JP5601750B2 - 糖尿病患者の内皮機能異常の治療 - Google Patents

Description

本発明は糖尿病患者の内皮機能不全の治療方法に関する。特に、本発明は糖尿病患者の内皮機能不全（大血管及び微小血管の両方の）に関連する障害の治療における内皮機能の改善方法に関する。

慢性疾患真性糖尿病（糖尿病）では、生体がホルモンインスリンを適切に生成し、又はそれに応答する能力を失い、その結果、末梢組織の細胞が使用又は貯蔵のためにグルコースを血液から活発に吸収することができない。糖尿病の個体では、末梢血中のグルコースのレベルが上昇されるようになることがあり（高血糖）、或る形態の介入（例えば、外因のインスリンの投与）が血液中のグルコースを正常なレベルに戻すのに使用されない限り、典型的にはこうして留まる。チェックされないと、糖尿病個体の高血糖がショック、臓器変性又は不全（例えば、腎不全、失明、神経病、心血管疾患）、組織壊死（例えば、足切断を必要とする）、そして更には死をもたらし得る。
糖尿病の二つの主要な形態は型１糖尿病及び型２糖尿病である。型１糖尿病（これはインスリン依存性真性糖尿病(IDDM)又は若年発症糖尿病として既に知られていた）は、生体が膵臓のインスリン生成β細胞（膵島細胞）を破壊して正常なグルコースレベルを維持するのに外因のインスリンの毎日の投与についての絶対要求をもたらす自己免疫疾患である。型１糖尿病は幼児及び若い成人で通常診断されるが、あらゆる年齢で生じ得る。型１糖尿病は診断された糖尿病の症例の5-10％に相当する。
糖尿病のはるかに流行している形態は型２糖尿病であり、これは非インスリン依存性真性糖尿病(NIDDM)として既に知られていた。型２糖尿病はまた成人発症糖尿病として既に知られていたが、この形態の糖尿病は超過体重及び臨床上肥満の幼児及び若い成人の増大する集団でますます流行しつつある。型２糖尿病は全ての診断された糖尿病の症例の約90-95％に相当する。型２糖尿病は典型的にはインスリン耐性、即ち、生体の細胞がインスリンに適当に応答しない障害で始まり、続いてインスリンを生成し、分泌する膵臓の部分を次第に失う。型２糖尿病は老齢、肥満、糖尿病の家族履歴、妊娠糖尿病の履歴、損なわれたグルコース代謝、肉体の不活動、及び種々の人種又は民族を含む種々の因子と関連している。型２糖尿病の個体は慎重なダイエット、運動及び体重減、並びに付加的な薬物でそれらの血液グルコースレベルを調節するように試みる必要がある。

糖尿病、特に型２真性糖尿病(DM2)における前じゅく腫形成状態に寄与する主要な因子として、脂質代謝異常、高血糖、高血圧、内臓肥満及びインスリン耐性が挙げられる(1,2)。観察研究は、低密度リポタンパク質(LDL)だけでなく、高密度リポタンパク質(HDL)vs心血管イベントの間の相関関係が絶食血漿グルコースのそれを超えているという事実により示された、糖尿病におけるじゅく腫形成に寄与する糖尿病性脂質代謝異常の重要性を明らかに実証していた(3)。スタチン介入研究はDM2における心血管イベントの減少についてのスタチン治療の明らかな利益を明らかにしていた(4,5)。しかしながら、この印象的な達成にもかかわらず、DM2患者の大半がスタチンを使用する場合でさえも依然として心血管イベントを患うであろう(6)。
過去20年中に、内皮機能不全がじゅく腫形成の最も早期の段階の一つとして出現していた。内皮機能不全（これは全ての糖尿病患者（即ち、型１及び２の両方）の特徴である）が将来の心血管イベントについての予測値を有すると示されていた(7-9)。糖尿病誘発血管疾患の多要因の病因(10,11)と合致して、多くの治療介入がDM2患者の内皮機能を改善するそれらの潜在性について評価されていた(9,12)。驚くことに、内皮機能は脂質代謝異常患者でスタチン治療により充分に回復し得たが(13)、幾つかの研究は集中スタチン治療でさえもがDM2の血管機能不全を正常化し得ないことを実証していた(14,15)。後者はこのハイリスクのグループにおける付加的な治療方法についての可能性を強調している。

高密度リポタンパク質(HDL)は殆ど球形の血漿リポタンパク質の広いグループに相当し、これらはそれらのサイズ、アポリポタンパク質(apo)及び脂質組成にかなりの多様性を示す。HDL粒子は1.063-1.21g/mlの密度範囲に入り(16)、それらはその他のリポタンパク質よりも小さいので、HDLは一層容易に内皮細胞間に侵入でき、比較的高い濃度が組織液体中に蓄積することを可能にする(17)。殆ど全ての血漿HDLの主要アポリポタンパク質はapo A-Iであり、これはリン脂質及びコレステロールと会合して、コレステリルエステルのコアーを密閉する(16)。肝臓及び腸により分泌された発生期（即ち、新たに合成された）HDLはコレステリルエステルを含まず、形状が円板状である(16)。冠動脈疾患との血漿HDL濃度の負の関連が疫学的研究で良く実証されていた(18)。動物における実験はHDLの坑じゅく腫形成活性を実証していたが(19)、この保護効果が逆のコレステロール輸送におけるリポタンパク質の役割又は異なるメカニズムに関連しているか否かは未だ知られていない。HDLがこれらの心臓保護作用を与える一つ以上のメカニズムは明らかに理解されていないが、末梢組織から肝臓へのコレステロールの逆の輸送におけるHDLの役割、低密度リポタンパク質の酸化の抑制、又はプロスタサイクリンの生成の変化により媒介される血管拡張及び血小板活性化の変調を含み得る(20)。HDLはまたスカベンジャー受容体-B1(SR-B1)とのその相互作用に続いて内皮の亜酸化窒素(NO)シンターゼを活性化し得る。
HDLのNO促進効果について出現しているデータに鑑みて、HDL増大能を有する化合物が特に重要である(21-24)。実際に、DM2患者では、HDLが内皮依存性血管運動応答と著しく関連している(8)。本発明に導く研究において、本発明者らは外因の再生HDL(rHDL)の注入後のHDL増大が血管機能の改善に変わるか否か及びどの程度かについて評価した。apoA-Iレベル及び内皮機能がDM2及びマッチする対照においてrHDLの注入後に急に（注入後４時間）だけでなく、７日後の両方で評価された。
この明細書に言及される刊行物の文献詳細が明細書の最後に記載される。明細書における従来技術書類への言及はなく、書類が普通の一般知識の一部を形成するという認識又は示唆のいずれかの形態と解されるべきではない。

この明細書及び特許請求の範囲中、文脈が特に必要としない限り、“含む”という用語、及び／又はその変化は、記述された整数もしくは工程又は整数もしくは工程のグループの包含を示すが、あらゆるその他の整数もしくは工程又は整数もしくは工程のグループの排除を示さないと理解されるであろう。
一局面において、本発明は患者への有効量の高密度リポタンパク質(HDL)の投与（好ましくは非経口投与）を含むことを特徴とする、糖尿病患者の内皮機能不全の治療方法を提供する。
別の局面において、本発明は糖尿病患者の内皮機能不全の治療のための患者への投与（好ましくは非経口投与）のための薬物の製造における高密度リポタンパク質(HDL)の使用を提供する。
更に別の局面において、本発明は高密度リポタンパク質(HDL)を含むことを特徴とする、糖尿病患者の内皮機能不全の治療における投与（好ましくは非経口投与）のための薬剤を提供する。

糖尿病、特に型２真性糖尿病(DM2)の患者は、心血管リスクの著しい増大を特徴とする。DM2の特徴である、全身の内皮機能不全は、心血管イベントの将来のリスクを予測する。HDLとNO経路の間の関係に鑑みて、本発明者らはDM2における内皮機能についてのrHDL注入の効果を評価した。詳しくは、７人のDM2患者及び７人の正常脂質代謝対照で、静脈閉塞プレスチモグラフ法を使用して内皮機能が評価された。夫々、内皮依存性及び非依存性の血管拡張薬セロトニン(5HT)及びナトリウムニトロプルシド、並びに亜酸化窒素シンターゼのインヒビターNG-モノメチル-1-アルギニン(L-NMMA)の動脈内注入への前腕血流(FBF)応答がrHDLの注入（タンパク質に基づいて80mg/kg）の前、４時間後及び１週後の両方で測定された。

基準線で、HDLはDM2 vs対照で同様であった（1.1±0.2 vs 1.2±0.3ミリモル/L、ns）。5HT誘発血管拡張（最大17±10％）及びL-NMMA誘発血管収縮（最大-17±15％）がDM2 vs対照で減少された（5-HT 114±22及びL-NMMA 48±５％、両方ともp<0.05）。rHDL注入は夫々DM2及び対照でapoA-Iレベルを上昇し（1.2±0.2から2.8±0.4へvs1.2±0.2から2.7±0.4g/Lへ、p<0.01）、DM2における5HT（86±22％、p<0.05）及びL-NMMA（-45±9％、p<0.01）に対するFBF応答を回復した。この効果は注入後７日間持続した（基準線と較べて5HT；80±25％、p<0.05及びL-NMMA 37±7％、p<0.01）。rHDL注入は対照では効果を有しなかった。それ故、この研究は急なHDL増大がDM2で内皮機能を改善すること及びその改善がHDL濃度の基準線への戻りにもかかわらず少なくとも７日間持続することを実証する。
一局面において、本発明は患者への有効量の高密度リポタンパク質(HDL)の投与を含むことを特徴とする、糖尿病患者の内皮機能不全の治療方法を提供する。
投与は非経口投与であることが好ましい。
“治療”についての本明細書中の言及はその最も広い状況で考えられるべきである。“治療”という用語は対象が完全回復まで治療されることを必ずしも示さない。それ故、治療は特別な症状又は障害の症候の回復だけでなく、特別な症状又は障害の重度の軽減、又はその排除を含む。
本明細書に使用される“内皮機能不全の治療”への言及は内皮機能不全に関連する障害の治療における内皮機能の改善への言及と考えられるべきである。このような障害として、大血管障害（大血管に関する）、例えば、一時性虚血発作、卒中、アンギーナ、心筋梗塞、心不全、及び末梢血管疾患だけでなく、微小血管障害（小血管に関する）、例えば、糖尿病性網膜症（非増殖性、増殖性、黄斑の浮腫）、ミクロアルブミン尿症、マクロアルブミン尿症、末期腎疾患、勃起機能不全、自律神経障害、末梢神経障害、骨髄炎及び下肢虚血の両方が挙げられる。

“糖尿病”患者への本明細書中の言及は型１糖尿病(DM1)又は型２糖尿病(DM2)を患っている患者への言及と理解されるべきである。
本発明に従って、HDLが糖尿病患者に投与される。本明細書に使用される“HDL”という用語は高密度リポタンパク質の全ての形態に関するものであり、成熟HDL、発生期HDLもしくは再生HDL(rHDL)又はこれらのあらゆる混合物だけでなく、組換えアポリポタンパク質から生成されたrHDL或いは発生期もしくは再生HDLに機能性関係を有するこれらの類似体を含む。このような類似体として、アポリポタンパク質(Apo)構造から誘導された機能性ペプチド、例えば、国際特許公開番号WO 99/16459及びWO 99/16408（これらの内容が参考として本明細書に含まれる）に記載されたものが挙げられる。
高密度リポタンパク質はタンパク質成分、及び脂質を含む。タンパク質はアポリポタンパク質、例えば、ヒトアポリポタンパク質、例えば、アポリポタンパク質A-I(apoA-I)、アポリポタンパク質A-II(apoA-II)もしくはアポリポタンパク質A-IV(apoA-IV)又は組換えアポリポタンパク質、或いは同様の性質を有する機能的に相同のペプチドであることが好ましい。好適な脂質は必要によりその他の脂質（コレステロール、コレステロールエステル、トリグリセリド、スフィンゴ脂質、又はその他の脂質）と混合されてもよいリン脂質、好ましくはホスファチジルコリンである。脂質は合成脂質、天然産脂質又はこれらの組み合わせであってもよい。
HDLは再生HDLであることが好ましい。
再生HDLの生成は、例えば、米国特許第5652339号並びにMatz及びJonas(25)並びにLerchら(26)に記載されている。組換えアポリポタンパク質によるrHDLの生成は、例えば、欧州特許EP 469017（酵母中）、米国特許第6559284号（E. coli中）、並びに国際特許公開番号WO 87/02062（E. coli、酵母及びCho細胞中）及びWO 88/03166（E. coli中）に記載されている。これらの書類の夫々の内容が参考として本明細書に含まれる。

HDLは有効量で投与される。“有効量”は所望の応答に少なくとも一部達し、又は発症を遅延し、もしくは進行を抑制し、或いは治療される特別な症状もしくは障害の発生もしくは進行を一緒に停止するのに必要な量を意味する。その量は治療すべき個体の健康及び肉体状態、治療すべき個体の人種的背景、所望される保護の程度、組成物の製剤化、医療状況の評価、及びその他の関係のある因子に応じて変化する。その量はルーチン試験により決められる比較的広い範囲に入ると予想される。
好ましいHDL用量範囲は治療当り体重1kg当りHDL 0.1-200mg、更に好ましくは10-80mg（アポリポタンパク質を基準とする重量）である。例えば、投与されるHDLの用量は臨床上必要な時間の期間、例えば、数分から数時間まで、例えば、24時間までの範囲の期間にわたって静脈内注射及び／又は注入として与えられる体重1kg当りHDL約0.2-100mg（アポリポタンパク質を基準とする重量）であってもよい。必要により、HDL投与は１回又は数回繰り返されてもよい。投与される実際の量は治療されている症状又は障害の性質及びHDLが投与されている速度の両方により決められるであろう。
患者はヒトであることが好ましいが、本発明は霊長類、家畜動物（例えば、ヒツジ、ブタ、ウシ、ウマ、ロバ）、実験試験動物（例えば、マウス、ウサギ、ラット、モルモット）、コンパニオン動物（例えば、イヌ、ネコ）及び捕らえられた野生動物を含むその他の哺乳類患者の治療及び／又は予防に及ぶ。
本発明に従って、HDLは投与の非経口経路により患者に投与されることが好ましい。非経口投与として、消化管（即ち、腸ではない）によらない投与のあらゆる経路（注射、注入等による投与を含む）が挙げられる。注射による投与として、例えば、静脈（静脈内）、動脈（動脈内）、筋肉（筋肉内）への投与及び皮膚の下（皮下）の投与が挙げられる。HDLはまた所望の薬理学的効果を得るのに充分である用量の、例えば、皮下、皮膚内又は筋肉内のデポー剤又は除放性製剤中で投与されてもよい。

非経口投与に適した組成物はレシピエントの血液と等張であることが好ましい活性成分の無菌の水性製剤を都合良く含む。この水性製剤は好適な分散剤又は湿潤剤及び懸濁剤を使用して既知の方法に従って製剤化し得る。無菌の注射可能な製剤はまた例えば、ポリエチレングリコール及び乳酸中の溶液のような無毒性の非経口上許される希釈剤又は溶媒中の無菌の注射可能な溶液又は懸濁液であってもよい。使用し得る許されるビヒクル及び溶媒の中に、水、リンゲル溶液、好適な炭水化物（例えば、蔗糖、マルトース、トレハロース、グルコース）及び等張塩化ナトリウム溶液がある。加えて、無菌の、固定油が溶媒又は懸濁媒体として都合良く使用される。この目的のために、あらゆるブランドの固定油（合成のモノグリセリド又はジグリセリドを含む）が使用されてもよい。加えて、オレイン酸の如き脂肪酸が注射液の調製に用途がある。
このような治療組成物の製剤化は当業者に公知である。好適な医薬上許される担体及び／又は希釈剤として、あらゆる通常の溶媒、分散媒体、充填剤、固体担体、水溶液、被覆物、抗菌剤及び坑真菌剤、等張剤及び吸収遅延剤等が挙げられる。医薬活性物質のためのこのような媒体及び薬剤の使用は当業界で公知であり、それは、例えば、Remington's Pharmaceutical Sciences, 第18編, Mack Publishing Company, Pennsylvania, USAに記載されている。いずれかの通常の媒体又は薬剤が活性成分と不適合である場合を除いて、本発明の医薬組成物中のこれらの使用が意図されている。補充の活性成分がまた組成物に混入し得る。
その他の送出系は除放性送出系を含み得る。好ましい除放性送出系は除放性ペレット又はカプセル中の本発明の活性成分の放出を与え得るものである。多くの型の除放性送出系が利用できる。これらとして、(a)活性成分がマトリックス内に含まれる侵食系、及び(b)活性成分がポリマー中に制御された速度で侵入する拡散系が挙げられるが、これらに限定されない。
本発明はまた糖尿病患者の内皮機能不全の治療のための患者への投与（好ましくは、非経口投与）のための薬物の製造における高密度リポタンパク質(HDL)の使用を提供する。
更に別の局面において、本発明は高密度リポタンパク質(HDL)を含むことを特徴とする、糖尿病患者の内皮機能不全の治療における投与（好ましくは、非経口投与）のための薬剤を提供する。
本発明が下記の非限定実施例により更に説明される。

I. 方法
非合併DM2の７人の非喫煙患者（４人の男性及び３人の女性）及び７人の非喫煙の年齢及び性別にマッチした正常脂質代謝の対照対象（４人の男性及び３人の女性）を登録した。DM2の患者についての算入基準は以下のとおりであった：(1)絶食血漿グルコース>7.0ミリモル/L、(2)ダイエット及びメトフォルミンによる治療下、(3)外因性インスリンを使用していない、(4)夫々、2.0ミリモル/l以下及び3.5ミリモル/l以下の血漿トリグリセリドレベル及びLDLコレステロールレベルを有する軽度の脂質代謝異常。大血管疾患（ECG異常と定義される）の存在、異常な足首関節-上腕血圧指数又は心臓イベント、末梢血管の脳のイベントの履歴及び自律神経障害が患者又は対照対象についての除外基準であった。全ての女性患者が閉経後であり、ホルモン置換治療を受けていなかった。糖尿病のメジアン期間は5.2±1.2〔平均±SD〕年であった。評価を血管活性薬物、例えば、ACEインヒビター、アンギオテンシン受容体ブロッカー、カルシウムチャンネルブロッカー、アスピリン、NSAID、及びビタミン補給の停止の少なくとも４週後に行なった。患者のいずれもがスタチン治療を使用しなかった。アルコール、カフェイン及びメトフォルミンを研究前の12時間以内に制止した。全ての対象が記載された情報同意を与え、許可をオランダ、アムステルダムにあるアムステルダム大学の、アカデミック・メディカル・センター(AMC)の内部レビュー・ボードから得た。その研究をヘルシンキの宣誓の原則に従って行なった。

研究プロトコル
血管機能を既に公表された（EC-4；Hokanson Inc, Bellevue, USA）(27)ような静脈閉塞歪ゲージプレチスモグラフ法を使用して基準線で、またrHDL注入後に評価した。測定を一定温度（22℃〜24℃）の静かな部屋中で午前08:00に開始して行なった。対象は研究中に背位に留まった。非支配腕の上腕動脈に20ゲージの、可撓性ポリウレタンカテーテル（Arrow Inc, Reading, USA）をカニューレ挿入した。挿入に続いて30分間隔で食塩水注入して基準線条件の再確立を可能にした。その後に、前腕血流(FBF)（前腕組織容積(FAV)100mL当りの毎分のミリリットル数として表される）を両腕で同時に測定した。オンラインモニタリングのためのマイクロコンピュータをベースとするR-ウェーブ・トリガード・システムを使用した。夫々の測定中に、両方の上腕のまわりの血圧カフを迅速カフ膨張器の使用により膨張した（40mm Hg）。同時に、両側リストカフを収縮期血圧以上に膨張して手循環を排除した（200mm Hg）。動脈内血圧及び心拍数を連続的に監視した。次に、内皮依存性血管拡張薬セロトニン（5HT、シグマ；0.6、1.8、及び6ng・100mL FAV^-1・分^-1）、内皮非依存性血管拡張薬ナトリウムニトロプルシド（SNP、スプルイト・ハイレン；６、60、180、及び600ng・100mL FAV^-1・分^-1）、及び内皮NOシンターゼ（eNOS）の競合的インヒビターN^G-モノメチル-L-アルギニン（L-NMMA、コルディア；50、100、200、及び400μg・100mL FAV^-1・分^-1）の累積的用量に対する応答を測定した。セロトニン及びナトリウムニトロプルシドの注入ブロックをランダム化順序で投与し、続いてL-NMMAを注入した。全ての注入液を良い製造実施(GMP)指針に従ってAMCの薬局で調製した。薬剤を一定速度の注入ポンプで夫々の用量で夫々６分、４分、及び８分にわたって動脈内投与した。夫々の注入ブロックの最後の２分中の６回の測定を平均して平均FBFを測定した。３つの異なる注入ブロックが15分の静止期間後に、又はFBFが基準線に戻るまで進行した。続いて、静脈カテーテルを４時間の期間にわたって体重1kg当り80mgの用量でrHDLの投与のために対側腕に挿入した（CSL Behring, Bern, Switzerland）（26、27）。その後に、注入ブロックを繰り返した。次いで患者に彼らの薬物（メトフォルミン以外）を再開しないように依頼し、患者がrHDL注入の７日後に内皮機能測定を繰り返すために戻る必要があった。

実験評価
血液サンプルを12時間の終夜後に早く、rHDL注入後に直ちに、その４時間後に、及び７日後に対象から抜き取った。収集後の１時間以内の遠心分離後に、アリコートを液体窒素中でスナップ凍結し、アッセイを行なうまで-80℃で貯蔵した。全ての測定をアムステルダムの大学病院のアカデミック・メディカル・センターの血管及び臨床研究室で行なった。ALAT及びASATをピリドキサルホスフェート活性化アッセイ（ロシェ・ダイアグノスチックス、バーゼル、スイス）により測定した。HbA1cをバリアントII（バイオ-ラド・ラボラトリィズ）によるHPLC（試薬バイオ-ラド・ラボラトリィズB.V.、オランダ）により測定した。ヘキソキナーゼ方法（日立917によるグルコ-クアント；日立）を使用して血漿グルコースを２回反復で評価した。血漿トリグリセリドレベル、全コレステロールレベル、LDLレベル及びHDLレベルを通常の酵素方法（ロシェ・ダイアグノスチックス、バーゼル、スイス）により測定した。apoA-I及びapoBの血漿レベルを速度ネフェロメトリーにより貯蔵血漿について評価した。
統計分析
プレスチモグラフデータを含む、臨床パラメーターの全ての結果を、平均±SDとして表す。２グループ間の記述統計を２テールド独立スチューデントｔ検定により比較した。FBFを夫々の注入工程の最後の２分中の６連続記録にわたって平均した。リスト-カフ膨張後の最初の30秒でつくったFBF記録を分析に使用しなかった。２グループ間の個々の対象についてのFBF測定、HDL品質及び炎症マーカーの統計分析を反復測定について２方向ANOVAにより行なった。P<0.05の可能性値を有意と考え、P<0.01の値を高度に有意と考えた。

II 結果
対象特性を表１にリストする。基準線FBFは患者と対照対象の間に有意差がなかった（表１）。予想されたように、絶食血漿グルコース（P<0.01）、ヘモグロビンA_1c（P<0.01）、トリグリセリド（P<0.01）及びapoB（P,0.05）の血漿レベルはDM2患者で高かった。HDL-Cレベル及びapoA-IレベルはDM2患者と対照の間で匹敵した。rHDL注入後に、血漿apoA-Iは４時間後にDM2及び対照で増加し（夫々、1.2±0.2→2.8±0.4vs1.2±0.2→2.7±0.4g/L、p<0.01）、一方、わずかな増加が注入７日後にDM2患者で留まった（1.5±0.3g/L、基準線と較べてp<0.05）。血漿apoBレベルは対照と較べてDM2で高く、rHDL注入により影響されなかった（夫々、1.0±0.3→0.9±0.3vs0.7±0.2→0.2g/L、ns）。
NO生体利用能に関するrHDLの急な効果及び長期効果
内皮依存性血管拡張薬セロトニンの動脈内注入は両方のグループで用量依存様式でFBFを増加した。基準線では、セロトニンに対するFBF応答が対照に較べてDM2で減少された（p<0.001、図１）。rHDL注入後に、セロトニンに対するFBF応答が有意に増大したが、対照に匹敵するレベルに達しなかった（p<0.01、図１）。重要なことに、内皮依存性血管拡張の改善がrHDL注入後に７日間持続した（p<0.01、図１）。rHDL注入は対照でセロトニン応答に影響しなかった（図１）。
基準線では、L-NMMAに対する血管収縮応答（基礎NO活性を反映する）は、対照と較べてDM2患者で鈍化された（p<0.001、図２）。rHDL注入後に、L-NMMA収縮応答は改善され、注入７日後に再度依然として存在した（p<0.01、図２）。セロトニンデータと合致して、rHDL注入は対照対象でL-NMMA応答に効果を有しなかった（図２）。
最後に、SNPに応答する内皮非依存性血管化拡張は対照に対してDM2で低く（p<0.01、図３）、rHDL注入は患者及び対照の両方でSNP血管拡張応答に効果を示さなかった。

III 解説
本研究は基礎NO活性及び刺激NO活性の両方が年齢及び性別にマッチした対照と較べてDM2患者でひどく悪化されることを示す。重要なことに、DM2患者におけるほぼ正常なHDLレベルにもかかわらず、rHDLの注入は内皮機能を有意に改善した。この改善はrHDL注入後の７日まで持続し、その時点でHDLレベルが既に基準線値に戻った。これらのデータは、たとえHDL-Cレベルがこれらの患者で明らかに減少されないとしても、HDL増加戦略がDM2で治療利益を与え得ることを示す。
基準線における血管機能
先の研究（８、９、12）と合致して、受容体媒介刺激後のDM2における損なわれた基礎NO活性だけでなく、減少されたNO放出の両方の存在が確認される。幾つかのメカニズムが糖尿病で内皮機能不全に寄与すると示されていた。必須コファクターテトラヒドロビオプテリン(BH4)の減少された生物利用能はNOに代えてeNOSによる酸素ラジカルの直接生成をもたらす内皮NOシンターゼの脱共役と関連する(28-30)。その他の源がまたNADPH-オキシダーゼだけでなく、ミトコンドリア脱共役を含む、増大されたラジカル生成に寄与し得る(10)。糖尿病性血管機能不全におけるROSの重要な役割が、高濃度の酸化防止剤の動脈内注入後の内皮機能の充分な回復を報告する、介入研究により強調されていた（９、12）。

血管機能に関するrHDL注入の効果
rHDLの注入は注入後の数時間以内の、基礎NO活性だけでなく、受容体刺激NO活性の両方の迅速な改善と関連していた。最初の説明はrHDLがNO生成を増大することであろう。亜酸化窒素(NO)はL-アルギニンからL-シトルリンへの変換によりeNOSにより合成される。その活性はeNOSのリン酸化を変化するキナーゼの活性化、即ち、MAPキナーゼ及びakt-キナーゼシグナリング、又は細胞内Ca²⁺含量の増大、続いてeNOSのカルシウム-カルモジュリン依存性活性化を含む複雑なシグナル伝達経路により調節される(33)。Yuhannaは内皮スカベンジャー受容体B-1へのapoA-Iの結合が、おそらくakt及びMAP-キナーゼ活性化(32)のために、大動脈中の増進された内皮依存性弛緩応答により伴われることを示した(24)。加えて、HDLはまたeNOSタンパク質安定性を保存することによるだけでなく、細胞膜から細胞内オルガネラへのeNOSトランスロケーションを阻止することにより内皮細胞内のeNOSの膜含量をアップレギュレートする能力を有する(23)。全てのこれらの効果が、rHDL注入後に、競合NOインヒビターL-NMMAに対する増大された血管収縮応答として評価された、基礎NO利用能の増大に寄与していたかもしれない。対照的に、前記メカニズムはセロトニン依存性の、受容体刺激NO利用能（これはeNOSのカルシウム-カルモジュリン活性化に依存する）の増大を充分に説明することができない(31)。内皮5HT-_2A受容体(33)へのセロトニン結合はおそらくrHDL注入後に変化しそうにないので、酸素ラジカルによるNOの減少された分解が増大されたNO生物利用能に寄与し得る第二の主要な経路を与える。実際に、HDLは、少しもHDL粒子上のパラオキソナーゼ及び血小板活性化因子ヒドロラーゼの如き酵素の存在のためでなく、強力な酸化防止特性を有する(23)。
血管機能に関するrHDLの長期効果
顕著には、内皮依存性血管拡張はrHDL注入１週間後に依然として有意に改善された。対照的に、apoAIレベルだけでなく、HDLレベルの両方が注入前のレベルに殆ど戻った。注目すべきは、基準線でDM2のHDLレベルがまた対照対象中のものと有意に異ならなかった。対照的に、rHDL注入は対照で血管機能にどんな効果も有しなかった。これらのデータは、通常のHDL濃度にもかかわらず、HDL品質がDM2中で損なわれるかもしれないことを示す。実際に、DM2中のHDL保護効果の損失はHDL中の主としてロイシン鎖の非酵素グリケーションに一部起因していた。apoAI-HDLのグリケーションは、中でもPON-1活性の損失により、LDLを酸化損傷から保護するHDLの能力を悪化する(34)。加えて、グリケーションされたHDLは内皮内のeNOS発現を減少し、損なわれたNO生成能をもたらす(35)。実際に、DM2患者におけるHDLの酸化防止活性レベルは酸化ストレスレベル及び糖血調節に緊密に関連している(36)。

研究制限
rHDLの効果は対照グループで注入４時間後に見られなかったので、血管機能研究は対照グループで７日後に繰り返されなかった。従って、DM2患者における７日目の血管機能データを対照における基準線及び１日目の観察と比較した。しかしながら、血管機能に関する主要な結論は基準線でDM2患者と較べた持続改善に関するので、対照における７日目の研究の欠如は本研究で導かれた結論に影響しない。第二に、DM2患者の比較的小さいグループのみが研究されたが、有意な改善が４時間後及び１週後に再現して患者の制限されたグループで既に見られたという事実は、小さいサンプルサイズにもかかわらず、DM2患者の血管機能に関するHDLの効果についての明らかな結論を支持する。
DM2患者に関する臨床含意
スタチンは心血管予防戦略に中心的なパラダイムである。しかしながら、スタチン治療中に予防されない多数のイベントに鑑みて、最適の組み合わせ治療についての研究が充分に進行中である。HDL増大戦略の有望さは迅速に拡大しつつある。HDL-Cと心血管イベントの間の強い逆の関係は非糖尿病患者だけでなく、糖尿病患者の両方で合致した知見である。不運なことに、HDL増大介入後の心血管リスクの軽減についての証拠を与えるゆるぎないデータは、主として選択的かつ強力なHDL増大化合物の欠如のために、乏しい(37)。
最近のデータは変異体アポリポタンパク質（apoA-I Milano）で生成されたrHDLの５週の注入が最近の心筋梗塞の患者で冠状アテローマの進行を遅くし、又は更にはその容積の回帰を誘発することができたことを示していた(38)。このような迅速な効果と合致して、実験研究だけでなく、in vivo研究の両方はHDLの坑じゅく腫形成能が単に逆のコレステロール輸送におけるその役割に限定されないことを示していた。DM2の内皮機能不全の急な回復及び持続した回復の本観察は逆のコレステロール輸送におけるその役割を超えてのHDLの効果についての更なる支持を与える。これは、たとえHDLレベルが明らかに減少されないとしても、DM2におけるHDL増大についての役割を支持する。

*p<0.05、#p<0.01

参考文献

内皮依存性血管拡張薬セロトニンの動脈内注入が健康なボランティア及びDM2の患者で用量依存様式で前腕血流(FBF)を増大したことを示す線図である。基準線で、セロトニンに対するFBF応答は対照と較べてDM2で減少された(p<0.001)。rHDL注入後に、セロトニンに対するFBF応答が有意に増大したが、対照に匹敵するレベルに達しなかった(p<0.01)。内皮依存血管拡張の改善がrHDL注入後に７日間持続した(p<0.01)。rHDL注入は対照でセロトニン応答に影響しなかった。 基準線で、基礎亜酸化窒素(NO)活性を反映する、L-NMMAに対する血管収縮応答が、対照と較べてDM2患者で鈍化されたことを示す線図である(p<0.001)。rHDL注入後に、L-NMMA収縮応答が改善され、再度注入後に７日間依然として存在する(p<0.01)。セロトニンデータと合致して、rHDL注入は対照対象でL-NMMA応答に効果を有しなかった。 ナトリウムニトロプルシドに応答する内皮非依存性血管拡張が対照に対してDM2で低く(p<0.01)、rHDL注入が患者及び対照の両方でSNP血管拡張薬応答に効果を示さなかったことを示す線図である。

Claims (12)

1. 高密度リポタンパク質(HDL)を含むことを特徴とする、２型糖尿病患者の内皮機能を改善させるための２型糖尿病患者治療用医薬組成物であって、投与後少なくとも７日間内皮機能の改善が持続する該医薬組成物。
2. 前記HDLが再生HDLである、請求項１記載の医薬組成物。
3. 前記HDLを治療当り患者の体重1kg当り0.1-200mgの用量範囲で投与する、請求項１記載の医薬組成物。
4. 前記投与が非経口投与である、請求項１記載の医薬組成物。
5. 前記非経口投与が静脈内、動脈内、筋肉内及び皮下の注射又は注入からなる群から選ばれる、請求項４記載の薬剤。
6. 前記非経口投与が静脈内の注射又は注入である、請求項５記載の医薬組成物。
7. ２型糖尿病患者の内皮機能を改善させるための２型糖尿病患者治療用医薬組成物であって、投与後少なくとも７日間内皮機能の改善が持続する該医薬組成物の製造における高密度リポタンパク質(HDL)の使用。
8. 前記HDLが再生HDLである、請求項７記載の使用。
9. 前記HDLを治療当り患者の体重1kg当り0.1-200mgの用量範囲で投与する、請求項７記載の使用。
10. 前記投与が非経口投与である、請求項７記載の使用。
11. 前記非経口投与が静脈内、動脈内、筋肉内及び皮下の注射又は注入からなる群から選ばれる、請求項１０記載の使用。
12. 前記非経口投与が静脈内の注射又は注入である、請求項１０記載の使用。

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