JP5594655B2 - Method for determining causal mutation of retinitis pigmentosa and oligonucleotide used therefor - Google Patents
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Description
本発明は網膜色素線条症(Angioid streaks;以下ASとする)の判定方法に関する。さらに詳しくは、ABCC6遺伝子のバリアントを調べることによるASの判定方法に関する。また、この判定方法に用いられる網膜色素線条症判定キットやこれに用いられるオリゴヌクレオチドに関する。 The present invention relates to a method for determining retinal pigment streaks (hereinafter referred to as AS). In more detail, it is related with the determination method of AS by investigating the variant of ABCC6 gene. Moreover, it is related with the retinitis pigmentosa determination kit used for this determination method, and the oligonucleotide used for this.
ASは色素線条と呼ばれるブルッフ膜の弾力線維の断裂を生じる疾患であり、ASの症状の進行によって脈絡膜新生血管(choroidal neovascularization;CNV)が発生すると、高度の視力低下を起こすことが知られている。この発生を避けるべく、ASの早期発見、早期治療が望まれているが、ASは原因不明であるため、従来は発症後に眼底検査や造影検査で判定することしかできず、患者の負担が重いという問題があった。また、軽症のASは無症状であることが多く、通常は眼底検査を受けることがないため、早期発見は困難であった。 AS is a disease that causes the rupture of Bruch's elastic fibers called pigment streaks, and it is known that when choroidal neovascularization (CNV) occurs due to progression of AS symptoms, it causes a high degree of visual acuity loss. Yes. In order to avoid this occurrence, early detection and early treatment of AS are desired. However, since the cause of AS is unknown, conventionally, it can only be determined by fundus examination or contrast examination after onset, and the burden on the patient is heavy. There was a problem. Moreover, since mild AS is often asymptomatic and usually does not undergo fundus examination, early detection is difficult.
AS患者は皮膚疾患である弾力線維性仮性黄色腫(Pseudoxanthoma elasticum;以下PXEとする)を高頻度で合併することが知られている(例えば、非特許文献1、参照)。そして、PXEの原因遺伝子として、染色体16p13.1に存在するABCC6遺伝子が報告されている(例えば、非特許文献2参照)。 It is known that AS patients are frequently complicated with a skin disease, elastic fiber pseudoxanthoma (Pseudoxanthoma elasticum; hereinafter referred to as PXE) (see Non-Patent Document 1, for example). And as a causative gene of PXE, the ABCC6 gene which exists in the chromosome 16p13.1 is reported (for example, refer nonpatent literature 2).
そこで、本発明者らはAS患者とABCC6遺伝子変異の関係をCase−control studyによって調べたところ、rs2239324、rs212620、rs2238470、rs2238472、rs212097と名付けた5個の一塩基多型(single nucleotide polymorphism:以下、SNPとする)において、顕著な有意差を示すことを確認した。
さらに、rs2238472を除くこれらのSNPについてのハプロタイプを用いたCase−control studyにおいても全体の有意差がp<0.0001と有意であったことから、ABCC6遺伝子がAS原因遺伝子であるとの予測を発表している。
このうち、最も頻度の多いハプロタイプを含めて、この4つのハプロタイプがAS群に占める割合は88.9%であり、Control群に占める割合は44%であったことから、この4つのハプロタイプを持つASサンプルについて塩基配列決定法にて変異検索をすることで、AS群のかなりの量の変異が予測できると考えられた(例えば、非特許文献3参照)。
Therefore, the present inventors examined the relationship between AS patients and ABCC6 gene mutations by Case-control study, and found that they had five single nucleotide polymorphisms named rs2239324, rs212620, rs2238470, rs2238472, and rs212097 (single nucleotide polymorphism). , SNP), a significant difference was confirmed.
Furthermore, in the case-control study using haplotypes for these SNPs except for rs2238472, the overall significant difference was significant as p <0.0001, so that the ABCC6 gene is predicted to be an AS causative gene. Announcing.
Of these, including the most frequent haplotypes, the proportion of these four haplotypes in the AS group was 88.9%, and the proportion in the Control group was 44%. It was considered that a considerable amount of mutations in the AS group can be predicted by searching for mutations in the AS sample by nucleotide sequencing (for example, see Non-Patent Document 3).
しかし、このようなSNPやハプロタイプを用いた関連解析(case−control study)において単にそれらの頻度分布を統計的に処理し、有意差を出す作業のみでは確定的な判定ができない。すなわち、常染色体劣性遺伝形式の疾患を確定診断するためには、少なくとも変異をホモ接合体で持つ者がControl群には存在しないことを確認するという作業が必要であり、実際、前記SNPやハプロタイプを用いた関連解析では原因SNP等の特定は不可能であった。
従って、現段階において、発症前を含むASの確定的な判定を高い確率で行う方法は得られておらず、臨床において有用なASの判定方法の提供が望まれていた。
Therefore, at the present stage, a method for performing a deterministic determination of AS including the onset with high probability has not been obtained, and it has been desired to provide a method for determining an AS useful in clinical practice.
本発明は、ASの判定方法の提供を課題とする。さらに詳しくは、ABCC6遺伝子のバリアントを調べることによるASの判定方法の提供を課題とする。 An object of the present invention is to provide an AS determination method. More specifically, an object of the present invention is to provide an AS determination method by examining ABCC6 gene variants.
本発明者は、上記課題を解決するために鋭意研究を行った結果、ABCC6遺伝子においてアミノ酸配列の変換又はフレームシフトを伴う複数のバリアント(p.R419Q、p.E422K、c.2542delG、エキソン23の欠落、c.3774−3775insC又はp.E1427K)を調べることで、ASの判定を行うことができることを見出し、本発明を完成するに至った。
これらのバリアントを用いる本発明の判定方法は、59.3%という高い確率で発症前のASの確定的な判定が可能であり、臨床における価値が極めて大きく有用である。また、判定対象において、AS患者のみ両染色体に変異が見られている「p.R419Q」、「p.E422K」、「p.E1427K」のバリアントのいずれかにおいて変異がホモでみつかれば、100%に近い確率でASの発症前判定が可能である。
さらに本発明者らはこれらのバリアントを認識するオリゴヌクレオチドを得て、これを有するAS判定キットを得た。このキットを用いることにより、ASの確定的な判定を容易に行うことができる。
As a result of intensive studies to solve the above problems, the present inventor has found that a plurality of variants (p.R419Q, p.E422K, c.2542delG, exon 23) with amino acid sequence conversion or frame shift in the ABCC6 gene. It was found that the determination of AS can be performed by investigating missing, c.3774-3775insC or p.E1427K), and the present invention has been completed.
The determination method of the present invention using these variants can determine the AS before onset with a high probability of 59.3%, and is extremely useful in clinical value. In addition, if a mutation is found in any of the variants of “p.R419Q”, “p.E422K”, and “p.E1427K” in which only AS patients have a mutation in the determination target, The pre-onset determination of AS is possible with a probability close to%.
Furthermore, the present inventors obtained an oligonucleotide that recognizes these variants and obtained an AS determination kit having the oligonucleotide. By using this kit, it is possible to easily determine the AS.
すなわち、本発明は次の(1)〜(14)の網膜色素線条症の判定方法、網膜色素線条症判定キット等に関する。
(1)判定対象におけるABCC6遺伝子のバリアントを調べる網膜色素線条症の判定方法。
(2)ABCC6遺伝子のバリアントが、p.R419Q、p.E422K、c.2542delG、DEL_エキソン23、c.3774−3775insC又はp.E1427Kの1以上である上記(1)に記載の網膜色素線条症の判定方法。
(3)ABCC6遺伝子のバリアントが、次の1)〜6)のいずれかである上記(1)又は(2)に記載の網膜色素線条症の判定方法、
1)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する419番目のアミノ酸がR(アルギニン)からQ(グルタミン)に変わる変異又はエキソン10に位置する1256番目(以下、いずれもスタートコドンのATGのAを1番目とした)の塩基がGからAに変わる変異、
2)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する422番目のアミノ酸がE(グルタミン酸)からK(リジン)に変わる変異又はエキソン10に位置する1264番目の塩基がGからAに変わる変異、
3)ABCC6遺伝子のエキソン19に位置する2542番目の塩基であるGが欠失し、フレームシフトが起こる変異、
4)ABCC6遺伝子のイントロン22の5’端から620番目の塩基対からイントロン23の493番目の塩基対までの3897塩基対が欠失する変異、
5)ABCC6遺伝子のエキソン27に位置する3774番目と3775番目の塩基の間の場所に1個新たなCという塩基が挿入(インサーション)されてフレームシフトが起こる変異、
6)ABCC6遺伝子のエキソン30に位置する1427番目のアミノ酸がE(グルタミン酸)からK(リジン)に変わる変異又はエキソン30に位置する4279番目の塩基がGからAに変わる変異。
(4)ABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド。
(5)ABCC6遺伝子のバリアントが、p.R419Q、p.E422K、c.2542delG、DEL_エキソン23、c.3774−3775insC又はp.E1427Kのいずれかである上記(4)に記載のオリゴヌクレオチド。
(6)オリゴヌクレオチドが、次の1)〜5)のいずれかである上記(4)又は(5)に
記載のオリゴヌクレオチド、
1)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1256番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
2)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1264番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
3)ABCC6遺伝子のエキソン19に位置する2542番目の塩基であるGが欠失した塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
4)ABCC6遺伝子のエキソン27に位置する3774番目と3775番目の塩基の間の場所に1個新たなCという塩基が挿入された塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
5)ABCC6遺伝子のエキソン30に位置する4279番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド。
(7)オリゴヌクレオチドが、次の1)〜5)のいずれかである上記(4)〜(6)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチド、
1)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1256番目の塩基がAである塩基配列に結合する配列表配列番号11に記載の全部又は一部のオリゴヌクレオチド、
2)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1264番目の塩基がAである塩基配列に結合する配列表配列番号12に記載の全部又は一部のオリゴヌクレオチド、
3)ABCC6遺伝子のエキソン19に位置する2542番目の塩基であるGが欠失した塩基配列に結合する配列表配列番号13に記載の全部又は一部のオリゴヌクレオチド、
4)ABCC6遺伝子のエキソン27に位置する3774番目と3775番目の塩基の間の場所に1個新たなCという塩基が挿入された塩基配列に結合する配列表配列番号14に記載の全部又は一部のオリゴヌクレオチド、
5)ABCC6遺伝子のエキソン30に位置する4279番目の塩基がAである塩基配列に結合する配列表配列番号15に記載の全部又は一部のオリゴヌクレオチド。
(8)上記(4)〜(7)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドをプローブとして有するマイクロアレイ。
(9)上記(8)に記載のマイクロアレイを用いて判定対象におけるABCC6遺伝子のバリアントを調べる網膜色素線条症の判定方法。
(10)ABCC6遺伝子のバリアントが、エキソン23の欠落である上記(4)に記載のオリゴヌクレオチド。
(11)オリゴヌクレオチドが、次の1)〜3)のいずれかである上記(10)に記載のABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド、
1)配列表配列番号16に記載のオリゴヌクレオチド、
2)配列表配列番号17に記載のオリゴヌクレオチド、
3)配列表配列番号18に記載のオリゴヌクレオチド。
(12)上記(10)又は(11)に記載のオリゴヌクレオチドをWT_エキソン23検出用プライマー又はDEL_エキソン23検出用プライマーとして用いて、判定対象におけるABCC6遺伝子のバリアントを調べる網膜色素線条症の判定方法。
(13)判定対象がアジア人である上記(1)〜(3)、(9)又は(12)のいずれかに記載の網膜色素線条症の判定方法。
(14)上記(4)〜(7)、(10)又は(11)のいずれかに記載のオリゴヌクレオチドを含む網膜色素線条症判定キット。
That is, the present invention relates to the following (1) to (14) retinal pigment striatum determination method, retinal pigment striatum determination kit and the like.
(1) A method for determining retinitis pigmentosa that examines a variant of the ABCC6 gene in a determination target.
(2) The retinal pigment striatum according to (1) above, wherein the ABCC6 gene variant is one or more of p.R419Q, p.E422K, c.2542delG, DEL_exon 23, c.3774-3775insC, or p.E1427K. How to determine the disease.
(3) The method for determining retinitis pigmentosa according to (1) or (2) above, wherein the ABCC6 gene variant is any one of the following 1) to 6):
1) A mutation in which the 419th amino acid located in exon 10 of ABCC6 gene is changed from R (arginine) to Q (glutamine) or 1256th position located in exon 10 (hereinafter, both ATG of the start codon ATG is designated as first) Mutation) in which the base of G) is changed from G to A,
2) A mutation in which the 422nd amino acid located in exon 10 of the ABCC6 gene is changed from E (glutamic acid) to K (lysine) or a 1264th base located in exon 10 is changed from G to A,
3) a mutation in which G, which is the 2542th base located in exon 19 of ABCC6 gene, is deleted, resulting in a frameshift;
4) A mutation in which 3897 base pairs from the 620th base pair from the 5 ′ end of intron 22 of the ABCC6 gene to the 493th base pair of intron 23 are deleted,
5) A mutation in which a frame shift occurs when one new base C is inserted (inserted) between the 3774th and 3775th bases located in exon 27 of ABCC6 gene,
6) A mutation in which the 1427th amino acid located in exon 30 of the ABCC6 gene is changed from E (glutamic acid) to K (lysine), or a 4279th base located in exon 30 is changed from G to A.
(4) An oligonucleotide that recognizes a variant of the ABCC6 gene.
(5) The oligonucleotide according to (4) above, wherein the ABCC6 gene variant is any one of p.R419Q, p.E422K, c.2542delG, DEL_exon 23, c.3774-3775insC, or p.E1427K.
(6) The oligonucleotide according to (4) or (5) above, wherein the oligonucleotide is any of the following 1) to 5):
1) an oligonucleotide that binds to a base sequence in which the 1256th base located in exon 10 of the ABCC6 gene is A, or an oligonucleotide that binds complementarily thereto,
2) an oligonucleotide that binds to a base sequence in which the 1264th base located in exon 10 of the ABCC6 gene is A or an oligonucleotide that binds complementarily thereto,
3) an oligonucleotide that binds to a nucleotide sequence in which G, which is the base of position 2542, located in exon 19 of ABCC6 gene is deleted or an oligonucleotide that binds complementarily thereto,
4) An oligonucleotide that binds to a base sequence in which one new base C is inserted at a position between the 3774th and 3775th bases located in exon 27 of the ABCC6 gene, or an oligonucleotide that complementarily binds to this. ,
5) An oligonucleotide that binds to a base sequence in which the 4279th base located in exon 30 of the ABCC6 gene is A or an oligonucleotide that binds complementarily thereto.
(7) The oligonucleotide according to any one of (4) to (6) above, wherein the oligonucleotide is any of the following 1) to 5):
1) All or a part of the oligonucleotides described in SEQ ID NO: 11 in the Sequence Listing, which binds to a base sequence in which the 1256th base located in exon 10 of ABCC6 gene is A,
2) All or a part of the oligonucleotides described in SEQ ID NO: 12 in the Sequence Listing, which binds to a base sequence in which the 1264th base located in exon 10 of ABCC6 gene is A;
3) All or a part of the oligonucleotides described in SEQ ID NO: 13 in the Sequence Listing, which binds to the base sequence from which G, which is the 2542th base located in exon 19 of ABCC6 gene,
4) All or part of the sequence listing SEQ ID NO: 14 that binds to a base sequence in which one new base C is inserted at a position between the 3774th and 3775th bases located in exon 27 of the ABCC6 gene Oligonucleotides of
5) All or part of the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 15 in the Sequence Listing, which binds to the base sequence in which the 4279th base located in exon 30 of the ABCC6 gene is A.
(8) A microarray having the oligonucleotide according to any one of (4) to (7) as a probe.
(9) A method for determining retinitis pigmentosa that examines a variant of ABCC6 gene in a determination target using the microarray according to (8) above.
(10) The oligonucleotide according to (4) above, wherein the ABCC6 gene variant is a deletion of exon 23.
(11) The oligonucleotide that recognizes a variant of the ABCC6 gene according to (10) above, wherein the oligonucleotide is any of the following 1) to 3):
1) the oligonucleotide set forth in SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing,
2) the oligonucleotide set forth in SEQ ID NO: 17 in the sequence listing,
3) The oligonucleotide set forth in SEQ ID NO: 18 in the sequence listing.
(12) Determination of retinitis pigmentosa to examine ABCC6 gene variants in a determination target using the oligonucleotide according to (10) or (11) above as a WT_exon 23 detection primer or a DEL_exon 23 detection primer Method.
(13) The method for determining retinitis pigmentosa according to any one of (1) to (3), (9), or (12), wherein the determination target is an Asian.
(14) A retinitis pigmentosa determination kit comprising the oligonucleotide according to any one of (4) to (7), (10) or (11) above.
本発明のASの判定方法により、ASに対する早期発見ができる。臨床においては臨床像からASの判定をさらに確かにすることができ、確診率が高められる。さらに判定後の治療として定期的に診断を受けるという方針を立てることができる。
また、本発明の判定方法に用いられるAS判定キット、AS発症予測キット、AS診療指導キット等の提供により、簡便にASに対する早期発見を行うことが可能となる。
The AS determination method of the present invention enables early detection of AS. In the clinic, the determination of AS can be further confirmed from the clinical picture, and the diagnosis rate is increased. Furthermore, it is possible to make a policy of receiving a diagnosis periodically as a treatment after the determination.
In addition, by providing an AS determination kit, an AS onset prediction kit, an AS medical care instruction kit, and the like used in the determination method of the present invention, early detection for AS can be easily performed.
本発明の「ASの判定方法」とは、判定対象においてABCC6遺伝子のバリアントを調べることによってASの判定を行うことをいう。
ABCC6遺伝子のバリアントとしては、ASの判定を行うことができるバリアントであればいずれのものでも良いが、p.R419Q、p.E422K、c.2542delG、DEL_エキソン23、c.3774−3775insC又はp.E1427Kのいずれかであることが好ましく、これらの1以上又はこれらを組み合わせて調べることが好ましい。判定対象において、これらのバリアントを調べることにより、ASの早期発見を行うことができる。
The “AS determination method” of the present invention refers to performing AS determination by examining a variant of the ABCC6 gene in a determination target.
The ABCC6 gene variant may be any variant that can determine AS, but p.R419Q, p.E422K, c.2542delG, DEL_exon 23, c.3774-3775insC or p.R. Any one of E1427K is preferred, and one or more of these or a combination thereof is preferably examined. An early detection of AS can be performed by examining these variants in the determination target.
本発明のABCC6遺伝子のバリアントを図1に示した。このうち、「p.R419Q」とは、ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する419番目のアミノ酸がR(アルギニン)からQ(グルタミン)に変わる変異である。これはエキソン10に位置する1256番目の塩基がGからAに変わることによる変異である。
「p.E422K」とは、エキソン10に位置する422番目のアミノ酸がE(グルタミン酸)からK(リジン)に変わる変異である。これはエキソン10に位置する1264番目の塩基がGからAに変わることによる変異である。
「c. 2542delG」とは、エキソン19に位置する2542番目の塩基であるGが欠失し、フレームシフトが起こる変異である。
「DEL_エキソン23」とは、イントロン22の一部からエキソン23を含み、イントロン23の一部までを含む一続きの塩基配列が欠失する変異である。具体的にはイントロン22の5’端から620番目の塩基対からイントロン23の493番目の塩基対までの3897塩基対の欠失という変異である。
「c.3774−3775insC」とは、エキソン27に位置する3774番目と3775番目の塩基の間の場所に1個新たなCという塩基が挿入されてフレームシフトが起こる変異である。
「p.E1427K」とは、エキソン30に位置する1427番目のアミノ酸がE(グルタミン酸)からK(リジン)に変わる変異である。これはエキソン30に位置する4279番目の塩基がGからAに変わることによる変異である。
これらのバリアントはNational Center for Biotechnology of Information(NCBI)を始めとするOnline databaseには見当たらない新たなバリアントである。
A variant of the ABCC6 gene of the present invention is shown in FIG. Among these, “p.R419Q” is a mutation in which the 419th amino acid located in exon 10 of the ABCC6 gene is changed from R (arginine) to Q (glutamine). This is a mutation caused by the 1256th base located in exon 10 being changed from G to A.
“P.E422K” is a mutation in which the 422nd amino acid located in exon 10 is changed from E (glutamic acid) to K (lysine). This is a mutation caused by the change of the 1264th base located in exon 10 from G to A.
“C. 2542delG” is a mutation in which G, which is the 2542th base located in exon 19, is deleted and a frame shift occurs.
“DEL_exon 23” is a mutation that includes exon 23 from a part of intron 22 and deletes a continuous base sequence including a part of intron 23. Specifically, the mutation is a deletion of 3897 base pairs from the 620th base pair from the 5 ′ end of intron 22 to the 493th base pair of intron 23.
“C. 3774-3775insC” is a mutation in which one new C base is inserted at a position between the 3774th and 3775th bases located in exon 27 to cause a frame shift.
“P.E1427K” is a mutation in which the amino acid at position 1427 located in exon 30 is changed from E (glutamic acid) to K (lysine). This is a mutation caused by the change of the 4279th base located in exon 30 from G to A.
These variants are new variants which are not found in Online database including National Center for Biotechnology of Information (NCBI).
本発明の「ABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド」としては、ABCC6遺伝子のバリアントを認識できるオリゴヌクレオチドであればいずれのものも含まれる。
このABCC6遺伝子のバリアントとしては、p.R419Q、p.E422K、c.2542delG、c.3774−3775insC又はp.E1427K等が挙げられる。これらのバリアントを認識するオリゴヌクレオチドとしては、1)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1256番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、2)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1264番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、3)ABCC6遺伝子のエキソン19に位置する2542番目の塩基であるGが欠失した塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド又は4)ABCC6遺伝子のエキソン27に位置する3774番目と3775番目の塩基の間の場所に1個新たなCという塩基が挿入された塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又は5)ABCC6遺伝子のエキソン30に位置する4279番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
これらの「ABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド」をプローブとして有するマイクロアレイを得て、本発明のASの判定方法に用いることができる。
The “oligonucleotide that recognizes a variant of ABCC6 gene” of the present invention includes any oligonucleotide that can recognize a variant of ABCC6 gene.
Examples of variants of the ABCC6 gene include p.R419Q, p.E422K, c.2542delG, c.3774-3775insC, and p.E1427K. Oligonucleotides that recognize these variants include 1) an oligonucleotide that binds to a base sequence in which the 1256th base located in exon 10 of the ABCC6 gene is A, or an oligonucleotide that binds complementarily thereto, and 2) ABCC6 Oligonucleotide that binds to or complementary to the nucleotide sequence in which the 1264th base located in exon 10 of the gene is A, 3) G that is the 2542th base located in exon 19 of the ABCC6 gene Is an oligonucleotide that binds to the deleted base sequence or an oligonucleotide that binds complementarily thereto, or 4) a new C at a position between the 3774th and 3775th bases located in exon 27 of the ABCC6 gene. Binds to the inserted base sequence Oligonucleotides or 5) such as oligonucleotides 4279 th base of ABCC6 located in exon 30 of the gene to complementarily bind to the oligonucleotide or it binds to a nucleotide sequence which is A and the like.
A microarray having these “oligonucleotides recognizing variants of the ABCC6 gene” as probes can be obtained and used in the AS determination method of the present invention.
さらに、これらのバリアントを認識するオリゴヌクレオチドとして、1)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1256番目の塩基がAである塩基配列に結合する配列表配列番号11に記載のオリゴヌクレオチド、2)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1264番目の塩基がAである塩基配列に結合する配列表配列番号12に記載のオリゴヌクレオチド、3)ABCC6遺伝子のエキソン19に位置する2542番目の塩基であるGが欠失した塩基配列に結合する配列表配列番号13に記載のオリゴヌクレオチド、4)ABCC6遺伝子のエキソン27に位置する3774番目と3775番目の塩基の間の場所に1個新たなCという塩基が挿入された塩基配列に結合する配列表配列番号14に記載のオリゴヌクレオチド、5)ABCC6遺伝子のエキソン30に位置する4279番目の塩基がAである塩基配列に結合する配列表配列番号15に記載のオリゴヌクレオチド等も挙げられる。これらの「ABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド」の全部又は一部をプローブとして有するマイクロアレイを得て、本発明のASの判定方法に用いることができる。このオリゴヌクレオチドの「一部」として、例えば、各変異部分の塩基とその前後6−15塩基程度の配列を含むオリゴヌクレオチド等が挙げられる。 Furthermore, as oligonucleotides for recognizing these variants, 1) the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 11 that binds to the base sequence in which the 1256th base located in exon 10 of the ABCC6 gene is A, 2) the ABCC6 gene The oligonucleotide described in SEQ ID NO: 12 in the Sequence Listing, which binds to the base sequence in which the 1264th base located in exon 10 of A is A, 3) the G being the 2542th base located in exon 19 of the ABCC6 gene is deleted Oligonucleotide described in SEQ ID NO: 13 that binds to the base sequence 4) One new base C was inserted at a position between the 3774th and 3775th bases located in exon 27 of the ABCC6 gene The oligonucleotide according to SEQ ID NO: 14 that binds to the base sequence, 5 4279 th base located in exon 30 of the ABCC6 gene may also be mentioned such as oligonucleotides depicted in SEQ ID NO: 15 that binds to a nucleotide sequence that is A. A microarray having all or a part of these “oligonucleotides recognizing variants of the ABCC6 gene” as probes can be obtained and used in the AS determination method of the present invention. Examples of the “part” of the oligonucleotide include an oligonucleotide containing a base of each mutated portion and a sequence of about 6-15 bases before and after that.
また、本発明の「ABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド」の対象とするバリアントとしては、エキソン23の欠落が挙げられる。このバリアントを認識するオリゴヌクレオチドとしては、1)配列表配列番号16に記載のオリゴヌクレオチド、2)配列表配列番号17に記載のオリゴヌクレオチド、3)配列表配列番号18に記載のオリゴヌクレオチド等が挙げられる。
これらの「ABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド」をWT_エキソン23検出用プライマー又はDEL_エキソン23検出用プライマーとして用いることで、本発明のASの判定方法に用いることができる。ここで、WT_エキソン23検出用プライマーとは、これを用いてPCRを行うことで、エキソン23の欠落が起きていないWild TypeにおいてはPCRによる増幅が起こるが、エキソン23の欠落が起きているDeletion TypeではPCRによる増幅が起こらないように設定されたプライマーのことをいう。また、DEL_エキソン23検出用プライマーとはエキソン23の欠落が起きていないWild TypeにおいてはPCRによる増幅が起こらず、エキソン23の欠落が起きているDeletion TypeではPCRによる増幅が起こるように設定されたプライマーのことをいう。
Moreover, lack of exon 23 is mentioned as a variant made into the object of the "oligonucleotide which recognizes the variant of ABCC6 gene" of this invention. Examples of the oligonucleotide recognizing this variant include 1) the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 16, 2) the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 17, and 3) the oligonucleotide described in SEQ ID NO: 18. Can be mentioned.
By using these “oligonucleotides recognizing variants of ABCC6 gene” as WT_exon 23 detection primers or DEL_exon 23 detection primers, they can be used in the AS determination method of the present invention. Here, the WT_exon 23 detection primer is used to perform PCR, and amplification by PCR occurs in wild type in which exon 23 is not missing, but deletion in which exon 23 is missing. In Type, it is a primer set so that amplification by PCR does not occur. The DEL_exon 23 detection primer is set so that amplification by PCR does not occur in Wild Type in which exon 23 is not lost, and PCR is amplified in deletion type in which exon 23 is missing. Refers to the primer.
本発明の判定方法として、判定対象よりDNAを得て、塩基配列決定法、TaqMan(登録商標) PCR法、Invader法やOligo−specific PCR法等の一般に用いられている方法を用いる事でABCC6遺伝子のバリアントを調べ、ASの判定を行うことができる。このうち特に塩基配列決定法は、各エキソンについて別々に行うことによって、エキソン内に存在する未知の変異を見出せるために有用である。さらにその変異が既知となった後も各患者がその変異を持つか否かの確認(Genotyping)にも利用できる。
また、TaqMan(登録商標) PCR法によるGenotypingは既知となった変異のみをターゲットとしているが、塩基配列決定法と比べて大量の患者を同時に解析することができるため、時間的、経済的に有用である。
As a determination method of the present invention, the ABCC6 gene is obtained by obtaining a DNA from a determination target and using a commonly used method such as a base sequence determination method, TaqMan (registered trademark) PCR method, Invader method, Oligo-specific PCR method or the like. The AS can be determined by examining the variants. Of these, the base sequence determination method is particularly useful for finding unknown mutations existing in exons by performing each exon separately. Furthermore, even after the mutation becomes known, it can be used for confirmation (Genotyping) whether or not each patient has the mutation.
In addition, TaqMan (registered trademark) Genotyping by PCR method targets only known mutations, but it can be analyzed in a large amount of patients at the same time compared with the base sequencing method, so it is useful in terms of time and cost. It is.
塩基配列決定法を用いる検出法としては、ジデオキシ法に基づく塩基配列決定法により本発明のバリアントを検出することが好ましい。塩基配列決定に用いるシークエンサースキットには、市販のABIシリーズやGEヘルスケアバイオサイエンス社製等を用いることができる。 As a detection method using the base sequence determination method, it is preferable to detect the variant of the present invention by a base sequence determination method based on the dideoxy method. A commercially available ABI series, GE Healthcare Biosciences, etc. can be used for the sequencer kit used for base sequence determination.
TaqMan(登録商標) PCR法を用いる検出法としては、蛍光標識したアレル特異的オリゴ(TaqMan(登録商標)プローブ)とTaq DNAポリメラーゼによるPCR反応とを利用した方法を用いることが好ましい。まず、TaqMan(登録商標)プローブが鋳型DNAとハイブリダイゼーションし、その後、PCRプライマーからの伸長反応が起こる。これによってTaq DNAポリメラーゼの5’ヌクレアーゼ活性により蛍光色素結合部分が切断されて、蛍光色素が遊離する。この蛍光を検出することで特定のバリアントを同定し、ゲノムタイプを判定することができる。TaqMan(登録商標) PCR法で用いるアレル特異的オリゴ(TaqMan(登録商標)プローブという)は、対象とするバリアントの遺伝子情報に基づいて設定できる。 As a detection method using the TaqMan (registered trademark) PCR method, it is preferable to use a method utilizing a PCR reaction with a fluorescently labeled allele-specific oligo (TaqMan (registered trademark) probe) and Taq DNA polymerase. First, a TaqMan (registered trademark) probe hybridizes with a template DNA, and then an extension reaction from a PCR primer occurs. As a result, the fluorescent dye-binding portion is cleaved by the 5 'nuclease activity of Taq DNA polymerase to release the fluorescent dye. By detecting this fluorescence, it is possible to identify a specific variant and determine the genome type. The allele-specific oligo (referred to as TaqMan (registered trademark) probe) used in the TaqMan (registered trademark) PCR method can be set based on the gene information of the target variant.
PCR法を用いる検出法としては、Fidelityの高いDNAポリメラーゼ、例えば、Ex Taq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社)、KOD Dashポリメラーゼ(TOYOBO社)等を用いて判定対象者のゲノムDNAを増幅することが好ましい。用いるプライマーは、対象とするバリアントを増幅できるようにプライマーの任意の位置にそのバリアントの塩基配列が含まれるように設定し合成することが好ましい。増幅反応終了後増幅産物の検出を行い、多型の有無を判定する。
数キロ塩基対の長い領域を増幅するにはLong PCR法(タカラバイオ社等)を用いることが好ましい。対象とするバリアントを増幅できるように設定したプライマーを用いて増幅したPCR産物や、Long PCR法で増幅したPCR産物をアガロースゲル電気泳動することで、多型の有無を判定することもできる。対象とするバリアントを増幅できるように設定したプライマーとしては、WT_エキソン23検出用プライマーやDEL_エキソン23検出用プライマーを挙げることができる。
As a detection method using the PCR method, it is preferable to amplify the genomic DNA of the judgment subject using a high fidelity DNA polymerase, such as Ex Taq DNA polymerase (Takara Bio), KOD Dash polymerase (TOYOBO) or the like. . The primer used is preferably set and synthesized so that the base sequence of the variant is included at any position of the primer so that the target variant can be amplified. After completion of the amplification reaction, the amplification product is detected and the presence or absence of the polymorphism is determined.
In order to amplify a long region of several kilobase pairs, it is preferable to use the Long PCR method (Takara Bio Inc.). The presence or absence of a polymorphism can also be determined by agarose gel electrophoresis of a PCR product amplified using a primer set so that the target variant can be amplified or a PCR product amplified by the Long PCR method. Examples of the primer set so that the target variant can be amplified include a WT_exon 23 detection primer and a DEL_exon 23 detection primer.
マイクロアレイを用いる検出法としては、支持体上にヌクレオチドプローブが固定されたDNAマイクロアレイを用いることが好ましい。このマイクロアレイには、DNAチップ、Gene チップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどを含む。
マイクロアレイを用いる検出法として、まず、判定対象者の染色体DNAのオリゴヌクレオチドを単離し、PCRにより増幅し、蛍光レポーター基により標識する。続いて、標識化DNA/mRNA,total RNAをアレイと共にインキュベートする。次にこのアレイをスキャナーに差し込み、ハイブリダイゼーションパターンを検出する。ハイブリダイゼーションのデータは、プローブアレイに結合した(すなわち標的配列に取り込まれた)蛍光レポーター基からの発光として採集する。標的配列と完全に一致したプローブは、標的配列と一致していない部分を有するものよりも強いシグナルを生じる。アレイ上の各プローブの配列及び位置は分かっているため、相補性によって、プローブアレイと反応させた標的オリゴヌクレオチドの配列を決定することができる。
As a detection method using a microarray, it is preferable to use a DNA microarray in which a nucleotide probe is immobilized on a support. The microarray includes a DNA chip, a Gene chip, a microchip, a bead array, and the like.
As a detection method using a microarray, first, an oligonucleotide of a chromosomal DNA of a determination subject is isolated, amplified by PCR, and labeled with a fluorescent reporter group. Subsequently, the labeled DNA / mRNA and total RNA are incubated with the array. The array is then inserted into a scanner and the hybridization pattern is detected. Hybridization data is collected as luminescence from fluorescent reporter groups attached to the probe array (ie, incorporated into the target sequence). A probe that perfectly matches the target sequence produces a stronger signal than one that has a portion that does not match the target sequence. Since the sequence and position of each probe on the array is known, the sequence of the target oligonucleotide reacted with the probe array can be determined by complementation.
インベーダー法を用いる検出法としては、アレル特異的オリゴと鋳型とをハイブリダイゼーションすることによりバリアントを検出することが好ましい。インベーダー・オリゴがターゲットDNAとプローブ間の二重鎖に少なくとも1塩基の浸入(インベージョン)を起こして部分的な三重鎖構造を形成すると、構造特異的な5’−ヌクレアーゼがプローブ5’末端部分を切断する。そして、対象とするバリアントの塩基配列に対応してインベージョンを発生させるインベーダー・オリゴを利用することで特定のバリアントを同定し、ゲノムタイプを判定することができる。インベーダー法を行うためのキットは市販されており、この方法により容易にバリアントを検出することが可能である。 As a detection method using the invader method, it is preferable to detect a variant by hybridizing an allele-specific oligo and a template. When the invader oligo forms at least one base in the double strand between the target DNA and the probe to form a partial triplex structure, the structure-specific 5′-nuclease becomes the probe 5 ′ end. Cut the part. A specific variant can be identified and a genome type determined by using an invader oligo that generates invasion corresponding to the base sequence of the target variant. Kits for performing the invader method are commercially available, and variants can be easily detected by this method.
本発明の「判定対象」は、ABCC6遺伝子のバリアントを調べることによってASの判定を行うことができるものであればいずれのものでも良いが、アジア人であることが好ましく、日本人であることが特に好ましい。 The “determination target” of the present invention may be any as long as it can determine AS by examining ABCC6 gene variants, but is preferably Asian and Japanese. Particularly preferred.
本発明の「AS判定キット」は、本発明の判定方法に用いられることで判定対象におけるASの判定を行うことができるものであれば、いずれのものも含むことができる。例えば、ABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチドと、本発明を実施するために必要な1種以上の成分を含むもの等を組み合わせてキットとして用いることもできる。
ABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチドとしては、ABCC6遺伝子のバリアントを認識できるオリゴヌクレオチドであればいずれのものも含まれるが、上記のようなオリゴヌクレオチドを用いることができる。
また、本発明を実施するために必要な1種以上の成分としては、例えば、酵素を保存若しくは供給するためのもの、及び/又はバリアントの検出を実施するために必要な反応成分が挙げられる。具体的には、酵素緩衝液、dNTP、コントロール用試薬(例えば、組織サンプル、ポジティブ及びネガティブコントロール用標的オリゴヌクレオチドなど)、標識用及び/又は検出用試薬、固相支持体、説明書などが挙げられる。また本発明のキットは、必要な成分のうちの一部のみを含む部分的キットであってもよく、その場合には、ユーザーが他の成分を用意することができる。
The “AS determination kit” of the present invention can include any one as long as it can be used in the determination method of the present invention to determine the AS in the determination target. For example, an oligonucleotide that recognizes a variant of the ABCC6 gene and one containing one or more components necessary for carrying out the present invention can be used in combination as a kit.
Any oligonucleotide that recognizes a variant of ABCC6 gene may be used as long as it can recognize a variant of ABCC6 gene, but the above-described oligonucleotide can be used.
In addition, examples of the one or more components necessary for carrying out the present invention include a component for storing or supplying an enzyme and / or a reaction component necessary for detecting a variant. Specific examples include enzyme buffers, dNTPs, control reagents (eg, tissue samples, target oligonucleotides for positive and negative controls, etc.), labeling and / or detection reagents, solid supports, instructions, and the like. It is done. Further, the kit of the present invention may be a partial kit containing only a part of necessary components, and in that case, the user can prepare other components.
本発明のキットは、上記のABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチドを支持体に固定したマイクロアレイを含むこともできる。マイクロアレイは、支持体上に本発明のオリゴヌクレオチドが固定されたものであればよく、DNAチップ、Geneチップ、マイクロチップ、ビーズアレイなどが含まれる。
本発明のABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチドを有するキットを用いることにより、治療用の薬物を患者等に使用する前、又は使用後の段階で、判定対象から得たABCC6遺伝子をキット中のオリゴヌクレオチドと反応させることができる。この反応の結果より判定対象の遺伝子型を同定し、同定された遺伝子型によってASの確定的な判定をすることができる。
本発明の「AS判定キット」には、ASが疑われるような患者に対して本発明のABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド等を用いて確定診断の判定に用いる「AS判定キット」、ASを発症していない者に対して行う「AS発症予測キット」、ASを発症した後に遺伝学的な確定診断の判定に用いる「AS診療指導キット」等を含むこともできる。
以下、試験例、実施例をあげて本発明をさらに詳細に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
The kit of the present invention can also include a microarray in which oligonucleotides that recognize variants of the ABCC6 gene are immobilized on a support. The microarray is not particularly limited as long as the oligonucleotide of the present invention is immobilized on a support, and includes a DNA chip, a Gene chip, a microchip, a bead array, and the like.
By using the kit having an oligonucleotide that recognizes the ABCC6 gene variant of the present invention, the ABCC6 gene obtained from the determination target is contained in the kit before or after the use of the therapeutic drug in a patient or the like. It can be reacted with an oligonucleotide. The genotype to be determined can be identified from the result of this reaction, and the AS can be deterministically determined based on the identified genotype.
The “AS determination kit” of the present invention includes an “AS determination kit” used for determination of a definitive diagnosis using an oligonucleotide or the like that recognizes a variant of the ABCC6 gene of the present invention for a patient suspected of having AS. "AS onset prediction kit" performed for persons who have not developed symptom, "AS medical treatment instruction kit" used for determination of genetic definitive diagnosis after the onset of AS can be included.
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to test examples and examples, but the present invention is not limited thereto.
ASの判定方法
1.DNAの抽出
判定対象者から採血を行った。各対象者においての末梢血全血を用いてゲノムDNAを標準的なフェノール・クロロホルム法で抽出した(例えば、参考文献1参照)。
これらの判定対象者は駿河台日本大学病院眼科を受診した日本人であり、片眼あるいは両眼にCNVを有するAS患者(AS群)54人及びボランティア(コントロール群)150人でインフォームドコンセントを得た者であった。
AS患者(AS群)の年齢は19〜78歳、60.9±10.0歳(平均±標準偏差)、男性34人、女性20人であった。全ての患者に視力測定、倒像鏡による眼底検査、フルオレセイン蛍光眼底造影(fluorescein angiography;以下FA)を行った。CNVの有無は眼底検査とFAで判断した。54人中41人は当院皮膚科を受診し、PXEの有無は皮膚生検又は視診で判定された。PXEは34人(82.9%)で認められ、7人(17.1%)では認められなかった。
コントロール群の年齢50〜81歳、57.5±6.4歳(平均±標準偏差)、男性107人、女性43人で血縁関係がない日本人であり、日本大学医学部総合健診センター受診者の中からボランティアを募って行った。
参考文献:Nakayama T, Soma M, Rahmutula D, et al. Med Sci Monit.2001;7:345−349.
AS determination method 1. DNA extraction Blood was collected from the subject. Genomic DNA was extracted by standard phenol / chloroform method using peripheral blood from each subject (see, for example, Reference 1).
These subjects were Japanese who visited the Department of Ophthalmology at Surugadai Nihon University Hospital. Informed consent was obtained from 54 AS patients (AS group) and 150 volunteers (control group) who have CNV in one or both eyes. It was a person.
The age of AS patients (AS group) was 19-78 years old, 60.9 ± 10.0 years old (mean ± standard deviation), 34 men, and 20 women. All patients were subjected to visual acuity measurement, fundus examination with an inversion mirror, and fluorescein fluorescence fundus angiography (hereinafter referred to as FA). The presence or absence of CNV was determined by fundus examination and FA. Forty-one of the 54 patients visited our dermatologist, and the presence or absence of PXE was determined by skin biopsy or visual inspection. PXE was observed in 34 (82.9%) and not in 7 (17.1%).
Control group age 50-81 years old, 57.5 ± 6.4 years old (mean ± standard deviation), 107 males, 43 females who are unrelated Japanese and have undergone a medical examination at Nihon University School of Medicine Volunteers were recruited from within.
References: Nakayama T, Soma M, Rahmutula D, et al. Med Sci Monitor. 2001; 7: 345-349.
2.塩基配列の決定
各対象者におけるABCC6遺伝子の配列情報を次のような手法によって調べた。
即ち、ABCC6遺伝子の全31エキソンのそれぞれをはさむようなプライマー対をイントロン領域に設定し、対象者末梢血から抽出したゲノムDNAを鋳型にしてPCRを行い、各領域を増幅した。PCR産物を精製後、ジデオキシ法にて塩基配列決定を行った。エキソン1から、エキソン9までは偽遺伝子と重複するため、既知のアレル特異的プライマーを使用した。
2. Determination of base sequence The sequence information of ABCC6 gene in each subject was examined by the following method.
That is, a primer pair sandwiching each of all 31 exons of ABCC6 gene was set in the intron region, PCR was performed using genomic DNA extracted from the subject's peripheral blood as a template, and each region was amplified. After purification of the PCR product, the base sequence was determined by the dideoxy method. Since exon 1 to exon 9 overlap with the pseudogene, known allele-specific primers were used.
1)PCR法
50ngの上記ゲノムDNA1μl、濃度10pmol/μlの表1に示した配列表配列番号1〜10のFプライマー(Forwardプライマー)及びRプライマー(Reverseプライマー)の溶液各々0.2μl、ヌクレオチド三リン酸(タカラバイオ社製)各々2.5mMの混合溶液を0.8μl、10倍緩衝液(20mMのMgCl2 含有、タカラバイオ社製)1μl、Ex Taq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)5units/μlを0.05μl、そして滅菌超純水6.75μlの混合物、計10μlの系にて、PCR装置(Applied Biosystems GeneAmp9700)を用いて増幅した。PCR条件は、95−96℃で3分間、続いて95℃で30秒間(デネーチャー)、55−66℃で30秒間(アニーリング)、72℃で1分間(エクステンション)のサイクルを35サイクル、その後、72℃で10分間の後、4℃に保温とした。
エキソン23の欠落に対してはLong PCRを行い増幅した。Long PCRでは、ヌクレオチド三リン酸各々2.5mMの混合溶液を1.6μl、DNAポリメラーゼとしてLA Taq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)を用い、エクステンションを72℃で10分間とした。
1) PCR method 1 μl of the above genomic DNA of 50 ng, 0.2 μl each of a solution of F primer (Forward primer) and R primer (Reverse primer) of SEQ ID NOs: 1 to 10 shown in Table 1 at a concentration of 10 pmol / μl, nucleotide 3 Phosphoric acid (manufactured by Takara Bio Inc.) 0.8 μl each of a mixed solution of 2.5 mM, 10 μl buffer (containing 20 mM MgCl 2, manufactured by Takara Bio Inc.) 1 μl, Ex Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) 5 units / μl Was amplified with a PCR apparatus (Applied Biosystems GeneAmp 9700) in a system of 0.05 μl and 6.75 μl of sterilized ultrapure water for a total of 10 μl. PCR conditions were 95-96 ° C. for 3 minutes, followed by 35 cycles of 95 ° C. for 30 seconds (denature), 55-66 ° C. for 30 seconds (annealing), and 72 ° C. for 1 minute (extension). After 10 minutes at 72 ° C., the temperature was kept at 4 ° C.
Long exon 23 was amplified by long PCR. In Long PCR, 1.6 μl of a mixed solution of 2.5 mM each of nucleotide triphosphates was used, LA Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.) was used as the DNA polymerase, and the extension was at 72 ° C. for 10 minutes.
2)PCR産物の精製
上記1)にて得られたPCR産物内に残存する過剰なプライマー等の一本鎖DNAを大腸菌由来のエキソヌクレアーゼI(ExoI)を用いて特異的に消化した。またシュリンプ由来アルカリホスファターゼ(SAP)によって未反応dNTPsのリン酸基を除去してdNTPsを不活性化した。
この2つの酵素を同時に含むExoSAP−IT(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を用い、先のPCR産物溶液10μlに2μl加え計12μlとして、ヒートブロックにて37℃で30分で反応を行った後80℃で15分にて酵素を失活させた。
2) Purification of PCR product Single-stranded DNA such as excess primers remaining in the PCR product obtained in 1) above was specifically digested with E. coli-derived exonuclease I (ExoI). Moreover, the phosphate group of unreacted dNTPs was removed with shrimp-derived alkaline phosphatase (SAP) to inactivate dNTPs.
After using ExoSAP-IT (manufactured by GE Healthcare Biosciences) containing these two enzymes at the same time, 2 μl was added to 10 μl of the previous PCR product solution to make a total of 12 μl, and the reaction was performed at 37 ° C. for 30 minutes in a heat block. The enzyme was inactivated at 80 ° C. for 15 minutes.
3)塩基配列決定法
上記2)にて精製したPCR産物のうち1μlを別のチューブにとりわけ、Applied Biosystems社製シーケンシングキット(BigDye(R) Terminators v1.1 Cycle Sequencing Kit)のMix Reaction溶液を8μl、PCR法に用いたプライマー(片側)(1pmol/μl)を3.2μl加え、さらに水を加え20μlとした。
シーケンシング条件は95℃で10秒間、55℃で5秒、60℃で2分間のサイクルを25サイクルとした。これをCentricep columns(Princeton Separations社製)で精製後、Applied Biosystems社製ジェネティックアナライザ3700にて解析した。
3) Nucleotide sequencing method 1 μl of the PCR product purified in 2) above is placed in a separate tube, especially with the Mix Reaction solution of Applied Biosystems sequencing kit (BigDye (R) Terminators v1.1 Cycle Sequencing Kit). 8 μl, 3.2 μl of primer (one side) (1 pmol / μl) used in the PCR method was added, and water was added to make 20 μl.
Sequencing conditions were 95 ° C for 10 seconds, 55 ° C for 5 seconds, and 60 ° C for 2 minutes for 25 cycles. This was purified with Centricep columns (manufactured by Princeton Separations) and then analyzed with a genetic analyzer 3700 (Applied Biosystems).
3.Genotyping
上記3)で調べたABCC6遺伝子の配列情報についてGenotypingを行った。5個すべては塩基配列決定法で決定した。また、p.R419Q、p.E422K、c.2542delG、c.3774−3775insC及びp.E1427KのGenotypingにおいて、その変異のみをより簡便に検出する方法としてTaqMan(登録商標) PCR法に用いるプローブを設定した。
エキソン23の欠落については、その変異をより簡便に検出する方法のために設定したWild TypeとDeletion Typeとで増幅が異なるプライマー対(WT_エキソン23検出用プライマー対及びDEL_エキソン23検出用プライマー対)を用いて、得られたPCR産物をアガロースゲル電気泳動することで、Genotypingを行った。
3. Genotyping
Genotyping was performed on the sequence information of the ABCC6 gene examined in 3) above. All five were determined by nucleotide sequencing. In addition, in Genotyping of p.R419Q, p.E422K, c.2542delG, c.3774-3775insC and p.E1427K, a probe used for TaqMan (registered trademark) PCR method is set as a method for more easily detecting only the mutation. did.
Regarding the lack of exon 23, a primer pair (WT_exon 23 detection primer pair and DEL_exon 23 detection primer pair) in which amplification is different between Wild Type and Delete Type set for a method for detecting the mutation more simply. The obtained PCR product was subjected to agarose gel electrophoresis to perform Genotyping.
1)p.R419Q、p.E422K、c.2542delG、c.3774−3775insC及びp.E1427Kについて
TaqMan(登録商標) PCR法に用いるプローブの設定
TaqMan(登録商標) PCR法に用いるプローブは、各バリアントの遺伝子情報に基づいて、各変異部分の塩基とその前後6−15塩基程度の配列をもとに設定できる。プローブ配列を含む周辺の配列を表2(配列表配列番号11〜15)に示した。
このように設定したTaqMan(登録商標)プローブを用い、TaqMan(登録商標) PCR法を行うことができる。例えば、鋳型DNAとしてヒトゲノムDNA 50ngを用い、各プライマー 900nM、5’側に蛍光プライマーが標識されたTaqMan プローブ 200nM(TaqMan(登録商標) SNP Genotyping Assays)、緩衝液とMgCl2とDNAポリメラーゼとを含んだPCRカクテル(TaqMan Universal Master Mixm)を全体量の半量(12.5・戟jを入れ、水で満たした全体量25・撃フ系にてPCRを行うことで、TaqMan(登録商標) PCR法を行うことができる(PCR条件:1.95 10分間、2.92 15秒間(デネーチャー)、3.60 1分間(アニーリング及びエクステンション)を40サイクル)。
1) Setting of probe used for TaqMan (registered trademark) PCR method for p.R419Q, p.E422K, c.2542delG, c.3774-3775insC and p.E1427K The probe used for TaqMan (registered trademark) PCR method is each variant. Can be set based on the base of each mutation part and the sequence of about 6-15 bases before and after that. The peripheral sequences including the probe sequences are shown in Table 2 (SEQ ID NOs: 11 to 15 in the sequence listing).
Using the TaqMan (registered trademark) probe set in this way, the TaqMan (registered trademark) PCR method can be performed. For example, 50 ng of human genomic DNA was used as template DNA, and each primer 900 nM, TaqMan probe 200 nM (TaqMan (registered trademark) SNP Genotyping Assays) labeled with a fluorescent primer on the 5 ′ side, buffer solution, MgCl 2 and DNA polymerase were included. Half of the total amount of the PCR cocktail (TaqMan Universal Master Mix) (12.5 · 戟 j is added, and the total amount is 25 · filled with water. (PCR conditions: 1.95 10 minutes, 2.92 15 seconds (denature), 3.60 1 minute (annealing and extension) 40 cycles).
2)エキソン23の欠落について
PCR法による検出
Long PCR法を用いずに一般的なPCRで判定できるように新たなWT_エキソン23検出用プライマー、DEL_エキソン23検出用プライマーを設定してPCRを行った。PCRとして、50ngのヒトゲノムDNA1μl、濃度10pmol/μlの表3に示した配列表配列番号16〜18のFプライマー及びRプライマーの溶液各々0.2μl、ヌクレオチド三リン酸(タカラバイオ社製)各々2.5mMの混合溶液を0.8μl、25mMのMgCl2 1μl、10倍緩衝液(20mMのMgCl2 含有、タカラバイオ社製)1μl、Ex Taq DNAポリメラーゼ(タカラバイオ社製)5units/μlを0.05μl、そして滅菌超純水6.75μlの混合物、計10μlの系にて、PCR装置(Applied Biosystems GeneAmp9700)を用いて増幅した。PCR条件は、95−96℃で3分間、続いて95℃で30秒間(デネーチャー)、55−66℃で30秒間(アニーリング)、72℃で1分間(エクステンション)のサイクルを35サイクル、その後、72℃で10分間の後、4℃に保温とした。
2) Detection of lack of exon 23 by PCR method PCR was performed by setting new WT_exon 23 detection primer and DEL_exon 23 detection primer so that it can be determined by general PCR without using the Long PCR method . As PCR, 1 μl of 50 ng human genomic DNA, 0.2 μl each of the F primer and R primer solutions of SEQ ID NOs: 16 to 18 shown in Table 3 at a concentration of 10 pmol / μl, 2 nucleotide triphosphates (Takara Bio Inc.) each 2 0.8 μl of 5 mM mixed solution, 1 μl of 25 mM MgCl 2, 10 μl buffer (containing 20 mM MgCl 2, manufactured by Takara Bio Inc.), 1 μl of Ex Taq DNA polymerase (manufactured by Takara Bio Inc.), 5 μs / μl, Then, 6.75 μl of sterilized ultrapure water was mixed and a total of 10 μl was amplified using a PCR apparatus (Applied Biosystems GeneAmp 9700). PCR conditions were 95-96 ° C. for 3 minutes, followed by 35 cycles of 95 ° C. for 30 seconds (denature), 55-66 ° C. for 30 seconds (annealing), and 72 ° C. for 1 minute (extension). After 10 minutes at 72 ° C., the temperature was kept at 4 ° C.
その結果、図2で示すように、Wild Typeにおいては、WT_エキソン23検出用プライマー対によって449bpの増幅産物が得られた。また、DEL_エキソン23検出用プライマー対ではプライマー間の距離があるので72℃ 1分間の伸長条件では増幅しなかった。
一方、図3で示すように、Deletion TypeではWT_エキソン23検出用プライマー対ではイントロン22の一部からエキソン23を含み、イントロン23の一部までを含む一続きの塩基配列が欠失しているため、増幅しなかった。また、DEL_エキソン23検出用プライマー対ではこの欠失によりプライマー間の距離が縮み442bpの増幅産物が得られた。
As a result, as shown in FIG. 2, in the Wild Type, an amplification product of 449 bp was obtained by the WT_exon 23 detection primer pair. In addition, since the DEL_exon 23 detection primer pair had a distance between the primers, it was not amplified under the extension condition of 72 ° C. for 1 minute.
On the other hand, as shown in FIG. 3, in the deletion type, the WT_exon 23 detection primer pair includes a part of intron 22 to exon 23, and a continuous base sequence including part of intron 23 is deleted. Therefore, it did not amplify. Further, in the primer pair for detecting DEL_exon 23, the distance between the primers was reduced by this deletion, and an amplification product of 442 bp was obtained.
4.ASの確定的な判定
上記1〜3の工程によって得られた結果より各判定者におけるASの確定的な判定を行った。その結果、表4に示すように、p.R419Q、p.E422K、c.2542delG、DEL_エキソン23、c.3774−3775insC又はp.E1427Kの6種類のバリアントについて変異を調べたところ、これら6種類のバリアントの変異はAS54人中32人に見出され、59.3%という高い頻度でこの6種類のバリアントの変異がASの原因として関与していることが示された。32人の内訳は両染色体17人(31.5%)、片染色体15人(27.8%)であり、この結果によってAS患者の31.5%がこの5種類によって完全に説明可能となった。従って、これら5種類のバリアントの変異を示すもののうち、57.4%がAS患者として確定的な判定がされ得ることが示された。
4). Deterministic determination of AS The deterministic determination of AS in each determiner was performed from the results obtained by the above steps 1 to 3. As a result, as shown in Table 4, mutations were examined for six variants of p.R419Q, p.E422K, c.2542delG, DEL_exon 23, c.3774-3775insC, or p.E1427K. These variants were found in 32 of 54 AS, and it was shown that mutations of these 6 variants were involved in the cause of AS at a high frequency of 59.3%. The breakdown of 32 people is 17 on both chromosomes (31.5%) and 15 on one chromosome (27.8%), and as a result, 31.5% of AS patients can be completely explained by these 5 types. It was. Therefore, it was shown that 57.4% of those showing mutations of these five variants can be definitively determined as AS patients.
AS判定キットの作製
ABCC6遺伝子のバリアントを認識するオリゴヌクレオチド、酵素緩衝液、dNTP、コントロール用試薬、標識用及び/又は検出用試薬、固相支持体、説明書を組み合わせてキットとした。
ABCC6遺伝子変異部位を含むオリゴヌクレオチドとして、次の1)〜5)の1以上のオリゴヌクレオチドを用いた。
1)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1256番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
2)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1264番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
3)ABCC6遺伝子のエキソン19に位置する2542番目の塩基であるGが欠失した塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
4)ABCC6遺伝子のエキソン27に位置する3774番目と3775番目の塩基の間の場所に1個新たなCという塩基が挿入された塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド、
5)ABCC6遺伝子のエキソン30に位置する4279番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド。
Preparation of AS determination kit An oligonucleotide recognizing a variant of the ABCC6 gene, an enzyme buffer, dNTP, a control reagent, a labeling and / or detection reagent, a solid support, and instructions were combined to form a kit.
As the oligonucleotide containing the ABCC6 gene mutation site, one or more of the following 1) to 5) oligonucleotides were used.
1) an oligonucleotide that binds to a base sequence in which the 1256th base located in exon 10 of the ABCC6 gene is A, or an oligonucleotide that binds complementarily thereto,
2) an oligonucleotide that binds to a base sequence in which the 1264th base located in exon 10 of the ABCC6 gene is A or an oligonucleotide that binds complementarily thereto,
3) an oligonucleotide that binds to a nucleotide sequence in which G, which is the base of position 2542, located in exon 19 of ABCC6 gene is deleted or an oligonucleotide that binds complementarily thereto,
4) An oligonucleotide that binds to a base sequence in which one new base C is inserted at a position between the 3774th and 3775th bases located in exon 27 of the ABCC6 gene, or an oligonucleotide that complementarily binds to this. ,
5) An oligonucleotide that binds to a base sequence in which the 4279th base located in exon 30 of the ABCC6 gene is A or an oligonucleotide that binds complementarily thereto.
本発明のASの判定方法を用いることで、ASに対する早期発見、早期治療が可能となる。本発明の判定方法を用いるAS判定キット、AS発症予測キット、AS診療指導キット等の提供は、研究や臨床において有用である。 By using the AS determination method of the present invention, early detection and early treatment for AS are possible. Provision of an AS determination kit, an AS onset prediction kit, an AS medical care instruction kit, and the like using the determination method of the present invention is useful in research and clinical practice.
Claims (5)
1)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する419番目のアミノ酸がR(アルギニン)からQ(グルタミン)に変わる変異又はエキソン10に位置する1256番目の塩基(以下、いずれもスタートコドンのATGのAを1番目とした)がGからAに変わる変異
2)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する422番目のアミノ酸がE(グルタミン酸)からK(リジン)に変わる変異又はエキソン10に位置する1264番目の塩基がGからAに変わる変異
3)ABCC6遺伝子のエキソン27に位置する3774番目と3775番目の塩基の間の場所に1個新たなCという塩基が挿入(インサーション)されてフレームシフトが起こる変異
4)ABCC6遺伝子のエキソン30に位置する1427番目のアミノ酸がE(グルタミン酸)からK(リジン)に変わる変異又はエキソン30に位置する4279番目の塩基がGからAに変わる変異 A method of determining retinitis pigmentosa striae by analyzing ABCC6 gene in DNA obtained from the determination target and the variant is any one of the following 1) to 4).
1) A mutation in which the 419th amino acid located in exon 10 of the ABCC6 gene is changed from R (arginine) to Q (glutamine) or the 1256th base located in exon 10 (hereinafter both are ATG of the start codon ATG 1) 2) mutation in which the amino acid at position 422 located in exon 10 of the ABCC6 gene changes from E (glutamic acid) to K (lysine), or the 1264th base located in exon 10 is G 3) Mutation that changes from A to 3) Mutation in which a new C base is inserted (inserted) into a position between the 3774th and 3775th bases located in exon 27 of ABCC6 gene 4) ABCC6 The 1427th amino acid located in exon 30 of the gene is E (glutamic acid) 4279 th base located mutation or exon 30 changed to K (lysine) from the changes in the G to A mutation
1)ABCC6遺伝子のエキソン19に位置する2542番目の塩基であるGが欠失し、フレームシフトが起こる変異
2)ABCC6遺伝子のイントロン22の5’端から620番目の塩基対からイントロン23の493番目の塩基対までの3897塩基対が欠失する変異 Furthermore, the ABCC6 gene is analyzed, and when the variant is the following 1) or 2), the method of claim 1 is determined as retinitis pigmentosa.
1) Mutation in which G, which is the 2542th base located in exon 19 of ABCC6 gene, is deleted and frame shift occurs 2) 493th base pair from intron 22 of 5th end of intron 22 of ABCC6 gene Mutations that delete 3897 base pairs up to
1)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1256番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド1) An oligonucleotide that binds to a base sequence in which the 1256th base located in exon 10 of the ABCC6 gene is A or an oligonucleotide that binds complementarily thereto
2)ABCC6遺伝子のエキソン10に位置する1264番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド2) An oligonucleotide that binds to a base sequence in which the 1264th base located in exon 10 of the ABCC6 gene is A, or an oligonucleotide that binds complementarily thereto
3)ABCC6遺伝子のエキソン19に位置する2542番目の塩基であるGが欠失した塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド3) An oligonucleotide that binds to a nucleotide sequence that lacks G, which is the 2542th base located in exon 19 of the ABCC6 gene, or an oligonucleotide that binds complementary thereto
4)ABCC6遺伝子のエキソン27に位置する3774番目と3775番目の塩基の間の場所に1個新たなCという塩基が挿入された塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド4) An oligonucleotide that binds to a base sequence in which one new base C is inserted at a position between the 3774th and 3775th bases located in exon 27 of the ABCC6 gene, or an oligonucleotide that complementarily binds to this.
5)ABCC6遺伝子のエキソン30に位置する4279番目の塩基がAである塩基配列に結合するオリゴヌクレオチド又はこれに相補的に結合するオリゴヌクレオチド5) An oligonucleotide that binds to a base sequence in which the 4279th base located in exon 30 of the ABCC6 gene is A or an oligonucleotide that binds complementarily thereto
1)配列表配列番号16に記載のオリゴヌクレオチド1) Oligonucleotide set forth in SEQ ID NO: 16 in the Sequence Listing
2)配列表配列番号17に記載のオリゴヌクレオチド2) Oligonucleotide set forth in SEQ ID NO: 17 in Sequence Listing
3)配列表配列番号18に記載のオリゴヌクレオチド3) Oligonucleotide set forth in SEQ ID NO: 18 in the Sequence Listing
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