JP4825956B2 - Determination of the risk of airway mucosal inflammatory disease - Google Patents
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Description
本発明は、ムチン遺伝子ＭＵＣ５Ｂのプロモーター領域に存在する遺伝子多型（ＳＮＰｓ、挿入／欠失型多型、及びハプロタイプ）を検出することを含む気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定方法、該方法に使用されるオリゴヌクレオチド、及び該オリゴヌクレオチドを含む気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを診断するためのキットなどに関する。 The present invention relates to a method for determining the risk of airway mucosal inflammatory disease, comprising detecting gene polymorphisms (SNPs, insertion / deletion polymorphisms, and haplotypes) present in the promoter region of the mucin gene MUC5B, and the method The present invention relates to an oligonucleotide used in the present invention, and a kit for diagnosing the risk of suffering from an airway mucosal inflammatory disease containing the oligonucleotide.
びまん性汎細気管支炎（diffuse panbronchiolitis；以下ＤＰＢと略す）は、慢性副鼻腔炎を伴う慢性気道炎症性疾患である。それまで分類されていた慢性閉塞性肺疾患とは別の新しい疾患として、１９６０年代半ばにその概念が確立されたが、その病因はまだ明らかでない。ＤＰＢの報告は主として日本・韓国・中国など東アジアが中心であり、少数の欧米からの報告も多くはアジア系の移民であり、その発症に人種差が見られることから遺伝的な背景が示唆されてきた。 Diffuse panbronchiolitis (hereinafter referred to as DPB) is a chronic airway inflammatory disease accompanied by chronic sinusitis. The concept was established in the mid 1960s as a new disease separate from the previously classified chronic obstructive pulmonary disease, but its etiology is still unclear. DPB reports are mainly from East Asia such as Japan, South Korea, and China. Many reports from Western countries are mostly Asian immigrants, and there are racial differences in the onset, suggesting a genetic background. It has been.
ＤＰＢの疾患感受性に関与する遺伝子の一つは、ＨＬＡ−Ａ遺伝子座とＨＬＡ−Ｂ遺伝子座の間に存在すると考えられ、この領域では新規遺伝子のクローニングが試みられている。それ以外に、ＤＰＢの病態に関連すると考えられる遺伝子として、これまでにTransporter associated with antigen processing（ＴＡＰ）（非特許文献１）、Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator（ＣＦＴＲ）（非特許文献２）、ＩＬ−８（非特許文献３）及びＴＮＦα（非特許文献４）などの解析が試みられてきたが、ＤＰＢと一義的な関連を示すものは認められていない。 One of the genes involved in the disease susceptibility of DPB is considered to exist between the HLA-A locus and the HLA-B locus, and cloning of a new gene has been attempted in this region. Other than that, as genes considered to be related to the pathological condition of DPB, transporter associated with antigen processing (TAP) (Non-patent Document 1), Cystic fibrosis transmembrane conductance regulator (CFTR) (Non-patent Document 2), IL- 8 (Non-Patent Document 3) and TNFα (Non-Patent Document 4) have been tried to be analyzed, but no one showing an unambiguous relationship with DPB has been recognized.
従って、ＤＰＢとの関連性を示す遺伝的因子を特定し、ＤＰＢの発症研究や治療に利用することが望まれていた。 Therefore, it has been desired to identify a genetic factor that is related to DPB and to use it for the study and treatment of DPB.
本発明の課題は、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）と関連性のある遺伝子多型（ＳＮＰｓ、挿入／欠失型多型、及びハプロタイプ）を同定し、これらの遺伝子多型を利用して気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを判定する方法、該方法に用いることのできるオリゴヌクレオチド、気道粘膜炎症性疾患の診断用キットなどを提供することにある。 An object of the present invention is to identify genetic polymorphisms (SNPs, insertion / deletion polymorphisms, and haplotypes) associated with diffuse panbronchiolitis (DPB), and to use these polymorphisms. An object of the present invention is to provide a method for determining the risk of afflicting an airway mucosal inflammatory disease, an oligonucleotide that can be used in the method, a kit for diagnosing an airway mucosal inflammatory disease, and the like.
本発明者らは上記の課題を解決すべくムチン遺伝子ＭＵＣ５Ｂのプロモーター領域の遺伝子多型を解析したところ、複数の変異が同定され、特に新規に同定された２塩基の欠失部位を含むハプロタイプでＤＰＢと強い負の関連を示すことを見出した。さらに、ルシフェラーゼアッセイ法を用いた実験により、上記のハプロタイプが転写活性に影響を与え、その結果遺伝子産物量が変化し、この変化がＤＰＢを引き起こす可能性を見出した。本発明はかかる知見により完成されたものである。 The present inventors analyzed the gene polymorphism of the promoter region of the mucin gene MUC5B in order to solve the above-mentioned problems. As a result, a plurality of mutations were identified, and in particular, a haplotype containing a newly identified 2-base deletion site. It was found to show a strong negative association with DPB. Furthermore, experiments using a luciferase assay have found that the above haplotype affects transcriptional activity, resulting in a change in gene product amount, which may cause DPB. The present invention has been completed based on such findings.
すなわち、本発明は、以下の（１）〜（８）を包含する。
（１）ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型を検出することを含む、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定方法。
上記方法において、検出される遺伝子多型としては、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡの挿入又は欠失が含まれる。ここで、該遺伝子多型が、３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡの欠失を有する場合には、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクは低いと判定される。
That is, this invention includes the following (1)-(8).
(1) A method for determining the risk of suffering from an airway mucosal inflammatory disease, comprising detecting a gene polymorphism present in the promoter region of the MUC5B gene.
In the above method, the detected gene polymorphism includes insertion or deletion of bases C and A at positions 394 and 395 in the promoter region of the MUC5B gene shown in SEQ ID NO: 1. Here, when the gene polymorphism has deletion of bases C and A at the 394th and 395th positions, it is determined that the risk of suffering from an airway mucosal inflammatory disease is low.
また上記方法において、検出される遺伝子多型としては、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目、１４８番目、３９４番目及び３９５番目、８１７番目、８３７番目、並びに９７６番目の塩基からなるハプロタイプが含まれる。ここで、該遺伝子多型が、１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＡ、３９４番目及び３９５番目の塩基が欠失、８１７番目の塩基がＧ、８３７番目の塩基がＣ、並びに９７６番目の塩基がＴのハプロタイプを有する場合に、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが低いと判定される。 Further, in the above method, the detected gene polymorphisms include the 135th, 148th, 394th and 395th, 817th, 837th, and 976th bases of the promoter region of the MUC5B gene shown in SEQ ID NO: 1. Haplotypes are included. Here, the gene polymorphism is such that the 135th base is G, the 148th base is A, the 394th and 395th bases are deleted, the 817th base is G, the 837th base is C, and 976 If the second base has a T haplotype, it is determined that the risk of developing an airway mucosal inflammatory disease is low.
（２）ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型を含む配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定においてプローブとして用いるオリゴヌクレオチド。
（３）ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型を含む配列を増幅することができ、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定においてプライマーとして用いるオリゴヌクレオチド。
上記オリゴヌクレオチドは、配列番号１に示される塩基配列のうち、連続する少なくとも１０塩基からなる配列、又は該配列に対し相補的な配列を有するものとすることができる。ここで、かかるオリゴヌクレオチドとしては、限定するものではないが、配列番号２〜５のいずれかに示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドが挙げられる。
(2) An oligonucleotide that can hybridize to an oligonucleotide comprising a sequence containing a gene polymorphism present in the promoter region of the MUC5B gene and is used as a probe in the determination of the risk of airway mucosal inflammatory disease.
(3) An oligonucleotide that can amplify a sequence containing a gene polymorphism present in the promoter region of the MUC5B gene and is used as a primer in determining the risk of airway mucosal inflammatory disease.
The oligonucleotide may have a sequence consisting of at least 10 consecutive bases in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a sequence complementary to the sequence. Here, the oligonucleotide includes, but is not limited to, an oligonucleotide having a base sequence represented by any one of SEQ ID NOs: 2 to 5.
（４）配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定に用いるプライマーセット。
（５）配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含む、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクの判定に用いるプライマーセット。
(4) A primer set used for determining the risk of affliction of airway mucosal inflammatory disease, comprising an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3.
(5) A primer set used for determining the risk of afflicting an airway mucosal inflammatory disease, comprising an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
（６）前記オリゴヌクレオチドの１種以上を含む、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを診断するためのキット。
上記診断キットにおいて、１種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとすることができる。また、１種以上のオリゴヌクレオチドは、配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドとすることもできる。
(6) A kit for diagnosing the risk of airway mucosal inflammatory disease, comprising one or more of the oligonucleotides.
In the above diagnostic kit, the one or more oligonucleotides can be an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3. Further, the one or more kinds of oligonucleotides may be an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5.
（７）遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、候補物質の存在下で該細胞を培養し、リポーター活性を測定することを含む、ＭＵＣ５Ｂ転写活性阻害物質のスクリーニング方法。
上記スクリーニング方法において、ＭＵＣ５Ｂプロモーター領域に含まれる遺伝子多型は、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーターの転写活性を増強し、ＭＵＣ５Ｂの転写を促進するものであることが好ましく、例えば、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡの挿入、あるいは、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＧ、３９４番目及び３９５番目の塩基Ｃ及びＡの挿入、８１７番目の塩基がＡ、８３７番目の塩基がＧ、並びに９７６番目の塩基がＣのハプロタイプとすることができる。
(7) A transcription unit having a reporter gene bound downstream of a gene fragment containing the promoter region of the MUC5B gene having a gene polymorphism is introduced into the cell, the cell is cultured in the presence of a candidate substance, and the reporter activity is measured. A screening method for a MUC5B transcription activity inhibitor.
In the above screening method, the gene polymorphism contained in the MUC5B promoter region preferably enhances the transcriptional activity of the MUC5B gene promoter and promotes MUC5B transcription. For example, the MUC5B gene represented by SEQ ID NO: 1 Insertion of bases C and A at the 394th and 395th of the promoter region, or the 135th base of the promoter region of the MUC5B gene shown in SEQ ID NO: 1 is G, the 148th base is G, the 394th and 395th Insertion of bases C and A, 817th base A, 837th base G, and 976th base C haplotype.
（８）遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子断片と被験試料を接触させ、該遺伝子断片と該被験試料に含まれる該遺伝子多型に特異的な転写因子との結合を検出することを含む、ＭＵＣ５Ｂの転写因子のスクリーニング方法。 (8) A gene fragment containing a promoter region of the MUC5B gene having a gene polymorphism is brought into contact with a test sample, and binding between the gene fragment and a transcription factor specific for the gene polymorphism contained in the test sample is detected. A method for screening a transcription factor of MUC5B.
本発明により、気道粘膜炎症性疾患（特にびまん性汎細気管支炎）の罹患リスクを判定することが可能となる。また、本発明のオリゴヌクレオチド及び診断キットにより、かかる判定を簡便かつ迅速に行うことができる。 The present invention makes it possible to determine the risk of suffering from an airway mucosal inflammatory disease (particularly diffuse panbronchiolitis). In addition, the determination can be performed easily and rapidly by the oligonucleotide and the diagnostic kit of the present invention.
また本発明により、ＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質及び転写因子をスクリーニングすることができ、ＭＵＣ５Ｂが関連する可能性のある気道粘膜炎症性疾患の発症機構の解明、その予防又は治療薬の開発などに有用である。 In addition, according to the present invention, MUC5B transcriptional activity inhibitors and transcription factors can be screened, which is useful for elucidating the onset mechanism of airway mucosal inflammatory diseases that may be associated with MUC5B, and developing preventive or therapeutic agents. It is.
１．気道粘膜の炎症性疾患の判定方法
（１）ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における遺伝子多型
本発明の方法は、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型（ＳＮＰｓ、挿入／欠失型多型、及びハプロタイプ）を検出することによって、気道粘膜の炎症性疾患の罹患リスクを判定する方法である。
1. Method for determining airway mucosal inflammatory disease (1) Gene polymorphism in promoter region of MUC5B gene The method of the present invention comprises gene polymorphisms (SNPs, insertion / deletion polymorphisms) present in the promoter region of MUC5B gene, and This is a method for determining the risk of inflammatory disease of the airway mucosa by detecting a haplotype.
本明細書において、「遺伝子多型」には、ＳＮＰｓ、挿入／欠失型多型、及びハプロタイプが含まれる。 As used herein, “gene polymorphism” includes SNPs, insertion / deletion polymorphisms, and haplotypes.
ここでＳＮＰ（Single nucleotide polymorphism：一塩基多型）とは、ある特定の遺伝子又は遺伝子群における一塩基の核酸の変異をいい、複数箇所に存在する上記一塩基の核酸の変異（ＳＮＰ）をＳＮＰｓとして表す。このようなＳＮＰｓは、個体間における形質や形態の多様性を引き起こすことがあることが知られている。 Here, SNP (Single nucleotide polymorphism) refers to a single nucleotide nucleic acid mutation in a specific gene or group of genes, and the single nucleotide polymorphism mutations (SNPs) present in a plurality of locations are referred to as SNPs. Represent as It is known that such SNPs may cause a variety of traits and forms among individuals.
また挿入／欠失型多型とは、１以上の塩基（例えば１〜数十塩基）が欠失又は挿入していることによる多型をいう。 The insertion / deletion polymorphism refers to a polymorphism caused by deletion or insertion of one or more bases (for example, 1 to several tens of bases).
またハプロタイプとは、連続した遺伝子領域又は遺伝子群中の複数箇所の変異部位における対立遺伝子の種類と数とによって表される上記変異（ＳＮＰｓ）のタイプ（近接する対立遺伝子（アレル）でのアレルの組み合わせ）を示す。その具体例は、例えば後記実施例に示される。ハプロタイプにおける組換え頻度は通常の組換え頻度よりも低く、遺伝的に保存される傾向がある。従って、多型と疾患との関連性を調べる場合には、個々の変異との関連性だけではなく、特定のハプロタイプとの関連性を調べることも重要である。 The haplotype is the type of mutation (SNPs) represented by the type and number of alleles at a plurality of mutation sites in a continuous gene region or gene group (alleles in the adjacent alleles). Combination). Specific examples thereof are shown in the examples described later, for example. Recombination frequencies in haplotypes are lower than normal recombination frequencies and tend to be genetically conserved. Therefore, when examining the association between a polymorphism and a disease, it is important to examine not only the association with individual mutations but also the association with a specific haplotype.
以下に、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における遺伝子多型について説明する。本明細書において、遺伝子（例えばＭＵＣ５Ｂ遺伝子）におけるＸ番目の塩基をその位置を示す数字Ｘと、塩基を表す記号との組み合わせで示す場合がある。例えば、「１３５Ｇ／Ａ」とは、１３５番目の位置にあるＧ又はＡを示す。また、プロモーター領域のＹ番目の塩基とは、配列番号１に示す塩基配列のＹ番目の位置にある塩基を示す。ここで、配列番号１に示すＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の最後の塩基（１１５３番目の塩基）は、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子の転写開始点から１００番目の塩基に相当する。すなわち、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子の転写開始点は、配列番号１に示される塩基配列の１０５４番目の塩基に相当し、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域は、配列番号１に示される塩基配列の１０５３番目の塩基（−１）から上流の１番目の塩基（−１０５３）の領域である。 The gene polymorphism in the promoter region of the MUC5B gene will be described below. In this specification, the X-th base in a gene (for example, the MUC5B gene) may be indicated by a combination of a number X indicating its position and a symbol indicating the base. For example, “135G / A” indicates G or A at the 135th position. The Y-th base in the promoter region refers to the base at the Y-th position in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1. Here, the last base (1153rd base) of the promoter region of the MUC5B gene shown in SEQ ID NO: 1 corresponds to the 100th base from the transcription start point of the MUC5B gene. That is, the transcription start point of the MUC5B gene corresponds to the 1054th base of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, and the promoter region of the MUC5B gene has the 1053rd base (-1 in the base sequence shown in SEQ ID NO: 1). ) Upstream of the first base (−1053) region.
（ａ）Ｌ１多型（１３５Ｇ／Ａ）：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目の塩基におけるＧ／ＡのＳＮＰ
（ｂ）Ｌ２多型（１４８Ａ／Ｇ）：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１４８番目の塩基におけるＡ／ＧのＳＮＰ
（ｃ）Ｌ３多型：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目の塩基におけるＣＡの挿入／欠失型多型
（ｄ）Ｌ４多型（８１７Ｇ／Ａ）：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の８１７番目の塩基におけるＧ／ＡのＳＮＰ
（ｅ）Ｌ５多型（８３７Ｃ／Ｇ）：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の８３７番目の塩基におけるＣ／ＧのＳＮＰ
（ｆ）Ｌ６多型（９７６Ｃ／Ｔ）：ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の９７６番目の塩基におけるＣ／ＴのＳＮＰ
また、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域におけるハプロタイプは、下記表１に示す多型を含むものである。
(A) L1 polymorphism (135G / A): G / A SNP at the 135th base of the promoter region of the MUC5B gene
(B) L2 polymorphism (148A / G): A / G SNP at the 148th base of the promoter region of the MUC5B gene
(C) L3 polymorphism: CA insertion / deletion polymorphism at the 394th and 395th bases in the promoter region of MUC5B gene (d) L4 polymorphism (817G / A): 817th in the promoter region of MUC5B gene G / A SNPs in different bases
(E) L5 polymorphism (837C / G): C / G SNP at the 837th base of the promoter region of the MUC5B gene
(F) L6 polymorphism (976C / T): C / T SNP at the 976th base of the promoter region of MUC5B gene
Moreover, the haplotypes in the promoter region of the MUC5B gene include polymorphisms shown in Table 1 below.
本発明においては、上記の遺伝子多型を検出することによって、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを判定する。 In the present invention, the risk of suffering from an airway mucosal inflammatory disease is determined by detecting the gene polymorphism.
ここで、「気道粘膜炎症性疾患」とは、気道粘膜における炎症性疾患を意味し、特に限定はされないが、例えば、びまん性汎細気管支炎（ＤＰＢ）、慢性気管支炎、嚢胞性線維症、気管支拡張炎及び慢性副鼻腔炎などが挙げられる。ムチンは、上皮（例えば粘膜）において細胞防御機能等を有する粘液性のタンパク質であり、また別のムチン遺伝子が炎症性疾患と関係していることも報告されていることから、本発明において検出する遺伝子多型は、上記の気道粘膜炎症性疾患と関連していると考えられる。 Here, the “airway mucosal inflammatory disease” means an inflammatory disease in the airway mucosa, and is not particularly limited. For example, diffuse panbronchiolitis (DPB), chronic bronchitis, cystic fibrosis, Examples include bronchiectasis and chronic sinusitis. Mucin is a mucosal protein having a cytoprotective function in the epithelium (for example, mucous membrane), and another mucin gene has been reported to be associated with an inflammatory disease, so that it is detected in the present invention. The genetic polymorphism is considered to be associated with the above-mentioned airway mucosal inflammatory diseases.
また本明細書において、「罹患リスク」とは、疾患への罹りやすさ（感受性）又は罹りにくさ（抵抗性）を意味し、「罹患リスクが高い」とは、他の被験者と比較して、特定の多型を有する被験者が疾患に罹る確率が高いことを意味し、一方「罹患リスクが低い」とは、他の被験者と比較して、特定の多型を有する被験者が疾患に罹る確率が低いことを意味する。また、疾患の罹患リスクの「判定」とは、疾患発症の可能性の判断（罹患危険性の予想）、疾患の遺伝性素因の有無の判断、疾患の遺伝的要因の解明などをいう。 In the present specification, “morbidity risk” means susceptibility to disease (susceptibility) or difficulty (resistance), and “high risk of morbidity” means that compared to other subjects. , Means that a subject with a particular polymorphism has a higher probability of suffering from the disease, whereas “low risk of disease” means the probability that a subject with the particular polymorphism will suffer from the disease compared to other subjects Means low. Also, “determination” of disease onset risk refers to determination of the possibility of disease onset (prediction of disease risk), determination of the presence or absence of an inherited predisposition of the disease, elucidation of genetic factors of the disease, and the like.
例えば、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＡ、３９４番目及び３９５番目の塩基が欠失、８１７番目の塩基がＧ、８３７番目の塩基がＣ、並びに９７６番目の塩基がＴのハプロタイプを有する場合には、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが低いと判定できる。 For example, the 135 th base in the promoter region of the MUC5B gene is G, the 148 th base is A, the 394 th and 395 th bases are deleted, the 817 th base is G, the 837 th base is C, and the 976 th position Can be determined to have a low morbidity risk of airway mucosal inflammatory disease.
これに対し、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＧ、３９４番目及び３９５番目の塩基（Ｃ及びＡ）が挿入、８１７番目の塩基がＡ、８３７番目の塩基がＧ、並びに９７６番目の塩基がＣのハプロタイプを有する場合には、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが相対的に高いと判定できる。 In contrast, the 135th base in the promoter region of the MUC5B gene is G, the 148th base is G, the 394th and 395th bases (C and A) are inserted, the 817th base is A, and the 837th base. Is G, and the 976th base has a haplotype of C, it can be determined that the risk of developing an airway mucosal inflammatory disease is relatively high.
また例えば、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡが欠失している多型を有する場合には、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが低いと判定できる。 For example, when it has a polymorphism in which the bases C and A at the 394th and 395th positions of the promoter region of the MUC5B gene are deleted, it can be determined that the risk of suffering from an airway mucosal inflammatory disease is low.
一方、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡが挿入されている多型を有する場合には、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクが相対的に高いと判定できる。 On the other hand, when it has a polymorphism in which the bases C and A at the 394th and 395th positions of the promoter region of the MUC5B gene are inserted, it can be determined that the morbidity risk of airway mucosal inflammatory disease is relatively high.
（２）遺伝子多型の検出
本発明において、遺伝子多型の検出の対象は、ゲノムＤＮＡ、ｃＤＮＡ、又はｍＲＮＡのいずれでもよい。また、上記対象を採取する試料としては、任意の生物学的試料、例えば血液、唾液、リンパ液、気道粘液、骨髄液、尿、精液、腹腔液、等の体液；気道粘膜、鼻腔粘膜等の組織細胞等が挙げられる。ゲノムＤＮＡ等は、これらの試料より常法に従い抽出、精製し、調製することができる。
(2) Detection of gene polymorphism In the present invention, the target of gene polymorphism detection may be genomic DNA, cDNA, or mRNA. Further, the sample from which the subject is collected includes any biological sample, for example, body fluid such as blood, saliva, lymph, airway mucus, bone marrow fluid, urine, semen, and peritoneal fluid; tissue such as airway mucosa and nasal mucosa Examples thereof include cells. Genomic DNA and the like can be extracted and purified from these samples according to a conventional method.
また本発明においては、気道粘膜の炎症性疾患の罹患リスクを判定する対象としては、ヒトを含む哺乳動物（例えば、ヒト、サル、マウスなど）であれば特に限定されない。判定対象は、特にヒトであることが好ましく、さらにはアジア人種であることが好ましい。 In the present invention, the target for determining the risk of inflammatory disease of the airway mucosa is not particularly limited as long as it is a mammal including a human (eg, human, monkey, mouse, etc.). The determination target is particularly preferably a human, and more preferably an Asian race.
上記試料から調製されたＤＮＡ等を用いて、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における遺伝子多型を検出する。ここで、遺伝子多型の「検出」とは、ある特定の遺伝子多型の種類を決定したり、遺伝子多型の有無を判定することをいい、「タイピング」とも呼ばれるものである。 The gene polymorphism in the promoter region of the MUC5B gene is detected using DNA prepared from the sample. Here, “detection” of a gene polymorphism refers to determining the type of a specific gene polymorphism or determining the presence or absence of a gene polymorphism, and is also referred to as “typing”.
遺伝子多型を検出するにあたっては、まず遺伝子多型を含む部分を増幅する。増幅は、例えばＰＣＲ法によって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ法、ＬＣＲ法、ＳＤＡ法、ＬＡＭＰ法等で行ってもよい。 In detecting a gene polymorphism, first, a portion containing the gene polymorphism is amplified. Amplification is performed by, for example, the PCR method, but may be performed by other known amplification methods such as the NASBA method, the LCR method, the SDA method, and the LAMP method.
プライマーの選択は、例えば、前記の遺伝子多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基の配列を増幅するように行う。 Selection of the primer is performed, for example, so as to amplify a sequence of at least 10 bases, preferably 10 to 100 bases, more preferably 10 to 50 bases, including the gene polymorphic site.
プライマーは、前記の遺伝子多型部位を含む所定塩基数の配列を増幅するためのプライマーとして機能し得る限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。 The primer may contain one or more substitutions, deletions and additions in the sequence as long as it can function as a primer for amplifying a sequence having a predetermined number of bases including the gene polymorphic site.
増幅のために用いるプライマーは、試料が一の遺伝子多型を有する場合にのみ増幅されるようにセンスプライマー又はアンチセンスプライマーの一方がその遺伝子多型部位にハイブリダイズするように選択してもよい。そのように選択することによって、増幅反応が起こったか否かを調べるだけで遺伝子多型を検出することが可能となる。プライマーは必要に応じて蛍光物質や放射性物質等により標識することができる。 The primer used for amplification may be selected so that one of the sense primer or the antisense primer hybridizes to the gene polymorphic site so that it is amplified only when the sample has one gene polymorphism. . By making such a selection, it becomes possible to detect a gene polymorphism simply by examining whether or not an amplification reaction has occurred. The primer can be labeled with a fluorescent substance, a radioactive substance, or the like as necessary.
あるいは、遺伝子多型の種類にかかわらず全ての場合にその遺伝子多型を含む領域を増幅できるように、遺伝子多型部位を挟むように２つのプライマーを設計することも可能である。そのようにして得られる増幅産物（断片）のサイズ、塩基配列、高次構造などの差異に基づいて、遺伝子多型を検出することができる。 Alternatively, it is possible to design two primers so as to sandwich the gene polymorphic site so that the region containing the gene polymorphism can be amplified in all cases regardless of the type of gene polymorphism. Gene polymorphism can be detected based on differences in the size, base sequence, higher order structure, etc. of the amplification product (fragment) thus obtained.
例えば、サイズの差異に基づいて遺伝子多型を検出する場合には、例えばアガロースゲル電気泳動、ポリアクリルアミドゲル電気泳動、キャピラリー電気泳動などにより、サイズの差異による移動度の違いを利用して、特定の遺伝子多型を検出することができる。また、制限酵素断片長多型（Restriction Fragment Length Polymorphism；ＲＦＬＰ）を利用して検出することもできる。この場合には、遺伝子多型を含む領域を増幅した後、得られた増幅産物を、所定の遺伝子多型に独特な長さの断片を生じることが知られている制限酵素で切断する。制限酵素により消化された増幅産物は、遺伝子多型の種類に応じてサイズが異なるため、上述と同様に電気泳動法などを利用して検出することができる。 For example, when detecting a genetic polymorphism based on a difference in size, it can be identified using the difference in mobility due to the difference in size, for example, by agarose gel electrophoresis, polyacrylamide gel electrophoresis, capillary electrophoresis, etc. Can be detected. Moreover, it can also detect using restriction enzyme fragment length polymorphism (Restriction Fragment Length Polymorphism; RFLP). In this case, after amplifying the region containing the gene polymorphism, the obtained amplification product is cleaved with a restriction enzyme known to produce a fragment having a length unique to the given gene polymorphism. Since amplification products digested with restriction enzymes have different sizes depending on the type of gene polymorphism, they can be detected using electrophoresis as described above.
また、塩基配列の差異に基づいて遺伝子多型を検出する場合には、得られる増幅産物を直接配列決定することによって、遺伝子多型を検出することができる（ダイレクトシークエンシング法）。配列決定は、例えばジデオキシ法、マキサム−ギルバート法等の公知の方法により行うことができる。 In addition, when detecting a gene polymorphism based on a difference in nucleotide sequence, the gene polymorphism can be detected by directly sequencing the obtained amplification product (direct sequencing method). Sequencing can be performed by known methods such as the dideoxy method and the Maxam-Gilbert method.
また立体構造の差異に基づいて遺伝子多型を検出する場合には、ＰＣＲ−単鎖高次構造多型（ＳＳＣＰ）分析を利用することができる。ＰＣＲ−ＳＳＣＰ法は、増幅して得られた増幅産物を熱変性によって一本鎖ＤＮＡとした後、これをゲル中での電気泳動によって分離し、配列変化による移動度の変化を解析する方法であり、遺伝子多型の差異によって、一本鎖ＤＮＡの高次構造が異なることにより移動度が異なることを利用するものである。 Moreover, when detecting a gene polymorphism based on the difference in three-dimensional structure, PCR-single chain conformation polymorphism (SSCP) analysis can be used. The PCR-SSCP method is a method in which amplification products obtained by amplification are converted into single-stranded DNA by heat denaturation, and then separated by electrophoresis in a gel to analyze changes in mobility due to sequence changes. Yes, it uses the fact that the mobility differs due to the difference in the higher order structure of the single-stranded DNA due to the difference in the gene polymorphism.
本発明の判定方法においてプライマーとして使用することのできるオリゴヌクレオチドとしては、限定されるものではないが、以下のものが挙げられる：
（ａ）配列番号２に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号３に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット
このプライマーセットを用いると、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における３９４番目及び３９５番目における塩基の多型部位を増幅することができる。得られる増幅断片は、上述した直接塩基配列決定法又はＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を用いて分析することにより、３９４番目及び３９５番目における塩基の挿入／欠失型多型を検出することができる。
Oligonucleotides that can be used as primers in the determination method of the present invention include, but are not limited to:
(A) Primer set comprising an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 2 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 3 When this primer set is used, the 394th and 395th positions in the promoter region of the MUC5B gene The polymorphic site of the base in can be amplified. By analyzing the obtained amplified fragment using the direct nucleotide sequencing method or the PCR-SSCP method described above, insertion / deletion polymorphisms at the 394th and 395th positions can be detected.
（ｂ）配列番号４に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチド及び配列番号５に示される塩基配列からなるオリゴヌクレオチドを含むプライマーセット
このプライマーセットを用いると、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目、１４８番目、３９４番目及び３９５番目、８１７番目、８３７番目、並びに９７６番目の塩基からなるハプロタイプを含む領域を増幅することができる。
(B) Primer set comprising an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 4 and an oligonucleotide consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 5 When this primer set is used, the 135th and 148th positions of the promoter region of the MUC5B gene A region containing a haplotype consisting of the 394th and 395th, 817th, 837th, and 976th bases can be amplified.
また、遺伝子多型の検出は、一の遺伝子多型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。プローブは、必要に応じて、蛍光物質や放射性物質等の適当な手段により標識してもよい。プローブは、前記の遺伝子多型部位を含み、試料から調製したＤＮＡ等とハイブリダイズし、採用する検出条件下に検出可能な程度の特異性を与えるものである限りいかなるものでもよい。プローブとしては、例えば前記の遺伝子多型部位を含む連続する少なくとも１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列、より好ましくは１０〜５０塩基の配列にハイブリダイズすることのできるオリゴヌクレオチドを用いることができる。また、遺伝子多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するようにオリゴヌクレオチドを選択するのが好ましい。該オリゴヌクレオチドは、プローブとして機能し得る限り、即ち、目的の遺伝子多型の配列とハイブリダイズするが、他の遺伝子多型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、その配列において１又はそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。 Moreover, detection of a gene polymorphism can be performed by hybridization with a probe specific to one gene polymorphism. The probe may be labeled with an appropriate means such as a fluorescent substance or a radioactive substance, if necessary. The probe may be any probe as long as it contains the above-described gene polymorphism site, hybridizes with DNA prepared from a sample, etc., and gives a degree of specificity that can be detected under the detection conditions employed. As the probe, for example, an oligonucleotide that can hybridize to a sequence of at least 10 bases or more, preferably 10 to 100 bases, more preferably 10 to 50 bases including the gene polymorphic site is used. Can do. In addition, it is preferable to select the oligonucleotide so that the gene polymorphic site is present at almost the center of the probe. As long as the oligonucleotide can function as a probe, that is, as long as it hybridizes with the sequence of the gene polymorphism of interest, but does not hybridize with the sequence of other gene polymorphisms, One or more substitutions, deletions, additions may be included.
本発明に用いるハイブリダイゼーション条件は、遺伝子多型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料から調製したＤＮＡ等が一の遺伝子多型の場合にはハイブリダイズするが、他の遺伝子多型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。 Hybridization conditions used in the present invention are conditions sufficient to distinguish gene polymorphisms. For example, it is a condition that hybridizes when DNA or the like prepared from a sample has one gene polymorphism, but does not hybridize with another gene polymorphism, such as stringent conditions.
プローブは、一端を基板に固定してＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の遺伝子多型に対応するプローブのみが固定されていても、両方の遺伝子多型に対応するプローブが固定されていてもよい。 The probe can also be used as a DNA chip with one end fixed to a substrate. In this case, only a probe corresponding to one gene polymorphism may be immobilized on the DNA chip, or probes corresponding to both gene polymorphisms may be immobilized.
また、遺伝子多型は、上述した以外にも、当業者に公知のあらゆる方法によって検出することができる。そのような方法としては、変性勾配ゲル電気泳動法（ＤＧＧＥ：denaturing gradient gel electrophoresis）、ミスマッチ部位の化学的切断を利用した方法（ＣＣＭ：chemical cleavage of mismatches）、プライマー伸長法（ＰＥＸ）、インベーダー（Ｉｎｖａｄｅｒ）法、定量的リアルタイムＰＣＲ検出法（ＴａｑＭａｎ法）等を用いることができる。 Moreover, gene polymorphism can be detected by any method known to those skilled in the art other than those described above. Such methods include denaturing gradient gel electrophoresis (DGGE), chemical cleavage of mismatches (CCM), primer extension method (PEX), invader ( Invader) method, quantitative real-time PCR detection method (TaqMan method) and the like can be used.
（３）気道粘膜炎症性疾患の罹患リスク診断キット
上述したプライマー又はプローブとしてのオリゴヌクレオチドは、気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを診断するためのキットとして提供される。
(3) Disease risk diagnosis kit for airway mucosal inflammatory disease The oligonucleotide as the primer or probe described above is provided as a kit for diagnosing the risk of disease of airway mucosal inflammatory disease.
本発明の診断キットは、少なくとも１つオリゴヌクレオチドを含むものである。また、さらに遺伝子多型の検出を実施するために必要な１種以上の成分を含んでもよい。そのような成分としては、限定されるものではないが、制限酵素、ポリメラーゼ、バッファー（例えばＴｒｉｓ緩衝液）、ｄＮＴＰ、標識用及び検出用試薬（蛍光色素など）、説明書などが挙げられる。 The diagnostic kit of the present invention comprises at least one oligonucleotide. Furthermore, one or more kinds of components necessary for carrying out detection of genetic polymorphism may be included. Such components include, but are not limited to, restriction enzymes, polymerases, buffers (eg, Tris buffer), dNTPs, labeling and detection reagents (such as fluorescent dyes), and instructions.
本発明の気道粘膜炎症性疾患の罹患リスクを診断するためのキットにより、被験者の罹患リスクを簡便かつ迅速に診断することが可能となり、その診断結果に応じて適切な処置を施すことができる。 The kit for diagnosing the morbidity risk of an airway mucosal inflammatory disease of the present invention makes it possible to easily and quickly diagnose the morbidity risk of a subject, and appropriate treatment can be performed according to the diagnosis result.
２．Ｍｕｃ５Ｂの発現状態の分析方法
ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型は、そのプロモーターの転写活性に影響することから、本発明によればまた、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に存在する遺伝子多型を検出することによって、Ｍｕｃ５Ｂの発現状態を分析することができる。
2. Method for analyzing the expression state of Muc5B Since the gene polymorphism present in the promoter region of the MUC5B gene affects the transcriptional activity of the promoter, according to the present invention, the gene polymorphism present in the promoter region of the MUC5B gene is also determined. By detecting, the expression state of Muc5B can be analyzed.
例えば、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＧ、３９４番目及び３９５番目の塩基が挿入（Ｃ及びＡ）、８１７番目の塩基がＡ、８３７番目の塩基がＧ、並びに９７６番目の塩基がＣのハプロタイプの場合には、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーターの転写活性が高く、その結果、Ｍｕｃ５Ｂの発現量が多いと判断できる。 For example, the 135 th base in the promoter region of the MUC5B gene is G, the 148 th base is G, the 394 th and 395 th bases are inserted (C and A), the 817 th base is A, and the 837 th base is G When the 976th base is a haplotype of C, the transcriptional activity of the MUC5B gene promoter is high, and as a result, it can be determined that the expression level of Muc5B is large.
これに対し、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＡ、３９４番目及び３９５番目の塩基が欠失、８１７番目の塩基がＧ、８３７番目の塩基がＣ、並びに９７６番目の塩基がＴのハプロタイプの場合には、ＭＵＣ５Ｂのプロモーターの転写活性が低く、その結果、Ｍｕｃ５Ｂの発現量が少ないと判断できる。 In contrast, the 135 th base in the promoter region of the MUC5B gene is G, the 148 th base is A, the 394 th and 395 th bases are deleted, the 817 th base is G, the 837 th base is C, and When the 976th base is a T haplotype, the transcriptional activity of the MUC5B promoter is low, and as a result, it can be determined that the expression level of Muc5B is small.
また、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡが挿入されている多型の場合には、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の転写活性が高く、その結果、Ｍｕｃ５Ｂの発現量が多いと判断できる。 In addition, in the case of a polymorphism in which bases C and A at positions 394 and 395 in the promoter region of the MUC5B gene are inserted, the transcriptional activity of the promoter region of the MUC5B gene is high, and as a result, the expression level of Muc5B is large. It can be judged.
一方、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーターの３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡが欠失している多型の場合には、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーターの転写活性が低く、その結果、Ｍｕｃ５Ｂの発現量が低いと判断できる。 On the other hand, in the case of a polymorphism in which the bases C and A at the 394th and 395th positions of the MUC5B gene promoter are deleted, the transcriptional activity of the MUC5B gene promoter is low, and as a result, the expression level of Muc5B is low. I can judge.
３．ＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質のスクリーニング方法
本発明においては、前記の遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子断片の下流にリポーター遺伝子を結合させた転写ユニットを細胞に導入し、候補物質の存在下で該細胞を培養し、リポーター活性を測定し、その活性を指標としてＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質をスクリーニングすることができる。
3. Method for screening MUC5B transcription activity inhibitor In the present invention, a transcription unit in which a reporter gene is bound downstream of a gene fragment containing the promoter region of the MUC5B gene having the above gene polymorphism is introduced into a cell, and a candidate substance The cells can be cultured in the presence, the reporter activity can be measured, and MUC5B transcriptional activity inhibitors can be screened using the activity as an index.
このスクリーニング方法において使用する遺伝子多型は、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーターの転写活性を増強し、ＭＵＣ５Ｂの転写を促進してその発現量を有意に高くするものであることが好ましく、例えば、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目における塩基Ｃ及びＡの挿入、あるいは、配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の１３５番目の塩基がＧ、１４８番目の塩基がＧ、３９４番目及び３９５番目の塩基Ｃ及びＡの挿入、８１７番目の塩基がＡ、８３７番目の塩基がＧ、並びに９７６番目の塩基がＣのハプロタイプであることが好ましい。 The gene polymorphism used in this screening method is preferably one that enhances the transcriptional activity of the MUC5B gene promoter, promotes MUC5B transcription, and significantly increases its expression level. Insertion of bases C and A at the 394th and 395th positions of the promoter region of the MUC5B gene shown, or the 135th base of the promoter region of the MUC5B gene shown in SEQ ID NO: 1 is G, the 148th base is G, 394 It is preferable that the haplotype is the insertion of the Cth and Ath bases C and A, the 817th base is A, the 837th base is G, and the 976th base is C.
スクリーニングは、例えば、上記の遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の遺伝子断片の下流にレポーター遺伝子を挿入した転写ユニットを構築し、該転写ユニットを導入した細胞を候補物質の存在下又は非存在下の両方の場合について培養し、候補物質の存在下で培養を行った場合にレポーター活性が下がれば、その候補物質はＭＵＣ５Ｂ転写活性阻害物質として選択することができる。 In the screening, for example, a transcription unit in which a reporter gene is inserted downstream of the gene fragment of the promoter region of the MUC5B gene having the above gene polymorphism is constructed, and the cell into which the transcription unit has been introduced is present in the presence or absence of a candidate substance. If the reporter activity is lowered when culturing in both cases below and culturing in the presence of a candidate substance, the candidate substance can be selected as a MUC5B transcription activity inhibitor.
ここでリポーター遺伝子としては、ルシフェラーゼ、クロラムフェニコール、アセチルトランスフェラーゼ、ガラクトシダーゼなどの遺伝子が用いられる。 Here, as the reporter gene, genes such as luciferase, chloramphenicol, acetyltransferase, and galactosidase are used.
候補物質としては任意の物質を使用することができる。候補物質の種類は特に限定されず、個々の低分子合成化合物でもよいし、天然物抽出物中に存在する化合物でもよく、あるいは化合物ライブラリー、ファージディスプレーライブラリー、コンビナトリアルライブラリーでもよい。候補物質は、好ましくは低分子化合物であり、低分子化合物の化合物ライブラリーが好ましい。化合物ライブラリーの構築は当業者に公知であり、また市販の化合物ライブラリーを使用することもできる。 Any substance can be used as a candidate substance. The kind of candidate substance is not particularly limited, and may be an individual low molecular synthetic compound, a compound existing in a natural product extract, a compound library, a phage display library, or a combinatorial library. The candidate substance is preferably a low molecular compound, and a compound library of low molecular compounds is preferable. The construction of a compound library is known to those skilled in the art, and a commercially available compound library can also be used.
上記のスクリーニング法により得られるＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質もまた本発明の範囲内である。このようなＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質は、喀痰量の減少につながり、気道粘膜炎症性疾患の治療剤の候補物質として有用である。 The MUC5B transcription activity inhibitor obtained by the above screening method is also within the scope of the present invention. Such a MUC5B transcriptional activity inhibiting substance leads to a decrease in the amount of drought and is useful as a candidate substance for a therapeutic agent for airway mucosal inflammatory diseases.
４．ＭＵＣ５Ｂ転写因子のスクリーニング方法
本発明においてはまた、前記の遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子断片と被験試料を接触させ、上記断片と該被験試料に含まれる該遺伝子多型に特異的な転写因子との結合を検出することによって、ＭＵＣ５Ｂの転写因子をスクリーニングすることができる。
4). Method for screening MUC5B transcription factor In the present invention, a gene fragment containing a promoter region of the MUC5B gene having the above gene polymorphism is contacted with a test sample, and the fragment and the gene polymorphism contained in the test sample are specific. MUC5B transcription factors can be screened by detecting binding to specific transcription factors.
スクリーニングにおいて、前記の遺伝子多型を有するＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域を含む遺伝子断片と転写因子との結合の検出は、ゲルシフト法（電気泳動移動度シフト解析：electrophoretic mobility shift assay，ＥＭＳＡ）、ＤＮａｓｅＩフットプリント法等によって行うことがきるが、ゲルシフト法が好ましい。ゲルシフト法では、タンパク質（転写因子）が結合すると、ＤＮＡ−タンパク質複合体となるため分子サイズが大きくなり、電気泳動におけるＤＮＡの移動度が遊離ＤＮＡの場合よりも低下するので、電気泳動におけるバンドの「シフト」が起こる。従って、放射性同位体（３２Ｐなど）で標識した遺伝子断片と被験試料とを、例えば混合により接触させ、ゲル電気泳動を行い、ＤＮＡ−タンパク質複合体形成により生じた移動度の違いをオートラジオグラフィーで検出することができる。すなわち、被験試料中に転写因子が含まれる場合には、転写因子の結合した遺伝子断片はゆっくり移動するため、通常のバンドよりも遅れて移動するバンドとして検出される。 In the screening, the detection of the binding between the gene fragment containing the promoter region of the MUC5B gene having the above gene polymorphism and a transcription factor is performed by gel shift method (electrophoretic mobility shift assay: EMSA), DNase I footprint. The gel shift method is preferable although it can be carried out by a method or the like. In the gel shift method, when a protein (transcription factor) binds to a DNA-protein complex, the molecular size increases, and the mobility of DNA in electrophoresis is lower than that in free DNA. A “shift” occurs. Therefore, a gene fragment labeled with a radioisotope (such as 32 P) and a test sample are brought into contact with each other by, for example, mixing, gel electrophoresis is performed, and the difference in mobility caused by DNA-protein complex formation is detected by autoradiography. Can be detected. That is, when a transcription factor is contained in the test sample, the gene fragment to which the transcription factor is bound moves slowly, so that it is detected as a band that moves later than the normal band.
スクリーニングにおいて用いる被験試料は、ＭＵＣ５Ｂの転写因子（タンパク質）の存在が予想される試料であれば特に限定されるものではなく、天然由来の試料、あるいはペプチドライブラリーなどでもよい。 The test sample used in the screening is not particularly limited as long as the presence of the MUC5B transcription factor (protein) is expected, and may be a naturally derived sample or a peptide library.
以下、実施例を用いて本発明をより詳細に説明するが、本発明の技術的範囲はこれら実施例に限定されるものではない。 EXAMPLES Hereinafter, although this invention is demonstrated in detail using an Example, the technical scope of this invention is not limited to these Examples.
〔実施例１〕ムチンＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における欠失・挿入多型の同定
ヒト末梢血白血球よりゲノムＤＮＡを抽出した。このＤＮＡを鋳型として表２に示すプライマーセット（配列番号２及び３）を用いてＰＣＲを行った。酵素にはＴａｑポリメラーゼ（AmpliTaq Gold DNA polymerase,Applied Biosystems,Foster City,California,USA）を用いた。
[Example 1] Identification of deletion / insertion polymorphism in the promoter region of mucin MUC5B gene Genomic DNA was extracted from human peripheral blood leukocytes. Using this DNA as a template, PCR was performed using the primer sets (SEQ ID NOs: 2 and 3) shown in Table 2. Taq polymerase (AmpliTaq Gold DNA polymerase, Applied Biosystems, Foster City, California, USA) was used as the enzyme.
得られたＰＣＲ産物を用いて、ABI BigDye terminator cycle-sequencing kit とABI3100 automated sequencer（Applied Biosystems, Foster City,California,USA）を用いて塩基配列を決定した。その結果、ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域に塩基Ｃ及びＡの欠失又は挿入の多型を見出すことができた。この欠失・挿入多型（Ｌ３とする）を含む周辺の塩基配列と、この多型の周囲に認められた別の５つの多型（Ｌ１、Ｌ２、Ｌ４、Ｌ５、Ｌ６）を図１に示す。Ｌ３以外は既知のものであり、ＮＣＢＩのデータベースであるｄｂＳＮＰの登録番号はそれぞれ、ｒｓ８８５４５５（Ｌ１），ｒｓ８８５４５４（Ｌ２）、ｒｓ７１１５４５７（Ｌ４）、ｒｓ７１１８５６８（Ｌ５）及びｒｓ２７３５７３８（Ｌ６）である。 Using the obtained PCR product, the base sequence was determined using ABI BigDye terminator cycle-sequencing kit and ABI3100 automated sequencer (Applied Biosystems, Foster City, California, USA). As a result, a deletion or insertion polymorphism of bases C and A could be found in the promoter region of the MUC5B gene. FIG. 1 shows the peripheral nucleotide sequence including this deletion / insertion polymorphism (referred to as L3) and other five polymorphisms (L1, L2, L4, L5, L6) found around this polymorphism. Show. The registration numbers of dbSNP, which is an NCBI database, are known except for L3, and are rs88455 (L1), rs884544 (L2), rs71115457 (L4), rs711118568 (L5), and rs2735738 (L6), respectively.
この多型Ｌ３は、表２に示したプライマーセット（配列番号２及び３）で増幅したＰＣＲ産物を、１０％アクリルアミドゲル上で泳動するＰＣＲ−ＳＳＣＰ法を用いても同様に確認することができた。 This polymorphism L3 can be confirmed in the same manner using the PCR-SSCP method in which PCR products amplified with the primer sets (SEQ ID NOs: 2 and 3) shown in Table 2 are run on a 10% acrylamide gel. It was.
〔実施例２〕ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域における多型とＤＰＢとの関連性
（１）ハプロタイプ解析
ＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域には、ハプロタイプ解析の結果、多型Ｌ１からＬ６よりなる３つの代表的なハプロタイプが認められ（表３）、Ｌ３が欠失となっているＨ２の頻度は、ＤＰＢ患者で有意に低下していた（ｐ＝０．０００２）。
[Example 2] Association between polymorphism in promoter region of MUC5B gene and DPB (1) Haplotype analysis In the promoter region of MUC5B gene, as a result of haplotype analysis, three representative haplotypes consisting of polymorphisms L1 to L6 are shown. (Table 3), the frequency of H2 with L3 deletion was significantly reduced in DPB patients (p = 0.0002).
ハプロタイプ関連解析の結果より、Ｌ３におけるＣＡの欠失をともなうハプロタイプがＤＰＢにおいては疾患抵抗性に関与している可能性が考えられた。このＬ３多型を含むプロモーターの転写活性を検討するためルシフェラーゼアッセイを行った。 From the results of haplotype-related analysis, it was considered that a haplotype with CA deletion in L3 may be involved in disease resistance in DPB. A luciferase assay was performed to examine the transcriptional activity of a promoter containing this L3 polymorphism.
上記６つの多型を含む１０９０塩基の領域を、制限酵素ＢｇｌＩＩサイト及びＨｉｎｄＩＩＩサイトを付加したプライマーセットで増幅し（表４；配列番号４及び５）、これらの制限酵素で処理した後、pGL3-Basic Vector（Promega,Madison,WI,USA）にクローニングした。このプラスミドを大腸菌に導入・増幅し、抽出後に肺粘液性類表皮癌由来のヒト気管支上皮細胞株ＮＣＩ−Ｈ２９２細胞（ＡＴＣＣ受託番号ＣＲＬ−１８４８）にトランスフェクトし、２４時間培養後にDual-Luciferase Reporter Assay System（Promega）にて活性を測定した（図２）。Ｌ３を含むハプロタイプが最も低い転写活性を有しており、健常者においてＭｕｃ５Ｂの分泌を低下させることにより、ＤＰＢの疾患抵抗性に関与している可能性が考えられた。 A region of 1090 bases containing the above 6 polymorphisms was amplified with a primer set to which restriction enzymes Bgl II site and Hind III site were added (Table 4; SEQ ID NOs: 4 and 5), and after treatment with these restriction enzymes, It was cloned into pGL3-Basic Vector (Promega, Madison, WI, USA). This plasmid was introduced and amplified in Escherichia coli, and after extraction, transfected into a human bronchial epithelial cell line NCI-H292 cell (ATCC accession number CRL-1848) derived from lung mucinous epidermoid carcinoma, and cultured for 24 hours, then a Dual-Luciferase Reporter Activity was measured with Assay System (Promega) (FIG. 2). The haplotype containing L3 has the lowest transcriptional activity, and it was considered that it may be involved in the disease resistance of DPB by reducing the secretion of Muc5B in healthy subjects.
（２）個々の多型とアリル頻度との解析
ＭＵＣ５Ｂのプロモーター領域に同定された６つの多型に関して、ＤＰＢ患者９２例と健常対照１２８例のＤＮＡを用いて遺伝子多型を検出し、その関連を解析した。アリル頻度の検討では、Ｌ２（ｐ＝０．００８）、Ｌ４（ｐ＝０．０４９）、Ｌ６（ｐ＝０．０４）で疾患と関連が示されたが、Ｌ３の欠失・挿入多型の検討の結果、表５に示すように、Ｌ３における塩基ＣＡの欠失はＤＰＢ患者で有意に低下していた（ｐ＜０．０００１）。従って、このＬ３多型は、ＤＰＢの疾患抵抗性に関係しているといえる。
(2) Analysis of individual polymorphisms and allele frequency Regarding 6 polymorphisms identified in the promoter region of MUC5B, genetic polymorphisms were detected using DNA of 92 DPB patients and 128 healthy controls. Was analyzed. In the examination of allele frequency, L2 (p = 0.008), L4 (p = 0.049), and L6 (p = 0.04) showed an association with the disease, but the deletion / insertion polymorphism of L3 As a result of the examination, as shown in Table 5, the deletion of base CA in L3 was significantly decreased in DPB patients (p <0.0001). Therefore, it can be said that this L3 polymorphism is related to the disease resistance of DPB.
本発明により、気道粘膜炎症性疾患（特にびまん性汎細気管支炎）の罹患リスクを判定することが可能となる。また、本発明のオリゴヌクレオチド及び診断キットにより、かかる判定を簡便かつ迅速に行うことができる。 The present invention makes it possible to determine the risk of suffering from an airway mucosal inflammatory disease (particularly diffuse panbronchiolitis). In addition, the determination can be performed easily and rapidly by the oligonucleotide and the diagnostic kit of the present invention.
また本発明により、ＭＵＣ５Ｂの転写活性阻害物質及び転写因子をスクリーニングすることができ、ＭＵＣ５Ｂが関連する可能性のある気道粘膜炎症性疾患の発症機構の解明、その予防又は治療薬の開発などに有用である。 In addition, according to the present invention, MUC5B transcriptional activity inhibitors and transcription factors can be screened, which is useful for elucidating the onset mechanism of airway mucosal inflammatory diseases that may be associated with MUC5B, and developing preventive or therapeutic agents. It is.
配列番号１：Ｙ＝Ｃ又はＴ、Ｒ＝Ａ又はＧ、Ｓ＝Ｇ又はＣ、ＮＮ＝ＣＡの挿入／欠失
配列番号２〜５：合成オリゴヌクレオチド
SEQ ID NO: 1: Y = C or T, R = A or G, S = G or C, NN = CA insertion / deletion SEQ ID NO: 2-5: Synthetic oligonucleotide
Claims (11)
（ａ）配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目に存在する遺伝子多型を含む配列からなるオリゴヌクレオチドにハイブリダイズすることができ、かつ配列番号１に示される塩基配列のうち該遺伝子多型を含む連続する少なくとも１９塩基からなる配列に対し相補的な配列からなるプローブ用オリゴヌクレオチド
（ｂ）配列番号１に示されるＭＵＣ５Ｂ遺伝子のプロモーター領域の３９４番目及び３９５番目に存在する遺伝子多型を含む配列を増幅することができ、かつ配列番号１に示される塩基配列のうち連続する少なくとも１９塩基からなる配列、又は該配列に対し相補的な配列を含むプライマー用オリゴヌクレオチド A kit for diagnosing the risk of suffering from an airway mucosal inflammatory disease, comprising one or more of the following oligonucleotides.
(A) a nucleotide sequence capable of hybridizing to an oligonucleotide comprising a sequence containing a gene polymorphism present at the 394th and 395th positions of the promoter region of the MUC5B gene represented by SEQ ID NO: 1 and represented by SEQ ID NO: 1 Probe oligonucleotide consisting of a sequence complementary to a sequence consisting of at least 19 consecutive nucleotides containing the gene polymorphism (b) present at the 394th and 395th of the promoter region of the MUC5B gene shown in SEQ ID NO: 1 A primer oligonucleotide that can amplify a sequence containing a gene polymorphism and includes a sequence consisting of at least 19 consecutive bases of the base sequence shown in SEQ ID NO: 1, or a sequence complementary to the sequence
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