JP2017006074A - Peripheral arterial disease inspection method and inspection reagent - Google Patents
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Abstract
Description
本発明は、末梢動脈疾患の発症リスク及び／又は発症の有無を検査する方法並びにその検査用試薬に関する。 The present invention relates to a method for inspecting the risk of developing peripheral arterial disease and / or the presence or absence of onset, and a reagent for the inspection.
末梢動脈疾患（PAD）は、主にアテローム性動脈硬化によって引き起こされる、頸動脈、腸間膜、腎臓、上肢及び下肢を含む複数箇所への血液供給の阻止によって特徴付けられる。下肢動脈の慢性虚血性変化は、当該疾患において最も一般的なものであり、深刻な障害を引き起こし、患者のクオリティオブライフを低減させる。また、PADの患者は、PADではない人々と比較して、およそ３倍の主な心血管疾患発症リスクと死亡率を有することも知られている。PADは、現在、アテローム性動脈硬化関連の血管疾患による死亡の主要原因の第３位であるとみられている。PAD患者数は過去10年間で20％増加しており、罹患率は全世界的に増加すると予想されている。 Peripheral arterial disease (PAD) is characterized by the blockage of blood supply to multiple locations, including the carotid artery, mesentery, kidneys, upper limbs and lower limbs, mainly caused by atherosclerosis. Chronic ischemic changes in the lower limb arteries are the most common in the disease, causing serious disability and reducing the patient's quality of life. It is also known that patients with PAD have approximately three times the major risk of developing cardiovascular disease and mortality compared to non-PAD people. PAD is currently seen as the third leading cause of death from atherosclerosis-related vascular disease. The number of PAD patients has increased by 20% over the past decade, and morbidity is expected to increase worldwide.
これまでに知られているPADのリスクファクターとしては、性別、年齢、及び喫煙が挙げられており、高血圧、脂質代謝異常、及び糖尿等の病気とも関連していることが知られている。それらの病気自体は遺伝的な感受性を有するが、ポジティブなPAD家族歴はPADとは独立した予測因子であることが示されていた。スウェーデンの双生児レジストリは、PADに罹患している双子間ではPADがハイリスクであることを報告しており、遺伝的な効果及び共有しない環境効果における発症率変動が、それぞれ58％と42％であると見積もった（非特許文献１）。PADについて、同胞研究に加えて、多数の候補遺伝子及び連鎖解析が行われたが、全体を通して決定的なものは未だに知られていない（非特許文献２）。PADは、複数の環境ファクターによって影響される多遺伝子性の疾患であると考えられているので、遺伝的ファクターを同定するにはより体系的なアプローチが必要とされていた。 Known risk factors for PAD include gender, age, and smoking, and are known to be associated with diseases such as hypertension, dyslipidemia, and diabetes. Although the diseases themselves have genetic susceptibility, positive PAD family history has been shown to be a predictor independent of PAD. Swedish twin registries report that PAD is at high risk among twins with PAD, with 58% and 42% variation in genetic and non-shared environmental effects, respectively. It was estimated that there was (Nonpatent literature 1). In addition to sibling research, many candidate genes and linkage analyzes have been performed on PAD, but what is definitive throughout is still unknown (Non-Patent Document 2). Since PAD is thought to be a polygenic disease affected by multiple environmental factors, a more systematic approach was needed to identify genetic factors.
本発明は、末梢動脈疾患（PAD）を検査する方法、並びに該方法に用いられる検査用試薬を提供することを課題とする。 An object of the present invention is to provide a method for examining peripheral arterial disease (PAD), and a test reagent used in the method.
本発明者らは、PADの感受性部位を同定するために、431,754個の一塩基多型（SNP）を使用して、日本人集団の785名の患者群と3,383名の対照群におけるゲノムワイド関連解析（GWAS）を行った。総計3,164名の患者群と20,134名の対照群を含む段階的な解析の後、本発明者らは、3つの新規なPAD感受性遺伝子を、IPO5/RAP2A、EDNRA及びHDAC9の近傍部位にゲノムワイド有意性をもって同定した。そして、これらの多型を調べることにより、PADの発症リスクおよび／または発症の有無を検査できることを見出し、本発明を完成するに至った。 We used 431,754 single nucleotide polymorphisms (SNPs) to identify sensitive sites for PAD and used a genome-wide association in 785 patient groups and 3,383 control groups in the Japanese population Analysis (GWAS) was performed. After a step-by-step analysis involving a total of 3,164 patient groups and 20,134 control groups, we found that three novel PAD susceptibility genes were genome-wide significant in the vicinity of IPO5 / RAP2A, EDNRA, and HDAC9. Identified with sex. And by investigating these polymorphisms, it discovered that the onset risk of PAD and / or the presence or absence of onset could be test | inspected, and came to complete this invention.
すなわち、本発明は以下の通りである。
［１］被検者の第13染色体長腕32領域（13q32.2）のIPO5/RAP2A遺伝子近傍に存在する一塩基多型、第4染色体長腕31領域（4q31.2）のEDNRA遺伝子近傍に存在する一塩基多型、及び／若しくは第7染色体短腕21領域（7ｐ21.1）のHDAC9遺伝子近傍に存在する一塩基多型、並びに／又はそれらの塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型を解析し、該解析結果に基づいて被検者の末梢動脈疾患を検査することを特徴とする、末梢動脈疾患の発症リスクおよび／または発症の有無の判定方法。
［２］前記一塩基多型が、配列番号１〜３から選ばれる１種又は２種以上の塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基、及び／又は該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、［１］に記載の方法。
［３］前記末梢動脈疾患が、動脈硬化によるものである、［１］又は［２］に記載の方法。
［４］前記末梢動脈疾患が、四肢の動脈の狭窄又は閉塞を起こすものである、［１］〜［３］のいずれか一に記載の方法。
［５］被検者の第13染色体長腕32領域（13q32.2）のIPO5/RAP2A遺伝子近傍に存在する一塩基多型、第4染色体長腕31領域（4q31.2）のEDNRA遺伝子近傍に存在する一塩基多型、及び／若しくは第7染色体短腕21領域（7ｐ21.1）のHDAC9遺伝子近傍に存在する一塩基多型、並びに／又はそれらの塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型を解析可能なポリヌクレオチドを含む、末梢動脈疾患検査用試薬。
［６］前記一塩基多型が、配列番号１〜３から選ばれる１種又は２種以上の塩基配列の塩基番号１０１番目の塩基に相当する塩基、及び／又は該塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型である、［５］に記載の試薬。
［７］配列番号１〜３から選ばれる塩基配列において、塩基番号１０１番目の塩基を含む１０塩基以上の配列、又はその相補配列を有する末梢動脈疾患検査用プローブ。
［８］配列番号１〜３から選ばれる塩基配列において、塩基番号１０１番目の塩基を含む領域を増幅することのできる末梢動脈疾患検査用プライマー。
［９］IPO5遺伝子からのmRNAまたはタンパク質の発現量を測定する工程を含む、末梢動脈疾患の検査方法。
That is, the present invention is as follows.
[1] Single nucleotide polymorphism in the vicinity of IPO5 / RAP2A gene in the long arm 32 region (13q32.2) of chromosome 13 in the subject, near the EDNRA gene in the long arm 31 region of chromosome 4 (4q31.2) Single nucleotide polymorphisms present and / or single nucleotide polymorphisms present in the vicinity of the HDAC9 gene in the short arm 21 region of chromosome 7 (7p21.1) and / or bases in linkage disequilibrium with those bases A method for determining the onset risk and / or presence of peripheral arterial disease, comprising analyzing single nucleotide polymorphisms and examining a subject's peripheral arterial disease based on the analysis result.
[2] The single nucleotide polymorphism is a base corresponding to the 101st base of the base number 101 of one or more base sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 3, and / or a relationship of linkage disequilibrium with the base. The method according to [1], wherein the base is a single nucleotide polymorphism in the base.
[3] The method according to [1] or [2], wherein the peripheral arterial disease is caused by arteriosclerosis.
[4] The method according to any one of [1] to [3], wherein the peripheral arterial disease causes stenosis or occlusion of an artery of a limb.
[5] Single nucleotide polymorphism existing in the vicinity of the IPO5 / RAP2A gene in the chromosome 13 long arm 32 region (13q32.2) of the subject, in the vicinity of the EDNRA gene in the chromosome 4 long arm 31 region (4q31.2) Single nucleotide polymorphisms present and / or single nucleotide polymorphisms present in the vicinity of the HDAC9 gene in the short arm 21 region of chromosome 7 (7p21.1) and / or bases in linkage disequilibrium with those bases A reagent for testing peripheral arterial disease, comprising a polynucleotide capable of analyzing a single nucleotide polymorphism.
[6] The single nucleotide polymorphism is a base corresponding to the 101st base of the base number 101 of one or more base sequences selected from SEQ ID NOs: 1 to 3, and / or a relationship of linkage disequilibrium with the base. The reagent according to [5], which is a single nucleotide polymorphism in the base in
[7] A probe for examination of peripheral arterial disease having a base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 3, a sequence of 10 bases or more including the base at the 101st base number, or a complementary sequence thereof.
[8] A primer for examining peripheral arterial disease, which can amplify a region containing the base at the 101st base number in the base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 3.
[9] A method for examining peripheral arterial disease, comprising a step of measuring the expression level of mRNA or protein from the IPO5 gene.
本発明によれば、PADの発症リスク（罹患リスク）および／または発症の有無を簡便に検査することができる。したがって、本発明はPADの早期診断による予防や治療に貢献するものである。 According to the present invention, the onset risk (morbidity risk) of PAD and / or the presence or absence of onset can be easily examined. Therefore, the present invention contributes to prevention and treatment by early diagnosis of PAD.
＜１＞本発明の方法
本発明の方法は、ヒトの第13染色体長腕32領域（13q32.2）、第4染色体長腕31領域（4q31.2）、及び第7染色体短腕21領域（7ｐ21.1）に存在するSNPを解析し、該解析結果に基づいて被検者の末梢動脈疾患の発症リスク及び／又は発症の有無を検査することを特徴とする、末梢動脈疾患の発症リスク及び／又は発症の有無の判定方法である。すなわち、本発明において、「検査」とは末梢動脈疾患の発症リスク及び／又は発症の有無の検査を含む。本発明の方法においては、SNPの解析結果を、末梢動脈疾患の発症リスク及び／又は発症の有無と関連付ける。本発明の方法においては、SNPを検査する試料を被検者から得る工程をさらに含めても良い。
<1> Method of the Present Invention The method of the present invention comprises human chromosome 13 long arm 32 region (13q32.2), chromosome 4 long arm 31 region (4q31.2), and chromosome 7 short arm 21 region ( 7p21.1) is analyzed, and the risk of developing peripheral arterial disease and / or the presence or absence of the occurrence of peripheral arterial disease is examined based on the analysis result, This is a method for determining the presence or absence of onset. That is, in the present invention, “examination” includes an examination of the onset risk of peripheral artery disease and / or the presence or absence of onset. In the method of the present invention, the analysis result of SNP is associated with the risk of developing peripheral arterial disease and / or the presence or absence of the onset. The method of the present invention may further include a step of obtaining a sample to be examined for SNP from the subject.
末梢動脈疾患には、末梢動脈において血管の狭窄又は閉塞が起こった結果、血行不良または血流遮断等の血流障害を起こす疾患を全て含む。例えば、閉塞性動脈硬化症やバージャー病等が例示される。末梢動脈には、心臓及び冠動脈以外の動脈を全て含み、例えば、上肢又は下肢等の四肢の動脈、胸部又は腹部の大動脈、腹部内臓の動脈、頚動脈、鎖骨下動脈、腸骨動脈等が含まれる。血管の狭窄又は閉塞は、動脈硬化により生じることが多いが、他に血管炎や形成異常等によっても起こり得るものであり、その原因はいかなるものであってもよい。また、急性及び慢性の狭窄又は閉塞のどちらも含まれる。本発明の方法においては、他疾患との併発例も含む。たとえば、冠動脈等における循環障害を起こす冠動脈疾患を、末梢動脈疾患と併発している例も含む。 Peripheral arterial diseases include all diseases that cause blood flow disorders such as poor circulation or blockage of blood flow as a result of stenosis or occlusion of blood vessels in the peripheral arteries. Examples thereof include obstructive arteriosclerosis and Buerger's disease. Peripheral arteries include all arteries other than the heart and coronary arteries, for example, arteries of the limbs such as the upper limbs or lower limbs, thoracic or abdominal aorta, abdominal visceral arteries, carotid artery, subclavian artery, iliac artery, etc. . A stenosis or occlusion of a blood vessel is often caused by arteriosclerosis, but can also be caused by vasculitis or dysplasia, and the cause thereof may be any. Also included are both acute and chronic stenosis or obstruction. In the method of the present invention, cases involving concurrent with other diseases are also included. For example, an example in which coronary artery disease causing circulatory disturbance in a coronary artery or the like is accompanied with peripheral artery disease is also included.
本発明の方法は、いずれの人種の被検者に対しても用いることができるが、特に、日本人等のアジア人の被検者に好適に用いることができる。また、本発明の方法は、男女いずれの性別、いずれの年齢の被検者に対しても用いることができるが、末梢動脈疾患のリスクファクターが高いとされている男性や高齢者に対して好適に用いることができる。 Although the method of the present invention can be used for subjects of any race, it can be suitably used for Asian subjects such as Japanese. The method of the present invention can be used for subjects of any gender and any age, but is suitable for men and elderly people who are considered to have high risk factors for peripheral arterial disease. Can be used.
本発明の方法は、高齢、喫煙歴あり、糖尿病患者、高血圧患者、及び脂質異常症患者等の動脈硬化の危険因子を有している被検者には好適である。また、チアノーゼ、冷感、蒼白、下肢の委縮、潰瘍、壊死等の局所所見に基づくFontaine分類や、足関節上腕血圧比等の末梢動脈疾患の評価方法により、末梢動脈疾患が疑われる被験者にも好適である。末梢動脈疾患は、重症化すると壊死部を切断しなければならないこともあるため、早期発見及び早期治療が大変重要である。そのため、特に自覚症状がない場合であっても、定期的に健康診断等により本発明の方法を適用することが好ましい。 The method of the present invention is suitable for a subject who has a risk factor of arteriosclerosis, such as elderly patients, smoking history, diabetic patients, hypertensive patients, and dyslipidemic patients. Also, subjects who are suspected of having peripheral arterial disease due to Fontaine classification based on local findings such as cyanosis, coldness, pallor, atrophy of the lower limbs, ulcer, necrosis, and peripheral arterial disease evaluation methods such as ankle brachial blood pressure ratio Is preferred. As peripheral arterial disease becomes severe, necrosis may have to be cut, so early detection and early treatment are very important. For this reason, it is preferable to apply the method of the present invention regularly by a health examination or the like even when there are no subjective symptoms.
第13染色体長腕32領域（13q32.2）のIPO5/RAP2A遺伝子近傍に存在するSNPとしては、ヒトのSNPのID番号：rs9584669を挙げることができる。ここで、rs番号はNational Center
for Biotechnology InformationのdbSNPデータベース（http//www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/SNP/）の登録番号を示す。当該SNPを含む配列情報は、GenBank（https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/）等より入手可能である。IPO5遺伝子としては、例えば、GenBank
Accession No. NC_000013.11 の97953638〜98024296の領域が挙げられる。RAP2A遺伝子としては、例えば、GenBank Accession No. NC_000013.11の97434221〜97467998の領域が挙げられる。本発明における「IPO5/RAP2A遺伝子近傍」とは、IPO5遺伝子またはRAP2A遺伝子から250Kb以内の範囲を意味し、または、図３で示す通り、１３番染色体の９７．０〜９７．３Ｍｂの範囲を意味する。
Examples of SNPs present in the vicinity of the IPO5 / RAP2A gene in the long arm 32 region of chromosome 13 (13q32.2) include human SNP ID number: rs9584669. Where rs number is National Center
The registration number of the dbSNP database (http // www.ncbi.nlm.nih.gov / projects / SNP /) of for Biotechnology Information is shown. Sequence information including the SNP can be obtained from GenBank (https://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank/) and the like. Examples of the IPO5 gene include GenBank
Accession No. NC — 000013.11. Examples of the RAP2A gene include the region of 9743421 to 97467998 of GenBank Accession No. NC — 000013.11. The “near IPO5 / RAP2A gene” in the present invention means a range within 250 Kb from the IPO5 gene or RAP2A gene, or a range of 97.0 to 97.3 Mb of chromosome 13 as shown in FIG. To do.
rs9584669は、GenBank Accession No. NT_009952.15の11458249番目の塩基におけるSNPである。また、この多型は、配列番号１で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるチミン（T）／シトシン（C）の多型を意味し、この塩基がT（リスクアレル）である場合には末梢動脈疾患の可能性または発症リスクが高いと判定できる。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、TT＞TC＞CCの順で末梢動脈疾患の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がTである被験者には、末梢動脈疾患の治療を行うことが考えられる。 rs9584669 is an SNP at the 11458249th base of GenBank Accession No. NT_009952.15. This polymorphism means a polymorphism of thymine (T) / cytosine (C) at the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 1, and this base is T (risk allele). ), It can be determined that there is a high possibility or risk of developing peripheral arterial disease. Moreover, when analyzing in consideration of the genotype, the possibility or the risk of developing peripheral arterial disease is higher in the order of TT> TC> CC. Therefore, it can be considered that a subject whose base is T is treated for peripheral arterial disease.
第4染色体長腕31領域（4q31.2）のEDNRA遺伝子近傍に存在するSNPとしては、ヒトのSNPのID番号：rs6842241を挙げることができる。EDNRA遺伝子としては、NC_000004.12 の147480917〜147544954が例示される。本発明における「EDNRA遺伝子近傍」とは、IEDNRA遺伝子から250Kb以内の範囲を意味し、または、図４で示す通り、４番染色体の１４８．４〜１４８．７Ｍｂの範囲を意味する。rs6842241は、GenBank Accession No. NT_016354.20の88558286番目の塩基におけるSNPである。この多型は、配列番号２で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるシトシン（C）／アデニン（A）の多型を意味し、この塩基がA（リスクアレル）である場合には末梢動脈疾患の可能性又は発症リスクが高いと判定できる。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、AA＞AC＞CCの順で末梢動脈疾患の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がAである被験者には、末梢動脈疾患の治療を行うことが考えられる。 Examples of SNPs present in the vicinity of the EDNRA gene in the long arm 31 region of chromosome 4 (4q31.2) include human SNP ID number: rs6842241. Examples of the EDNRA gene include 147480917 to 147544954 of NC_000004.12. The “near EDNRA gene” in the present invention means a range within 250 Kb from the IEDNRA gene, or a range of 148.4 to 148.7 Mb of chromosome 4 as shown in FIG. rs6842241 is a SNP at the 88558286 base of GenBank Accession No. NT — 016354.20. This polymorphism means a polymorphism of cytosine (C) / adenine (A) at the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 2, and this base is A (risk allele). In some cases, it can be determined that the peripheral arterial disease has a high possibility or risk of onset. In addition, when analyzing in consideration of genotype, the possibility of peripheral arterial disease or the risk of onset is high in the order of AA> AC> CC. Therefore, it is considered that a subject whose base is A is treated for peripheral arterial disease.
第7染色体短腕21領域（7ｐ21.1）のHDAC9遺伝子近傍に存在するSNPとしては、ヒトのSNPのID番号：rs2074633を挙げることができる。HDAC9遺伝子としては、NC_000007.14 の18086942〜18999521が例示される。本発明における「HDAC9遺伝子近傍」とは、HDAC9遺伝子から250Kb以内の範囲を意味し、または、図５で示す通り、７番染色体の１８．９〜１９．２Ｍｂの範囲を意味する。rs2074633は、GenBank Accession No. NT_007819.18の18986297番目の塩基におけるSNPである。この多型は、配列番号３で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるアデニン（A）／グアニン（G）の多型を意味し、この塩基がG（リスクアレル）である場合には末梢動脈疾患の可能性又は発症リスクが高いと判定できる。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、GG＞GA＞AAの順で末梢動脈疾患の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がGである被験者には、末梢動脈疾患の治療を行うことが考えられる。 Examples of SNPs present in the vicinity of the HDAC9 gene in the chromosome 7 short arm 21 region (7p21.1) include human SNP ID number: rs2074633. Examples of the HDAC9 gene include 18086942-18999521 of NC_000007.14. The “near HDAC9 gene” in the present invention means a range within 250 Kb from the HDAC9 gene, or a range of 18.9 to 19.2 Mb of chromosome 7 as shown in FIG. rs2074633 is an SNP at the 18986297th base of GenBank Accession No. NT_007819.18. This polymorphism means an adenine (A) / guanine (G) polymorphism in the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 3, and this base is G (risk allele). In some cases, it can be determined that the peripheral arterial disease has a high possibility or risk of onset. In addition, when analysis is performed in consideration of genotype, the possibility of peripheral arterial disease or the risk of onset is high in the order of GG> GA> AA. Therefore, it is considered that a subject whose base is G is treated for peripheral arterial disease.
本発明においては、上記SNPに相当する塩基を解析する。「上記SNPに相当する塩基」とは、上記配列がSNP以外の位置で個体差等により若干変化していても、その前後配列に鑑みれば、当該SNPであると認定できる塩基を意味する。 In the present invention, a base corresponding to the SNP is analyzed. The “base corresponding to the SNP” means a base that can be recognized as the SNP in view of the sequence before and after the sequence even if the sequence is slightly changed due to individual differences at positions other than the SNP.
また、本発明において解析するSNPは、上記３つのものに限定されず、上記のSNPと連鎖不平衡にあるSNPを解析してもよい。ここで「上記のSNPと連鎖不平衡にあるSNP」とは、上記のSNPとｒ2（連鎖不平衡係数）＞０．５、好ましくはｒ2＞０．８、さらに好ましくはｒ2＞０．９の関係を満たすSNPをいう。また、上記のSNPと連鎖不平衡にあるSNPは、例えば、HapMapデータベース(http://www.hapmap.org/index.html.ja)等を用いて同定する
ことができる。もしくは、３０人程度から採取したＤＮＡの塩基配列を解析し、連鎖不平衡にあるSNPを探索することにより同定してもよい。上記の塩基と連鎖不平衡にある塩基は、遺伝子型を考慮して解析した場合は、リスクアレルのホモ接合体 ＞ リスクアレルと非リスクアレルのへテロ接合体 ＞ 非リスクアレルのホモ接合体の順で末梢動脈疾患の可能性または発症リスクが高い。そのような連鎖不平衡にあるSNPとしては、たとえばrs9556806, rs9805548, rs9556797, rs9556795, rs4001162, rs9556799等が例示される。
In addition, the SNP analyzed in the present invention is not limited to the above three, and an SNP in linkage disequilibrium with the above SNP may be analyzed. Here, “SNP in linkage disequilibrium with the above SNP” means that the above SNP and r 2 (link disequilibrium coefficient)> 0.5, preferably r 2 > 0.8, more preferably r 2 > 0. SNP that satisfies the relationship of .9. Moreover, SNPs in linkage disequilibrium with the above SNPs can be identified using, for example, the HapMap database (http://www.hapmap.org/index.html.ja). Or you may identify by analyzing the base sequence of DNA extract | collected from about 30 persons, and searching for SNP in a linkage disequilibrium. Bases that are in linkage disequilibrium with the above bases, when analyzed in consideration of genotype, are homozygotes for risk alleles> heterozygotes for risk and non-risk alleles> homozygotes for non-risk alleles In order, there is a high probability or risk of developing peripheral arterial disease. Examples of such SNPs in linkage disequilibrium include rs9556806, rs9805548, rs9556797, rs9556795, rs4001162, rs9556799, and the like.
rs9556806は、GenBank Accession No. NT_009952.15の11473598番目の塩基におけるSNPである。この多型は、配列番号３４で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるチミン（T）／グアニン（G）の多型を意味し、この塩基がT（リスクアレル）である場合には末梢動脈疾患の可能性又は発症リスクが高いと判定できる。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、TT＞TG＞GGの順で末梢動脈疾患の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がTである被験者には、末梢動脈疾患の治療を行うことが考えられる。 rs9556806 is a SNP at the 11473598th base of GenBank Accession No. NT_009952.15. This polymorphism means a polymorphism of thymine (T) / guanine (G) in the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 34, and this base is T (risk allele). In some cases, it can be determined that the peripheral arterial disease has a high possibility or risk of onset. Moreover, when analyzing in consideration of the genotype, there is a high possibility of peripheral arterial disease or risk of onset in the order of TT> TG> GG. Therefore, it can be considered that a subject whose base is T is treated for peripheral arterial disease.
rs9805548は、GenBank Accession No. NT_009952.15の11451733番目の塩基におけるSNPである。この多型は、配列番号３５で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるチミン（T）／アデニン（A）の多型を意味し、この塩基がT（リスクアレル）である場合には末梢動脈疾患の可能性又は発症リスクが高いと判定できる。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、TT＞TG＞GGの順で末梢動脈疾患の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がTである被験者には、末梢動脈疾患の治療を行うことが考えられる。 rs9805548 is an SNP at the 11451733th base of GenBank Accession No. NT_009952.15. This polymorphism means a polymorphism of thymine (T) / adenine (A) at the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 35, and this base is T (risk allele). In some cases, it can be determined that the peripheral arterial disease has a high possibility or risk of onset. Moreover, when analyzing in consideration of the genotype, there is a high possibility of peripheral arterial disease or risk of onset in the order of TT> TG> GG. Therefore, it can be considered that a subject whose base is T is treated for peripheral arterial disease.
rs9556797は、GenBank Accession No. NT_009952.15の11454416番目の塩基におけるSNPである。この多型は、配列番号３６で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるシトシン（C）／アデニン（A）の多型を意味し、この塩基がC（リスクアレル）である場合には末梢動脈疾患の可能性又は発症リスクが高いと判定できる。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、CC＞CA＞AAの順で末梢動脈疾患の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がCである被験者には、末梢動脈疾患の治療を行うことが考えられる。 rs9556797 is an SNP at the 11454416th base of GenBank Accession No. NT_009952.15. This polymorphism means a cytosine (C) / adenine (A) polymorphism in the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 36, and this base is C (risk allele). In some cases, it can be determined that the peripheral arterial disease has a high possibility or risk of onset. In addition, when analyzing in consideration of genotype, the possibility of peripheral arterial disease or the risk of onset is high in the order of CC> CA> AA. Therefore, it is considered that a subject whose base is C is treated for peripheral arterial disease.
rs9556795は、GenBank Accession No. NT_009952.15の11449746番目の塩基におけるSNPである。この多型は、配列番号３７で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるアデニン（A）／シトシン（C）の多型を意味し、この塩基がA（リスクアレル）である場合には末梢動脈疾患の可能性又は発症リスクが高いと判定できる。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、AA＞AC＞CCの順で末梢動脈疾患の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がAである被験者には、末梢動脈疾患の治療を行うことが考えられる。 rs9556795 is a SNP at the 11449746th base of GenBank Accession No. NT_009952.15. This polymorphism means an adenine (A) / cytosine (C) polymorphism in the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 37, and this base is A (risk allele). In some cases, it can be determined that the peripheral arterial disease has a high possibility or risk of onset. In addition, when analyzing in consideration of genotype, the possibility of peripheral arterial disease or the risk of onset is high in the order of AA> AC> CC. Therefore, it is considered that a subject whose base is A is treated for peripheral arterial disease.
rs4001162は、GenBank Accession No. NT_009952.15の11451928番目の塩基におけるSNPである。この多型は、配列番号３８で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるチミン（T）／アデニン（A）の多型を意味し、この塩基がT（リスクアレル）である場合には末梢動脈疾患の可能性又は発症リスクが高いと判定できる。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、TT＞TA＞AAの順で末梢動脈疾患の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がTである被験者には、末梢動脈疾患の治療を行うことが考えられる。 rs4001162 is an SNP at the 11451928th base of GenBank Accession No. NT_009952.15. This polymorphism means a thymine (T) / adenine (A) polymorphism in the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 38, and this base is T (risk allele). In some cases, it can be determined that the peripheral arterial disease has a high possibility or risk of onset. Moreover, when analyzing in consideration of the genotype, there is a high possibility of peripheral arterial disease or risk of onset in the order of TT> TA> AA. Therefore, it can be considered that a subject whose base is T is treated for peripheral arterial disease.
rs9556799は、GenBank Accession No. NT_009952.15の11455876番目の塩基におけるSNPである。この多型は、配列番号３９で表される塩基配列の第１０１番目の塩基に相当する塩基におけるシトシン（C）／チミン（T）の多型を意味し、この塩基がC（リスクアレル
）である場合には末梢動脈疾患の可能性又は発症リスクが高いと判定できる。また、遺伝子型を考慮して解析した場合は、CC＞CT＞TTの順で末梢動脈疾患の可能性または発症リスクが高い。よって、この塩基がCである被験者には、末梢動脈疾患の治療を行うことが考えられる。
rs9556799 is an SNP at the 11455876th base of GenBank Accession No. NT_009952.15. This polymorphism means a cytosine (C) / thymine (T) polymorphism in the base corresponding to the 101st base of the base sequence represented by SEQ ID NO: 39, and this base is C (risk allele). In some cases, it can be determined that the peripheral arterial disease has a high possibility or risk of onset. Moreover, when analyzing in consideration of the genotype, the possibility of peripheral arterial disease or the risk of onset is high in the order of CC>CT> TT. Therefore, it is considered that a subject whose base is C is treated for peripheral arterial disease.
上記SNPの塩基の種類を調べ、得られた結果を上記基準に基づいて末梢動脈疾患と関連付けることにより、末梢動脈疾患を検査することができる。なお、いずれのSNPも、二本鎖ＤＮＡのセンス鎖とアンチセンス鎖のどちらを解析してもよい。 By examining the type of the SNP base and associating the obtained result with the peripheral arterial disease based on the above criteria, the peripheral arterial disease can be examined. In addition, any SNP may analyze either the sense strand or the antisense strand of the double-stranded DNA.
上記SNPは単独で解析されてもよいし、上記SNPの少なくとも１つを含む複数のSNPをまとめてハプロタイプ解析してもよい。または、上記SNPの少なくとも１つと、末梢動脈疾患との関連が示唆されているSNPや、当該示唆されているSNPと連鎖不平衡にあるSNPとを組み合わせて解析してもよい。検査の精度を向上するために、末梢動脈疾患と関連する複数のSNPをまとめて解析することが好ましい。 The SNP may be analyzed alone, or a plurality of SNPs including at least one of the SNPs may be collectively analyzed for haplotype analysis. Alternatively, at least one of the above SNPs may be analyzed in combination with an SNP that has been suggested to be associated with peripheral arterial disease, or an SNP that is in linkage disequilibrium with the suggested SNP. In order to improve the accuracy of the examination, it is preferable to collectively analyze a plurality of SNPs related to peripheral arterial disease.
SNPの解析に用いる試料としては、染色体ＤＮＡを含む試料であれば特に制限されない。例えば、血液、尿等の体液、口腔粘膜等の細胞、毛髪等の体毛、及び爪などが挙げられる。SNPの解析にはこれらの試料を直接使用することもできるが、これらの試料から染色体ＤＮＡを常法により単離したものを用いて解析することが好ましい。 The sample used for SNP analysis is not particularly limited as long as it is a sample containing chromosomal DNA. Examples include body fluids such as blood and urine, cells such as oral mucosa, body hair such as hair, and nails. Although these samples can be used directly for the analysis of SNP, it is preferable to analyze them using chromosomal DNA isolated from these samples by a conventional method.
SNPの解析は、通常の遺伝子多型解析方法によって行うことができる。例えば、シークエンス解析、ＰＣＲ、ハイブリダイゼーション、インベーダー法などが挙げられるが、これらに限定されない。 Analysis of SNP can be performed by an ordinary gene polymorphism analysis method. Examples include, but are not limited to, sequence analysis, PCR, hybridization, invader method and the like.
シークエンス解析は、通常の方法により行うことができる。具体的には、SNPから数十塩基５’側に離れた位置にプライマーを設定し、そのプライマーを使用してシークエンス反応を行い、その解析結果から、該当するSNPがどの種類の塩基であるかを決定することができる。なお、シークエンス反応の前に、ＰＣＲなどによって、あらかじめSNP部位を含む断片を増幅しておくことが好ましい。 Sequence analysis can be performed by a normal method. Specifically, a primer is set at a position several tens of bases 5 'away from the SNP, a sequencing reaction is performed using the primer, and based on the analysis results, which type of base the corresponding SNP is. Can be determined. In addition, it is preferable to amplify the fragment containing the SNP site in advance by PCR or the like before the sequencing reaction.
また、SNPの解析は、ＰＣＲによる増幅の有無を調べることによって行うことができる。例えば、プライマーの３’末端が各SNPの位置となるように、プライマーを設計する。それぞれのプライマーを使用してＰＣＲを行い、増幅産物の有無によってどのタイプの多型であるかを決定することができる。また、ＬＡＭＰ法（特許第３３１３３５８号明細書）、ＮＡＳＢＡ法（Nucleic Acid Sequence-Based Amplification；特許２８４３５８６号明細書）、ＩＣＡＮ法（特開２００２−２３３３７９号公報）、ＳｍａｒｔＡｍｐ法（特許第３８９７８０５号明細書）などによっても増幅の有無を調べることができる。その他、単鎖増幅法を用いてもよい。 SNP analysis can be performed by examining the presence or absence of amplification by PCR. For example, the primer is designed so that the 3 'end of the primer is positioned at each SNP. PCR can be performed using each primer, and the type of polymorphism can be determined depending on the presence or absence of the amplification product. Also, the LAMP method (Japanese Patent No. 3313358), NASBA method (Nucleic Acid Sequence-Based Amplification; Japanese Patent No. 2844386), ICAN method (Japanese Patent Laid-Open No. 2002-233379), SmartAmp method (Japanese Patent No. 3897805) The presence or absence of amplification can also be examined by means of ( In addition, a single-strand amplification method may be used.
また、SNP部位を含むＤＮＡ断片を増幅し、増幅産物の電気泳動における移動度の違いによって、どのタイプの多型であるかを決定することもできる。このような方法としては、例えば、ＰＣＲ−ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法（Genomics. 1992 Jan 1; 12(1): 139-146.）が挙げられる。具体的には、まず、目的のSNPを含むＤＮＡを増幅し、増幅したＤＮＡを一本鎖ＤＮＡに解離させる。次いで、解離させた一本鎖ＤＮＡを非変性ゲル上で分離し、分離した一本鎖ＤＮＡのゲル上での移動度の違いによってどのタイプの多型であるかを決定することができる。 It is also possible to amplify a DNA fragment containing an SNP site and determine which type of polymorphism is based on the difference in mobility in electrophoresis of the amplified product. An example of such a method is a PCR-SSCP (single-strand conformation polymorphism) method (Genomics. 1992 Jan 1; 12 (1): 139-146.). Specifically, first, DNA containing the target SNP is amplified, and the amplified DNA is dissociated into single-stranded DNA. Next, the dissociated single-stranded DNA is separated on a non-denaturing gel, and the type of polymorphism can be determined by the difference in mobility of the separated single-stranded DNA on the gel.
さらに、多型を示す塩基が制限酵素認識配列に含まれる場合は、制限酵素による切断の有無によって解析することもできる（ＲＦＬＰ法）。この場合、まず、ＤＮＡ試料を制限酵素により切断する。次いで、ＤＮＡ断片を分離し、検出されたＤＮＡ断片の大きさによ
ってどのタイプの多型であるかを決定することができる。
Furthermore, when a base showing polymorphism is included in the restriction enzyme recognition sequence, it can be analyzed by the presence or absence of cleavage by a restriction enzyme (RFLP method). In this case, first, the DNA sample is cleaved with a restriction enzyme. The DNA fragments can then be separated and the type of polymorphism determined by the size of the detected DNA fragment.
他に、DNAチップ等によりハイブリダイゼーションの有無を調べることによって、多型の種類を解析することも可能である。すなわち、各塩基に対応するプローブを用意し、いずれのプローブにハイブリダイズするかを調べることによって、SNPがいずれの塩基であるかを調べることもできる。 In addition, the type of polymorphism can be analyzed by examining the presence or absence of hybridization using a DNA chip or the like. That is, by preparing a probe corresponding to each base and investigating which probe hybridizes, it is possible to examine which base the SNP is.
また、DNA三重鎖構造を特異的に認識して切断するクリベース、インベーダーと呼ばれる遺伝子多型を認識するプローブ、及び、蛍光シグナルを発生するよう設計されたプローブを使用するインベーダー法により、多型解析をしてもよい。 In addition, polybase analysis is performed by an invader method that uses a DNA base that specifically recognizes and cleaves a DNA triplex structure, a probe that recognizes a gene polymorphism called invader, and a probe designed to generate a fluorescent signal. You may do.
本発明の方法の具体的態様の一例としては、まず上記SNPに相当する塩基を解析し、被検者の塩基の種類を決定する。次に、当該塩基の種類がリスクアレルである場合には、末梢動脈疾患の可能性又は発症リスクが高く、非リスクアレルである場合には低いと判定し、検査結果として被験者に直接或いは医師等に情報を提供することができる。当該判定は、被験者の塩基の種類がリスクアレルであるか非リスクアレルであるかによって機械的に振り分けるものである。従って、本発明の方法に基づく発症リスクの判定及びその情報の提供は、医師等による専門的な判断は要さない。 As an example of a specific embodiment of the method of the present invention, first, a base corresponding to the above SNP is analyzed to determine the type of the subject's base. Next, if the type of base is a risk allele, the possibility or risk of developing peripheral arterial disease is high, and if it is a non-risk allele, it is determined to be low, and the test result is directly to the subject or a doctor Can provide information. The determination is mechanically distributed depending on whether the type of the base of the subject is a risk allele or a non-risk allele. Therefore, determination of the onset risk based on the method of the present invention and provision of information thereof do not require professional judgment by a doctor or the like.
提供された検査結果に基づき、必要に応じて医師等に提供され、医師等が被験者に対して処置を行うことができる。たとえば、末梢動脈疾患の発症リスクが高いとの判定結果が出た被験者に対しては、まず、現在既に発症しているか否かを、画像診断等のより詳細な検査を行うことによって確認することが重要である。末梢動脈疾患は、初期症状が足の痛みやしびれといった軽度の場合もあり、患者本人が自覚症状を訴えていないこともある。しかし、自覚症状がなくても、狭窄や閉塞が既に起こっている場合もあるため、より詳細な検査を行って、早期治療を行うことが好ましい。詳細な検査でも発症が確認できない場合には、その後定期的に検査を行い、発症の有無を確認することができる。一方、発症リスクが低いとの判定結果が出た被験者に対しては、受診・検査の頻度、回数を減じることができる。このように、本発明の方法を行うことにより、受診の回数や検査の方法を適切に設定し、末梢動脈疾患患者やその疑いのある患者、医療従事者等の医学的、経済的負担、労力を軽減することができる。 Based on the provided test result, it is provided to a doctor or the like as needed, and the doctor or the like can perform treatment on the subject. For example, for subjects who are judged to have a high risk of developing peripheral arterial disease, first confirm whether or not it has already developed by conducting a more detailed examination such as diagnostic imaging. is important. Peripheral artery disease may have mild initial symptoms such as foot pain or numbness, and the patient may not complain of subjective symptoms. However, even if there is no subjective symptom, stenosis or occlusion may have already occurred, so it is preferable to conduct early treatment by conducting a more detailed examination. If the onset cannot be confirmed even by a detailed examination, then it can be periodically examined to confirm the presence or absence of onset. On the other hand, the frequency and frequency of medical examinations / tests can be reduced for subjects who have been judged to have a low risk of onset. In this way, by performing the method of the present invention, the number of medical examinations and the method of examination are appropriately set, and the medical and economic burdens and labor of peripheral arterial disease patients, suspected patients, medical workers, etc. Can be reduced.
＜２＞本発明の検査用試薬
本発明は、被検者の第13染色体長腕32領域（13q32.2）のIPO5/RAP2A遺伝子近傍に存在する一塩基多型、第4染色体長腕31領域（4q31.2）のEDNRA遺伝子近傍に存在する一塩基多型、及び／若しくは第7染色体短腕21領域（7ｐ21.1）のHDAC9遺伝子近傍に存在する一塩基多型、並びに／又はそれらの塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基における一塩基多型を解析可能なポリヌクレオチドを含む、末梢動脈疾患を検査するための検査試薬を提供する。上記「＜１＞本発明の方法」において説明された事項は、本発明の検査用試薬の説明に全て適用される。当該ポリヌクレオチドとしては、プライマーやプローブなどが含まれるが、それらに限定されない。また、１つのSNPを検出可能なポリヌクレオチドを、単独で検査試薬に含めてもよいし、当該ポリヌクレオチドを複数含めてもよい。検査の精度を向上するために、複数のポリヌクレオチドにより複数のSNPを検査することが好ましい。さらに、非リスクアレルを検出可能なポリヌクレオチドを含めてもよい。
<2> Test reagent of the present invention The present invention is a single nucleotide polymorphism present in the vicinity of the IPO5 / RAP2A gene of the chromosome 13 long arm 32 region (13q32.2) of the subject, and the chromosome 4 long arm 31 region. (4q31.2) single nucleotide polymorphism near the EDNRA gene and / or single nucleotide polymorphism near the HDAC9 gene of chromosome 7 short arm 21 region (7p21.1) and / or their bases The present invention provides a test reagent for testing peripheral arterial disease, comprising a polynucleotide capable of analyzing a single nucleotide polymorphism in a base that is in linkage disequilibrium with the base sequence. The matters described in the above “<1> Method of the present invention” are all applied to the description of the test reagent of the present invention. Such polynucleotides include, but are not limited to, primers and probes. In addition, a polynucleotide capable of detecting one SNP may be included alone in the test reagent, or a plurality of such polynucleotides may be included. In order to improve the accuracy of the test, it is preferable to test a plurality of SNPs using a plurality of polynucleotides. Furthermore, a polynucleotide capable of detecting a non-risk allele may be included.
上記プローブとしては、上記SNP部位を含み、ハイブリダイズの有無によってSNP部位の塩基の種類を判定できるプローブが挙げられる。具体的には、配列番号１〜３から選ばれる塩基配列の１０１番目の塩基を含む配列、又はその相補配列を有する連続した１０塩基以上の長さのプローブや、当該１０１番目の塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む配列、又はその相補配列を有する連続した１０塩基以上の長さのプローブが挙げられる。プ
ローブの長さは、好ましくは１０〜５０塩基であり、より好ましくは１５〜４０塩基であり、さらに好ましくは２０〜３５塩基である。複数のプローブを含むセットとしてもよい。
Examples of the probe include a probe that includes the SNP site and can determine the type of base at the SNP site based on the presence or absence of hybridization. Specifically, a sequence containing the 101st base of the base sequence selected from SEQ ID NOS: 1 to 3, or a probe having a length of 10 or more consecutive bases having a complementary sequence thereof, or a sequence not linked to the 101st base. Examples thereof include a probe having a length of 10 bases or more having a sequence containing bases in an equilibrium relationship or a complementary sequence thereof. The length of the probe is preferably 10 to 50 bases, more preferably 15 to 40 bases, and further preferably 20 to 35 bases. A set including a plurality of probes may be used.
上記プライマーとしては、上記SNP部位を増幅するためのＰＣＲに用いることのできるプライマー、又は上記SNP部位を配列解析（シークエンシング）するために用いることのできるプライマーが挙げられる。具体的には、配列番号１〜３から選ばれる塩基配列の１０１番目の塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーや、当該１０１番目の塩基と連鎖不平衡の関係にある塩基を含む領域を増幅したりシークエンシングしたりすることのできるプライマーが挙げられる。このようなプライマーの長さは１０〜５０塩基が好ましく、１５〜５０塩基がより好ましく、１５〜３５塩基がさらに好ましく、２０〜３５塩基が特に好ましい。プライマーは、単独であってもよいし、または、SNP部位の５’側領域のプライマー及びSNP部位の３’側領域のプライマーを含むプライマーセットであってもよい。複数のプライマーセットを含むセットとしてもよい。 Examples of the primer include a primer that can be used for PCR for amplifying the SNP site, or a primer that can be used for sequence analysis (sequencing) of the SNP site. Specifically, a primer capable of amplifying or sequencing a region containing the 101st base of the base sequence selected from SEQ ID NOs: 1 to 3, or a linkage disequilibrium relationship with the 101st base Examples include primers that can amplify or sequence a region containing a certain base. The length of such a primer is preferably 10 to 50 bases, more preferably 15 to 50 bases, further preferably 15 to 35 bases, and particularly preferably 20 to 35 bases. The primers may be used alone or may be a primer set including a primer in the 5 'region of the SNP site and a primer in the 3' region of the SNP site. It is good also as a set containing a some primer set.
上記SNP部位をシークエンシングするためのプライマーとしては、上記塩基の５’側領域、好ましくは３０〜１００塩基上流の配列を有するプライマーや、上記塩基の３’側領域、好ましくは３０〜１００塩基下流の領域に相補的な配列を有するプライマーが例示される。ＰＣＲによる増幅の有無で多型を判定するために用いるプライマーとしては、上記塩基を含む配列を有し、上記塩基を３’側に含むプライマーや、上記塩基を含む配列の相補配列を有し、上記塩基の相補塩基を３’側に含むプライマーなどが例示される。 As a primer for sequencing the SNP site, a primer having a 5′-side region of the base, preferably 30 to 100 bases upstream, or a 3′-side region of the base, preferably 30 to 100 bases downstream A primer having a sequence complementary to this region is exemplified. As a primer used to determine polymorphism based on the presence or absence of amplification by PCR, it has a sequence containing the base, a primer containing the base on the 3 ′ side, a complementary sequence of the sequence containing the base, Examples include a primer containing a base complementary to the above base on the 3 ′ side.
なお、本発明の検査用試薬は、これらのプライマーやプローブに加えて、ＰＣＲ用のポリメラーゼやバッファー、ハイブリダイゼーション用試薬、蛍光色素などを含むものであってもよい。 The test reagent of the present invention may contain PCR polymerase, buffer, hybridization reagent, fluorescent dye and the like in addition to these primers and probes.
＜３＞IPO5遺伝子の発現量に基づく検査方法
本発明はまた、IPO5遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量を測定する工程を含む、末梢動脈疾患の検査方法（検査データを得る方法）を提供する。上記「＜１＞本発明の方法」または「＜２＞本発明の検査用試薬」において説明された事項は、本項におけるIPO5遺伝子の発現量に基づく検査方法の説明に全て適用される。IPO5遺伝子のmRNAまたはタンパク質の発現量が健常人などの対照と比べて減少している場合、末梢動脈疾患に罹患している、または末梢動脈疾患の危険性が高いと判定することができる。本発明の検査方法においては、発現量を測定する試料を検査対象者から得る工程をさらに含めても良い。
<3> Test Method Based on IPO5 Gene Expression Level The present invention also provides a peripheral arterial disease test method (method for obtaining test data), which includes a step of measuring the expression level of IPO5 gene mRNA or protein. The matters described in the above “<1> the method of the present invention” or “<2> the test reagent of the present invention” are all applied to the description of the test method based on the expression level of the IPO5 gene in this section. When the expression level of the mRNA or protein of the IPO5 gene is decreased as compared with a control such as a healthy person, it can be determined that the patient is suffering from peripheral arterial disease or has a high risk of peripheral arterial disease. In the test | inspection method of this invention, you may further include the process of obtaining the sample which measures expression level from a test subject.
IPO5遺伝子の発現量は、ＲＴ−ＰＣＲ、ノーザンブロット、マイクロアレイ法などで調べることができる。また、IPO5遺伝子産物の発現量はＥＬＩＳＡ、ウエスタンブロットなどで調べることができる。それら測定に使用する抗IPO5抗体は、市販の抗体を用いることもできるし、公知のIPO5蛋白質のアミノ酸配列（例えば、配列番号３３）の一部を抗原として作製された抗体を用いることもできる。IPO5のコード領域の塩基配列としては配列番号３２が例示され、この配列等を利用して発現解析用プライマーやプローブなどを設計または取得することができる。検査に用いる試料としては、血液、尿、髄液等の体液、子宮頸部や口腔粘膜などの細胞、毛髪等の体毛などが挙げられる。 The expression level of the IPO5 gene can be examined by RT-PCR, Northern blot, microarray method and the like. The expression level of the IPO5 gene product can be examined by ELISA, Western blot, or the like. As the anti-IPO5 antibody used for these measurements, a commercially available antibody can be used, or an antibody prepared by using a part of a known IPO5 protein amino acid sequence (for example, SEQ ID NO: 33) as an antigen can also be used. SEQ ID NO: 32 is exemplified as the base sequence of the coding region of IPO5, and primers or probes for expression analysis can be designed or obtained using this sequence or the like. Samples used for the test include body fluids such as blood, urine, and cerebrospinal fluid, cells such as the cervix and oral mucosa, and body hairs such as hair.
以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。但し、本発明はこれらの実施例に限定されない。 Hereinafter, the present invention will be described more specifically with reference to examples. However, the present invention is not limited to these examples.
１．実験方法
＜研究対象集団＞
今回のGWAS及びフォローアップステージに使用された患者群と対照群のサンプルの多くは、バイオバンクジャパンから得られた（Nakamura, Y. (2007) The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol., 5, 696-697）。再現解析における患者群サンプルのサブセットは、東京医科大学病院、東京大学医学部付属病院及び関連病院から、2009年9月から2014年９月に得られた。
1. Experimental method <Research group>
Many of the patient and control samples used in this GWAS and follow-up stage were obtained from Biobank Japan (Nakamura, Y. (2007) The BioBank Japan Project. Clin Adv Hematol Oncol., 5, 696-697). Subsets of patient group samples in reproducibility analysis were obtained from September 2009 to September 2014 from Tokyo Medical University Hospital, University of Tokyo Hospital and related hospitals.
バイオバンク・ジャパンプロジェクトは、日本の全ての地域における66病院の共同ネットワークにより、47疾患のいずれかに診断された約300,000名の患者からのゲノムDNA、血清及び臨床情報の収集を目的として、2003年に開始された。GWAS解析のために、2003年5月から2006年12月の間にバイオバンク・ジャパンにおいて収集されたPAD患者が、臨床情報を確認した後に使用された。臨床情報（足関節・上腕血圧指数、Fontaine分類）によれば、全ての患者はPADであると診断されていた。全ての研究対象者には、本研究に参加する旨のインフォームドコンセントを行った。本研究のプロトコールは、理化学研究所統合生命医科学研究センター、東京医科大学、東京大学及び関連病院の倫理委員会によって承認された。 Biobank Japan Project aims to collect genomic DNA, serum and clinical information from approximately 300,000 patients diagnosed with any of 47 diseases by a joint network of 66 hospitals in all regions of Japan. Started in the year. For GWAS analysis, PAD patients collected at Biobank Japan between May 2003 and December 2006 were used after confirming clinical information. According to clinical information (ankle / brachial blood pressure index, Fontaine classification), all patients were diagnosed with PAD. All subjects were given informed consent to participate in this study. The protocol for this study was approved by the ethics committees of RIKEN Center for Integrated Biomedical Sciences, Tokyo Medical University, University of Tokyo, and related hospitals.
＜SNP遺伝子型解析＞
患者群サンプルはIllumina HumanHap610-Quad BeadChipにより遺伝子型解析され、対照群はIllumina HumanHap550v3により遺伝子型解析された。厳格なクオリティコントロール基準を適用し、785名の患者群と3,383名の対照群を、両方のBeadChipにおいて利用可能な431,754常染色体SNPについて検討した。GWASでは、SNPクオリティコントロール（患者群と対照群の両方において0.99以上のコールレート、及び対照群においてハーディワインバーグ平衡テストがP≧1.0×10-6）を適用した。全ての染色体上の431,754SNPが、そのクオリティコントロールフィルターをパスしたので、さらに解析された。
<SNP genotype analysis>
The patient group samples were genotyped by Illumina HumanHap610-Quad BeadChip, and the control group was genotyped by Illumina HumanHap550v3. Applying strict quality control criteria, 785 patient groups and 3,383 control groups were examined for available 431,754 autosomal SNPs in both BeadChips. In GWAS, SNP quality control was applied (call rate of 0.99 or higher in both patient and control groups, and Hardy-Weinberg equilibrium test P ≧ 1.0 × 10 −6 in the control group). 431,754 SNPs on all chromosomes passed the quality control filter and were further analyzed.
フォローアップステージにおける全ての対照群サンプルは、Illumina HumanHap610-Quad BeadChipを使用して遺伝子型解析された。rs9584669におけるIllumina遺伝子型解析の正確性を確認するために、Invader assay (Third Wave Technologies)（Ohnishi,Y., (2001) J Hum Genet., 46, 471-477）を使用してダイレクト遺伝子型解析を行ったところ、Invader assayとIllumina遺伝子型解析との結果の間に不一致は見られなかった。全てのクラスタープロットは、熟練した人材による外観検査により確認され、不明確なコールを有するSNPは除外された。フォローアップステージにおける患者群には、multiplex PCR-based Invader Assayを使用した。 All control samples in the follow-up stage were genotyped using an Illumina HumanHap610-Quad BeadChip. Direct genotyping using Invader assay (Third Wave Technologies) (Ohnishi, Y., (2001) J Hum Genet., 46, 471-477) to confirm the accuracy of Illumina genotyping in rs9584669 As a result, there was no discrepancy between the results of Invader assay and Illumina genotype analysis. All cluster plots were confirmed by visual inspection by skilled personnel, and SNPs with ambiguous calls were excluded. Multiplex PCR-based Invader Assay was used for the patient group in the follow-up stage.
＜統計解析＞
SNPとPADとの間の関連性解析は、コクラン・アーミテージの傾向検定により評価された。GWASの有意なレベルは、多重テストのためのボンフェローニ補正後において1.2 x 10-7(0.05/431,754)にセットされた。さらにGWASの結果を確認することを目的として、さらに1,150名の患者及び16,752名の対照群において再現解析をするために、コクラン・アーミテージの傾向検定のP値が最も有意であった500SNPが選択された。選択された500個のSNPの中で、145個のSNPが、Haploviewソフトウェアにより評価されたような他の選択されたマーカーと共に、強い連鎖不平衡の証拠（ｒ2＞0.8）を示した。
<Statistical analysis>
Association analysis between SNP and PAD was assessed by Cochrane Armitage trend test. The significant level of GWAS was set at 1.2 x 10-7 (0.05 / 431,754) after Bonferroni correction for multiple tests. In order to further confirm the GWAS results, 500 SNPs with the most significant P-value for the Cochrane Armitage trend test were selected for further analysis in 1,150 patients and 16,752 control groups. It was. Of the 500 SNPs selected, 145 SNPs showed evidence of strong linkage disequilibrium (r 2 > 0.8), along with other selected markers as assessed by Haploview software.
次に、さらなる遺伝子型解析のために、355個のSNPが選択された。複合解析は、Mantel-Haenszel法を使用して行われた。潜在的な集団階層化の補正は、遺伝子コントロール法（4Freedman,M.L., (2004) Nat Genet., 36, 388-393.）及び主成分分析（PCA）（Price,A.L., (2006) Nat Genet., 38, 904-909）の結果を使用することにより行われた。 Next, 355 SNPs were selected for further genotyping. Composite analysis was performed using the Mantel-Haenszel method. Potential population stratification correction includes gene control methods (4 Freedman, ML, (2004) Nat Genet., 36, 388-393.) And principal component analysis (PCA) (Price, AL, (2006) Nat Genet. , 38, 904-909).
臨床プロフィールと患者群の遺伝子型との間の関連性は、χ２テストによって、性別の
相違、冠疾患危険因子について検討された。定量的臨床パラメーターについては、one-way ANOVAにより検討された。
Association between clinical profile and the patient group genotype by chi 2 test, the difference in sex was studied coronary disease risk factors. Quantitative clinical parameters were examined by one-way ANOVA.
＜ファインマッピング＞
rs9584669(染色体部位 (NCBI build 38); 97,658,003-97,758,002)周辺の100kbの領域について、48名の患者サンプルを使用してSangerシークエンスを行った。総計249個のSNPが見つかったので、さらに48名のサンプルを使用して、再度シークエンスを行った。MAF≧0.05の191SNPを選択し、そして、25個のタグSNPを選んだ。また、Haploviewソフトウェアを使用して、連鎖不平衡（LD）パターンを解析し、LDブロックを決定した。全てのタグSNPについて、GWAS患者サンプル（n=750）及びGWAS対照群サンプル（n=2,418）を使用して、Invader assayを行った。統計解析は、Mantel-Haenszel法を使用して行われた。
<Fine mapping>
A Sanger sequence was performed on a 100 kb region around rs9584669 (chromosomal site (NCBI build 38); 97,658,003-97,758,002) using 48 patient samples. A total of 249 SNPs were found, so another 48 samples were used and the sequence was repeated. 191 SNPs with MAF ≧ 0.05 were selected and 25 tag SNPs were selected. In addition, Haploview software was used to analyze linkage disequilibrium (LD) patterns and determine LD blocks. All tag SNPs were subjected to Invader assay using GWAS patient samples (n = 750) and GWAS control group samples (n = 2,418). Statistical analysis was performed using the Mantel-Haenszel method.
＜細胞＞
ヒト大動脈平滑筋細胞(HASMC, Gibco（登録商標） Invitrogen cell culture)を平滑筋細胞メディウム(SMCM, ScienCell research laboratories)にて培養し、37℃、5%CO2の湿潤環境にて維持した。
<Cell>
Human aortic smooth muscle cells (HASMC, Gibco (registered trademark) Invitrogen cell culture) were cultured in smooth muscle cell medium (SMCM, ScienCell research laboratories) and maintained in a humid environment of 37 ° C. and 5% CO 2 .
＜ルシフェラーゼアッセイ＞
染色体13q32.2上のIPO5/RAP2A領域にあるH3K27Acシークエンス(UCSC genome browser; http://genome.ucsc.edu)、及びH3K27Acシークエンスの遺伝子断片(染色体位置(NCBI build 38); 97,980,373-97,980,941：IPO5、97,428,261-97,428,846： RAP2A)を、pGL3 basic vector（プロメガ）のマルチプルクローニングサイトにクローニングした。空のpGL3 basic vectorと比較して、ルシフェラーゼ活性の顕著な増加が確認された。
<Luciferase assay>
H3K27Ac sequence in the IPO5 / RAP2A region on chromosome 13q32.2 (UCSC genome browser; http://genome.ucsc.edu), and gene fragment of H3K27Ac sequence (chromosome location (NCBI build 38); 97,980,373-97,980,941: IPO5 97,428,261-97,428,846: RAP2A) was cloned into the multiple cloning site of pGL3 basic vector (Promega). A significant increase in luciferase activity was observed compared to the empty pGL3 basic vector.
次に、目的とするターゲットSNP (rs9584669, rs9556806, rs9805548, rs9556797, rs9556795, rs4001162, rs9556799)を含む下記表１の25bp二重鎖オリゴヌクレオチドを用意し、それらのそれぞれを、H3K27AcシークエンスをクローニングしたGL3 vectorに挿入した。それらのコンストラクトを、nucleofectorTM system (Amaxa)を使用して、ヒト大動脈平滑筋細胞（HASMC）にトランスフェクトした。トランスフェクションから48時間後、ルミノメーター（Centro LB960, BERTHOLD TECHNOLOGIES GmbH & Co. KG）及びデュアルルシフェラーゼレポーターアッセイシステム（プロメガ）を添付のプロトコールに従って使用して、ルシフェラーゼ活性を解析した。各々のサンプルのfirefly/Renillaルシフェラーゼの相対的な値を計算し、同じ実験においてIPO5/RAP2A H3K27AシークエンスをクローニングしたpGL3 vectorの値に基づいて、各々の値を標準化した。空のpGL3-basic vectorはネガティブコントロールとして使用された。各々の実験は独立して３回行われ、各々のサンプルは二重測定された。非リスクアレルとリスクアレルにおける活性の有意差を評価するために、Student’s t-testが行われた。 Next, 25 bp double-stranded oligonucleotides shown in Table 1 below containing target target SNPs (rs9584669, rs9556806, rs9805548, rs9556797, rs9556795, rs4001162, rs9556799) were prepared, and each of them was GL3 obtained by cloning the H3K27Ac sequence. Inserted into vector. These constructs were transfected into human aortic smooth muscle cells (HASMC) using the nucleofector ™ system (Amaxa). 48 hours after transfection, luciferase activity was analyzed using a luminometer (Centro LB960, BERTHOLD TECHNOLOGIES GmbH & Co. KG) and a dual luciferase reporter assay system (Promega) according to the attached protocol. The relative value of firefly / Renilla luciferase for each sample was calculated and each value was normalized based on the value of the pGL3 vector that cloned the IPO5 / RAP2A H3K27A sequence in the same experiment. An empty pGL3-basic vector was used as a negative control. Each experiment was performed three times independently and each sample was duplicated. Student's t-test was performed to assess the significant difference in activity between non-risk alleles and risk alleles.
＜ソフトウェア＞
一般的な統計解析には、R statistical environment version 2.10.0. または PLINK1.05（Purcell,S. et al. (2007) Am J Hum Genet., 81, 559-575）を使用した。LDマップは、Haploviewソフトウェアを使用して作成した（Barrett,J.C.,(2005)Bioinformatics.,
21, 263-265）。局所マップはLocus zoomソフトウェアを使用して作成した。
<Software>
R statistical environment version 2.10.0. Or PLINK1.05 (Purcell, S. et al. (2007) Am J Hum Genet., 81, 559-575) was used for general statistical analysis. LD maps were generated using Haploview software (Barrett, JC, (2005) Bioinformatics.,
21, 263-265). Local maps were created using Locus zoom software.
２．結果
＜GWAS＞
新規なPAD感受性部位を同定するために、785名の患者及び3,383名の対照群を含む日本人集団においてPADについてのGWASを行った。集団階層化の存在を、主成分分析（PCA）を使用してHapMapサンプルとの比較により評価したところ、患者群及び対照群の全員がアジア人集団内に集まり、ほぼ全ての対象者が公知の二つの主な日本人一般的集団のクラスタ内に収まった（図１）。
2. Result <GWAS>
To identify new PAD sensitive sites, GWAS for PAD was performed in a Japanese population including 785 patients and 3,383 control groups. The presence of population stratification was assessed by comparison with the HapMap sample using principal component analysis (PCA), and all of the patient and control groups gathered within the Asian population and almost all subjects were known. It fell within the cluster of two main Japanese general populations (Figure 1).
SNP遺伝子型とPADとの間の関連性をコクラン・アーミテージの傾向検定を使用して検討した。図２は、検討した431,754のSNPの-log10P値を示す。今回のGWASでは、ボンフェローニ補正（P<1.2×10-7）に基づく統計的有意差の閾値に達したSNPはなかった。検定統計量の拡張（inflation of test statistics）、λgenomic control（λgc）は、1.04であった（図2ｂ）。さらに感受性部位を調査するために、GWASにおけるP値のランクが上位500SNPであるものに着目することとし、連鎖不平衡（LD）を考慮すると355部位となった。次に、1,150名の患者群及び16,752名の対照群からなる他のパネルを遺伝子型解析したところ、13のSNPがP<0.0001を示した。これらの部位について、さらに1,229名の患者群を検査し、PAD患者群の総数を3,164名にまで拡張した（表２）。 The association between SNP genotype and PAD was examined using Cochrane Armitage trend test. FIG. 2 shows the -log 10 P values of the 431,754 SNPs studied. In the current GWAS, no SNP reached the statistical significance threshold based on Bonferroni correction (P <1.2 × 10 -7 ). The extension of test statistics (inflation of test statistics), λ genomic control (λ gc ) was 1.04 (Fig. 2b). In order to investigate more sensitive sites, we focused on the one with the rank of the top 500 SNP in GWAS, and it was 355 sites considering linkage disequilibrium (LD). Next, genotyping of another panel of 1,150 patient groups and 16,752 control groups revealed 13 SNPs with P <0.0001. For these sites, an additional 1,229 patient groups were examined, expanding the total number of PAD patient groups to 3,164 (Table 2).
これらの解析を通して、PADと関連する3つの部位を同定した。それらの部位は、IPO5/RAP2A, EDNRA及びHDAC9遺伝子に極めて近かった（表３、図３、４及び５）。 Through these analyses, three sites associated with PAD were identified. These sites were very close to the IPO5 / RAP2A, EDNRA and HDAC9 genes (Table 3, FIGS. 3, 4, and 5).
次に、有意であった3つのSNPについて、患者群における糖尿病、高血圧、喫煙及び高脂血症を含む典型的なリスクファクター、年齢、及び性別による交絡効果を、one-way ANOVA及びχ2テストを使用して調査したところ、遺伝子型とそれらのファクターとの間に明確な関連は見られなかった。このことは、これら3つのSNP部位は日本人集団におけるPADについての上記ライフスタイルとは独立していることを示している（表４）。 Next, for the three SNPs that were significant, the one-way ANOVA and χ 2 tests were performed to determine the confounding effects by typical risk factors, including age, gender, and diabetes in patients, hypertension, smoking and hyperlipidemia. Was used to find no clear association between genotypes and their factors. This indicates that these three SNP sites are independent of the above lifestyle for PAD in the Japanese population (Table 4).
＜13q32部位のファインマッピング＞
染色体13q32上のIPO5/RAP2A部位を絞り込むために、当該部位のダイレクトシークエンスを行い、100kbのLD部位内にある249のSNPを同定した。さらなるファインマッピングのために、これらの中から、この部位を代表する24のタグSNPを選択した。これらタグSNPの関連解析から、rs9584669が最も強いP値を有することが明らかとなった（表５）。
<Fine mapping of 13q32 site>
In order to narrow down the IPO5 / RAP2A site on chromosome 13q32, direct sequencing of the site was performed, and 249 SNPs within the 100 kb LD site were identified. Of these, 24 tag SNPs representing this site were selected for further fine mapping. Association analysis of these tag SNPs revealed that rs9584669 has the strongest P value (Table 5).
遺伝子型解析は、rs9584669と13q32.2領域にある6つのSNP（rs9556806, rs9805548, rs9556797, rs9556795, rs4001162, rs9556799）とは完全なLDが保たれていることを明らかにした。 Genotyping revealed that the complete LD was maintained for the six SNPs in the rs9584669 and 13q32.2 regions (rs9556806, rs9805548, rs9556797, rs9556795, rs4001162, rs9556799).
＜染色体13q32.2における関連SNPの機能的解析＞
この関連領域内にある7つのSNPのいずれもタンパク質のアミノ酸配列を変化させるものではなかったので、これらのSNPがIPO5及び／又はRAP2A発現に影響するかどうかを、ヒト大動脈平滑筋細胞（HASMC）におけるレポーター遺伝子解析を使用して調査した。この細胞を使用したのは、定量的RT-PCR実験において、IPO5及びRAP2AのどちらのmRNAも豊富に発現することが観察されたからである。図６は、IPO5プロモーターコンストラクトにおいて、rs9584669のSNPの非リスクアレルを含むクローンはリスクアレルを含むクローンと比べて約2.5倍大きい転写活性を有することを示している。他のIPO5プロモーターコンスト
ラクトとRAP2Aプロモーターコンストラクトにおいては、アレル間の差は観察されなかった（図７及び８）。これらの結果は、関連SNPがIPO5の転写レベルには影響するが、RAP2Aには影響しないことを示している。
<Functional analysis of related SNP in chromosome 13q32.2>
Since none of the seven SNPs in this related region changed the amino acid sequence of the protein, we examined whether these SNPs affect IPO5 and / or RAP2A expression in human aortic smooth muscle cells (HASMC) Was investigated using reporter gene analysis. This cell was used because it was observed in the quantitative RT-PCR experiment that both IPO5 and RAP2A mRNAs were abundantly expressed. FIG. 6 shows that in the IPO5 promoter construct, the clone containing the non-risk allele of rs9584669 SNP has about 2.5 times greater transcriptional activity than the clone containing the risk allele. In other IPO5 promoter constructs and RAP2A promoter constructs, no difference between alleles was observed (FIGS. 7 and 8). These results indicate that the relevant SNPs affect IPO5 transcription levels but not RAP2A.
よって、rs9584669、rs6842241、rs2074633またはそれらと連鎖不平衡であるrs9556806, rs9805548, rs9556797, rs9556795, rs4001162, rs9556799等のマーカーは、末梢動脈疾患患者において強い関連性を示す末梢動脈疾患感受性マーカーであることから、これらのマーカーの遺伝子型を決定することは、末梢動脈疾患診断の指標となることが明らかとなった。 Therefore, markers such as rs9584669, rs6842241, rs2074633 or linkage disequilibrium with them, such as rs9556806, rs9805548, rs9556797, rs9556795, rs4001162, rs9556799, etc. are peripheral arterial disease susceptibility markers showing strong association in patients with peripheral arterial disease. It has been clarified that determining the genotype of these markers is an index for diagnosis of peripheral arterial disease.
配列番号１：rs9584669の前後100bpを含む配列
配列番号２：rs6842241の前後100bpを含む配列
配列番号３：rs2074633の前後100bpを含む配列
配列番号４：rs9556806 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号５：rs9556806 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号６：rs9805548 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号７：rs9805548 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号８：rs9556797 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号９：rs9556797 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１０：rs9556795を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１１：rs9556795 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１２：rs4001162 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１３：rs4001162 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１４：rs9556799 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１５：rs9556799 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１６：rs9584669 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１７：rs9584669 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１８：rs9556806 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号１９：rs9556806 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号２０：rs9805548 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号２１：rs9805548 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号２２：rs9556797 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号２３：rs9556797 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号２４：rs9556795 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号２５：rs9556795 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号２６：rs4001162 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号２７：rs4001162 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号２８：rs9556799 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号２９：rs9556799 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号３０：rs9584669 を含むセンスオリゴヌクレオチド
配列番号３１：rs9584669 を含むアンチセンスオリゴヌクレオチド
配列番号３２：IPO5遺伝子のmRNA配列
配列番号３３：IPO5のアミノ酸配列
配列番号３４：rs9556806の前後100bpを含む配列
配列番号３５：rs9805548の前後100bpを含む配列
配列番号３６：rs9556797の前後100bpを含む配列
配列番号３７：rs9556795の前後100bpを含む配列
配列番号３８：rs4001162の前後100bpを含む配列
配列番号３９：rs9556799の前後100bpを含む配列
SEQ ID NO: 1 includes 100 bp before and after rs9584669 SEQ ID NO: 2 includes 100 bp before and after rs6842241 SEQ ID NO: 3 includes 100 bp before and after rs2074633 SEQ ID NO: 4 includes sense oligonucleotide SEQ ID NO: 5 includes rs9556806 Antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 6: Sense oligonucleotide SEQ ID NO: 7 comprising rs9805548 Antisense oligonucleotide SEQ ID NO: 7 comprising rs9805548 Sense oligonucleotide comprising SEQ ID NO: 8: rs9556797 Antisense oligonucleotide comprising SEQ ID NO: 9: rs9556797 Sense oligonucleotide containing rs9556795 SEQ ID NO: 11: antisense oligonucleotide containing rs9556795 SEQ ID NO: 12: sense oligonucleotide containing rs4001162 SEQ ID NO: 13: antisense oligonucleotide containing rs4001162 SEQ ID NO: 14: containing rs9556799 Antisense oligonucleotide comprising SEQ ID NO: 15: rs9556799 antisense oligonucleotide comprising SEQ ID NO: 16: sense oligonucleotide comprising rs9584669 SEQ ID NO: 17: antisense oligonucleotide comprising rs9584669 SEQ ID NO: 18: sense oligonucleotide comprising rs9556806 SEQ ID NO: 19: rs9556806 Antisense oligonucleotide comprising SEQ ID NO: 20: sense oligonucleotide comprising SEQ ID NO: 21: rs9805548 antisense oligonucleotide comprising SEQ ID NO: 22: sense oligonucleotide comprising SEQ ID NO: 22: rs9556797 antisense oligonucleotide comprising SEQ ID NO: 23: antisense oligonucleotide comprising SEQ ID NO: rs9556797 24: sense oligonucleotide comprising rs9556795 SEQ ID NO: 25: antisense oligonucleotide comprising rs9556795 SEQ ID NO: 26: sense oligonucleotide comprising rs4001162 No. 27: antisense oligonucleotide comprising rs4001162 SEQ ID NO: 28: sense oligonucleotide comprising rs9556799 SEQ ID NO: 29: antisense oligonucleotide comprising rs9556799 SEQ ID NO: 30: sense oligonucleotide comprising rs9584669 SEQ ID NO: 31: antisense comprising rs9584669 Oligonucleotide SEQ ID NO: 32: mRNA of IPO5 gene SEQ ID NO: 33: Amino acid sequence of IPO5 SEQ ID NO: 34: SEQ ID NO: 35 including 100 bp before and after rs9556806 SEQ ID NO: 35: SEQ ID NO: 36 including 100 bp before and after rs9805548 SEQ ID NO: 36: 100 bp before and after rs9556797 Containing SEQ ID NO: 37: SEQ ID NO: 38 containing 100 bp before and after rs9556795 SEQ ID NO: 38: SEQ ID NO: 39 containing 100 bp before and after rs4001162 SEQ ID NO: 39: Sequence containing 100 bp before and after rs9556799
rs9584669、rs6842241、rs2074633またはそれらと連鎖不平衡であるrs9556806, rs9805548, rs9556797, rs9556795, rs4001162, rs9556799等の遺伝子型を決定することにより、末梢動脈疾患を正確かつ迅速に検査することができ、当該疾患患者の早期診断による予防及び治療に貢献するものである。 By determining the genotype of rs9584669, rs6842241, rs2074633, or rs9556806, rs9805548, rs9556797, rs9556795, rs4001162, rs9556799, etc., which are linkage disequilibrium with them, peripheral arterial disease can be accurately and rapidly examined, and the disease It contributes to prevention and treatment by early diagnosis of patients.
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