JP4111481B2 - Method for determining genetic factors of myocardial infarction and oligonucleotides used therefor - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は心筋梗塞の遺伝的要因を検出するための方法及びこれに使用されるオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
心筋梗塞の発病には、いくつかの遺伝的因子と生活習慣等の非遺伝的因子とが関わっていると考えられるが、その発病のメカニズムは解明されていない。
従って、心筋梗塞を発病する可能性の高い遺伝的因子が明らかになれば、発病のメカニズムの解明に大きな役割を果たすと共に、その遺伝的因子の判定により心筋梗塞に罹患する可能性の高い患者に対し、生活習慣等の非遺伝的因子を最小限とする指導を行い、発病の危険性を著しく低下させ得ると考えられる。
本発明の発明者は、１０個のエキソンを有するヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のゲノムＤＮＡ構造（Gene Bank D84115）を解明しているが（T.Nakayama et al., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 221, 803-806 (1996))、さらにその機能を研究する過程で、プロスタサイクリン遺伝子における多型が、心筋梗塞の発症に関連することを見出し、本発明を完成させた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型の分析により心筋梗塞の遺伝的要因を判定する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
第１に、本発明は、下記の方法に関する。
（１） ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子における多型を分析することからなる心筋梗塞の遺伝的要因を判定するための方法。
（２） 試料から核酸を抽出し、配列表の配列番号１に示されるヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン８（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の塩基番号１８２の部位を含む配列を増幅し、得られた増幅産物を分析することにより該塩基がＡかＣかを決定することを含む（１）の方法。
（３） 試料から核酸を抽出し、配列表の配列番号２の開始コドン（塩基番号５０１〜５０３）の上流側の配列（塩基番号１〜６００、好ましくは塩基番号３００〜５００）を増幅し、増幅産物を分析してＣＣＧＣＣＡＧＣＣを繰り返し単位とするＶＮＴＲ多型の繰り返し数を決定することを含む（１）の方法。
（４） 試料から核酸を抽出し、配列表の配列番号１に示されるヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン８（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の塩基番号１８２の部位を含む配列を増幅し、得られた増幅産物を分析することにより該部位がＡかＣかを決定すること、及び配列表の配列番号２の塩基番号５０１〜５０３の開始コドンの上流側の配列（塩基番号１〜６００、好ましくは塩基番号３００〜５００）を増幅し、増幅産物を分析してＣＣＧＣＣＡＧＣＣを繰り返し単位とするＶＮＴＲ多型の繰り返し数を決定することを含む（１）の方法。
【０００５】
第二に、本発明は下記のプローブ及びプライマーに関する。
（５） 配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基の配列にハイブリダイズし得る（１）、（２）または（４）の方法においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチド。
（６） 配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基の配列を増幅するためのフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして機能し得る（１）、（２）または（４）の方法に使用されるオリゴヌクレオチド。
（７） 配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基の配列を、１塩基または数塩基の置換、欠失、付加を導入することにより、１８２の部位の塩基がＡまたはＣのいずれか一方である場合にのみ特定の制限酵素による認識配列が生じるように増幅するためのフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして機能し得る（１）、（２）または（４）の方法に使用されるオリゴヌクレオチド。
（８） （１）〜（４）の方法に使用されるフォワードプライマーとリバースプライマーとして機能する一組のオリゴヌクレオチドであって、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの一方が配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する配列にハイブリダイズすることができ、他方が配列番号１の配列の他の部分にハイブリダイズすることができる一組のオリゴヌクレオチド。
（９） 配列番号２の配列または配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列の一部であって、ＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位のＶＮＴＲ多型部分を含んで連続する配列を増幅するためのフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして機能し得る（１）、（３）または（４）の方法に使用されるオリゴヌクレオチド。
さらに、本発明は、少なくとも、（５）のオリゴヌクレオチドの一またはそれ以上が基板に固定化されている（１）〜（４）の方法に使用されるＤＮＡチップに関する。
また、本発明は、少なくとも、（５）〜（９）のオリゴヌクレオチドの一またはそれ以上、及び／または（１０）のＤＮＡチップを含む（１）〜（４）の方法に使用されるキットに関する。
なお、上記において、オリゴヌクレオチドは適宜標識されたものであってもよい。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、「心筋梗塞の遺伝的要因を判定する」とは、被験者が心筋梗塞の発症の危険性が高いことを示す対立遺伝子型を有するか否かを判定することを意味する。
上記、本発明の判定方法において、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子（以下、場合よりＰＧＩＳ遺伝子と記す）における多型を分析するとは、ＰＧＩＳ遺伝子のゲノムＤＮＡのエキソンまたはイントロン、ＰＧＩＳ遺伝子の上流側（例えば、塩基番号１〜５００）等における多型を分析するこという。
多型の分析は、例えば多型を含む部分の配列を増幅し、対立遺伝子型を分析することからなる。また、ゲノムＤＮＡの分析であっても、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの分析であってもよい。
本発明において使用される試料は、任意の生物学的試料、例えば血液、毛髪、組織片、尿等であり得る。
多型は、例えばSingle nucleotide polymorphism（ＳＮＰ）多型、variable number of tandem repeat（ＶＮＴＲ）多型等であり得る。
【０００７】
（増幅）
多型を含む部分の増幅は、例えばＰＣＲによって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＲＣＲ等で行ってもよい。
プライマーの選択は、例えば、多型部分を含む１０塩基以上の配列を増幅するように行い得る。増幅される配列は、ＳＮＰの場合には１０〜１００塩基、好ましくは１０〜５０塩基であり得る。ＶＮＴＲ多型の場合には、繰り返し単位を構成するヌクレオチドの数及び最大繰り返し数によるが、例えば２０〜３００塩基であり得る。
また、プライマーは、試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅されるように、フォワードプライマー（以下、Ｆプライマーと記す）またはリバースプライマー（以下、Ｒプライマーと記す）の一方が多型部位にハイブリダイズするように選択してもよい。
プライマーは必要に応じて蛍光，ＲＩ等の適当な手段により標識され得る。
【０００８】
（多型の分析）
多型の分析は、公知の方法を適宜選択して行い得る。分析方法の例を下記に示す。
ａ．ハイブリダイゼーション
多型の分析は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。
プローブは、必要に応じて、蛍光，ＲＩ等の適当な手段により標識され得る。
プローブは、例えば多型部分を含む１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基の配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。ＳＮＰの分析の場合には、１０〜５０塩基の配列を有するのが好ましい。また、ＳＮＰの分析の場合、多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するようにプローブを選択するのが好ましい。
本発明において、ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。
プローブの一端を基板上に固定化してなるＤＮＡチップを用いてもよい。
【０００９】
ｂ．制限酵素断片長多型を利用する方法
多型の分析は、制限断片長多型を利用して行うこともできる。この方法は、多型部位がいずれの遺伝子型をとるかによって、制限酵素により切断されるか否かが異なってくる制限酵素で試料核酸を消化し、消化物の断片の大きさを調べることにより、該制限酵素で試料核酸が切断されたか否かを調べ、それによって試料の多型を分析する方法である。
ｃ．配列決定
多型の分析を、増幅産物の配列決定により行ってもよい。
配列決定は、例えばジデオキシ法、Maxam-Gilbert法等の公知の方法により行い得る。
ｄ．変性勾配ゲル電気泳動
試料ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を変性勾配ゲル電気泳動にかけることにより分析することもできる。
ｅ．その他
ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法、Allele Specific PCR法等を多型の分析に使用することもできる。
【００１０】
本発明は、上記多型の分析方法により分析した結果を、所望により他の多型分析、及び／または他の検査結果と合わせて、心筋梗塞に罹患する可能性を判断することを含む心筋梗塞の診断方法にも関する。該方法において、いくつかのヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の多型分析を組み合わせて利用することも有効である。
また、本発明は上記診断方法による診断の結果、さらに精密な検査を行うこと、心筋梗塞の治療を行うこと、及び／または食餌内容等の生活習慣の改善を指導することを含む心筋梗塞の予防または治療方法にも関する。
【００１１】
上記本発明の方法の実施態様の一つとして、上記方法において、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン８におけるＳＮＰ、具体的には配列番号１の配列の塩基番号１８２の部位におけるＳＮＰを検出することを含む方法が挙げられる。なお、配列番号１の配列において、エキソン８は塩基番号９０〜２７１の部分である。
該方法においては、プライマーとして、配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば１５〜３０塩基の配列を増幅するためのＦプライマーまたはＲプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチド、またはＦプライマーとＲプライマーからなる一組のプライマーであって、ＦプライマーまたはＲプライマーの一方が配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば１５〜３０塩基の配列にハイブリダイズし、他方が配列番号１の配列の他の部分の少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば２０〜２５塩基の配列にハイブリダイズする一組のプライマーを使用することができる。
この場合、ＰＣＲ条件は、例えば下記のものであり得る。
プライマー濃度：０．１〜１．０μＭ
ＭｇＣｌ２濃度：０．７〜１．５μＭ
ｄＮＴＰ濃度：各１００〜２００μＭ
至適酵素量：０．５〜２．５Ｕ／５０μｌ
鋳型ゲノムＤＮＡ量：５０〜５００ｎｇ
サイクル数：２５〜３５サイクル
denature温度：約９４℃
denature時間：２０〜３０秒
annealing温度：５５〜６５℃
annealing時間：２０〜６０秒間
extension温度：７２〜７５℃
extension時間：２０〜１８０秒間
アガロースゲル濃度：０．４〜２．０％
【００１２】
上記プライマーとしてのオリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列の一部に相補的な配列を有していてもよく、また、上記プライマーとして機能し得る限り、該配列において１またはそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
上記方法においては、プローブとして配列番号１の配列（配列中、ｍはＡまたはＣを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１８２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば１５〜３０塩基の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用することができる。
該オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列の目的とする部位と相補的な配列を有していてもよく、またプローブとして機能し得る限り、即ち、目的の対立遺伝子型の配列とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、該配列において１またはそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。このプローブは、一端を各々基板に固定してなるＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の対立遺伝子型（即ちｍがＡまたはＣ）に対応するプローブのみが固定されていても、両方の対立遺伝子型に対応するプローブが固定されていてもよい。ＤＮＡチップには、本発明で検出できる多型と異なる多型を分析するためのプローブも共に固定され得る。
【００１３】
上記本発明の方法の他の実施態様としては、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の開始コドンから１〜約１００塩基上流の範囲に存在するＣＣＧＣＣＡＧＣＣを繰り返し単位とするＶＮＴＲ多型を分析することを含む方法が挙げられる。ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の上流側の配列は、配列番号２に示される。配列番号２において、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の開始コドンは塩基番号５０１〜５０３である。
該方法に使用されるプライマーとしては、配列番号２の配列または配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列の一部であって、該配列に示されるヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の上流のＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位のＶＮＴＲ多型部分を含んで連続する配列を増幅するためのフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして機能し得る上記方法に使用されるオリゴヌクレオチドを使用することができる。
該プライマーは配列番号２の配列または配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列の一部に相補的な配列を有していてもよく、また、上記プライマーとして機能し得る限り、該配列において１またはそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
上記方法においては、プローブとして配列番号２または配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列の多型部分を含んで連続する５０塩基以上、好ましくは５０〜２００塩基の配列とハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用することができる。
これらのオリゴヌクレオチドは、配列番号２または配列番号２の配列においてＣＣＧＣＣＡＧＣＣの繰り返し単位が４単位ではなく２，３，５，６または７単位含まれる配列の多型を含む部分の配列に相補的な配列を有していてもよく、また、プローブとして機能し得る限り、該配列において１またはそれ以上の置換、欠失、付加を含んでいてもよい。
各繰り返し数の配列に対応する全てまたは一部のオリゴヌクレオチドからなる一組のプローブセットを使用することもできる。また、該プローブセットを構成する各プローブの一端が基板に固定されているＤＮＡチップとして用いることもできる。ＤＮＡチップには、上記のエキソン８のＳＮＰを検出するためのプローブが共に固定されていてもよい。また、本発明で検出できる多型と異なる多型を分析するためのプローブが共に固定されていてもよい。
【００１４】
本発明は、上記で説明したプライマーと、上記プローブとしてのオリゴヌクレオチド及び／または上記ＤＮＡチップを含む心筋梗塞診断用キットにも関する。
キットは、さらに制限断片長多型法に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識のための手段、緩衝液等、本発明の方法を実施するのに必要な他の要素を含んでいてもよい。
なお、本発明に使用されるプライマー及びプローブは市販のＤＮＡ合成機等により合成することができる。また、本発明において、ハイブリダイゼーションは、Sambrook，J．Fritsch，E.F.，Maniatis T.（1989）Molecular Cloning．A laboratory manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yorkの記載を参考に行うことができる。また、ＰＣＲ法は、下記の文献を参考に行うことができる：PCR Technology，J.A．Ehrlich編，Stockholm Press，New York（1989）; Molecular Methods for Virus Detection，D.L．Wiedbrauk及びD.H．Farkas編，Academic Press，New York(1995)．Nucleic Acid Hybridisation，B.D．Hames及びS.J．Higgins編，IRL Press，Oxford，Washington DC(1985)）。
本明細書において、塩基番号は添付の配列表に基づく。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、これらは本発明を限定するものではない。
実施例１
エキソン８の多型と心筋梗塞との関連について、心筋梗塞と診断された患者１２２名（ＭＩ群）及び年齢を一致させた健常人１５５名（non-ＭＩ群）を年齢を一致させて選択した。
各被験者の末梢血を採取し、標準方法（例えばSambrook，J．Fritsch，E.F.，Maniatis T.（1989）Molecular Cloning．A laboratory manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yorkに記載）により、ゲノムＤＮＡを抽出し、下記に示す方法によりプロスタサイクリン遺伝子のエキソン８の多型部位を増幅した。
200ngの上記ゲノムＤＮＡ、下記の配列を有する濃度19pmol/μｌのＦプライマー溶液及びＲプライマー溶液各々0.8μｌ、ヌクレオチド三リン酸（Takara社製造）各々２５mM、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２４μl、TaqＤＮＡポリメラーゼ（Takara社製）０．２Ｕ／４０μl、水２５．０μl及び１０倍緩衝液（Takara社製）４μlの混合物計４０μｌの系にて、ＰＣＲ装置（PerkinElmer GeneAmp9700）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、続いて９８℃２５秒間、６３℃１分間、７２℃１分間のサイクルを３０サイクル、その後、７２℃で１０分間の後、４℃に保温とした。
【００１６】
プライマー配列
Ｆプライマー：TGGCATATGAGCAGGTGAAGGG（配列番号：３）
Ｒプライマー：CCACGTCGCAGGTTGAATTGT（配列番号：４）
得られたＰＣＲ産物をエタノール沈殿により精製し、dry upペレットにした後、制限酵素溶液（１０ｘ緩衝液（第一化学）５μl、水４４μl及び制限酵素BsmAI１（第一化学）１μlと反応させ、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。
制限酵素BsmAIの認識配列はGAGACであり、上記配列番号１の配列の塩基番号１８２の部位の塩基がＡである場合は切断され、Ｃである場合は切断されない。
上記の方法により、各試料を分析したところ、下記の表に示す結果が得られた。表中、Ａは上記配列番号１の配列の塩基番号１８２の部位がＡである遺伝子型を意味し、Ｃは、該塩基がＣである遺伝子型を意味する。なお、被験者は全て日本人である。
【００１７】
【表１】
これを対立遺伝子頻度として下記の表に示した。
【００１９】
【表２】
上記の結果をχ2解析により分析したところ、対立遺伝子と表現型とは統計学的に有意な相関を有していた（ｐ値＝０．００７６）。
従って、配列番号１の塩基番号１８２がＣである場合に心筋梗塞の発症の危険性が高いと判定することができる。
【００２１】
実施例２：
ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン１の上流側に存在するＶＮＴＲ多型を調べるために、心筋梗塞と診断された患者１１０名（ＭＩ群）及び年齢を一致させた健常者１３４名（non-ＭＩ群）を年齢を一致させて選択した。各患者の抹消血白血球から実施例１と同様の標準的な方法により、下記に示す方法によりヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子のエキソン１の上流側の約２００塩基を増幅した。プライマーとしては、下記の配列を有するプライマーを使用した。
Ｆプライマー：5'-ACATTTTCCCCCAGGCCTGAGCTGC-3'（配列番号：５）
Ｒプライマー：5'-CGGCTCAGTAGCAGCAGCAGCAACAGT-3'（配列番号：６）
【００２２】
50ngの上記ゲノムＤＮＡ、３２Ｐで標識した上記配列を有するＦプライマー0.125pmol、未標識のＲプライマー0.125pmol、ヌクレオチド三リン酸（Takara社製）各々２５mM、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２４μl、TaqＤＮＡポリメラーゼ（Takara社製）０．２Ｕ／４０μl、水２５．０μl及び１０倍緩衝液（Takara社製）４μlの混合物を調製し、ＰＣＲ装置（PerkinElmer GeneAmp9700）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は９５℃で３分間、続いて９８℃２５秒間、６８℃９０秒間、７２℃の２Ｓｔｅｐサイクルを３０サイクル、その後、７２℃で１０分間の後、４℃に保温とした。
増幅された断片をpCRＴＭ2.1（Invitrogen)にサブクローニングした後、ジデオキシ法によりＤＮＡシーケンシングを行い、これを標準とした。各群のサンプル及び標準のプラスミドクローンを増幅した後、同時に６％ポリアクリルアミドシーケンシングゲルにて電気泳動する事により遺伝子型を決定した。なお、７タンデムリピートアレルＰＣＲ産物の大きさは３１７ｂｐであり、３タンデムリピートアレルＰＣＲ産物の大きさは２８１ｂｐであった。
non−ＭＩ群及びＭＩ群のタンデムリピート数を下記に示す。なお、被験者は全て日本人である。
【００２３】
【表３】
これを対立遺伝子頻度として下記の表に示した。
【００２５】
【表４】
上記の結果をχ2解析により分析したところ、対立遺伝子と表現型とは統計学的に有意な相関を有していた（ｐ値＝０．０３７５）。従って、繰り返し数が少ない場合に心筋梗塞発症の危険性が高いと考えられ、ヒトプロスタサイクリン合成酵素遺伝子の上記ＶＮＴＲ多型は心筋梗塞の遺伝的要因の判定に利用できることが明らかである。
【００２７】
【発明の効果】
本発明の方法により、心筋梗塞の遺伝的要素を有するか否かが判定でき、これにより心筋梗塞の危険性を予測することができる。さらに、その結果に基づき、食餌内容等の生活習慣の改善により心筋梗塞の環境的要因を最低限に押さえる指導を行い、心筋梗塞の予防または治療を行うことができる。
【配列表】
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a method for detecting a genetic factor of myocardial infarction and an oligonucleotide used therefor.
[0002]
[Prior art]
It is thought that several genetic factors and non-genetic factors such as lifestyle are related to the onset of myocardial infarction, but the mechanism of the onset has not been elucidated.
Therefore, if a genetic factor that is highly likely to cause myocardial infarction is clarified, it will play a major role in elucidating the mechanism of the disease, and by determining the genetic factor, patients who are highly likely to suffer from myocardial infarction On the other hand, guidance that minimizes non-genetic factors such as lifestyle habits is considered to reduce the risk of disease.
The inventor of the present invention has clarified the genomic DNA structure (Gene Bank D84115) of a human prostacyclin synthase gene having 10 exons (T. Nakayama et al., BIOCHEMICAL AND BIOPHYSICAL RESEARCH COMMUNICATIONS 221, 803). -806 (1996)), in the course of studying its function, it was found that polymorphisms in the prostacyclin gene are associated with the onset of myocardial infarction, and the present invention was completed.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for determining a genetic factor of myocardial infarction by analyzing a polymorphism of a human prostacyclin synthase gene.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
First, the present invention relates to the following method.
(1) A method for determining a genetic factor of myocardial infarction, comprising analyzing a polymorphism in a human prostacyclin synthase gene.
(2) A nucleic acid is extracted from a sample, and a sequence containing the site of base number 182 of exon 8 (m represents A or C in the sequence) of the human prostacyclin synthase gene shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing The method according to (1), comprising amplifying and determining whether the base is A or C by analyzing the obtained amplification product.
(3) Nucleic acid is extracted from the sample, and the sequence (base numbers 1 to 600, preferably base numbers 300 to 500) upstream of the start codon (base numbers 501 to 503) of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing is amplified. The method according to (1), comprising analyzing the amplification product and determining the number of repeats of the VNTR polymorphism having CCGCCAGCC as a repeat unit.
(4) A nucleic acid is extracted from the sample, and a sequence containing the site of base number 182 of exon 8 (m represents A or C in the sequence) of the human prostacyclin synthase gene shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing Amplifying and analyzing the obtained amplification product to determine whether the site is A or C, and a sequence upstream of the start codon of base numbers 501 to 503 of SEQ ID NO: 2 in the sequence listing (base number 1 (600), preferably base numbers 300 to 500), and analyzing the amplification product to determine the number of repeats of the VNTR polymorphism having CCCGCCAGCC as a repeat unit.
[0005]
Secondly, the present invention relates to the following probes and primers.
(5) A part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (in the sequence, m represents A or C), which hybridizes to a sequence of at least 10 bases that includes the site of base number 182 of SEQ ID NO: 1 An oligonucleotide used as a probe in the obtained method (1), (2) or (4).
(6) To amplify a sequence of at least 10 bases which is a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (in the sequence, m represents A or C) and includes the site of base number 182 of SEQ ID NO: 1. The oligonucleotide used for the method of (1), (2) or (4) which can function as a forward primer or a reverse primer.
(7) A sequence of at least 10 bases that is a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (wherein m represents A or C) and includes the site of base number 182 of SEQ ID NO: 1 Alternatively, by introducing substitutions, deletions or additions of several bases, a forward for amplification so that a recognition sequence by a specific restriction enzyme is generated only when the base at position 182 is either A or C. The oligonucleotide used for the method of (1), (2) or (4) which can function as a primer or a reverse primer.
(8) A set of oligonucleotides functioning as a forward primer and a reverse primer used in the methods (1) to (4), wherein one of the forward primer and the reverse primer is the sequence of SEQ ID NO: 1 (in the sequence, m represents A or C), and can hybridize to a continuous sequence including the site of base number 182 of SEQ ID NO: 1, and the other to the other part of the sequence of SEQ ID NO: 1. A set of oligonucleotides that can hybridize.
(9) The sequence of SEQ ID NO: 2 or the sequence of SEQ ID NO: 2 is a part of a sequence in which the CCCGCCAGCC repeat unit is contained in 2, 3, 5, 6 or 7 units instead of 4 units, and the CCNGCCAGCC repeat unit VNTR The oligonucleotide used for the method of (1), (3) or (4) which can function as a forward primer or a reverse primer for amplifying a continuous sequence including a polymorphic part.
Furthermore, the present invention relates to a DNA chip used in the methods (1) to (4) in which at least one or more of the oligonucleotides (5) are immobilized on a substrate.
The present invention also relates to a kit for use in the methods (1) to (4) comprising at least one or more of the oligonucleotides (5) to (9) and / or the DNA chip (10). .
In the above, the oligonucleotide may be appropriately labeled.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, “determining the genetic factor of myocardial infarction” means determining whether or not the subject has an allele type indicating that the risk of developing myocardial infarction is high.
In the determination method of the present invention, polymorphism in a human prostacyclin synthase gene (hereinafter referred to as PGIS gene) is analyzed by exon or intron of PGIS gene genomic DNA, upstream of PGIS gene (for example, , Analysis of polymorphisms in base numbers 1 to 500).
Analysis of polymorphism consists of, for example, amplifying the sequence of the portion containing the polymorphism and analyzing the allelic form. Further, it may be genomic DNA analysis or cDNA or mRNA analysis.
The sample used in the present invention can be any biological sample, such as blood, hair, tissue pieces, urine, and the like.
The polymorphism can be, for example, a single nucleotide polymorphism (SNP) polymorphism, a variable number of tandem repeat (VNTR) polymorphism, or the like.
[0007]
(amplification)
Amplification of the portion containing the polymorphism is performed by PCR, for example, but may be performed by other known amplification methods such as NASBA, LCR, RCR and the like.
Selection of a primer can be performed, for example, so as to amplify a sequence of 10 bases or more including a polymorphic part. In the case of SNP, the sequence to be amplified can be 10 to 100 bases, preferably 10 to 50 bases. In the case of VNTR polymorphism, depending on the number of nucleotides constituting the repeating unit and the maximum number of repetitions, it may be, for example, 20 to 300 bases.
In addition, as for the primer, one of the forward primer (hereinafter referred to as “F primer”) or the reverse primer (hereinafter referred to as “R primer”) is a polymorphic site so that it is amplified only when the sample is of one allele type. You may choose to hybridize.
The primer can be labeled by appropriate means such as fluorescence or RI as required.
[0008]
(Analysis of polymorphism)
Analysis of polymorphism can be performed by appropriately selecting a known method. Examples of analysis methods are shown below.
a. Hybridization polymorphism analysis can be performed by hybridization with a probe specific for one allele.
The probe can be labeled by an appropriate means such as fluorescence or RI as required.
The probe is, for example, an oligonucleotide that can hybridize to a sequence of 10 bases or more, preferably 10 to 100 bases including a polymorphic part. In the case of SNP analysis, it preferably has a sequence of 10 to 50 bases. In addition, in the case of SNP analysis, it is preferable to select a probe so that the polymorphic site is present at substantially the center of the probe.
In the present invention, hybridization conditions are sufficient to distinguish allelic types. For example, the conditions are such that the sample hybridizes if it is one allelic type but does not hybridize if it is another allelic type, eg, stringent conditions.
A DNA chip in which one end of the probe is immobilized on a substrate may be used.
[0009]
b. Method of Using Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of polymorphism can also be performed using restriction fragment length polymorphism. This method involves digesting a sample nucleic acid with a restriction enzyme that can be cleaved by a restriction enzyme depending on which genotype the polymorphic site takes, and examining the size of the digested fragments. This is a method for examining whether or not a sample nucleic acid has been cleaved by the restriction enzyme, thereby analyzing the polymorphism of the sample.
c. Sequencing polymorphism analysis may be performed by sequencing the amplification product.
Sequencing can be performed by known methods such as the dideoxy method and the Maxam-Gilbert method.
d. Denaturing gradient gel electrophoresis Sample DNA or RNA amplification products can also be analyzed by subjecting to denaturing gradient gel electrophoresis.
e. In addition, a single-strand conformation polymorphism (SSCP) method, an Allele Specific PCR method, or the like can also be used for polymorphism analysis.
[0010]
The present invention includes determining the possibility of suffering from myocardial infarction by combining the result analyzed by the polymorphism analysis method with other polymorphism analysis and / or other test results as desired. It also relates to the diagnostic method. In the method, it is also effective to use a combination of polymorphism analysis of several human prostacyclin synthase genes.
In addition, the present invention provides a method for preventing myocardial infarction, including performing a more precise examination, treating myocardial infarction, and / or instructing improvement of lifestyle habits such as diet contents as a result of diagnosis by the above diagnostic method. Or it relates to a treatment method.
[0011]
As one embodiment of the method of the present invention, in the above method, a SNP in exon 8 of the human prostacyclin synthase gene, specifically, a SNP at the site of base number 182 of the sequence of SEQ ID NO: 1 is detected. The method containing is mentioned. In the sequence of SEQ ID NO: 1, exon 8 is a portion of base numbers 90 to 271.
In the method, as a primer, at least 10 bases that are part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (in the sequence, m represents A or C) and include the site of base number 182 of SEQ ID NO: 1, Preferably, an oligonucleotide that can function as an F primer or an R primer for amplifying a sequence of 10 to 50 bases, for example, 15 to 30 bases, or a set of primers composed of an F primer and an R primer, One of the R primers is part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (in the sequence, m represents A or C), and includes at least 10 bases including the site of base number 182 of SEQ ID NO: 1, preferably 10 Hybridizes to a sequence of ~ 50 bases, for example 15-30 bases, the other being at least 10 bases of the other part of the sequence of SEQ ID NO: 1, preferably Properly 10 to 50 bases, can be used a pair of primers that hybridize to a sequence, for example 20 to 25 bases.
In this case, the PCR conditions can be, for example:
Primer concentration: 0.1 to 1.0 μM
MgCl 2 concentration: 0.7 to 1.5 μM
dNTP concentration: 100-200 μM each
Optimum enzyme amount: 0.5 to 2.5 U / 50 μl
Template genomic DNA amount: 50-500 ng
Number of cycles: 25-35 cycles
denature temperature: about 94 ℃
denature time: 20-30 seconds
Annealing temperature: 55-65 ° C
Annealing time: 20-60 seconds
extension temperature: 72-75 ℃
extension time: 20-180 seconds agarose gel concentration: 0.4-2.0%
[0012]
The oligonucleotide as the primer may have a sequence complementary to a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 and, as long as it can function as the primer, one or more substitutions or deletions in the sequence. Loss and addition may be included.
In the above method, the probe is a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (wherein m represents A or C), and includes at least 10 bases including the site of base number 182 of SEQ ID NO: 1, preferably Can use oligonucleotides that hybridize to sequences of 10-50 bases, for example 15-30 bases.
The oligonucleotide may have a sequence complementary to the target site of the sequence of SEQ ID NO: 1 and hybridizes with the target allelic sequence as long as it can function as a probe. As long as it hybridizes under conditions that do not hybridize with other allelic sequences, the sequence may contain one or more substitutions, deletions and additions. This probe can also be used as a DNA chip having one end fixed to a substrate. In this case, only a probe corresponding to one allele type (that is, m is A or C) may be fixed to the DNA chip, or probes corresponding to both allele types may be fixed. A probe for analyzing a polymorphism different from the polymorphism that can be detected by the present invention can be immobilized on the DNA chip.
[0013]
In another embodiment of the method of the present invention, the method comprises analyzing a VNTR polymorphism having CCGCCAGCC as a repeating unit present in the range of 1 to about 100 bases upstream from the initiation codon of the human prostacyclin synthase gene. Is mentioned. The upstream sequence of the human prostacyclin synthase gene is shown in SEQ ID NO: 2. In SEQ ID NO: 2, the start codon of the human prostacyclin synthase gene is base numbers 501 to 503.
The primer used in the method is a part of the sequence of SEQ ID NO: 2 or a sequence containing 2, 3, 5, 6 or 7 units of CCCGCCAGCC in the sequence of SEQ ID NO: 2 instead of 4 units. Used in the above method, which can function as a forward primer or a reverse primer for amplifying a continuous sequence containing the VNTR polymorphic portion of the recurring unit of CCGCCCAGCC upstream of the human prostacyclin synthase gene shown in the sequence Oligonucleotides can be used.
The primer has a sequence complementary to a part of the sequence of SEQ ID NO: 2 or a sequence containing 2, 3, 5, 6 or 7 units of CCGCCAGCC in the sequence of SEQ ID NO: 2 instead of 4 units. In addition, one or more substitutions, deletions, and additions may be included in the sequence as long as it can function as the primer.
In the above method, as a probe, 50 bases including a polymorphic portion of a sequence in which the repeating unit of CCGCCAGCC is not 4 units but 2, 3, 5, 6 or 7 units in the sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2 As described above, an oligonucleotide that hybridizes with a sequence of preferably 50 to 200 bases can be used.
These oligonucleotides are complementary to the sequence of the sequence containing the polymorphism of the sequence containing 2, 3, 5, 6 or 7 units of CCCGCCAGCC in the sequence of SEQ ID NO: 2 or SEQ ID NO: 2 instead of 4 units. It may have a sequence and may contain one or more substitutions, deletions and additions in the sequence as long as it can function as a probe.
A set of probes consisting of all or part of the oligonucleotides corresponding to each repeat number of sequences can also be used. Moreover, it can also be used as a DNA chip in which one end of each probe constituting the probe set is fixed to a substrate. A probe for detecting the SNP of exon 8 may be fixed to the DNA chip. Moreover, a probe for analyzing a polymorphism different from the polymorphism that can be detected by the present invention may be fixed together.
[0014]
The present invention also relates to a myocardial infarction diagnostic kit including the primer described above and the oligonucleotide as the probe and / or the DNA chip.
The kit further includes other elements necessary for carrying out the method of the present invention, such as restriction enzymes, polymerases, nucleoside triphosphates, means for labeling, buffers, etc. used in the restriction fragment length polymorphism method. You may go out.
The primers and probes used in the present invention can be synthesized by a commercially available DNA synthesizer or the like. In the present invention, hybridization is performed in Sambrook, J. et al. Fritsch, EF, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. The PCR method can be performed with reference to the following literature: PCR Technology, JA. Ehrlich, Stockholm Press, New York (1989); Molecular Methods for Virus Detection, DL. Wiedbrauk and DH. Farkas, Academic Press, New York (1995). Nucleic Acid Hybridisation, BD. Hames and SJ. (Higgins, IRL Press, Oxford, Washington DC (1985)).
In this specification, the base number is based on the attached sequence listing.
[0015]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these do not limit the present invention.
Example 1
Regarding the relationship between polymorphism of exon 8 and myocardial infarction, 122 patients diagnosed with myocardial infarction (MI group) and 155 healthy individuals whose age matched (non-MI group) were selected according to age. .
Peripheral blood of each subject is collected and standard methods (eg Sambrook, J. Fritsch, EF, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York In the above, the genomic DNA was extracted, and the polymorphic site of exon 8 of the prostacyclin gene was amplified by the method described below.
200 ng of the genomic DNA, 19 pmol / μl F primer solution and R primer solution each having the following sequence: 0.8 μl each, nucleotide triphosphate (manufactured by Takara) 25 mM each, 2.5 mM MgCl 2 4 μl, Taq DNA polymerase ( Amplification was performed using a PCR apparatus (PerkinElmer GeneAmp9700) in a 40 μl mixture of 0.2 U / 40 μl, 25.0 μl of water and 4 μl of 10-fold buffer (Takara) 4 μl. PCR conditions were 95 ° C. for 3 minutes, followed by 30 cycles of 98 ° C. for 25 seconds, 63 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute, and then kept at 4 ° C. after 10 minutes at 72 ° C.
[0016]
Primer sequence F primer: TGGCATATGAGCAGGTGAAGGG (SEQ ID NO: 3)
R primer: CCACGTCGCAGGTTGAATTGT (SEQ ID NO: 4)
The obtained PCR product was purified by ethanol precipitation and made into a dry up pellet, and then reacted with 5 μl of a restriction enzyme solution (10 × buffer solution (Daiichi Kagaku), 44 μl of water and 1 μl of restriction enzyme BsmAI1 (Daiichi Kagaku), . 5% agarose gel electrophoresis.
The recognition sequence of the restriction enzyme BsmAI is GAGAC. When the base at the base number 182 of the sequence of SEQ ID NO: 1 is A, it is cleaved, and when it is C, it is not cleaved.
When each sample was analyzed by the above method, the results shown in the following table were obtained. In the table, A means a genotype in which the site of base number 182 in the sequence of SEQ ID NO: 1 is A, and C means a genotype in which the base is C. All subjects are Japanese.
[0017]
[Table 1]
This is shown in the table below as the allele frequency.
[0019]
[Table 2]
When the above results were analyzed by χ 2 analysis, the allele and the phenotype had a statistically significant correlation (p value = 0.0076).
Therefore, when the base number 182 of SEQ ID NO: 1 is C, it can be determined that the risk of developing myocardial infarction is high.
[0021]
Example 2:
In order to examine the VNTR polymorphism existing upstream of exon 1 of human prostacyclin synthase gene, 110 patients diagnosed with myocardial infarction (MI group) and 134 age-matched healthy subjects (non-MI) Group) was selected to match age. About 200 bases upstream of exon 1 of the human prostacyclin synthase gene were amplified from the peripheral blood leukocytes of each patient by the following method using the same standard method as in Example 1. As the primer, a primer having the following sequence was used.
F primer: 5'-ACATTTTCCCCCAGGCCTGAGCTGC-3 '(SEQ ID NO: 5)
R primer: 5'-CGGCTCAGTAGCAGCAGCAGCAACAGT-3 '(SEQ ID NO: 6)
[0022]
50 ng of the genomic DNA, F primer 0.125 pmol having the sequence labeled with 32 P, unlabeled R primer 0.125 pmol, nucleotide triphosphate (Takara) 25 mM, 2.5 mM MgCl 2 4 μl, Taq DNA polymerase A mixture of 0.2 U / 40 μl (Takara), 25.0 μl of water and 4 μl of 10-fold buffer (Takara) was prepared and amplified using a PCR device (PerkinElmer GeneAmp9700). PCR conditions were 95 ° C. for 3 minutes, followed by 30 cycles of 98 ° C. for 25 seconds, 68 ° C. for 90 seconds, and 72 ° C. for 2 cycles, then 72 ° C. for 10 minutes and then kept at 4 ° C.
The amplified fragment was subcloned into pCR TM 2.1 (Invitrogen) and then subjected to DNA sequencing by the dideoxy method, which was used as a standard. After amplifying each group of samples and standard plasmid clones, the genotype was determined by simultaneous electrophoresis on a 6% polyacrylamide sequencing gel. The size of the 7 tandem repeat allele PCR product was 317 bp, and the size of the 3 tandem repeat allele PCR product was 281 bp.
The number of tandem repeats in the non-MI group and the MI group is shown below. All subjects are Japanese.
[0023]
[Table 3]
This is shown in the table below as the allele frequency.
[0025]
[Table 4]
When the above results were analyzed by χ 2 analysis, the allele and the phenotype had a statistically significant correlation (p value = 0.0375). Therefore, it is considered that the risk of developing myocardial infarction is high when the number of repetitions is small, and it is clear that the VNTR polymorphism of the human prostacyclin synthase gene can be used to determine the genetic factor of myocardial infarction.
[0027]
【The invention's effect】
By the method of the present invention, it can be determined whether or not it has a genetic component of myocardial infarction, and thereby the risk of myocardial infarction can be predicted. Furthermore, based on the results, guidance for minimizing environmental factors of myocardial infarction can be provided by improving lifestyle habits such as diet content, and myocardial infarction can be prevented or treated.
[Sequence Listing]
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