JP5646505B2 - 疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法 - Google Patents
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Description
例えば、腫瘍細胞や腫瘍組織内の新生血管の内皮細胞内に取り込ませた光感受性物質にレーザー光を照射して活性酸素を発生させることにより、腫瘍細胞に傷害を与えて腫瘍を消失させる光線力学療法において、光感受性物質として炭素クラスター化合物であるフラーレンを用いることが試みられている。
また、腫瘍細胞に集積させたホウ素化合物に熱中性子線を照射して核反応によりホウ素からα線を照出させて周囲の腫瘍細胞を死滅させるホウ素中性子捕捉療法において、ホウ素化合物としてホウ素クラスター化合物であるカルボランを用いることが試みられている。
また、金属クラスター化合物は、その導電性や半導体性を活かして微粒子化することにより、従来のめっき方法に代わる塗布方法を用いた手法で配線が可能となるため、電子機器や情報機器の回路形成やセンサーへの応用等、多方面で検討が進められており、プリンタブルエレクトロニクスとして一つの技術が形成されつつある。
さらにカーボンナノチューブはその高い導電性や炭素化合物として環境保護性が高いことから、それらを用いた導電性担体やデバイスへの用途開発が期待されている。
また、疎水性クラスター化合物の中で、金属クラスター化合物は、単独ではなく規則性を持った構造体にすることによって、単独では見られなかった新規な電子的、光学的、磁気的性質などを示すことから、先端的なエレクトロニクスおよび光学分野のデバイスへの応用を期待した研究が近年盛んに行なわれている。しかし、金属クラスター化合物の粒子間には、特異的な相互作用が存在しないため、自己組織的な集積は困難である。一方、高分子鎖は、自己組織的に特定の高次構造を有し、単独の金属クラスター化合物を集合化させたり分散化させたりする特徴を有している。例えば、特許文献5には、シゾフィランと金を複合体化することにより、金に水溶性及び分散性を付与することが開示されている。しかしながら、これらの金属クラスター化合物の複合体は、水への分散性が不十分であり、実用上十分な水溶性を有しない。
本発明はこの知見に基づき完成されたものであり、以下の疎水性クラスター化合物複合体、その製造方法、及び疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法を提供する。
項2. 疎水性クラスター化合物が、ホウ素、炭素、ケイ素、硫黄、及びリンからなる群より選ばれる少なくとも1種の非金属原子を含む化合物である項1に記載の複合体。
項3. 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである項2に記載の複合体。
項4. 疎水性クラスター化合物が、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、鉄、コバルト、マグネシウム、アルミニウム、及びジルコニウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の金属原子を含む化合物である項1に記載の複合体。
項5. 疎水性クラスター化合物と、β−1,3結合に対するβ−1,6結合の分岐度が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとの複合体の製造方法。
項6. 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである項5に記載の方法。
項7. 疎水性クラスター化合物が、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、鉄、コバルト、マグネシウム、アルミニウム、及びジルコニウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の金属原子を含む化合物である項5に記載の方法。
項8. 疎水性クラスター化合物と、β−1,3結合に対するβ−1,6結合の分岐度が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとの複合体の製造方法。
項9. 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである項8に記載の方法。
項10. 疎水性クラスター化合物が、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、鉄、コバルト、マグネシウム、アルミニウム、及びジルコニウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の金属原子を含む化合物である項8に記載の方法。
項11. 疎水性クラスター化合物と、β−1,3結合に対するβ−1,6結合の分岐度が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法。
項12. 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである項11に記載の方法。
項13. 疎水性クラスター化合物が、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、鉄、コバルト、マグネシウム、アルミニウム、及びジルコニウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の金属原子を含む化合物である項11に記載の方法。
項14. 疎水性クラスター化合物と、β−1,3結合に対するβ−1,6結合の分岐度が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法。
項15. 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである項14に記載の方法。
項16. 疎水性クラスター化合物が、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、鉄、コバルト、マグネシウム、アルミニウム、及びジルコニウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の金属原子を含む化合物である項14に記載の方法。
本発明では、食品成分としても利用されるβ-1,3-1,6-D-グルカンを用いて疎水性クラスター化合物を水可溶化又は水分散化しているため、本発明の複合体は安全性が高く、医薬として応用可能なものである。また、本発明の複合体は、触媒材料、磁気記録材料、導電膜形成材料、半導体膜形成材料、顔料等の各種用途に使用できる。
(1)複合体
本発明の複合体は、疎水性クラスター化合物と、主鎖のβ-1,3結合に対する側鎖のβ-1,6結合の比率(分岐度)が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとの複合体である。
(1−1)疎水性クラスター化合物
本発明において、クラスター化合物は、数個〜数百個の原子又は分子が凝集して形成された集団又は微粒子を指す。また、疎水性クラスターとは、水に対する25℃における溶解度が、例えば10mg/ml以下のクラスター化合物を意味し、好ましくは5mg/ml以下、より好ましくは3mg/ml以下、さらに好ましくは1mg/ml以下である。疎水性クラスター化合物としては、鉛(Pb)、ニッケル(Ni)、鉄(Fe)、マグネシウム(Mg)、コバルト(Co)、ロジウム(Rh)、ルテニウム(Ru)、白金(Pt)、金(Au)、銀(Ag)、銅(Cu)、チタン(Ti)、亜鉛(Zn)、パラジウム(Pd)、インジウム(In)、ガリウム(Ga)、ゲルマニウム(Ge)、アルミニウム(Al)、ジルコニウム(Zr)などの金属原子、又はこれらの金属の酸化物や硫化物の1種又は2種以上を含む金属クラスター化合物;ホウ素(B)、炭素(C)、ケイ素(Si)、硫黄(S)、リン(P) などの非金属原子の1種又は2種以上を含む非金属クラスター化合物などが挙げられる。また、金属原子と非金属原子とを含むクラスター化合物であってもよい。
また、例えば、非金属クラスター化合物内に金属原子が内包されている化合物;フタロシアニンと金属原子との錯体、ポルフィリンと金属原子との錯体のような有機金属錯体等、他原子を内包したクラスター化合物であってもよい。また、錯体としては、ルテニウム、コバルトの金属錯体も好ましいものとして例示できる。
クラスター化合物は一次粒子が凝集している場合があるが、β-1,3-1,6-D-グルカンとの複合化には一次粒子の大きさが影響を与えるので、ここでいう最大径は一次粒子の最大径である。また、クラスター化合物がカーボンナノチューブのように繊維状である場合は、周方向の長さがβ-1,3-1,6-D-グルカンとの複合化に影響を与えるので、ここでいう最大径は周方向の最大径である。また、クラスター化合物がカーボンナノコイルのようにコイル状である場合は、コイルの周方向の長さがβ-1,3-1,6-D-グルカンとの複合化に影響を与えるので、ここでいう最大径はコイルの周方向の最大径である。
非金属クラスター化合物の中では、フラーレンやカーボンナノチューブ、カーボンナノコイルのような炭素クラスター化合物、カルボランのようなホウ素クラスター化合物がより好ましい。また、フラーレンやカルボランのように、正多面体構造を有する化合物が好ましい。
フラーレンとしては、炭素数60,70,76,78,80,82,84,86,88,90,92,94,96など炭素数60〜120程度のものが知られている。本発明において炭素数は特に限定されないが、入手が容易で、β-1,3-1,6-D-グルカンと複合体を形成したときの安定性や水への溶解性に優れる点で、炭素数60〜70のものが好ましい。また、スカンジウム(Sc)、ランタン(La)、セリウム(Ce)、チタン(Ti)、窒素(N)などの異種原子を内包したフラーレンも使用できる。
単層カーボンナノチューブは、直径約1nmであるが、本発明では、溶解性の点で、1本から数本(例えば10本)がバンドル化した状態のものが好ましい。直径では1nm〜20nm程度が最適である。また、本発明によれば、単層カーボンナノチューブが複数個入れ子状に積層された多層カーボンナノチューブにも十分な水溶性又は水分散性を付与することができる。多層カーボンナノチューブの直径は、例えば、約150〜200nmであり、長さは、例えば、約1〜10μmである。
カルボランは、ボランの骨格構造のホウ素原子の一部を炭素原子で置換した化合物及びイオンの総称であり、多面体構造を有する。多面体頂点の数が6〜12のものが知られているが、本発明では多面体頂点の数は特に限定されない。特に、β-1,3-1,6-D-グルカンと複合体を形成したときの安定性に優れる点で、B10C2H12で表され正20面体構造を有するm−カルボラン及びo−カルボランが好ましい。
本発明に用いるβ-1,3-1,6-D-グルカンにおいて、主鎖のβ-1,3結合数に対する側鎖のβ-1,6結合数の比率である分岐度は、通常約50〜100%、好ましくは約75〜100%、より好ましくは約85〜100%であればよい。
β-1,3-1,6-D-グルカンが上記分岐度を有することは、β-1,3-1,6-D-グルカンをエキソ型のβ−1,3−グルカナーゼ(キタラーゼ M、ケイアイ化成製)で加水分解処理した場合に分解生成物としてグルコースとゲンチオビオースが遊離すること、及びNMRの積算比から確認できる(今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス(2002))。
上記の分岐度を有するβ-1,3-1,6-D-グルカンは、オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物から得ることができる。
オーレオバシジウム属(Aureobasidium sp.)に属する微生物由来のβ-1,3-1,6-D-グルカンは、1N水酸化ナトリウム重水溶液を溶媒とする溶液の1H NMRスペクトルが約4.7ppm及び約4.5ppmの2つのシグナルを有する。NMRの測定値は条件の微妙な変化によって変化し、また誤差を伴うことは周知のことであることから、「約4.7ppm」「約4.5ppm」は、通常予測される範囲の測定値の変動幅(例えば±0.2)を含む数値を意味する。
上記の分岐度を有するβ-1,3-1,6-D-グルカンは、水溶液の30℃、pH5.0、濃度0.5(w/v%)における粘度が、好ましくは200cP(mPa・s)以下、より好ましくは100cP(mPa・s)以下、さらに好ましくは50cP(mPa・s)以下のものである。上記粘度の下限値は通常10cP(mPa・s)程度であり得る。
本発明において、粘度は、BM型回転粘度計を用いて測定した値である。
オーレオバシジウム属の微生物が産生するβ-1,3-1,6-D-グルカンは、菌体外に分泌されるため、キノコ類やパン酵母の細胞壁に含まれるβ-グルカンと比べて、回収が容易であり、また水溶性である点で好ましいものである。オーレオバシジウム属の微生物は、分子量が100万以上の高分子量のグルカンから分子量が数万程度の低分子のグルカンまでを培養条件に応じて産生することができる。
また、オーレオバシジウム属微生物が産生するβ-1,3-1,6-D-グルカンは、通常、硫黄含有基を有するところ、K-1株の産生するβ−グルカンはスルホ酢酸基を有することが知られている(Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983)),科学と工業,64,131-135(1990))。GM-NH-1A1株、及びGM-NH-1A2株が生産するβ-1,3-1,6-D-グルカンもスルホ酢酸基を有すると考えられる。オーレオバシジウム属微生物の中には、リン酸基のようなリン含有基、リンゴ酸基などを含むβ-1,3-1,6-D-グルカンを産生する菌種、菌株も存在する。
GM-NH-1A1株及びGM-NH-1A2株は、後に実施例において示すようにメインピークが見かけ上50〜250万の高分子量のβ−グルカン(微粒子グルカン)とメインピークが見かけ上2〜30万の低分子量のβ−グルカンの両方を産生する菌株である。この微粒子状グルカンは、一次粒子径が0.05〜2μm程度である。
β-1,3-1,6-D-グルカンは、水溶液にしたときの粘度が、オーレオバシジウム属微生物が産生する天然型β-1,3-1,6-D-グルカンより低いものが好ましい。この低粘度β-1,3-1,6-D-グルカンは、水溶液の30℃、pH5.0、濃度0.5(w/v%)における粘度が、通常200cP(mPa・s)以下であり、より好ましくは100cP(mPa・s)以下であり、さらに好ましくは50cP(mPa・s)以下であり、よりさらに好ましくは10cP以下である。
β-1,3-1,6-D-グルカンは、金属イオン濃度が、β-1,3-1,6-D-グルカンの固形分1g当たり0.4g以下であることが好ましく、0.2g以下であることがより好ましく、0.1g以下であることがさらにより好ましい。原料β-1,3-1,6-D-グルカンが水溶液状態のものである場合は、金属イオン濃度は、水溶液の100ml当たり120mg以下であることが好ましく、50mg以下であることがより好ましく、20mg以下であることがさらにより好ましい。
ここでいう金属イオンには、アルカリ金属イオン、アルカリ土類金属イオン、第3〜第5族金属イオン、遷移金属イオンなどが含まれるが、混入する可能性のある金属イオンとしては、代表的には、低粘度β-1,3-1,6-D-グルカンの製造において使用されるアルカリ由来のカリウムイオン、ナトリウムイオンなどが挙げられる。金属イオン濃度は、限外ろ過や透析により調整できる。
金属イオン濃度が上記範囲であれば、水溶液状態で保存する場合や、水溶液状態で加熱滅菌する際に、β-1,3-1,6-D-グルカンのゲル化、凝集、沈殿が生じ難い。また、固形で使用する場合は、再溶解させる場合に凝集などが生じ難い。
分岐度50〜100%のβ-1,3-1,6-D-グルカンは、例えば、これを産生する微生物の培養上清に有機溶媒を添加することにより沈殿物として得ることができる。
また、オーレオバシジウム属の微生物を培養して、β-1,3-1,6-D-グルカンを産生させる方法は種々報告されている。培養培地に使用できる炭素源としては、シュークロース、グルコース、フラクトースなどの炭水化物、ペプトンや酵母エキスなどの有機栄養源等を挙げることができる。窒素源としては、硫酸アンモニウムや硝酸ナトリウム、硝酸カリウムなどの無機窒素源等を挙げることができる。場合によってはβ−グルカンの産生量を上昇させるために適宜、塩化ナトリウム、塩化カリウム、リン酸塩、マグネシウム塩、カルシウム塩などの無機塩、更には鉄、銅、マンガンなどの微量金属塩やビタミン類等を添加するのも有効な方法である。
オーレオバシジウム属微生物を、炭素源としてシュークロースを含むツアペック培地にアスコルビン酸を添加した培地で培養した場合、高濃度のβ-1,3-1,6-D-グルカンを産生することが報告されている(Arg.Biol.Chem.,47,1167-1172(1983));科学と工業,64,131-135(1990);特開平7−51082号公報)。しかし、培地は、微生物が生育し、β-1,3-1,6-D-グルカンを生産するものなら特に限定されない。必要に応じて酵母エキスやペプトンなどの有機栄養源を添加してもよい。
効果的に培養pHを制御するためにアルカリ、あるいは酸で培養液のpHを制御することも可能である。更に培養液の消泡のために適宜、消泡剤を添加してもよい。培養時間は通常1〜10日間程度、好ましくは1〜4日間程度であり、これによりβ−グルカンを産生することが可能である。なお、β−グルカンの産生量を測定しながら培養時間を決めてもよい。
上記条件下オーレオバシジウム属の微生物を4〜6日間程度通気攪拌培養すると、培養液にはβ-1,3-1,6-D-グルカンを主成分とするβ−グルカン多糖が0.1%(w/v)〜数%(w/v)含有されており、その培養液の粘度はBM型回転粘度計(東機産業社製)により30℃では数百cP(mPa・s)から数千cP(mPa・s)という非常に高い粘度を有する。この培養を遠心分離して得られる上清に例えば有機溶媒を添加することにより、β-1,3-1,6-D-グルカンを沈殿物として得ることができる。
上記の高粘度のβ-1,3-1,6-D-グルカンを含む培養液を、常温で攪拌しながら、これにアルカリを添加すると、急激に粘度が低下する。
アルカリは、水溶性で、かつ医薬品や食品添加物として用いることができるものであればよく、特に限定されない。例えば、炭酸カルシウム水溶液、炭酸ナトリウム水溶液、炭酸カリウム水溶液、炭酸アンモニウム水溶液などの炭酸アルカリ水溶液;水酸化ナトリウム水溶液、水酸化カリウム水溶液、水酸化カルシウム水溶液などの水酸化アルカリ水溶液;あるいはアンモニア水溶液などを使用できる。アルカリは、培養液のpHが12以上、好ましくは13以上になるように添加してもよい。例えば水酸化ナトリウムを使用して培養液のpHを上げる場合は、水酸化ナトリウムの最終濃度が好ましくは0.5%(w/v)以上、より好ましくは1.25%(w/v)以上になるように添加すればよい。培養液にアルカリを添加し、良く攪拌すると、瞬時に培養液の粘度が低下する。
次いで、アルカリ処理後の培養液から菌体などの不溶性物質を分離する。培養液の粘度が低いため、菌体を自然沈降させて上澄みを回収する方法(デカント法)、遠心分離、ろ紙あるいはろ布を利用した全量ろ過、フィルタープレス、更に膜ろ過(MF膜などの限外ろ過)などの方法で、容易に不溶性物質とグルカンとを分離できる。ろ紙あるいはろ布による全量ろ過の場合は、セライトなどろ過助剤を利用するのも一つの手段である。工業的にはフィルタープレスによる菌体除去が好ましい。また、不溶性物質除去前のβ−D−グルカン液は必要に応じて水で希釈しても良い。濃度が高すぎると不溶性物質除去が困難であり、低すぎても効率的でない。β−D−グルカン濃度は、0.1mg/ml〜20mg/ml程度、好ましくは0.5mg/ml〜10mg/ml程度、さらに好ましくは1mg/ml〜5mg/ml程度が良い。
pH12以上のアルカリ処理後、中和して得られるβ-1,3-1,6-D-グルカンは、30℃、pH5.0、濃度0.5(w/v%)における粘度が通常200cP以下、場合によっては、100cP以下、50cP以下、又は10cP以下である。粘度は製造方法ないしは精製方法によって変動する。
アルカリ処理された低粘度のβ-1,3-1,6-D-グルカンは、中和しても粘度が高くなることがない。さらに、常温(15〜35℃)では、液性をpHが4を下回るような酸性にしても、粘度が高くなることがない。
また、培養上清をアルカリ処理、及び中和した後に、菌体などを除去するのに代えて、培養上清から菌体などを除去した後に、アルカリ処理、及び中和を行うこともできる。
また、アルカリ処理、除菌した後、中和せずに、アルカリ性条件下で限外ろ過することもでき、これにより透明性、熱安定性、長期保存性に一層優れる精製β−1,3−1,6−D−グルカンが得られる。アルカリ性条件は、pH10以上、好ましくは12以上であり、pHの上限は通常13.5程度である。
このようにして得られる水溶液に含まれるβ-1,3-1,6-D-グルカンは、乾燥させて固形製剤にする場合も、また水溶液のまま製剤として使用する場合も、一旦、水溶液から析出させることができる。β-1,3-1,6-D-グルカンの析出方法は、特に限定されないが、例えば、限外ろ過などにより濃縮してグルカン濃度を1w/w%以上にした水溶液に、エタノールのようなアルコールを、水溶液に対して容積比で等倍以上、好ましくは2倍以上添加することにより、β-1,3-1,6-D-グルカンを析出させることができる。この場合にpHをクエン酸などの有機酸によりpHを酸性、好ましくはpH4未満、さらに好ましくはpH3−3.7に調製して、エタノールを添加すると高純度のβ-1,3-1,6-グルカンの粉末を得ることができる。
β-1,3-1,6-D-グルカンを低粘度化することにより、限外ろ過などによる濃縮を容易に行えることから、アルコール沈殿に使用するアルコール量を少なくすることができる。
固形物として得る場合は、低粘度β-1,3-1,6-D-グルカン水溶液を直接乾燥させてもよく、析出させたβ-1,3-1,6-D-グルカンを乾燥させてもよい。乾燥は、噴霧乾燥法、凍結乾燥法等公知の方法で行うことができる。
複合体における疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとの比率(疎水性クラスター化合物:β-1,3-1,6-D-グルカン)は、乾燥重量比で、1:0.01〜1000程度が好ましく、1:0.1〜100程度がより好ましく、1:0.1〜50程度がさらにより好ましく、1:0.1〜20程度が特に好ましい。上記範囲であれば、十分な水溶性が得られる。
(2−1)高速振動粉砕法
上記説明した本発明の複合体の製造方法は、特に限定されない。
例えば、疎水性クラスター化合物と、β−1,3結合に対するβ−1,6結合の分岐度が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む方法により、製造することができる。
疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとの混合比率(疎水性クラスター化合物:β-1,3-1,6-D-グルカン)は、乾燥重量比で、1:0.01〜1000程度が好ましく、1:0.1〜100程度がより好ましく、1:0.1〜50程度がさらにより好ましく、1:0.1〜20程度が特に好ましい。
固体状態での撹拌は、疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとが充分に粉砕、混合されればよく、従来から知られた各種の混合・粉砕装置を用いて行うことができる。例えば、遊星式や遠心回転式のボールミルによる粉砕・混合法;混合される材料を硬球と共に容器内に入れ、この容器を高速で振動させる高速振動粉砕装置による高速振動粉砕法などが挙げられる。
中でも、高速振動粉砕法が好ましく、その振動数は、例えば約10〜120s−1(約10〜120Hz)とすることができる。
固体状態での撹拌は、室温下で行うことができる。
このようにして得られた疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとの混合物に水を添加して撹拌する。水は、複合体の形成を阻害しない範囲で、緩衝剤や塩などを含んでいてもよい。水の量は、上記混合物1重量部に対して約10〜10,000重量部とすることができる。この工程での撹拌は、例えば、マグネティックスターラーを使用して行うことができる。この攪拌工程は、室温下で少なくとも2日間、例えば、4〜7日間行うことが好ましい。
これにより、疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとの複合体が溶解した液体が得られる。必要に応じて、約1,000〜20,000gで約5〜60分間の遠心分離などにより、水不溶性の夾雑物を除去すればよい。
上記説明した本発明の複合体は、疎水性クラスター化合物と、β−1,3結合に対するβ−1,6結合の分岐度が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む方法によっても製造することができる。
疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとの使用比率(疎水性クラスター化合物:β-1,3-1,6-D-グルカン)は、乾燥重量比で、1:0.01〜1000程度が好ましく、1:0.1〜100程度がより好ましく、1:0.1〜50程度がさらにより好ましく、1:0.1〜20程度が特に好ましい。
極性溶媒の使用量は、β-1,3-1,6-D-グルカン1重量部に対して約10〜10,000重量部とすることができる。
極性溶媒は、水、酢酸、蟻酸、低級アルコールのようなプロトン性極性溶媒でもよく、ジメチルスルホキシド、アセトン、アセトニトリル、N,N-ジメチルホルムアミド、塩化メチレン、テトラヒドロフランのような非プロトン性極性溶媒でもよいが、特に、非プロトン性極性溶媒が好ましく、ジメチルスルホキシドがより好ましい。
混合は、例えば、マグネティックスターラーを使用して行うことができる。
次いで、この混合物1重量部に対して水を好ましくは約1〜15重量部添加し、通常、室温下に1〜3日間静置することにより熟成させればよい。水は、複合体の形成を阻害しない範囲で、緩衝剤や塩などを含んでいてよい。
これにより、疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとの複合体が溶解した液体が得られる。必要に応じて、約1,000〜20,000gで約5〜60分間の遠心分離などにより、水不溶性の夾雑物を除去すればよい。
さらに、通常は、極性溶媒を除去するために50〜500体積比の蒸留水で透析(MWCO=3,500)を行い、回収後、エバポレーター等で濃縮すればよい。以上の操作により疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとの複合体が溶解した水溶液が得られる。
上記説明した本発明の複合体の製造方法は、疎水性クラスター化合物の水溶化又は水分散化方法、又は疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法と捉えることもできる。
本発明の複合体は安全性が高く、医薬として応用可能なものである。
また、本発明の疎水性クラスター化合物の複合体は、触媒材料、磁気記録材料、導電膜形成材料、半導体膜形成材料、顔料等の各種用途に使用することができる。例えば、本発明の金属クラスター化合物やカーボンナノチューブとの複合体を基板に塗布した後、20〜600℃の温度で乾燥、焼成し被膜を形成することができる。この基板は、電極、配線、回路などを構成するのに一般に用いられている、乾燥・焼成によって焼失、劣化しない耐熱性のものであれば良い。具体的には、例えば、鉄、銅、アルミニウムなどの金属基板、ポリイミドフィルムなどの耐熱性樹脂基板、ガラス基板などを挙げることができる。塗布方法は公知の方法を採用できる。具体的には、例えば、スクリーン印刷法、ディップコーティング法、スプレー法、スピンコーティング法などが挙げられる。また、インクジェットヘッドを用いて複合体を基板上の必要な部分のみに塗布することもできる。塗布後に約20〜600℃、好ましくは約100〜450℃、更に好ましくは約100〜350℃で乾燥、焼成することができる。焼成時の雰囲気は、不活性雰囲気または還元性雰囲気であることが好ましい。焼成時間は約0.1〜3時間、好ましくは約0.2〜2時間である。得られた被膜は配線として用いることができる。
また、本発明の疎水性クラスター化合物の複合体は架橋剤を添加することにより成形体とすることもできる。用いられる架橋剤としては、カードランのような長鎖の多糖や酸無水物、イソシアネート化合物等を例示できる。
本発明の疎水性クラスター化合物の複合体を用いた成形体は、各種センサー、放熱体、磁性体、固体触媒、光学素子、導電体等、種々の用途に用いることができる。
実験例(精製β-1,3-1,6-D-グルカンの製造)
(1)低粘度β-1,3-1,6-D-グルカンの調製
(1-1)β−グルカンの培養産生
後掲の表1に示す組成を有する液体培地100mlを500ml容量の肩付きフラスコに入れ、121℃で、15分間、加圧蒸気滅菌を行った後、オーレオバシジウム プルランス(Aureobasidium pullulans)GM-NH-1A1株(FERM P-19285)を同培地組成のスラントより無菌的に1白金耳植菌し、130rpmの速度で通気攪拌しつつ、30℃で24時間培養することにより種培養液を調製した。
次いで、同じ組成の培地200Lを300L容量の培養装置(丸菱バイオエンジ製)に入れ、121℃で、15分間、加圧蒸気滅菌し、上記のようにして得られた種培養液2Lを無菌的に植菌し、200rpm、27℃、40L/minの通気攪拌培養を行った。なお、培地のpHは水酸化ナトリウム及び塩酸を用いてpH4.2〜4.5の範囲内に制御した。96時間後の菌体濁度はOD660nmで23ODで、多糖濃度は0.5%(w/v)で、硫黄含量から計算される置換スルホ酢酸含量は0.09%であった。
多糖濃度は、培養液を数mlサンプリングし、菌体を遠心分離除去した後、その上清に最終濃度が66%(v/v)となるようにエタノールを加えて多糖を沈殿させて回収した後、イオン交換水に溶解し、フェノール硫酸法で定量した。
<置換スルホ含量測定>
同様にして菌体を除去した培養上清にエタノールを最終濃度が66%となるように添加し、β−グルカンを沈殿回収した。その後、再度イオン交換水に溶解し、再度遠心分離後、その上清に最終濃度が0.9%になるように食塩を加えた後、再度66%エタノールでβ−グルカンを回収した。このβ−グルカン回収精製操作を更に2回繰り返し、得られたβ−グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。
このβ−グルカン粉末を燃焼管式燃焼吸収後、イオンクロマト法で組成分析した結果、S含量は239mg/kgであり、この値から計算される置換スルホ酢酸含量は0.09%であった。
上記のようにして得られた培養液の粘度をBM型回転粘度計(東京計器製)を用いて、30℃、12rpmで測定したところ、1500cP(mPa・s)であった。測定に用いるロータは粘度にあわせて適当なものを選択した。
この培養液に水酸化ナトリウム最終濃度が2.4%(w/v)となるように25%(w/w)水酸化ナトリウムを添加し攪拌したところ(pH13.6)、瞬時に粘度が低下した。引き続いて50%(w/v)クエン酸水溶液でpH5.0となるように中和してから、濃度0.5(w/v%)における粘度を測定したところ、そのときの粘度(30℃)は20cP(mPa・s)であった。
次いで、この培養液にろ過助剤としてKCフロック(日本製紙社製)を1wt%添加し、薮田式ろ過圧搾機(薮田機械製)を用いて菌体を除去し、最終的に培養ろ液(約230L)を得た。その多糖濃度は0.5%(w/v)で、ほぼ100%の回収率であった。
上記のβ−グルカン水溶液(培養ろ液)を0.3%に希釈後、限外ろ過(UF)膜(分子量カット5万、日東電工社製)を用いて脱塩を行い、最終的にナトリウムイオン濃度を20mg/100mlに落とした後、50%(w/v)クエン酸水溶液によりpHを3.5に調整した。
引き続いて、ホット充填用加熱ユニット(日阪製作所製)を用いて95℃で、3分間保持することにより殺菌処理を行い、最終製品のβ−グルカン水溶液を得た。この時のβ−グルカンの濃度をフェノール硫酸法により測定したところ0.22%(w/v)であった。また、培養液からのトータル収率は約73%であった。
また、得られたβ−グルカン水溶液をイオン交換水で透析後、凍結乾燥によりβ−グルカン粉末を得た。本β−グルカンの組成分析結果からS含量は330mg/kgであり、これから計算される置換スルホ酢酸含量は0.12%であった。
<結合状態の確認>
また、脱塩を行った上記培養ろ液について、コンゴーレッド法によって、480nmから525nm付近への波長シフトを確認することができたのでβ−1,3結合を含むグルカンを含有していることが証明された(K. Ogawa, Carbohydrate Research, 67, 527-535 (1978)、今中忠行 監修, 微生物利用の大展開, 1012-1015, エヌ・ティー・エス(2002))。そのときの極大値へのシフト差分はΔ0.48/500μg多糖であった。
上記培養ろ液15mlを取り出し、30mlのエタノールを添加し、4℃、1000rpm、10minで遠心して、沈殿する多糖を回収した。66%エタノールで洗浄し、4℃、1000rpm、10分間遠心して、沈殿する多糖に2mlのイオン交換水と、1mlの1N水酸化ナトリウム水溶液を添加撹拌後、60℃、1時間保温して沈殿を溶解させた。次に-80℃にて凍結後、一晩、真空凍結乾燥を行い、乾燥後の粉末を1mlの1N水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、2次元NMRに供した。
2次元NMR(13C−1H COSY NMR)106ppmと相関関係を有する1H NMRスペクトルを図1に示す。このスペクトルにおいて4.7ppmと4.5ppm付近との2つのシグナルが得られた。
この結果、本β−グルカンがβ-1,3-1,6-D-グルカンであることが証明された(今中忠行 監修、微生物利用の大展開、1012-1015、エヌ・ティー・エス(2002))。それぞれの1H NMRシグナルの積分比から、β−1,3結合/β−1,6結合の比は1.15であることが判明した。従って、主鎖のβ−1,3結合に対する側鎖のβ−1,6結合の分岐度は、約87%である。
次に、レ−ザ回折/散乱式粒度分布測定装置(HORIBA製LA−920)を用いて培養液の粒度を測定したところ、粒子としては0.3μmと100μm程度の大きさのところにピ−クが見られた。続いて、超音波を照射しながら、粒度測定を行うと、100μmのピ−クはみるみるうちに消失し、0.3μmのピ−クが増え、最終的に0.3μmのみとなった。超音波照射したときの培養液の粒度分布を図2に示す。
0.3μmのピークはβ-1,3-1,6-D-グルカンの一次粒子によるピークであり、100〜200μmのピークはβ-1,3-1,6-D-グルカンの一次粒子が凝集した二次粒子によるピークであると考えられる。
また、二次粒子はマグネチックスターラ−による攪拌、軽い振とうでも同じように消失し、容易に砕けて一次粒子になることが確認された。よって、二次粒子は非常に緩い凝集(緩凝集状態)と考えられる。
また、東ソー社製のトーヨーパールHW65(カラムサイズ75cm×φ1cm、排除分子量250万(デキストラン))を用いて、0.1Mの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルろ過クロマトグラフィーを行い、溶解β−1,3−1,6−D−グルカンとβ−1,3−1,6−Dグルカンの1次粒子とを含む溶液の分子量を測定したところ、溶解β−1,3−1,6−D−グルカンに由来する2〜30万のピークの低分子画分と、1次粒子に由来する見かけ上50〜250万の高分子画分との二種類が検出された。分子量のマーカーとしてShodex社製のプルランを用いた。
水溶性β-1,3-1,6-D-グルカンと微粒子とを分離するため、上記の微粒子画分と可溶性画分とを含むβ-1,3-1,6-D-グルカン溶液をアドバンテック社製のフィルター(0.2μm)でろ過を行ったところ、50〜250万の高分子画分が消失した。このことから、高分子画分はβ-1,3-1,6-D-グルカンの一次粒子や一次粒子が凝集した二次粒子に相当することが判明した。よって、水溶性β-1,3-1,6-D-グルカンの分子量は2〜30万と考えられる。
(1−2)において、アルカリ処理および菌体除去処理により調製された微粒子β-1,3-1,6-D-グルカンを含むβ-1,3-1,6-D-グルカン水溶液に、最終濃度が66%(v/v)となるようにエタノールを添加して、多糖グルカンを沈殿させ、遠心分離法により回収した。次いで凍結乾燥法によりエタノールと水分を除去し、乾燥β-1,3-1,6-D-グルカンを得た。そのときの収率はエタノール沈殿前の全糖濃度と比較して95%以上であった。
次いで、得られた乾燥β-1,3-1,6-D-グルカンを最終濃度が0.3%(w/v)となるように水に溶解分散後、前述したと同様にして東ソー社製のトーヨーパールHW65(カラムサイズ 75cm×φ1cm、排除分子量250万(デキストラン))により0.1Mの水酸化ナトリウム水溶液を溶離液としてゲルクロマトグラフィーを行い、分子量を測定したところ、得られた多糖の分子量は2〜30万のピークの低分子画分と見かけ上50〜250万の高分子画分の二種類からなることが判明した。ここで、分子量のマーカーとしてShodex社製のプルランを用いた。
一方、水溶性β-1,3-1,6-D-グルカンと微粒子を分離するため、本法で調製したβ-1,3-1,6-D-グルカン水溶液(微粒子と可溶化グルカンを含むもの)をアドバンテック社製のフィルター(0.2μm)でろ過を行ったところ、50〜250万の高分子画分が消失した。よって、本法により得られたβ-1,3-1,6-D-グルカンを乾燥させても、再溶解させれば乾燥前のβ-1,3-1,6-D-グルカンと同様の物理的挙動を再現することが実証された。
(1)においてアルカリ処理を行い低粘度化した培養液(多糖濃度0.5%(5mg/ml))90Lを50%クエン酸水溶液9kgで中和後、ろ過助剤(日本製紙ケミカル製粉末セルロ−スKCフロック)を1.8kgプレコートした薮田式濾過圧搾機40D-4を通して、菌体を取り除いた。ろ液を限外ろ過スパイラルエレメント(日東電工製NTU3150−S4)で9Lまで濃縮した。本濃縮液を攪拌しながら、pHを3.0-3.5にクエン酸により調整して、エタノール18Lを加え、グルカン/エタノール/水スラリーを得た。スラリーの粘度はBM型粘度計で22mPa・s(30℃)であった。室温で3時間静置し、上澄み液(エタノール/水)約17Lを取り除いた。残ったスラリーの粘度は45mPa・s(30℃)であった。本濃縮スラリー10Lを坂本技研型の噴霧乾燥装置R-3を用いて噴霧乾燥し、360gのβ-1,3-1,6-D-グルカン粉末を得た(回収率80%)。得られたβ-1,3-1,6-D-グルカンの純度はNMRスペクトルの解析の結果、90%以上であった。
なお、得られたβ-1,3-1,6-D-グルカン粉末を1N水酸化ナトリウム重水溶液に溶解させ、NMRスペクトルを測定したところ、1H NMRスペクトルが約4.7ppm及び約4.5ppmの2つのシグナルを得た。また、得られたβ-1,3-1,6-D-グルカン粉末の濃度0.5(w/v%)の水溶液の粘度は200cP以下であった(pH5.0、30℃)。上記記載の方法によって得られた精製β-グルカンを下記の試験に供した。
フラーレン(C60、又はC70)(フロンティアカーボン社製)1mgと、上記実験例により得たβ-1,3-1,6-D-グルカン粉末(ダイソー社製、アクアβ)、シゾフィラン(三井製糖社製)、デキストラン(和光純薬社製)、又はアミロース(和光純薬社製)各10mgとを混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ製粉砕ボールとともに封入し、レッチェ社製ミキサーミル(MM200)にて25Hz、25分間高速粉砕した。
次いで、混合物1重量部に対して水8,000重量部を添加しマグネティックスターラーを使用して2日間室温下にて撹拌し、60分間超音波分散させた。次いで、1,400rpmで20分間遠心して不溶性夾雑物を除去し、上清を取り出して、フラーレン水溶液とした。
これらのフラーレン水溶液の吸収スペクトルを測定し、C60は450nmのモル吸光係数(ε=1.3×10−4)、C70は381nmのモル吸光係数(ε=3.8×10-4)を用いてフラーレン濃度を算出した。結果を以下の表2に示す。
なお、シゾフィランの分岐度はK. Tabata et al., Carbohydrate Research, 89, 121-135 (1981)に記載された値である。
γCD−[60]フラーレン(C60)錯体水溶液、及びγCD−[70]フラーレン(C70)錯体水溶液を、K. Komatsu, K. Fujiwara, Y. Murata, T. Braun, J. Chem. Soc., Perkin Trans. 1 1999, 2963.に記載されている方法で調製した。
γCD−[60]フラーレン(C60)錯体水溶液(γCD:和光純薬社製、C60:MER Corporation製)のUV-vis吸収スペクトルを測定した結果を、図3A及び図3BにγCD−C60として示す。また、γCD−[70]フラーレン(C70)錯体水溶液(γCD:和光純薬社製、C70:MTR Limited製)のUV-vis吸収スペクトルを測定した結果を、図4A及び図4BにγCD−C70として示す。
なお、溶液中のC70濃度は、アクアβ−C70複合体水溶液に過剰量のエタノールを加え、減圧乾燥することで水を除去し、トルエンに再分散させUV−vis吸収スペクトルを測定することで決定している(ε382 = 40918 cm−1 mol−1 dm3)。
(1)担腫瘍マウスの作製
6週齢のヌードマウス(BALB/c Sic-nu/nu mice、オス、18〜23g、SLC)をイソフルラン吸入麻酔下、ハンクス液に懸濁したColon26 細胞(60×104 cell/100μL)を26G注射針を用いて背部皮下投与した。
(2)アクアβ-フラーレン(C70)複合体の抗腫瘍効果の評価
前記のようにして得た担腫瘍マウスを、1群5匹として2群に分け、アクアβ-フラーレン(C70)複合体を投与して光照射する群、及び光照射のみの群とした。アクアβ-フラーレン(C70)複合体投与は、フラーレン濃度9.33×10-5(M)のアクアβ-フラーレン(C70)複合体水溶液400μlを25%グルコース溶液100μlと混合し、等張液とし、100μlを30G注射針を用いてマウスの腫瘍へ局注した。投与1時間後に30分間光照射を行う操作を投与開始初日、3日後、5日後、及び7日後の計4回行った。光照射は、アクアβ-フラーレン(C70)複合体水溶液投与1時間後より、腫瘍から5cmの高さより、Xeランプを30分照射することにより行った。照射強度は35mW/cm2とした。
また、マウスの体重の推移を図5(B)に示す。両群共に、体重は微増した。
アクアβ-フラーレン(C70)複合体は正常細胞には影響を与えず、腫瘍細胞にのみ毒性を持ち、抗腫瘍効果が得られたことが分かる。
(ホウ素クラスター化合物(m-カルボラン)の高速振動粉砕法による水溶化)
ダイソー社製アクアβと三井製糖社製シゾフィラン(SPG)を、m-カルボランと下記表3に示す所定量で混合し、メノウ製粉砕ジャーにメノウ粉砕ボールと共に封入し、レッチェ社製ミキサーミル(MM200)にて25Hz,25分間高速振動粉砕した。その後、混合物1重量部に対して水10,000重量部を添加しマグネティックスターラーを使用して2日間室温下にて撹拌し、さらに2時間ボルテックスミキサーで攪拌した。遠心分離(25℃,14,000rpm,20min)を行い、上清を0.45 μmメンブレンフィルターでろ過した。ろ液についてICP発光分析装置でホウ素濃度を測定し、水溶化度を評価した。結果を以下の表3に示す。
(ホウ素クラスター化合物(m-カルボラン)のDMSO-Renature法による水溶化)
β-1,3-1,6-D-グルカンとしてダイソー社製アクアβ、又は三井製糖社製シゾフィラン(SPG)を、m-カルボランと後掲の表4に示す所定量で混合し、DMSO (5mL)に溶解した。浴槽型超音波槽にて1時間超音波処理を行い分散液を得た。通常三重螺旋を形成しているβ-1,3-1,6-D-グルカンをDMSOに溶解させることで、一本ずつランダムコイルで解離させた。
次いで、1mL×5回,2mL×5回,5mL×6回で、MilliQ水を順次1分間隔で加え、水含の組成比を増大することで、疎水相互作用に基づく三重螺旋の再構築を行い、その際に疎水性のm-カルボランを三重螺旋内部の疎水空孔へ取り込ませることで水溶化させるべく操作した。
次いで、DMSOを除去するために透析(MWCO=3,500)を行い、回収後、エバポレーターで濃縮した。ICP発光分析装置でホウ素濃度を測定し、水溶化度を評価した。結果を以下の表4に示す。
単層カーボンナノチューブ(SWNT:カーボンナノテクノロジー社製)1.0mgをDMSO0.5mlに分散させ、超音波照射を行うことにより予備分散化を行った。ここにダイソー社製アクアβのDMSO溶液(2.0mg / ml)を1.0ml加え、さらに超音波照射を1時間行った。得られた分散液を蒸留水1.5mlに加えた。この分散液にさらに蒸留水35mlに加え1日放置し、アクアβのRenatureを行った。この時点で均一な溶液となっていることが目視により確認された。遠心分離(8,000rpm, 60min)により複合体を沈殿として回収、上澄みを除去した後、蒸留水に沈殿を再分散させた。この操作を3回繰り返すことにより、未複合の多糖の除去と溶媒の水への置換を行った。最終的に蒸留水5 mlに分散させた溶液を得た。
複合体水溶液のUV-VIS-NIRスペクトルを図6に示す。近赤外領域にまで伸びたSWNT特有の吸収帯が確認され、アクアβによってSWNTが水に分散できていることが解る。500nmにおける吸光度(Abs500=0.575)より溶解しているSWNTの濃度は5.0mg/mlと見積もられる。これは、シゾフィランを用いた場合(2.5 mg/ml)と比較しても分散性が2倍に格段に向上していることを示す結果である。アクアβの側鎖率がシゾフィランより高いことが分散性を向上させた原因であると考察される。
次に、得られた水溶液をマイカ基盤上キャストし、複合体の形態観察を実施した。結果を図7に示す。SWNT表面をアクアβが被覆している様子が分る。アクアβがSWNT表面をらせん状に被覆した結果であると考えられる。この様に、アクアβの層をSWNT表面に構築したことにより、SWNT間の凝集が抑制され、結果的にSWNTが高濃度で分散できたと考えられる。
50%以上の分岐度を有するβ-1,3-1,6-D-グルカンであるアクアβは、単層カーボンナノチューブに高い分散性を与えたことが分かる。
実施例6において、単層カーボンナノチューブを多層カーボンナノチューブに換えた他は、実施例6と同様の操作を行った。
即ち、多層カーボンナノチューブ(MWNT:カーボンナノテクノロジー社製)15mgをDMSO1.0mlに分散させ、超音波照射を行うことにより予備分散化を行った。ここにダイソー社製アクアβのDMSO溶液(5mg / ml)を3.0ml加え、さらに超音波照射を1時間行った。得られた分散液を蒸留水4.0mlに加え、アクアβのRenatureを行った。この時点で均一な溶液となっていることが目視により確認された。遠心分離(8,000rpm, 60min)により複合体を沈殿として回収、上澄みを除去した後、蒸留水に沈殿を再分散させた。この操作を3回繰り返すことにより、未複合の多糖の除去と溶媒の水への置換を行った。最終的に蒸留水3.0 mlを加えて、MWNTの5.0mg/ml分散溶液を得た。
50%以上の分岐度を有するβ-1,3-1,6-D-グルカンであるアクアβは、多層カーボンナノチューブにも高い分散性を与えたことが分かる。
実施例6で得た単層カーボンナノチューブ分散溶液(5.0mg/ml)2mlに、カードラン(和光純薬社製;β‐1,3−D-グルカン、分子量200万)の50mg/mlの1N水酸化ナトリウム水溶液1mlを添加してボルテックスで数十秒攪拌した。次いで等量の1N塩酸を速やかに添加して同様に攪拌しpHを中性に調整した。調整したサンプルを均一な厚さになるようにガラスプレート上に塗布し、真空ポンプで1時間乾燥させた。その結果、ゲル状の乾燥物が得られた。
銀ナノ粒子(平均粒径20nm同和エレクトロニクス社製)1.0mgをDMSO0.5mlに分散させ、超音波照射を行うことにより予備分散化を行った。ここにダイソー社製アクアβのDMSO溶液(2.0mg / ml)を1.0ml加え、さらに超音波照射を1時間行った。得られた分散液を蒸留水1.5mlに加えた。この分散液にさらに蒸留水35mlに加え1日放置し、アクアβのRenatureを行った。この時点で均一な溶液となっていることが目視により確認された。遠心分離(8,000rpm, 60min)により複合体を沈殿として回収、上澄みを除去した後、蒸留水に沈殿を再分散させた。この操作を3回繰り返すことにより、未複合の多糖の除去と溶媒の水への置換を行った。最終的に蒸留水5mlに分散させた溶液を得た。
この溶液は10mlのガラス製スクリュー管(日電硝子社製)に入れて1日放置しても沈殿が発生せず、良好な分散性を示した。さらに、銀の含有量が200ppmとなるよう蒸留水で希釈し、得られた黄色透明の水溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定すると、420nmに銀ナノ粒子に特有のプラズモン吸収に基づくピークトップを有するシャープな吸収が見られた。
ダイソー社製アクアβ100mgを100mlの脱イオン水に溶解させた。この溶液にテトラクロロ金酸四水和物0.1mmol(41.19mg)を添加し、この時点で均一な溶液となっていることが目視により確認された。
この溶液にジメチルアミノエタノールを添加し、還元反応を進め、室温で3時間撹拌させた。
この溶液を遠心分離(8,000rpm, 60min)により複合体を沈殿として回収、上澄みを除去した後、蒸留水に沈殿を再分散させた。この操作を2回繰り返し、ジメタノールアミンや残留イオン物を除去した。最終的に蒸留水100mlに分散させた溶液を得た。この溶液を10mlのガラス製スクリュー管(日電硝子社製)に5ml入れて一日放置しても沈殿が発生せず、良好な分散性を示した。さらに、金の含有量が200ppmとなるよう蒸留水で希釈し、得られた赤色透明の水溶液の紫外可視吸収スペクトルを測定すると、530nmに金ナノ粒子に特有のプラズモン吸収に基づくピークトップを有するシャープな吸収が見られた。
Claims (16)
- 疎水性クラスター化合物と、β−1,3結合に対するβ−1,6結合の分岐度が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとの複合体。
- 疎水性クラスター化合物が、ホウ素、炭素、ケイ素、硫黄、及びリンからなる群より選ばれる少なくとも1種の非金属原子を含む化合物である請求項1に記載の複合体。
- 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである請求項2に記載の複合体。
- 疎水性クラスター化合物が、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、鉄、コバルト、マグネシウム、アルミニウム、及びジルコニウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の金属原子を含む化合物である請求項1に記載の複合体。
- 疎水性クラスター化合物と、β−1,3結合に対するβ−1,6結合の分岐度が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとの複合体の製造方法。
- 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである請求項5に記載の方法。
- 疎水性クラスター化合物が、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、鉄、コバルト、マグネシウム、アルミニウム、及びジルコニウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の金属原子を含む化合物である請求項5に記載の方法。
- 疎水性クラスター化合物と、β−1,3結合に対するβ−1,6結合の分岐度が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、疎水性クラスター化合物とβ-1,3-1,6-D-グルカンとの複合体の製造方法。
- 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである請求項8に記載の方法。
- 疎水性クラスター化合物が、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、鉄、コバルト、マグネシウム、アルミニウム、及びジルコニウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の金属原子を含む化合物である請求項8に記載の方法。
- 疎水性クラスター化合物と、β−1,3結合に対するβ−1,6結合の分岐度が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとを固体状態のままで撹拌する工程と、この混合物に水を添加して撹拌する工程とを含む、疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法。
- 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである請求項11に記載の方法。
- 疎水性クラスター化合物が、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、鉄、コバルト、マグネシウム、アルミニウム、及びジルコニウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の金属原子を含む化合物である請求項11に記載の方法。
- 疎水性クラスター化合物と、β−1,3結合に対するβ−1,6結合の分岐度が50〜100%であるβ-1,3-1,6-D-グルカンとを極性溶媒中で混合する工程と、得られる混合物に水を加えて熟成する工程とを含む、疎水性クラスター化合物への水溶性又は水分散性の付与方法。
- 疎水性クラスター化合物が、カルボラン、フラーレン、カーボンナノチューブ、又はカーボンナノコイルである請求項14に記載の方法。
- 疎水性クラスター化合物が、白金、金、銀、銅、チタン、亜鉛、鉄、コバルト、マグネシウム、アルミニウム、及びジルコニウムからなる群より選ばれる少なくとも1種の金属原子を含む化合物である請求項14に記載の方法。
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