JP5603486B2

JP5603486B2 - 抗腫瘍組成物

Info

Publication number: JP5603486B2
Application number: JP2013513684A
Authority: JP
Inventors: シユライヤー，カルラ・クリスチーナ; ヤハト，ヘンリクス・ヨハネス・マリア
Original assignee: インターベットインターナショナルベー．フェー．
Priority date: 2010-06-10
Filing date: 2011-06-09
Publication date: 2014-10-08
Anticipated expiration: 2031-06-09
Also published as: CN102917717A; US20140212386A1; CA2799076A1; WO2011154476A1; CN102917717B; EP2579884B1; EP2579884A1; US20130084264A1; BR112012029887A2; JP2013528197A; ES2492691T3

Description

本発明は、哺乳動物における腫瘍の治療に使用するためのトリパラミクソウイルス（ＡＰＭＶ）を含む医薬組成物に関する。

ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）は、種々の鳥類において感染を引き起こすトリパラミクソウイルス（ＡＰＭＶ）のメンバーである。ＮＤＶはＡＰＭＶ１に属する。該疾患は気道、脳または胃腸管の炎症により特徴づけられる。ニューカッスル病ウイルスは、もう１つの意外な特徴を有することが何十年も前から公知である。十分には知られていない理由により、それは哺乳動物において或る抗腫瘍効果を有するのである。したがって、トリ種へのワクチン接種に対する関心と並んで、ヒトの癌治療を含む癌治療におけるニューカッスル病ウイルスおよび他のパラミクソウイルスの使用における関心が増大しつつある。ニューカッスル病ウイルスがヒトにおいて複製される場合、一般的に言うと、該ウイルスはビルレントには挙動しない。ＮＤＶに感染したヒトにおける最もよく知られている症状は軽度の結膜炎である。そのような結膜炎は、しばしば、大量のニワトリへの生弱毒化ＮＤＶでのワクチン接種に初めて関与した獣医により経験される。しかし、十分には理解されていない理由により、哺乳類腫瘍細胞に対する病原性は非腫瘍細胞における病原性と比べて遥かに高い。ＮＤは癌細胞においては正常細胞におけるより約１００．０００倍良好に複製されると推定される。ＮＤＶは、腫瘍細胞溶解効果のような抗腫瘍効果を有する唯一のＡＰＭＶではない。現在、ＡＰＭＶ１、３、４、５、６、７、８、９、マプエルタ（Ｍａｐｕｅｒｔａ）ウイルスおよびフェル・デ・ランス（Ｆｅｒ−ｄｅ−Ｌａｎｃｅ）ウイルスの腫瘍細胞溶解性株が公知である。例えば、米国特許出願ＵＳ２００９／０２０８４９５を参照されたい。２つの型のＡＰＭＶ、すなわち、細胞溶解性株および非細胞溶解性株が存在する。細胞溶解性株および非細胞溶解性株は共に癌細胞を殺しうるが、細胞溶解性細胞は幾らか速い作用様式を有する（Ｓｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒ，Ｖ．ら，Ｉｎｔ．Ｊ．Ｏｎｃｏｌ．２００１Ｍａｙ；１８（５）：９４５−５２）。細胞溶解性株は感染細胞の細胞膜を損傷し、非細胞溶解性株は該細胞の代謝を妨げるらしい。したがって、細胞溶解性株および非細胞溶解性株は共に、異なるメカニズムによってではあるが、腫瘍細胞に対して毒性である。したがって、混乱を避けるために、細胞溶解性株および非細胞溶解性株を共に、更に、細胞毒性株とも称することとする。文献においては細胞溶解性株は腫瘍細胞溶解性株とも称されているため、細胞溶解性株なる語は本明細書においては腫瘍細胞溶解性株を意味する。

細胞溶解性ＮＤＶ株および非細胞溶解性ＮＤＶ株は共に、癌との闘いにおけるそれらの使用に関して研究されている。これは以下の３つの異なる基本的な抗腫瘍療法の開発につながっている：
１）患者への非細胞溶解性または細胞溶解性ＡＰＭＶ株の投与、
２）インビトロＡＰＭＶ感染癌細胞からの細胞膜断片を含む、いわゆる腫瘍細胞溶解液の、患者への投与、
３）非細胞溶解性ＡＰＭＶ株に感染した無傷癌細胞の、患者への投与。

第１のアプローチの原理は、該細胞溶解性ウイルス株の広がり、およびそれに続くその株の複製が、最終的に、体内の全腫瘍細胞への感染を招くというものである。このアプローチの不利な結果は、ある時間の後に免疫応答が誘導され、これが親および／または後代ウイルスを中和しうることである。第２および第３のアプローチの原理は、腫瘍細胞の表面上の腫瘍特異的抗原が、それらがウイルス抗原に結合する際に良好に認識されるというものである。第２および第３のアプローチのどちらを選ぶかは、細胞膜または全細胞のどちらが良好な応答を与えると考えられるかにかかっている。ウイルスに基づく抗腫瘍アプローチ１、２および３の欠点は、ある時間の後にＡＰＭＶに対する免疫応答が誘導され、これが親および／または後代ウイルスを阻害し、更なる細胞への感染を阻止することである。この問題は幾つかの方法で対処されている。幾つかのアプローチは、とりわけ、宿主の免疫系を阻害する化合物をコードする異種遺伝子の、ウイルスゲノム内への導入に基づく。もう１つのアプローチは、誘導抗体の効果を抑制するために、または該ウイルスに対する或る種の免疫寛容を誘導するために、（非常に）高い力価のウイルスを週数回投与するというものである。他のアプローチは、非常に強固な最初の攻撃により、第２ラウンド以降のウイルス感染の必要性を回避することを試みる。これは、例えば、ＮＤＶと何らかの抗腫瘍薬（例えば、細胞毒性または細胞分裂抑制性化合物）との組合せ投与により行われうる。他のそのようなアプローチは、例えば、腫瘍特異的抗原に対する完全ＩｇＧ抗体をコードする遺伝子の、ＮＤＶ内への導入に基づくものである。

これらのアプローチの共通の欠点は、それらのそれぞれが、比較的低い濃度のＮＤＶでの基本的治療と比較して患者を悪化させることである。したがって、抗体誘導に伴う問題を軽減するための代替的アプローチが必要とされている。

前記の欠点を引き起こすことなく抗体誘導に伴う問題を軽減するための手段を提供することが、本発明の目的である。

この点において、本発明の１つの実施形態は、哺乳動物における腫瘍の治療に使用するための、トリパラミクソウイルス（ＡＰＭＶ）を含む医薬組成物に関する。この場合、該治療は、第１ＡＰＭＶの細胞毒性量を該哺乳動物に投与する工程、ついで、該第１ＡＰＭＶの投与から２〜５６週間以内に第２ＡＰＭＶの細胞毒性量をその哺乳動物に投与する工程を含み、ここで、該第２ＡＰＭＶは、第１ＡＰＭＶのものとは免疫学的に異なるＨＮタンパク質を有する。

全てのＡＰＭＶは、赤血球凝集素／ノイラミニダーゼ（ＨＮ）活性をコードする遺伝子と、融合（Ｆ）タンパク質をコードする遺伝子とを含有する。赤血球凝集素／ノイラミニダーゼは防御免疫応答の強力な誘導因子であり、一方、融合タンパク質も、それらよりは低い度合ではあるが防御免疫応答の誘導に関与している。驚くべきことに、トリパラミクソウイルス（ＡＰＭＶ）の種々のメンバーの赤血球凝集素／ノイラミニダーゼおよび融合タンパク質の間には顕著に低い免疫学的交差反応性が存在することが本発明において見出された。免疫学的交差反応性は、ある場合には更には実質的に存在しない。この意外な知見は、ＡＰＭＶ株の初回投与後の免疫誘導に伴う問題を軽減する又は好ましくは回避する新規アプローチの可能性を開くものである。この目的を達成するための１つの方法は、第１ＡＰＭＶの細胞毒性量を哺乳動物に投与し、ついで該第１ＡＰＭＶの投与から２〜５６週間以内に第２ＡＰＭＶの細胞毒性量をその哺乳動物に投与することであり、この場合、第２ＡＰＭＶは、第１ＡＰＭＶのものとは免疫学的に異なるＨＮタンパク質（および好ましくは融合タンパク質）を有することに留意する。この場合に免疫学的に異なるとは、第２ＨＮタンパク質（および好ましくは融合タンパク質）が、第１ＡＰＭＶに属しないＡＰＭＶに由来することを意味する。単なる例示としてであるが、第１ＡＰＭＶのＨＮタンパク質がＡＰＭＶ１に属する場合、免疫学的に異なるものとして適合するためには、第２ＡＰＭＶのＨＮタンパク質は別のＡＰＭＶ、例えばＡＰＭＶ３またはＡＰＭＶ５に属する必要がある。このアプローチに従うことにより、異なるＡＰＭＶ間の免疫学的交差反応性が（非常に）低いため、第２ＡＰＭＶは、第１ＡＰＭＶに対する考えられうる免疫応答により、低い度合で又はより一層低い度合で阻害されるであろう。これは経時的に数ラウンドのウイルス投与を可能にするであろう。治療すべき腫瘍が充実性腫瘍である場合には尚更、そのようなアプローチの利点は明らかである。そのような場合には特に、腫瘍塊の全細胞が同時に感染するとは考えにくい。腫瘍の中心部は最初は未攻撃のままであろう。初回ウイルス投与後に感染した細胞は、腫瘍塊内のより深い細胞層が感染しうる前に死亡し消失するに違いない。その時点までに、該ウイルスに対して生じた免疫は残存ウイルスを十分に除去可能であり、その結果、これらの深部細胞層は死亡しないであろう。しかしながら、本発明においては、免疫応答が生じない第２（および必要な場合には第３またはそれ以降の）ＡＰＭＶ株でのＡＰＭＶ投与の第２ラウンドがこの問題を解決するであろう。

第１および第２ＡＰＭＶを選択するための方法は幾つか存在する。容易な方法は、ＡＰＭＶ１、３、４、５、６、７、８、９、マプエルタ（Ｍａｐｕｅｒｔａ）ウイルスおよびフェル・デ・ランス（Ｆｅｒ−ｄｅ−Ｌａｎｃｅ）ウイルスからなる群から選択されるＡＰＭＶの１つを第１ＡＰＭＶとして使用し、この群の別のＡＰＭＶを第２ＡＰＭＶとして使用するものである。単なる一例としてであるが、第１ＡＰＭＶとしてＡＰＭＶ１の細胞毒性量を投与し、ついで該第１投与から２〜５６週間以内にＡＰＭＶ３の細胞毒性量を投与することが可能であろう。第１および第２ＡＰＭＶを選択するためのもう１つのより複雑であるがエレガントな方法は、前記のとおり、ＡＰＭＶに対する主免疫応答が該ウイルスのＨＮに対するもの、そしてそれより低い度合ではあるがＦタンパク質に対するものであることに基づく。特定のＡＰＭＶのＨＮをコードする遺伝子、および所望により、Ｆタンパク質をコードする遺伝子を、別のＡＰＭＶのものにより単に置換することにより、同じＡＰＭＶバックボーンを２回、すなわち、１回は野生型として、そしてもう１回は、野生型のものの代わりに別のＡＰＭＶのＨＮ（をコードする遺伝子）および恐らくはＦタンパク質を今や含有する組換え体として使用することが可能であろう。単なる一例としてであるが、ＮＤＶを第１ＡＰＭＶとして使用し、そして別のＡＰＭＶ（例えば、ＡＰＭＶ３）の同じＮＤＶバックボーンに基づくが別のＡＰＭＶ（例えば、ＡＰＭＶ）のＨＮ（をコードする遺伝子）および恐らくはＦタンパク質を今や含有する組換えＮＤＶを第２ＡＰＭＶとして使用することが可能であろう。第２（組換えＮＤＶ）ＡＰＭＶは、第１ＡＰＭＶに対して生じた免疫応答により（遥かに）低い度合で阻害されるであろう。なぜなら、（第２ＡＰＭＶの基礎はＮＤＶであるにもかかわらず）第２（組換えＮＤＶ）の主免疫原性決定基はＮＤＶのものではなく、別のＡＰＭＶ（例えば、ＡＰＭＶ３）のものであるからである。

第１ＡＰＭＶの投与と第２ＡＰＭＶの投与との間の２〜５６週間の期間は以下の根拠を有する。幾つかの腫瘍は迅速に成長し、一方、他の腫瘍または更には転移腫瘍細胞は遅く成長し、または更にはかなりの時間にわたって「休眠状態」となりうる。したがって、該腫瘍の特性に応じて、時間的により早く又はより遅く第２ＡＰＭＶを投与することが有益でありうるであろう。多くの場合、第１ＡＰＭＶの投与と第２ＡＰＭＶの投与との間の期間はより短いであろう。なぜなら、「休眠状態」の期間は５６週間未満だからである。更に、細胞の早期成長のリスクを回避したい場合もあるであろう。したがって、好ましい期間は２〜２８週間、より好ましいのは２〜２０、２〜１６、２〜１２、または更には２〜８週間（その順序で好ましくなる）であろう。

この新規アプローチは、それが専らＡＰＭＶの細胞毒性効果に基づいており、したがって、原理的には、公知アプローチが基づいている前記のとおりの免疫系および免疫応答を妨げる化合物もしくは治療方式または細胞毒性薬の強制的使用を伴わないという、既存アプローチと比較した場合の利点を有する。

本発明の追加的利点は以下のとおりである。ある時間の後、２段階で患者が本発明の組成物で治療された後で休眠（または）転移腫瘍細胞が分裂を開始した場合、該方法は、第３ＡＰＭＶおよび所望により他のＡＰＭＶを投与することにより単に反復されうる。

ある免疫応答がＦタンパク質に対して誘導されることを考慮すると、好ましくは、第２ＡＰＭＶは、第１ＡＰＭＶのものと免疫学的に異なるＨＮタンパク質だけでなく、第１ＡＰＭＶのものと免疫学的に異なるＦタンパク質をも有する。

第１および第２工程の両方において例えばＮＤＶバックボーンが使用される場合、第２組換えＮＤＶにおけるＨＮおよび融合タンパク質は、好ましくは、１つの同じ非ＮＤＶＡＰＭＶに由来するべきであると理解されるべきである。一例としては、第１ＮＤＶが野生型ＮＤＶである場合、組換えＮＤＶである第２ＮＤＶは、好ましくは、例えばＡＰＭＶ４またはＡＰＭＶ５のＨＮおよび融合タンパク質の両方を含有するべきであり、ＡＰＭＶ４のＨＮおよびＡＰＭＶ５の融合タンパク質を含有するべきではない。

したがって、本発明の好ましい実施形態は、第２ＡＰＭＶが、第１ＡＰＭＶのものとは免疫学的に異なるＦタンパク質を更に有する、本発明の医薬組成物に関する。

ウイルスの選択は非常に広範である。抗腫瘍療法に適したＡＰＭＶは公知であり、古くから当技術分野で公知である。例えば、ヒトの癌研究において使用されるＮＤＶ株の概観は、とりわけ、７３−Ｔ（ＣａｓｓｅｌＷＡ，ＧａｒｒｅｔｔＲＥ．Ｃａｎｃｅｒ１８：８６３−８，１９６５）、Ｕｌｓｔｅｒ（ＢｏｈｌｅＷ，ＳｃｈｌａｇＰ，ＬｉｅｂｒｉｃｈＷら，Ｃａｎｃｅｒ６６（７）：１５１７−２３，１９９０）、ＭＴＨ−６８（ＣｓａｔａｒｙＬＫ，ＭｏｓｓＲＷ，ＢｅｕｔｈＪら，ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ１９（１Ｂ）：６３５−８，１９９９）（ＣｓａｔａｒｙＬＫ，ＥｃｋｈａｒｄｔＳ，ＢｕｋｏｓｚａＩら，ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔＰｒｅｖ１７（６）：６１９−２７，１９９３．）、Ｉｔａｌｉｅｎ（ＭａｌｌｍａｎｎＰ．Ｈｙｂｒｉｄｏｍａ１２（５）：５５９−６６，１９９３）、Ｈｉｃｋｍａｎ（ＷｈｅｅｌｏｃｋＥＦ，ＤｉｎｇｌｅＪＨ．ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２７１（１３）：６４５−５１，１９６４）、ＰＶ７０１（ＰｅｃｏｒａＡＬ，ＲｉｚｖｉＮ，ＣｏｈｅｎＧＩら，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２０（９）：２２５１−６６，２００２）、ＨＵＪ（ＦｒｅｅｍａｎＡＩ，Ｚａｋａｙ−ＲｏｎｅｓＺ，ＧｏｍｏｒｉＪＭら，ＭｏｌＴｈｅｒ１３（１）：２２１−８，２００６）およびＬａＳｏｔａ（ＬｉａｎｇＷ，ＷａｎｇＨ，ＳｕｎＴＭら，ＷｏｒｌｄＪＧａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌ９（３）：４９５−８，２００３）を含む。

投与経路に関しても、当技術分野における既存の知見は当業者に十分な指針を提供する。当技術の単なる例示としてであるが、以下に概要を示す。動物研究においては、とりわけ、ＳｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒＶ，ＧｒｉｅｓｂａｃｈＡ，ＡｈｌｅｒｔＴ．，ＩｎｔＪＯｎｃｏｌ１８（５）：９４５−５２，２００１において概説されているとおり、腫瘍内、腹腔内および静脈内経路によりＮＤＶ感染が達成されている。筋肉内または皮下経路によるＮＤＶ感染は、とりわけ、ＨｅｉｃａｐｐｅｌｌＲ，ＳｃｈｉｒｒｍａｃｈｅｒＶ，ｖｏｎＨｏｅｇｅｎＰら，ＩｎｔＪＣａｎｃｅｒ３７（４）：５６９−７７，１９８６に概説されている。ヒトでの研究においては、患者がＮＤＶの細胞溶解性株に感染している場合、腫瘍内、静脈内または筋肉内注射が用いられている（ＣａｓｓｅｌＷＡ，ＧａｒｒｅｔｔＲＥ，Ｃａｎｃｅｒ１８：８６３−８，１９６５，ＣｓａｔａｒｙＬＫ，ＭｏｓｓＲＷ，ＢｅｕｔｈＪら，ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ１９（１Ｂ）：６３５−８，１９９９，ＰｅｃｏｒａＡＬ，ＲｉｚｖｉＮ，ＣｏｈｅｎＧＩら，ＪＣｌｉｎＯｎｃｏｌ２０（９）：２２５１−６６，２００２，ＣｓａｔａｒｙＬＫ，ＢａｋＡａｃｓＴ，ＪＡＭＡ２８１（１７）：１５８８−９，１９９９，ＷｈｅｅｌｏｃｋＥＦ，ＤｉｎｇｌｅＪＨ，ＮＥｎｇｌＪＭｅｄ２７１（１３）：６４５−５１，１９６４，ＣｓａｔａｒｙＬＫ．，Ｌａｎｃｅｔ２（７７２８）：８２５，１９７１）。

以下の経路も用いられる：吸入および結腸内への直接注射（すなわち、人工肛門開口によるもの）（ＣｓａｔａｒｙＬＫ，ＭｏｓｓＲＷ，ＢｅｕｔｈＪら，ＡｎｔｉｃａｎｃｅｒＲｅｓ１９（１Ｂ）：６３５−８，１９９９Ｊａｎ−Ｆｅｂ，ＣｓａｔａｒｙＬＫ，ＥｃｋｈａｒｄｔＳ，ＢｕｋｏｓｚａＩら，ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔＰｒｅｖ１７（６）：６１９−２７，１９９３）。

また、癌治療におけるＮＤＶのようなＡＰＭＶの使用の詳細な概説がＰｏｓｉｔｉｏｎＤｅｓｃｒｉｐｔｉｏｎＱｕｅｓｔｉｏｎａｉｒｅ “ＮｅｗｃａｓｔｌｅＤｉｓｅａｓｅＶｉｒｕｓ（ＰＤＱ（登録商標））ＨｅａｌｔｈＰｒｏｆｅｓｓｉｏｎａｌＶｅｒｓｉｏｎ”ｏｆｔｈｅＮａｔｉｏｎａｌＣａｎｃｅｒＩｎｓｔｉｔｕｔｅに見出されうる。

ＡＰＭＶの細胞毒性量は、細胞死の誘導に必要なウイルスの量である。理論的に言えば、１個のＡＰＭＶは１個の細胞に感染し、それを殺しうる。しかし、実際の状況においては、感染させるべき腫瘍細胞の数の数倍の量を投与するであろう。適量は、例えば、ＣｓａｔａｒｙＬＫ，ＥｃｋｈａｒｄｔＳ，ＢｕｋｏｓｚａＩら，：Ａｔｔｅｎｕａｔｅｄｖｅｔｅｒｉｎａｒｙｖｉｒｕｓｖａｃｃｉｎｅｆｏｒｔｈｅｔｒｅａｔｍｅｎｔｏｆｃａｎｃｅｒ．ＣａｎｃｅｒＤｅｔｅｃｔＰｒｅｖ１７（６）：６１９−２７，１９９３に記載されている。一般的に言うと、哺乳動物の非腫瘍細胞における感染の非常に軽度な挙動は比較的高い用量の投与を可能にする。１０^４〜１０^１２ｐｆｕの広範囲の用量が許容用量となろう。ほとんどの用途には、１０^５〜１０^９ｐｆｕの範囲の用量が好ましい用量となろう。前記で引用されている文献はこれに関する十分な指針を示している。

ニューカッスル病感染がベロゲニックまたはメソゲニックＮＤＶ株により引き起こされた場合、ほとんどの西洋諸国においては該疾患の届け出義務がある。したがって、ＮＤＶ株が抗腫瘍組成物において使用される場合、届け出を回避するためにレントゲニック株を選択するであろう。

全てのＡＰＭＶのうち、ニューカッスル病ウイルス（ＮＤＶ）が最もよく使用されるウイルスである。したがって、第１または第２ＡＰＭＶのいずれかとして、このウイルスの使用が多少は優先されうるであろう。したがって、本発明のより好ましい実施形態は、第１ＡＰＭＶがニューカッスル病ウイルスである、本発明の医薬組成物に関する。

第２ＡＰＭＶが組換えＡＰＭＶであり、そのＡＰＭＶの野生型遺伝子の代わりに別のＡＰＭＶのＨＮタンパク質（をコードする遺伝子）および所望によりＦタンパク質をも含有する場合、第１および第２ＡＰＭＶの両方のための好ましいＡＰＭＶバックボーンはＮＤＶである。

もう１つの魅力的なＡＰＭＶは第１または第２ＡＰＭＶのいずれかとしてのＡＰＭＶ３である。したがって、本発明のもう１つのより好ましい実施形態は、第１ＡＰＭＶ３である、本発明の医薬組成物に関する。

より一層好ましいのは、第１ＡＰＭＶがニューカッスル病ウイルスであり、第２ＡＰＭＶがＡＰＭＶ３（またはその逆）である、本発明の医薬組成物である。したがって、本発明のより一層好ましい実施形態は、第１ＡＰＭＶがニューカッスル病ウイルスであり、第２ＡＰＭＶがＡＰＭＶ３である、本発明の医薬組成物に関する。本発明のもう１つのそのようなより一層好ましい実施形態は、第１ＡＰＭＶがＡＰＭＶ３であり、第２ＡＰＭＶがニューカッスル病ウイルスである、本発明の医薬組成物に関する。

前記のとおり、細胞溶解性ＡＰＭＶは、それが非細胞溶解性ＡＰＭＶと比べて細胞をより迅速に殺すという点において、より迅速に作用する。したがって、好ましくは、該ＡＰＭＶの１以上は細胞溶解性ＡＰＭＶであるべきである。したがって、本発明のより一層好ましい実施形態は、少なくとも第１または第２ＡＰＭＶが細胞溶解性である、本発明の医薬組成物に関する。

この実施形態の最も好ましい形態は、第１ＡＰＭＶおよび第２ＡＰＭＶの両方が細胞溶解性である、本発明の医薬組成物に関する。

先進国においては特に、癌に罹患したネコおよびイヌに対する関心およびケアが益々増大しつつある。ヒトの場合と同様に、これらの動物において、寿命の増加は癌の発生率を増加させている。そして本発明の医薬組成物はネコおよびイヌにおいて非常に良く作用することが示されている。したがって、この実施形態のもう１つの形態は、ウマ、フェレット、ネコおよびイヌ種のような随伴動物における使用のための、本発明の医薬組成物に関する。好ましくは、そのような組成物は、ウマおよびイヌ種における使用、より好ましくは、イヌ種における使用のためのものであろう。

前記のとおり、該医薬組成物は、そのまま使用される場合、公知の抗癌アプローチと比較して有意な利点を有する。それでも、本発明の医薬組成物をいずれかの抗腫瘍剤と組合せる理由が尚も存在しうる。そのような抗腫瘍剤の詳細な一覧は例えば米国特許出願第ＵＳ２００９／０２０８４９５号に記載されている。したがって、該実施形態のもう１つの形態は、少なくとも第１または第２ＡＰＭＶの投与中に、ある量の抗腫瘍剤、例えば細胞毒性薬を共投与する、本発明の医薬組成物に関する。

第１および／または第２ＡＰＭＶは、例えばプロドラッグの変換のための酵素または結合性タンパク質をコードする異種遺伝子を更に含有する組換えＡＰＭＶでありうる。そのような結合性タンパク質は例えば抗体でありうるであろう。そのような遺伝子のもう１つの例は、ＷＯ２００６／０５０９８４に開示されているとおり、免疫グロブリンドメインを含有する融合タンパク質をコードする遺伝子でありうるであろう。

したがって、該実施形態のもう１つの形態は、少なくとも第１または第２ＡＰＭＶが、追加的遺伝子を含有する組換えＡＰＭＶである、本発明の医薬組成物に関する。

本発明の医薬組成物は、ＡＰＭＶの投与を可能にするために、原則として、医薬上許容される担体中にＡＰＭＶを含むべきである。該担体の性質は、とりわけ、投与経路に左右される。投与経路が吸入による場合には、担体は無菌水、生理塩溶液またはバッファーのような単純なものでありうるであろう。注射が好ましい経路である場合には、担体は、好ましくは、等張性であり、それを注射に適したものにするｐＨ制限を有するべきである。しかし、そのような担体は当技術分野で広範に知られている。本発明において有用な医薬上許容される担体の例には、安定剤、例えばＳＰＧＡ、炭水化物（例えば、ソルビトール、マンニトール、デンプン、スクロース、グルコース、デキストラン）、タンパク質、例えばアルブミンまたはカゼイン、タンパク質含有物質、例えばウシ血清または脱脂乳およびバッファー（例えば、リン酸バッファー）が含まれる。そのような安定剤を該ワクチンに添加する場合には特に、該ワクチンは凍結乾燥に非常に適している。凍結乾燥は、ＡＰＭＶの不活性化を防ぐための非常に適した方法である。したがって、より好ましい形態においては、本発明の医薬組成物は凍結乾燥形態である。

異種遺伝子を含有する組換えＡＰＭＶは、とりわけ、ＡＰＭＶを含む多数の非分節化マイナス鎖ＲＮＡウイルスに関して記載されている良く知られた逆遺伝学の技術により製造されうる。例えば、Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，Ｊ．Ｇｅｎ．Ｖｉｒｏｌ．７７：３８１−３８９（１９９６）、Ｃｏｎｚｅｌｍａｎｎ，Ａｎｎ．Ｒｅｖ．Ｇｅｎｅｔ．３２，１２３−１６２（１９９８）、Ｐａｌｅｓｅら，Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．９３：１１３５４−１１３５８（１９９６）、Ｐｅｅｔｅｒｓら，Ｊ．Ｖｉｒｏｌｏｇｙ７３：５００１−５００９（１９９９）、Ｒｏｍｅｒ−Ｏｂｅｒｄｏｒｆｅｒら，Ｊ．Ｇｅｎｖｉｒｏｌ．８０：２９８７−２９９５（１９９９）を参照されたい。

実施例１
イヌにおける種々のレントゲニックＡＰＭＶ株の安全性および複製
１．序論
１．１この実験の目的は、レントゲニックトリパラミクソウイルス（ＡＰＭＶ）ＮＤＶＣｌｏｎｅ（クローン）３０、ＮＤＶＵｌｓｔｅｒおよびＡＰＭＶ３がイヌにおいて安全であり複製されるかどうかを評価することであった。

２．材料および方法
２．１実験の概要
３群のビーグル犬（１群当たり２頭）に、表１「群分け及び投与」に示されているとおり、レントゲニック生ＮＤＶＣｌｏｎｅ３０、ＮＤＶＵｌｓｔｅｒまたはＡＰＭＶ３を経口、鼻腔内、眼内および皮下（ｓ．ｃ．）経路により接種した。３群に分けられた４頭（１−１−２）のイヌを接触対照（歩哨動物）として使用した。接種後の第３−６−９−１３および１５日の時点で、経口、眼内および直腸スワブを採取した。鼻腔内スワブは接種後の第３および６日においてのみ採取した。接種後８週間まで毎週、血液サンプルを採取した。第１接種後の第６週において、経口、鼻腔内、眼内および皮下経路によりＮＤＶＣｌｏｎｅ３０またはＡＰＭＶ３のいずれかでイヌに２回目の接種を行った（表１「群分け及び投与」を参照されたい）。第２接種後の第３日および６日に、経口、鼻腔内、眼内および直腸スワブを採取した。スワブはウイルスの再分離に使用されるように計画されている。第１および第２接種後の第３日および第６日に、膀胱から尿サンプルを採取した（必要に応じて利尿薬を使用した）。各接種後の１４日間に、埋め込みチップを使用して各イヌの体温を測定した。疾患の臨床徴候または他の異常の発生に関してイヌを毎日観察した。第１接種の８週間後、すなわち、第２接種の２週間後、イヌを安楽死させ、肉眼的に検査した。組織学的検査のためのサンプルを膵臓、脾臓、肝臓、腎臓、脳、心臓、気管、肺および深鼡径リンパ節から採取した。

使用した株：
生ＮＤＶＵｌｓｔｅｒ： −９．７ｌｏｇ１０ＥＩＤ_５０／ｍｌ
生ＮＤＶＣｌｏｎｅ３０： −９．５ｌｏｇ１０ＥＩＤ_５０／ｍｌ
生ＡＰＭＶ３： −８．７ｌｏｇ１０ＥＩＤ_５０／ｍｌ

２．３接種
表１に従い、Ｔ＝０において生ＡＰＭＶをイヌに接種した。第１接種の６週間後、表１に示されているとおりに動物に第２接種を行った。

２．４血液サンプル
血清学的検査のための血液サンプルを、第８週まで毎週、全動物から採取した。第１および第２接種後の血液サンプル（凝固体およびヘパリン添加体）を、第７日ではなく第６日に採取した。ＳＯＰ５６１９．０７４に従い、および接種前に、頸静脈から血液サンプル採取（１頭のイヌ当たり少なくとも４〜５ｍｌ）を行った。血液サンプル（凝固体）を使用して、ＨＩおよびＩＦＴ力価を決定した。

２．５ＨＩアッセイ
Ｔ＝４、Ｔ＝６およびＴ＝８週におけるＮＤＶ特異的抗体の血清レベルを赤血球凝集阻止（ＨＩ）アッセイにより決定した。血清の系列２倍希釈液をマイクロタイタープレート内で調製し、８赤血球凝集単位／５０μｌＮＤＶ抗原を含有する等体積と混合した。力価は、ニワトリ赤血球（緩衝食塩水中の１％（ｖ／ｖ））の赤血球凝集の完全阻止を示す最高希釈度の逆数として表されている。サンプルは、希釈度＞１：２において、赤血球凝集の阻止に関して陽性とみなされた。各接種イヌの血清を３つ全てのＡＰＭＶに対する交差反応性に関して試験した。

２．６ＩＦＴアッセイ
また、Ｔ＝４、Ｔ＝６およびＴ＝８週におけるＮＤＶ特異的抗体の血清レベルを免疫蛍光試験（ＩＦＴ）により試験した。マイクロタイタープレートを、ＲＰＭＩ１６４０＋標準抗生物質混合物＋５％ＦＣＳ中、３７℃／５％ＣＯ_２において、１００μｌ／ウェルの１．５×１０^６／ｍｌニワトリ胚繊維芽細胞（ＣＥＦ）で一晩「コート」した。２４時間後、該培地を、１００μｌ（１：１００）のＲＰＭＩ１６４０＋標準抗生物質混合物培地希釈ＡＰＭＶウイルス（ＮＤＶＣｌｏｎｅ３０、ＮＤＶＵｌｓｔｅｒまたはＡＰＭＶ３）と交換した。２４時間後、該プレートを空にし、該感染ＣＥＦを１００μｌ／ウェルの氷冷９６％エタノール（−７０℃）で３０分間固定した。イヌ血清の系列２倍希釈液をマイクロタイタープレート（幾つかのＮＤＶ陽性およびＮＤＶ陰性ニワトリ血清の隣）内で調製し、（洗浄された）コート化プレートに加え、３７℃で１時間インキュベートした。ついでプレートを洗浄（３×）し、１：２０希釈ＦＩＴＣ標識ヤギ抗イヌＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）またはヤギ抗ニワトリＩｇＧ（Ｈ＋Ｌ）ポリクローナル抗体と共にインキュベートした。３７℃で１時間の後、該プレートを洗浄（３×）し、２０μｌのＰＢＳ／グリセロール（１：１）を各ウェルに加えた。力価は、特異的蛍光シグナルを与える最高希釈度の逆数として表されている。＞１２の力価は１３（ｌｏｇ２）として表されている。各接種イヌの血清を３つ全てのＡＰＭＶに対する交差反応性に関して試験した。

スワブ
第１接種後のＴ＝３−６−９−１３および１５日において、経口、眼内および直腸スワブを採取した。鼻腔内スワブは第１および第２接種後の第３日および第６日にのみ採取した。第２接種後の第３日および第６日に、経口、鼻腔内、眼内および直腸スワブを採取した。スワブを２．５ｍｌのトリプトン２．５％中に集め、それに１０００Ｕ／１０００μｇ（１ｍｌ当たり）のＰｅｎ／Ｓｔｒｅｐを加えた（−７０℃で保存）。

尿
第１および第２接種後の第３日および第６日に、尿サンプルを膀胱から採取した（必要に応じて利尿薬を使用した）。

ウイルス再分離
１０日齢の孵化卵（Ｎ＝８）に０．１ｍｌの未希釈サンプル物質を接種することによりウイルスの再分離を行った。４〜６日間のインキュベーションの後、ＳｐａｅｒｍａｎおよびＫａｅｒｂｅｒ（Ｉｎ：Ｂ．ＢｉｂｒａｃｋおよびＧ．Ｗｈｉｔｔｍａｎｎ編，Ｖｉｒｏｌｏｇｉｓｃｈｅａｒｂｅｉｔｓｍｅｔｈｏｄｅｎ，ＦｉｓｈｅｒＶｅｒｌａｇ，Ｓｔｕｔｔｇａｒｔ（１９７４），ｐｐ．３７−３９）の方法に従い、全ての卵からの尿膜腔液をＨＡ活性に関して試験した。

２．１０体温
接種の当日および各接種後の１４日間、各イヌの体温を、埋め込みチップを使用して測定した。

２．１１観察
疾患の臨床徴候または他の異常の存在に関して動物を毎日観察した。

２．１２組織学的検査および病理学的検査
該実験の終了時、すなわち、第１接種の８週間後／第２接種の２週間後、全てのイヌを安楽死させ、肉眼的に検査した。組織学的検査のためのサンプルを膵臓、脾臓、肝臓、腎臓、脳、心臓、気管、肺および深鼡径リンパ節から採取した。

３．結果

３．１ＮＤＶＩＦおよびＨＩ抗体価
ＮＤＶＩＦ抗体価：第１接種の４週間後、該接種ＡＰＭＶに対する抗体がＧｒ１、Ｇｒ３およびＧｒ５において検出可能であった。このことは、これらのＡＰＭＶ株がイヌにおいて複製され、抗体を誘導したことを示している。該データから、ＮＤＶＵｌｓｔｅｒに対して産生された抗体がＮＤＶＣｌｏｎｅ３０と交差反応し、その逆も生じることも明らかである。これは、ＮＤＶＵｌｓｔｅｒともＮＤＶＣｌｏｎｅ３０とも交差反応しないＡＰＭＶ３特異的抗体には当てはまらない。第１接種の６週間後の抗体価はこの第４週のデータに匹敵する。興味深いことに、全ての群において第２接種の２週間後（Ｔ＝６週の時点でイヌに第２接種を行った）、抗体価の増加が検出可能であった。これは、生ウイルスでの第２接種が追加免疫（ブースター）効果を誘導して、該ウイルスの複製による抗体価の増加をもたらすことを示している。

ＮＤＶＨＩ抗体価：これらのデータから、生ウイルスでの第２接種は、高い抗体価をもたらす強力な追加免疫効果を誘導することが、より一層明らかである。Ｇｒ１およびＧｒ３においては特に、抗体価は、Ｔ＝４週と比べてＴ＝６週において低下すること、および第２接種の２週間後、抗体価は再び増加し、Ｔ＝４週と比べて高くなることが明らかである。また、これらのデータは、該ウイルスがイヌにおいて複製されることを示している。

３．２スワブおよび尿サンプル
第１接種後の第３日および第６日に集められた、全てのイヌからの経口、眼内および直腸スワブならびに尿サンプルを、ウイルスの再分離のために使用した。全てのサンプルは陰性と評価された。

３．３体温および観察
接種の当日および各接種後の１４日間に、埋め込みチップを使用して各イヌの体温を測定した。顕著な体温変化は認められなかった。該実験中、該イヌにおける疾患の臨床徴候または他の異常の存在に関する顕著な観察は得られなかった。

３．４組織学的検査および病理学的検査
実験の終了時に、全てのイヌを安楽死させ、肉眼的に検査した。該肉眼的観察は、Ｇｒ５からの１頭のイヌにおいて、脾臓における厚さ３ｍｍの大きな白斑が認められることを示した。これは顕微鏡的には巣状中等度急性被膜下血腫に相当する。イヌにおける脾臓血腫はほとんどは外傷に由来する。全ての他の動物は剖検で肉眼的病変を示さなかった。組織学的検査のためのサンプルは膵臓、脾臓、肝臓、腎臓、脳、心臓、気管、肺および深鼡径リンパ節から採取した。鼻腔内、眼内および経口経路によるイヌにおけるレントゲニックトリパラミクソウイルスの接種は、ＮＤＶＣｌｏｎｅ３０およびＮＤＶＵｌｓｔｅｒが接種されたイヌにおいて特に、肺における炎症病変を引き起こすと結論づけられた。ＡＰＭＶ３が接種された１頭のイヌにおいて、膵臓炎症病変および重度の出血が認められた。

結論：
１）ＮＤＶＣｌｏｎｅ３０、ＮＤＶＵｌｓｔｅｒおよびＡＰＭＶ３はイヌに対して感染性であり、イヌにおいて複製能を有する。

２）該イヌにおいて臨床徴候は見出されず、ウイルスは再分離できなかった。これは、イヌにおけるそのようなウイルスの使用が安全であることを示している。

３）ＮＤＶ株とＡＰＭＶ３株との間に交差免疫は存在しない。

実施例２
ヒト腫瘍細胞系上でのＡＰＭＶ３の増殖
細胞培養に使用した細胞：
ヒト結腸癌細胞系ＣＬ１８８．
使用した培地：
ＣＬ１８８：
ＲＰＭＩ１６４０＋１０％ＦＢＳ＋１×標準抗生物質混合物＋Ｌ−グルタミン＋２μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（増殖培地）。

ＲＰＭＩ１６４０＋２％ＦＢＳ＋１×標準抗生物質混合物＋２μｇ／ｍｌアンホテリシンＢ（維持培地）。

ウイルス株：
トリパラミクソウイルス３型。

９．７ｌｏｇ１０ＥＩＤ_５０／ｍｌ。

卵源：
Ｌ１１１０３１０日齢孵化卵。

Ｌ１１２０３１１日齢孵化卵。

力価測定およびＨＡ試験：
・トリプトース２．５％。

・Ｐｅｎ−Ｓｔｒｅｐ。

・５％ニワトリ赤血球。

・０．１ＭＰＢＳ。

ＡＰＭＶ３での細胞の接種
１個のフラスコの各細胞系／培地を継代の３日後に集めた。

該細胞を計数して、０．１のＭＯＩでのウイルス接種（ＣＬ１８８）のための希釈度を決定した。

希釈は、適当な培地中で行った。

該細胞の接種は以下のとおりに行った。付着細胞の培地（ＣＬ１８８）を取り出した。次に１ｍｌのウイルスを該細胞に加えた。該細胞を３７℃で１時間インキュベートし、ついで４ｍｌの新鮮培地を該細胞＋ウイルスに加えた。細胞を３７℃で更に４日間インキュベートした。接種後、残りの希釈ウイルスを−２０℃で保存した。４日後、該培養フラスコを−２０℃で３回、凍結−融解した。最後の融解の後、該細胞を１５ｍｌのチューブに移し、２００×Ｇで５分間遠心させた。上清を集め、−７０℃の低温チューブ内で保存した。

卵上の力価測定によるウイルス増殖の決定：
２％ＦＢＳの存在下のＣＬ１８８細胞上で増殖させたウイルスからの回収物および接種物に関して力価測定を行った。サンプルを１０^−７の希釈度までトリプトース中で１０倍希釈した。１０個の１０日齢孵化卵に０．２ｍｌの希釈サンプル（希釈度１０^−２／１０^−７）を注入した。卵を３７℃で４日間インキュベートした。ＨＡ試験により力価を決定した。

２％ＦＢＳの存在下のＣＬ１８８細胞上で増殖させたウイルスからの回収物および接種物に関して力価測定を繰返した。サンプルを１０^−４（ＣＬ１８８接種物）または１０^−５（ＣＬ１８８回収物）の希釈度までトリプトース中で１０倍希釈した。１１日齢孵化卵に０．２ｍｌの希釈サンプル（ＣＬ１８８接種物は希釈度１０^−２／１０^−４またはＣＬ１８８回収物は希釈度１０^−２／１０^−５）を注入した。卵を３７℃で３日間インキュベートした。ＨＡ試験により力価（ｌｏｇ１０）を決定した。

結果
４日間のインキュベーションの後、ＡＰＭＶ３ウイルスに感染したＣＬ１８８細胞上で明らかなＣＰＥ（死細胞）が視認可能であった。

結論：
ＡＰＭＶ３ウイルスは、視認可能なＣＰＥを伴ってヒト結腸癌細胞系ＣＬ１８８上で良く増殖することが示された。

Claims

哺乳動物における腫瘍の治療に使用するための、トリパラミクソウイルス（ＡＰＭＶ）を含む医薬組成物であって、該治療が、第１ＡＰＭＶの細胞毒性量を該哺乳動物に投与する工程、ついで、第１ＡＰＭＶの投与から２〜５６週間以内に第２ＡＰＭＶの細胞毒性量を該哺乳動物に投与する工程を含み、ここで、第１ＡＰＭＶがニューカッスル病ウイルスであり、且つ、第２ＡＰＭＶがＡＰＭＶ３であるか、又は、第１ＡＰＭＶがＡＰＭＶ３であり、且つ、第２ＡＰＭＶがニューカッスル病ウイルスである、医薬組成物。
少なくとも第１または第２ＡＰＭＶが細胞溶解性である、請求項１に記載の医薬組成物。
第１および第２ＡＰＭＶが共に細胞溶解性である、請求項２に記載の医薬組成物。
該哺乳動物がウマ、イヌまたはネコ種の哺乳動物である、請求項１〜３のいずれか１項に記載の医薬組成物。
少なくとも第１または第２ＡＰＭＶの投与中に、ある量の抗腫瘍剤を共投与する、請求項１〜４のいずれか１項に記載の医薬組成物。
少なくとも第１または第２ＡＰＭＶが、追加的遺伝子を含有する組換えＡＰＭＶである、請求項１〜５のいずれか１項に記載の医薬組成物。