物、骨液、精子、肺の流体物及び／又は分泌物である。

前記分泌物は、好ましくは、ミルク、汗、涙流体物、唾液及び／又は胃腸管分泌物、特に、胆液流体物及び／又は膵臓の分泌物である。体流体物として、血液、好ましくは全血液を用いることは、本発明に従って可能である。血液は、好ましくは、本発明の方法で生体物質として用いられる。前処理時、前記血液は、好ましくは、抗凝血性の物質で、特に、ポリアニオン系多糖類で、好ましくは、ヘパリン及び／又はヘパリンに似たもので処理される。更に、抗凝血剤として、特にヘパリン−アンチトロンビン複合体の形態で、アンチトロンビンＩＩＩを用いることが可能である。また、外来栄養の抗凝血剤は、加えて用いられ得る。適した外来栄養の抗凝血剤は、特に、ビタミンＫ拮抗薬、若しくはカルシウム複合体物質である。クマリンは、特にビタミンＫ拮抗薬として述べられべきであり、且つクエン酸塩、シュウ酸塩、好ましくは、エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）は、特にカルシウム複合体物質として述べられるべきである。

血液、特に血液細胞の溶血は、有利に、本発明の方法で避けられる。本発明に従った血液の濃縮は、血液細胞をゲル状の環境に埋められ、このようにして溶血から保護される。

さらに、抽出は、手で振ることによって、特に注意深く振ることによって実施されて溶血を避けるのに有利となる。また、血液を溶媒で抽出する補佐、特に、テーブルを振動させること、装置を振動させること、鉛直の回転装置、マグネチックスターラー、及びその他の撹拌技術を用いることが可能である。手動の混合は、電流源若しくは電気装置に無関係に抽出を実施できるという利点がある。

前記方法に従った更に好ましい実施形態では、動物及び／又は植物由来の食物製品、特に、均質の食物製品は、生体物質として用いられる。

適した食物製品は、特に卵、好ましくは、卵の黄身全体、フルーツ、野菜、特にニンジン、並びに／又は魚及び／若しくは肉である。これらに加えて、本発明の方法は、食物製品ジュースとして、特に、フルーツ及び／又は野菜ジュース、好ましくは、ニンジンジュースを調べるのに用いられ得る。

本発明の方法に好ましく適した食物製品は、人間の食事にとって本質的な構成要素、好ましくは脂溶性の構成要素を含むものである。

前記方法の更に好ましい実施形態では、極方向にプロトン性の溶媒が、有機溶媒、特にアルコールとして用いられる。

前記方法の更に好ましい実施形態では、極方向にプロトン性の溶媒は、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、ブタノール、ペンタノール、ヘキサノール及びこれらの混合物からなる群より選ばれる。

本発明の方法でのアルコールの使用は、意外にも生体試料を濃縮することをもたらす。エタノール及び２−プロパノール（イソプロパノール）の混合物は、好ましくは、用いられる。

前記方法の更に好ましい実施形態では、極性非プロトン性溶媒の少なくとも一が、有機溶媒として用いられ、特にエステル、好ましくは酢酸エチルが、用いられる。

また、好ましい極性プロトン性溶媒に加えて、本発明の方法で非プロトン性の溶媒を用いることが有利に可能である。

前記方法のさらなる実施形態では、ニトリル、好ましくはアセトニトリルが、極性非プロトン性溶媒として用いられる。

前記方法のさらなる実施形態では、ケトン、好ましくはアセトンが、極性非プロトン性溶媒として用いられる。

前記方法のさらなる実施形態では、ジメチルスルホキシド及び／又はＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドが、極性非プロトン性溶媒として用いられる。

前記方法のさらなる実施形態では、エーテル、特にジエチルエーテルが、極性非プロトン性溶媒として用いられる。

これまでに述べた溶媒は、前記生体物質を濃縮するのに役立つ。極性溶媒は、好ましくは、前記生体物質に依存して混合物の形態で用いられる。

前記方法の更に好ましい実施形態では、少なくとも一の非極性溶媒、特に、アルカン、好ましくは、Ｃ５〜Ｃ１２のアルカンが、溶媒として用いられる。

前記方法の更に好ましい実施形態では、ヘキサン、ヘプタン、及び／又はオクタン、特にイソオクタンが、非極性溶媒として用いられる。

前記方法の更に好ましい実施形態では、芳香族化合物、特にトルエン及び／又はベンゼンが、非極性溶媒として用いられる。

前記非極性溶媒は、本発明の方法において、構成要素のための、特に脂溶性の構成要素のための抽出溶媒として役立つ。

有機溶媒分子の派生物若しくは異性体を用いることは、本発明によって都合が良いであろう。溶媒は、無水のもの、含水のもの、枝分かれしたもの、枝分かれしてないもの、環状のもの、非環状のもの、ハロゲン化のもの、又は非ハロゲン化のものであろう。

極性若しくは非極性溶媒への分配は、技術の様々な観点から行うことができる。例えば、化学からの極性若しくは溶媒の振る舞いの定義が、適用され得る。

これらに加えて、実際には、Snyder 若しくはKeller（Snyder, Principles of absorption chromatography, Decker, New York, 1968; Keller, Analytical chemistry, Weinheim, 1998, page 195）に従った極性インデックスが、溶媒若しくは溶媒混合物を分類するのに用いられる。従って、Snyderに従って、極性の溶媒若しく溶媒混合物は、４〜８、特に、５〜７、好ましくは、５．５〜６．５の極性インデックスを有する溶媒若しく溶媒混合物を意味する。極性溶媒は、例えば、水、特に水溶液である。極性非プロトン性溶媒は、例えば、アセトン、アセトニトリル、酢酸エチル、ジメチルスルホキシド、若しくはＮ，Ｎ−ジメチルホルムアミドである。極性プロトン性溶媒は、例えば１〜６つの炭素原子を有するアルカリ残余を備えるアルコール、例えば、メタノール、エタノール、１−プロパノール、２−プロパノール（イソプロパノール）、ブタノール、ペンタノール、若しくはヘキサノールである。

非極性溶媒若しくは非極性溶媒混合物は、参照溶媒若しくは参照溶媒混合物の極性インデックスよりも０．３以上の差で小さい極性インデックスを有する溶媒若しくは溶媒混合物を意味する。０．５の差で小さい極性インデックスが好ましく、特に極性インデックスが１以上の差で小さく、より好ましくは、極性インデックスが２以上の差で小さい。その結果、Snyderに従って、非極性溶媒若しくは溶媒混合物の極性インデックスは、５〜１、特に４〜２、好ましくは３．５〜２．５の値を有する。６０％メタノール／４０％ジクロロメタン溶媒混合物は、例えば、Snyderに従って３．１の極性インデックスを有する。従って、適切な非極性溶媒は、例えば、クロロホルム、ジクロロメタン、テトラクロロメタン等のハロゲン化溶媒である。また、言及は、ペンタン、ヘキサン、ヘプタン若しくはシクロヘキサン等の脂肪族化合物溶媒で形成される。これらに加えて、トルエン若しくはベンゼン等の芳香族溶媒は、非極性溶媒として言及されるべきである。また、ジエチルエーテル、ｔ−ブチルメチルエーテル、若しくはテトラヒドロフラン等のエーテルが適切である。

前記方法の更に好ましい実施形態では、前記溶媒は、溶媒混合物の形態で、特に、極性及び非極性溶媒を含有する溶媒混合物の形態で用いられる。

極性及び非極性溶媒は、好ましくは、１：１の比率、特に１：２の比率、好ましくは１：１０の比率（極性／非極性）で用いられる。

この測定は、溶媒混合物が生体物質の特徴に適合されて準備され得るという利点を有する。この方法では、分離の問題の多くに対応することが可能となる。

また、前記方法の更に好ましい実施形態では、界面活性剤、特に非イオン性界面活性剤が用いられる。

前記方法の更に好ましい実施形態では、共重合体、特にポリエチレン酸化物及びポリプロピレン酸化物の共重合体が、界面活性剤として用いられる。

ゲル生成は、表面活性の物質、いわゆる界面活性剤を加えることによって遅らされることが有利に見られる。ゲル生成の遅延の結果として、有機溶媒と生体物質との間のより長い相互作用があり、ゲル化に耐える。構成要素の抽出、特に脂溶性の構成要素の抽出が、改良される。血液の場合における構成要素、特に脂溶性の構成要素の改良された抽出は、特に蛋白結合からの置換における脂質の場合に於いて、細胞膜からの構成要素の置換から導かれる。界面活性剤の使用は、有利に、浮遊物の構成要素の分光学的特性を改良することが調査されるのに導き、好ましくは、構成要素の増加された吸収に導く。

好ましく用いられる界面活性剤は、溶媒混合物に溶解でき、毒の特性がなく、及び／又は浮遊物に存在する構成要素の分析への影響がないものである。構成要素の吸収及び／又は蛍光の可測性は、好ましくは、損なわれないままである。

界面活性剤は、好ましくは、血液の溶血を除外する濃度で用いられる。有利に用いられる界面活性剤は、共重合体、特に、ポリエチレン酸化物及びポリプロピレン酸化物の共重合体である。適した共重合体の界面活性剤は、例えば、市販されているPluronic界面活性剤、好ましくは、Pluronic 101である。

更に好ましい実施形態では、前記生体物質は、１：５０の比率において、特に１：１０の比率において、好ましくは１：３の比率において有機溶媒で処理される。

前記生体物質の特徴、及び前記有機溶媒の抽出力に依存するが、有機溶媒に対する生体物質のより大きい若しくはより小さい比率を選ぶことは、都合がよいであろうが、これは、特に後の分析に依存する。前記比率は、好ましくは、前記構成要素の分析それぞれの検出限界及び定量限界が考慮されるように選ばれる。

さらなる実施形態では、前記方法は、５℃〜６０℃の範囲、特に１０℃〜４０℃の範囲の温度で実施される。

さらなる実施形態では、前記方法は、０．５バールと５バールとの間、特に０．８バールと２バールとの間の圧力のもとで実施される。

前記方法は、ゲルの生成が予想され得る温度及び／又は圧力の範囲で理論上実施され得る。これに加えて、溶媒の特性、特に融点、沸点、引火点に注意が払われなければならない。前記方法は、本発明に従って室温及び大気圧で実施される。

前記方法のさらなる好ましい実施形態では、前記生体物質は、構成要素を抽出すべく１０秒〜１０分間、特に１０秒〜５分間、好ましくは１０秒〜３分間で処理される。

前記生体物質の濃縮は、構成要素の抽出と同時に本発明に従って有利に行う。濃縮期間は、溶媒混合物での生体物質の処理を通じて望ましい方法でコントロールされ得る。ゲル化剤の添加は、抽出の所要時間を短縮し、界面活性剤の添加は、抽出の所要時間を長くする。意外にも、生体物質、特に血液、好ましくは全血液は、本発明の方法に従った処理によって数分以内で濃縮されることが見られる。底への生体物質の沈降によって濃縮された沈殿物と、その上に置かれる浮遊物との単なる重力による生成がある。前記浮遊物は、もし要求があれば、簡単に取り除かれ得る。浮遊物に溶解する生体物質の構成要素は、より詳細な分析に供される。遠心分離及び／又は濾過によって抽出物から生体物質を分離する必要はない。従って、本発明に従って実施される方法の有利な結果は、分析時間の節約である。

前記生体物質は、好ましくは、有機溶媒による処理の前に、溶媒に耐える環境に移される。

更に好ましい実施形態では、使用され溶媒に耐える環境は、疎水性表面を有する容器、特に、シラン化により疎水性にされた表面を有する容器である。

さらなる実施形態では、疎水性表面を有する容器、特にプラスチック容器、好ましくはポリプロピレンで形成されたものが用いられる。

本発明の方法では、疎水性表面を有する容器を用いることが有利にあり得る。疎水性表面は、ガラス容器の場合、ガラス表面のシラン化により、若しくは、フッ化水素でのエッチングにより生成され得る。また、これらに加えて、本発明の方法では、プラスチック容器、好ましくはポリプロピレンで形成されたものを用いることがあり得る。また、容器、特にプラスチックコーティングされた容器のための複合材料の使用があり得る。好ましく使用される容器は、分光学の調査のために適した特徴を有する。

前記方法の更に好ましい実施形態では、構成要素は、脂溶性の形態に転換され、及び／又は抽出前に脂溶性に改質される。

浮遊物は、好ましくは、脂溶性の構成要素のために調べられる。前記脂溶性の構成要素は、結合された形態で、特に、物理的及び／又は化学的に結合された状態で、生体物質中に存在し得る。これらに加えて、疎油性の若しくは親水性の性質を有する構成要素を調べることは、利益があり得る。

構成要素の親油性化は、化学的及び／又は物理的手段によって有利に達成される。明確化された製品を導く酵素−基質反応は、化学的にもたらされた親油性化として述べられるべきである。述べられ得る例は、リパーゼによる脂肪酸エステルの裂け目、又は他の酵素による脂溶性に改質された基質の反応であろう。このように、例えば、Dabcyl-NHSエステル等の色素分子に結合されたでんぷん分子は、脂溶性の色素にかかわらず、まだ水に溶解できる。前記でんぷん高分子は、アミラーゼによって生じる消化により、より小さいユニットに徐々に分解される。これは、色素分子が溶解性を支配し有機相の中に移動するまでに、サイズ的に減少する親水性の部分と、より脂溶性になる全体の分子とをもたらす。物理的にもたらされ適している親油性化は、脂溶性物質との結合である。例えば、親水性の物質は、そのような全体の複合体に対して脂溶性を引き起こす抗体に、その脂溶性の部分を通して結合し得る。また、その上、脂溶性の分子としてキレート剤を用いることが可能である。例えば、鉄は、脂溶性のキレート剤への結合を通じて血液から有機相に移動され、そこで分析され得る。

前記方法のさらなる実施形態では、構成要素の少なくとも一が、糖質、脂質、核酸、蛋白、マクロ元素、トレース元素、及び／又はビタミンを含有する。

適した糖質は、サッカリド、特に多糖類、好ましくは、単糖類である。適した脂質は、脂肪酸、トリグリセリド（トリアシルグリセリド、グリセロールの脂肪酸エステル）、グリセロリン脂質（例えば、ホスファチジン酸、レシチン、カルジオリピン、プラズマロゲン等）、スフィンゴ脂質（例えば、スフィンゴシン、セラミド、スフィンゴリン及びスフィンゴ糖脂質等）、イソプレノイド（テルペン）（例えば、ステロイド、特にステロイド派生物、カロチノイド等）、ワックス（長鎖の脂肪族化合物アルコールと脂肪酸とのエステル）、及びリポ多糖類（グラム陰性バクテリアの細胞表面の構成要素）である。ビタミンの適した例は、脂溶性のビタミン、特に、ビタミンＡ、ビタミンＤ、ビタミンＥ及び／又はビタミンＫである。また、これらに加えて、プロビタミン、プロファクター及び／又はレチノイド（ビタミンＡ派生物）は、構成要素として適し得る。前記脂質は、好ましくは、トリグリセリド、脂肪酸、コレステロール及び／又はカロチン、特にベータカロチンである。ホルモンは、特に複数の種類の物質に生じる構成要素として述べられるべきである。

前記方法のさらに好ましい実施形態では、前記構成要素が二次構成要素である。適した二次構成要素は、アルカロイド、フラボノイド及び／又はカロチノイド、特に、キサントフィル及び／又はカロチン、好ましくはベータカロチンである。

本発明の方法によってアクセスできる生体物質の構成要素のすべては、後の分析を受け得る。これは、特に、上記構成要素の派生物を含む。

前記方法のさらに好ましい実施形態では、前記構成要素は、分光分析、特に比色分析、好ましくは蛍光光度法によって調べられる。

すべての知られた若しくは知られていないがその他の分析技術は、前記構成要素の後の分析にとって適し得る。例えば、クロマトグラフ法によって、特には高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）を用いた前記構成要素の分離は、さらなる分析にとって役立つことが判明され得る。前記浮遊物は、分光分析による前記構成要素を調べる分析方法に都合よく供される。適した分光方法は、電磁放射線との相互作用によって構成要素を調べるものであり、例えば、ＮＭＲ、ＩＲ、紫外線可視、レーザーラマン分光法である。これらに加えて、すべての知られた質量分光法は使用され得る。

また、本発明は、その下にある技術問題を、生体物質の構成要素を分析するための有機溶媒若しくは有機溶媒混合物の使用によって解決するが、そこでは、前記分析は、診断、並びに／又は、障害の治療の観察、特に新陳代謝の障害及び／若しくは欠乏障害の治療の観察に用いられる。

新陳代謝の障害及び／又は欠乏障害は、一般に、人間及び／又は動物のオーガニズムにおける物質の過剰若しくは欠乏、特に不足の原因となる。障害はそこから生じ得る。本発明は、そのような障害を診断するために用いられ得る。特に、治療に用いられる薬理的活性構成要素、及び／又は栄養物を分析するための、好ましくは、栄養物の補足を観察するための治療の観察は、本発明で特に有利に実施され得る。

前記構成要素は、好ましくは、実質的な脂溶性の物質である。

また、本発明は、その下にある技術問題を、円筒型の容器にある生体物質の構成要素を測定するための分光光度計、特にハンド光度計を提供し、計測が容器の上半分をカバーするように光度計の光線経路が調整されることで解決する。

本発明の状況では、円筒型の容器は、その全体の長さと同じままとなる外形を有する容器を意味する。同じままとなり適した外形は、分光学キュベットで使用されるように、長方形の断面、特に正方形の断面である。前記生体物質の構成要素を測定するために用いられる容器は、有利に、本発明の方法で実施されるものである。前記構成要素の分析は、有利に、本発明の分光光度計での遅延なしに抽出後に行う。

本発明が、生体物質から構成要素を抽出し、該構成要素のさらなる分析を単純化するのを可能にすることが、要約に述べられ得る。従って、特に血液の分析は、単純化される。本発明の方法は実施され、且つ血液の溶血が観察されない一方で、かろうじて測定しうる温度変化が生じる。加えて、試料の濾過及び／又は遠心分離等の複雑な分離ステップは必要ない。本発明は、一つのステップで実施され得る。従って、小型方法、特に、チップ上のラボの形態で知られ、好ましくはケアシステムのいわゆるポイントで使用される高処理能力方法にとって、それは特に適している。

本発明のさらなる特徴及び利点は、従属項に関係した例による好ましい実施形態の次の記述から明らかである。この関係では、それぞれの特徴は、それぞれ、それ自体で又は互いの多数の組み合わせとして実行され得る。

本発明は、補足図に関連され選ばれた典型的な実施形態のもとで詳細に記述され、説明される。

＜全血液からのビタミンＡ、ビタミンＥ及びカロチノイドの抽出及び測定＞
まず、牛、馬、犬、猫、コウモリ、若しくは人間由来の全血液は、抗凝血剤で、好ましくはエチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で、抑制されなかった。それから、全血液の試料は、プラスチックチューブ（ポリプロピレン、ＰＰ）若しくは表面処理（シラン化）されたガラスチューブの中に入れられた。それから、前記試料は、有機溶媒の混合物で混合された。極性及び非極性溶媒の混合物（エタノール／イソプロパノール／イソオクタン、１：４：１０）は、シリンジ若しくはピペットを用いて、容器に存在する血液に添加された。この方法で得られる混合物は、注意深く、１０秒間手で激しく振られた。前記血液試料は、その粘性の増加を示した。それから、相分離が５分間沈降によって実施する。２〜３分後、振ることと立たせたままにすることとが繰り返された。チューブの下方部分では血液試料のゲル状の濃縮が発達した。有機相は、チューブの上方部分に浮遊物として形成した。前記有機相は、イソオクタンを本質的に含有し、前記血液から構成要素を抽出した。前記有機相は、抽出されたカロチノイドによって黄色っぽい色を有した。前記試料の着色は、カロチノイドの濃度に依存してより激しかった。前記浮遊物は、分光光度計で直接測定され、又は、最初にピペットで移動され且つ濃縮され且つ適切な溶媒に溶解され且つ例えば高速液体クロマトグラフ（ＨＰＬＣ）で測定された。

＜血清からのビタミンＡ、ビタミンＥ及びカロチノイドの抽出及び測定＞
記述されたテスト手順が保持された。さらに浮遊物の測定。

＜初乳のミルクからのビタミンＡ、ビタミンＥ及びカロチノイドの抽出及び測定＞
牛の若しくは人間の初乳のミルクが生体物質として使用された。テスト手順及び測定は、示されたように着手された。

＜肝組織のミルクからのビタミンＡ、ビタミンＥ及びカロチノイドの抽出及び測定＞
肝組織は、知られた方法によるUltratorax処理によって、バッファーのもとで均質化された。

粘性が均質の流体物は、生体物質として用いられ、テスト手順及び測定は、示されたように着手された。

＜全血液、血清、初乳のミルク、または肝組織からのコレステロールの抽出及び検出＞
脂溶性の構成要素は、まず、先の例に記載されるように、有機浮遊物中で抽出された。コレステロールは、知られた酵素の方法によって有機抽出物の一定分量で検出された。

＜全血液、血清又は初乳のミルクからの非エステル化脂肪酸（ＮＥＦＡ）の抽出及び検出＞
脂溶性の構成要素は、まず、先の例に記載されるように、有機浮遊物中で抽出された。ＮＥＦＡは、まず、銅で複合体化され、その後、そのような脂肪酸−銅複合体は、色反応によって検出された。色反応は、分光光度計で測定された。すべての工程は、有利に、前記方法で同じ抽出チューブで実施された。使用された銅試薬は、銅−トリエタノールアミン溶液の混合物（１ＭのＴＥＡ、１Ｎの酢酸、６．４５％のＣｕ（ＮＯ３）；９：１：１０ ｖ／ｖ）であった。前記銅試薬は、全血液の明確な濃縮が生じた後に、有機浮遊物に添加された。２０秒間の激しい振とう及び約３０分の培養は、カラー試薬（ジフェニルカルバゾール及びジフェニルカルバジド（５：９５％）の０．５％溶液、又はメタノールにおけるジフェニルカルバゾールの０．５％の強い溶液）の浮遊物への添加及び振とうに続いた。色の変化は、分光光度計により５５０ｎｍで測定された。

＜リパーゼ活性の検出＞
全血液若しくは血清、全血液試料若しくは血清試料におけるリパーゼ活性を検出することは、最初に基質で供された。使用された基質は、蛍光の脂肪酸を有する脂肪酸エステルであり、それは、胆汁酸で乳状化された。前記試料に存在するリパーゼは、前記基質を切り裂いた。前記試料の培養は、記載された溶媒混合物の一つによるその抽出、及び解放されラベル化された脂肪酸の測定に続かれた。信号強度は、前記血液中の酵素の濃度に比例する。

＜図の説明＞
＜図１＞
図１は、３６０ｎｍ〜５８０ｎｍの波長範囲における牛の血清試料（ＢＳ７３、ＢＳ７５、ＢＳ７６、ＢＳ７９、ＢＳ８０）からのベータカロチン抽出物の５つの異なる紫外線可視スペクトルがそれらの吸収で描写される図を示す。従来技術の方法は、血液試料から血液細胞を移動するのに、及び血液血清を得るのに用いられた。ベータカロチンは、直接血液血清で測定された。４５０ｎｍ、４８０ｎｍでの通常のベータカロチンの特徴的なバンドと、４２５ｎｍでの小さな肩は、そのような抽出物では期待される。前記試料の全ては、赤血球の溶血によって弱められたスペクトルを与えた。特徴的なバンドは、より大きな波長にシフトされた。３つの試料は、溶血によってかなり汚染されていたため、強い血清着色により評価が不可能であった。

＜図２＞
図２は、ベータカロチンの更なる５つの紫外線可視スペクトルを示す。前記ベータカロチンは、図１で記載された牛の血液から得られたが、全血液からの抽出が、本発明によって実施された。ここでは、ベータカロチンの典型的なスペクトルのみが、すべての試料において見られた。

＜図３＞
図３は、本発明の方法によって得られた抽出物のＨＰＬＣクロマトグラムを示す。カロチノイドの抽出物は、人間の全血液から得られた。吸収単位は、分単位の保持時間に対してプロットされた。“ピーク”と呼ばれる信号は、１＝ルテイン、２＝ゼアキサンチン、３＝カンタキサンチン、４＝ベータクリプトキサンチン、５＝アルファカロチン及び１３‐シス−ベータカロチン、６＝ベータカロチン、７＝９−シス−ベータカロチン、８及び９＝リコピンの異性体のシス体、１０＝トランス−リコピンに対して得られた。前記信号は、視覚的に左右対称的、すなわち、いわゆる信号テール（ピークテール）が視覚的になく、いくつかのケースではベースから離れられている。

＜図４＞
図４は、様々な界面活性剤の添加の機能として、ベータカロチン濃度の外形を示す表を示す。用いられた界面活性剤は、様々な濃度（０．１％〜３．０％）におけるPluronic１０１であった。前記界面活性剤は、牛の血液試料の異なる二つを等分して一定の濃度で加えられた。ベータカロチンの吸収は、分光測定法で測定され、ベータカロテン濃度は、平均値±標準偏差（ｍｇ／Ｌ）として計算される。界面活性剤の増加は、両方の血液試料において、抽出物中のベータカロチン濃度の増加を導いた。

＜図５＞
図５は、アルファトコフェロール（ビタミンＥ）、レチノール（ビタミンＡ）、及びベータカロチンの回収率の実験の結果を示す。牛の全血液は、４つに等分され、本発明の方法によって抽出された。各等分は、２５０μＬである。次の溶媒混合物は、定まった体積比で抽出のために使用された：１＝エタノール／イソオクタン（１：２ Ｖ／Ｖ）、２＝メタノール／イソオクタン（１：２ Ｖ／Ｖ）、３＝酢酸エチル／イソオクタン（１：２ Ｖ／Ｖ）、４＝イソプロパノール／イソオクタン（１：２ Ｖ／Ｖ）。ＨＰＬＣは、標準分析として使用された。レチノールは、メタノール／イソオクタン混合物での６５％の最小値、イソプロパノール／イソオクタン混合物での８８％の最大値であった回収率で検体として測定された。アルファトコフェロールは、酢酸エチル／イソオクタン混合物での２１％の最小値、イソプロパノール／イソオクタン混合物での１０７％の最大値で回収された。１〜３の溶媒混合物におけるベータカロチンに対して測定された回収率は、１３％の最小値、４０％の最大値で、他の検体よりも低かった。最良の回収率は、イソプロパノール／イソオクタン混合物においてすべての検体で見られた。

＜図６＞
図６は、アルファトコフェロール（ビタミンＥ）、レチノール（ビタミンＡ）、及びベータカロテンの回収率に関する実験の結果を示す。前記回収率は、図５に対する記述に示されたように実施された。溶媒混合物５〜１１は、使用された：５＝エタノール／イソプロパノール／イソオクタン（１：１：４、Ｖ／Ｖ）、６＝メタノール／イソプロパノール／イソオクタン（１：１：４、Ｖ／Ｖ）、７＝酢酸エチル／イソプロパノール／イソオクタン（１：１：４、Ｖ／Ｖ）、８＝水／イソプロパノール／イソオクタン（１：１：４、Ｖ／Ｖ）、９＝塩化ナトリウム溶液（０．９％）／エタノール／イソプロパノール／イソオクタン（１：１：４、Ｖ／Ｖ）、１０＝ｎ‐ブタノール／イソプロパノール／イソオクタン（１：１：４、Ｖ／Ｖ）、１１＝イソプロパノール／イソオクタン（２：４、Ｖ／Ｖ）。溶媒混合物５〜１０は、図５からの溶媒混合物４と一致するがここでの量は２倍である溶媒混合物１１との比較のために用いられた。さらに、アルコール、水、食塩水等の様々なプロトン溶媒は、基本のイソプロパノール／イソオクタン溶媒混合物に加えられた。アルファトコフェロール及びベータ−カロチンの両方は、溶媒混合物５〜１０でのそれらの回収率の比較できる減少及び増加を示したことが浮かび上がった。また、全ての検体にとって最良であったイソプロパノール／イソオクタン溶媒混合物に加えて、エタノール／イソプロパノール／イソオクタン混合物は、全ての検体で高い回収率を示した。

＜図７＞
図７は、従来の血清の抽出と、全血液から本発明の方法での抽出との間の抽出結果の比較を示す。調べられた検体は、乳牛からの様々な血液試料１０検体におけるベータカロチンであった。本発明の方法での検体の回収率は、すべての血液試料に対して、伝統的な方法とほとんど一致した。

＜図８＞
図８は、アルファトコフェロール（ビタミンＥ）、レチノール（ビタミンＡ）、及びベータカロチン検体の抽出におけるイソプロパノールに対するエタノールの溶媒比の影響を調べる。伝統データは、それぞれの極性溶媒の量（μＬ）に関係する。１μＬは、非極性溶媒イソオクタンの量として用いられた。２５０μＬの牛の全血液が用いられた。

＜図９＞
図９は、血液細胞の付着に関する容器表面への影響、及び濃縮の結果を示す。図９Ａは、未処理の表面を有する容器での抽出、図９Ｂは、シラン化により疎水性化された表面を有する容器での抽出を示す。チューブのターンオーバーによる約１０分後の血液細胞の完全な濃縮は、図９Ｃで明らかにされた。

各検体の回収率は、乳牛及び馬からの血液試料において、平均で、アルファトコフェロール（ビタミンＥ）に対して１０６％、レチノール（ビタミンＡ）に対して８９％、及びベータカロチンに対して９５％であった。

Claims (8)

1. 全血の構成要素を、前記全血からの前記構成要素の濃縮により分析するための方法であって、前記全血は、溶媒混合物であり且つ極性の有機溶媒及び非極性の有機溶媒を含有し且つ前記構成要素を抽出する少なくとも一つの有機溶媒により、分光分析に適した容器で処理されて、前記全血は、抽出で濃縮された形態に転換され、濃縮された沈殿物及び液体有機相の浮遊物は、底への全血の濃縮された沈殿物の沈降による単なる重力を通じて形成され、前記浮遊物で抽出された構成要素は、直接的に分光分析又は蛍光光度法によって同じ容器内で調査される方法。
2. 極性プロトン性溶媒が、極性有機溶媒として用いられることを特徴とする請求項１に記載の方法。
3. アルカンが、非極性溶媒として用いられることを特徴とする請求項１又は２に記載の方法。
4. 前記構成要素が、脂溶性の形態に転換され、及び／又は、抽出前に脂溶性に改質されることを特徴とする請求項１〜３の何れか１項に記載の方法。
5. 抽出前に、前記水に溶解し得る構成要素が、脂溶性の分子及び／又は脂溶性に改質された分子で脂溶性の複合体を形成することを特徴とする請求項４記載の方法。
6. 前記水に溶解し得る構成要素が、酵素−基質反応から得られ且つ脂溶性に若しくは脂溶性に改質された生成物を抽出することによって検出されることを特徴とする請求項１〜５の何れか１項に記載の方法。
7. 疎水性表面を有する容器が用いられることを特徴とする請求項１〜６の何れか１項に記載の方法。
8. シラン化により、若しくは、フッ化水素でのエッチングにより形成される表面を有するガラス容器が用いられることを特徴とする請求項７記載の方法。
   

Images