JP4111482B2 - Method for determining genetic factors of cardiovascular disease and oligonucleotides used therefor - Google Patents
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Description
【０００１】
【発明が属する技術分野】
本発明は循環器疾患の遺伝的要因を検出するための方法及びこれに使用されるオリゴヌクレオチドに関する。
【０００２】
【従来の技術】
循環器疾患の発病には、いくつかの遺伝的因子と生活習慣等の非遺伝的因子とが関わっていると考えられる。
従って、循環器疾患を発病する可能性の高い遺伝的因子が明らかになれば、発病のメカニズムの解明に大きな役割を果たすと共に、その遺伝的因子の判定により循環器疾患に罹患する可能性の高い患者に対し、生活習慣等の非遺伝的因子を最小限とする指導を行い、発病の危険性を著しく低下させ得ると考えられる。
本発明の発明者は、２２個のエキソンを有するヒトナトリウム利尿ペプチドＡ型受容体遺伝子のエキソン３における多型が、循環器疾患の発症に関連することを見出し、本発明を完成させた。
【０００３】
【発明が解決しようとする課題】
従って、本発明の目的は、ヒトナトリウム利尿ペプチドＡ型受容体遺伝子の多型の分析により循環器疾患の遺伝的要因を判定する方法を提供することにある。
【０００４】
【課題を解決するための手段】
第１に、本発明は、下記の方法に関する。
（１） 試料から核酸を抽出し、配列表の配列番号１に示されるヒトナトリウム利尿ペプチドＡ型受容体遺伝子のエキソン３（配列中、ｓはｇまたはｃを表す）の塩基番号１０２の部位を含む配列を増幅し、得られた増幅産物を分析することにより塩基番号１０２の部位がｇかｃかを決定することを含む循環器疾患の遺伝的要因を判定するための方法。
配列番号１に示す配列は、ヒトナトリウム利尿ペプチドＡ型受容体遺伝子のエキソン３の全配列であり、本発明の方法においては、該配列の塩基番号１０２の塩基がｇであるかｃであるかを検出し、ｃ／ｃである場合及びｃアレルを有する場合に循環器疾患に罹患する可能性が高いと判断する。
また、本発明は下記のオリゴヌクレオチドに関する。
（２） 配列番号１の配列（配列中、ｓはｇまたはｃを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１０２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基の配列にハイブリダイズし得る（１）の方法においてプローブとして使用されるオリゴヌクレオチド。
（３） 配列番号１の配列（配列中、ｓはｇまたはｃを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１０２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基の配列を増幅するためのフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして機能し得る（１）の方法に使用されるオリゴヌクレオチド。
（４） 配列番号１の配列（配列中、ｓはｇまたはｃを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１０２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基の配列を、１塩基または数塩基の置換、欠失、付加を導入することにより、１０２の部位がｇまたはｃのいずれか一方である場合にのみ特定の制限酵素による認識配列が生じるように増幅するためのフォワードプライマーまたはリバースプライマーとして機能し得る（１）の方法に使用されるオリゴヌクレオチド。
（５）（１）の方法に使用されるフォワードプライマーとリバースプライマーとして機能する一組のオリゴヌクレオチドであって、フォワードプライマーまたはリバースプライマーの一方が配列番号１の配列（配列中、ｓはｇまたはｃを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１０２の部位を含んで連続する配列にハイブリダイズすることができ、他方が配列番号１の配列の他の部分にハイブリダイズすることができる一組のオリゴヌクレオチド。
さらに、本発明は、少なくとも、（２）のオリゴヌクレオチドの一またはそれ以上が基板に固定化されている（１）の方法に使用されるＤＮＡチップに関する。
【０００５】
また、本発明は、少なくとも、（２）〜（５）のオリゴヌクレオチドの一またはそれ以上、及び／または上記ＤＮＡチップを含む（１）の方法に使用されるキットに関する。
なお、上記において、オリゴヌクレオチドは適宜標識されたものであってもよい。
【０００６】
【発明の実施の形態】
本発明において、「循環器疾患の遺伝的要因を判定する」とは、被験者が循環器疾患の発症の危険性が高いことを示す対立遺伝子型を有するか否かを判定することを意味する。
すなわち、本発明の方法においては、該配列の塩基番号１０２の塩基がｇであるかｃであるかを検出し、特に、遺伝子型がｃ／ｃである場合及びｃアレルを有する場合に循環器疾患が発症する可能性が高いと判定される。また、本発明において「循環器疾患」には、本態性高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞及び狭心症等の虚血性心疾患等が含まれる。
上記、本発明の判定方法において、ヒトナトリウム利尿ペプチドＡ型受容体遺伝子（以下、場合よりＮＰＲＡ遺伝子と記す）における多型の分析は、例えば多型を含む部分の配列を増幅し、対立遺伝子型を分析することからなる。また、ゲノムＤＮＡの分析であっても、ｃＤＮＡまたはｍＲＮＡの分析であってもよい。
本発明において使用される試料は、任意の生物学的試料、例えば血液、毛髪、組織片、尿等であり得る。
【０００７】
（増幅）
多型を含む部分の増幅は、例えばＰＣＲによって行われるが、他の公知の増幅方法、例えばＮＡＳＢＡ、ＬＣＲ、ＲＣＲ等で行ってもよい。
プライマーの選択は、例えば、多型部分を含む１０塩基以上の配列を増幅するように行い得る。増幅される配列は、１０〜１００塩基、好ましくは１０〜５０塩基であり得る。
また、プライマーは、試料が一の対立遺伝子型の場合にのみ増幅されるように、フォワードプライマー（以下、Ｆプライマーと記す）またはリバースプライマー（以下、Ｒプライマーと記す）の一方が多型部位にハイブリダイズするように選択してもよい。
プライマーは必要に応じて蛍光，ＲＩ等の適当な手段により標識され得る。
【０００８】
（多型の分析）
多型の分析は、公知の方法を適宜選択して行い得る。分析方法の例を下記に示す。
ａ．ハイブリダイゼーション
多型の分析は、一の対立遺伝子型に特異的なプローブとのハイブリダイゼーションにより行うことができる。
プローブは、必要に応じて、蛍光，ＲＩ等の適当な手段により標識され得る。
プローブは、例えば多型部分を含む１０塩基以上、好ましくは１０〜１００塩基、より好ましくは１０〜５０塩基の配列にハイブリダイズし得るオリゴヌクレオチドである。また、多型部位がプローブのほぼ中心部に存在するようにプローブを選択するのが好ましい。
本発明において、ハイブリダイゼーション条件は、対立遺伝子型を区別するのに十分な条件である。例えば、試料が一の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の場合にはハイブリダイズしないような条件、例えばストリンジェントな条件である。
本発明の方法においては、プローブの一端を基板上に固定化してなるＤＮＡチップを用いてもよい。
【０００９】
ｂ．制限酵素断片長多型を利用する方法
多型の分析は、制限断片長多型を利用して行うこともできる。この方法は、多型部位がいずれの遺伝子型をとるかによって、制限酵素により切断されるか否かが異なってくる制限酵素で試料核酸を消化し、消化物の断片の大きさを調べることにより、該制限酵素で試料核酸が切断されたか否かを調べ、それによって試料の多型を分析する方法である。
この場合、もとの配列に制限部位がなくても、増幅工程で１もしくは数塩基が置換されるようにプライマーを選択し、上記配列においてｓがｇかｃのいずれか一方である場合に、増幅産物において制限部位が提供されるようにしてもよい。
ｃ．配列決定
多型の分析を、増幅産物の配列決定により行ってもよい。
配列決定は、例えばジデオキシ法、Maxam-Gilbert法等の公知の方法により行い得る。
ｄ．変性勾配ゲル電気泳動
試料ＤＮＡまたはＲＮＡの増幅産物を変性勾配ゲル電気泳動にかけることにより分析することもできる。
ｅ．その他
ＳＳＣＰ（single-strand conformation polymorphism）法、Allele Specific PCR法等を多型の分析に使用することもできる。
【００１０】
本発明は、上記多型の分析方法により分析した結果を、所望により他の多型分析、及び／または他の検査結果と合わせて、循環器疾患に罹患する可能性を判断することを含む循環器疾患の診断方法にも関する。また、本発明は、本態性高血圧症、脳梗塞、心筋梗塞、狭心症等の循環器疾患がナトリウム利尿ペプチドＡ型受容体に関連するものであるか否かを判定することを含む診断方法をも提供する。上記方法において、いくつかのヒトナトリウム利尿ペプチドＡ型受容体遺伝子の多型分析を組み合わせて利用することも可能である。さらに、上記方法において循環器疾患に関連する他の多型分析を組み合わせて利用することも可能である。
また、本発明は、上記診断方法による診断の結果に基づいて、さらに精密な検査を行うこと、投与すべき医薬を決定すること、循環器疾患の治療を行うこと、及び／または食餌内容等の生活習慣の改善を指導することを含む循環器疾患の予防または治療方法をも提供する。
【００１１】
上記本発明の方法においては、プライマーとして、配列番号１の配列（配列中、ｓはｇまたはｃを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１０２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば１５〜３０塩基の配列を増幅するためのＦプライマーまたはＲプライマーとして機能し得るオリゴヌクレオチド、またはＦプライマーとＲプライマーからなる一組のプライマーであって、ＦプライマーまたはＲプライマーの一方が配列番号１の配列（配列中、ｓはｇまたはｃを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１０２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば１５〜３０塩基の配列にハイブリダイズし、他方が配列番号１の配列の他の部分の少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば１５〜３０塩基の配列にハイブリダイズする一組のプライマーを使用することができる。
【００１２】
この場合、ＰＣＲ条件は、例えば下記のものであり得る。
プライマー濃度：０．１〜１．０μＭ
ＭｇＣｌ２濃度：０．７〜１．５μＭ
ｄＮＴＰ濃度：各１００〜２００μＭ
至適酵素量：０．５〜２．５Ｕ／５０μｌ
鋳型ゲノムＤＮＡ量：５０〜５００ｎｇ
サイクル数：２５〜３５サイクル
denature温度：９４℃〜９９℃
denature時間：２０〜３０秒
annealing温度：５５〜６５℃
annealing時間：２０〜６０秒間
extension温度：７２〜７５℃
extension時間：２０〜１８０秒間
アガロースゲル濃度：０．４〜２．０％
【００１３】
上記プライマーとしてのオリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列の一部に相補的な配列を有していてもよく、また、上記プライマーとして機能し得る限り、該配列において１または数個の置換、欠失及び／または付加を含んでいてもよい。
上記方法においては、プローブとして配列番号１の配列（配列中、ｓはｇまたはｃを表す）の一部であって、配列番号１の塩基番号１０２の部位を含んで連続する少なくとも１０塩基、好ましくは１０〜５０塩基、例えば１５〜３０塩基の配列にハイブリダイズするオリゴヌクレオチドを使用することができる。
該オリゴヌクレオチドは、配列番号１の配列の目的とする部位と相補的な配列を有していてもよく、またプローブとして機能し得る限り、即ち、目的の対立遺伝子型の配列とハイブリダイズするが、他の対立遺伝子型の配列とはハイブリダイズしない条件下でハイブリダイズする限り、該配列において１または数個の置換、欠失及び／または付加を含んでいてもよい。このプローブは、一端を各々基板に固定してなるＤＮＡチップとして用いることもできる。この場合、ＤＮＡチップには、一の対立遺伝子型（即ちｓがｇまたはｃ）に対応するプローブのみが固定されていても、両方の対立遺伝子型に対応するプローブが固定されていてもよい。ＤＮＡチップには、本発明で検出できる多型と異なる多型を分析するためのプローブも共に固定され得る。
【００１４】
本発明は、上記で説明したプライマー、上記プローブとしてのオリゴヌクレオチド及び／または上記ＤＮＡチップを含む循環器疾患診断用キットにも関する。
キットは、さらに制限断片長多型法に使用される制限酵素、ポリメラーゼ、ヌクレオシド三リン酸、標識のための手段、緩衝液等、本発明の方法を実施するのに必要な他の要素を含んでいてもよい。
なお、本発明に使用されるプライマー及びプローブは市販のＤＮＡ合成機等により合成することができる。また、本発明において、ハイブリダイゼーションは、Sambrook，J．Fritsch，E.F.，Maniatis T.（1989）Molecular Cloning．A laboratory manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yorkの記載を参考に行うことができる。また、ＰＣＲ法は、下記の文献を参考に行うことができる：PCR Technology，J.A．Ehrlich編，Stockholm Press，New York（1989）; Molecular Methods for Virus Detection，D.L．Wiedbrauk及びD.H．Farkas編，Academic Press，New York(1995)．Nucleic Acid Hybridisation，B.D．Hames及びS.J．Higgins編，IRL Press，Oxford，Washington DC(1985)）。
本明細書において、塩基番号は添付の配列表に基づく。
【００１５】
【実施例】
以下、本発明を実施例によりさらに詳細に説明する。しかしながら、これらは本発明を限定するものではない。
実施例１
エキソン３の多型と循環器疾患との関連について調べるため、本態性高血圧と診断された患者３００名、脳梗塞と診断された患者１３８名、心筋梗塞と診断された患者１８７名及び健常人１１４名を年齢を一致させて選択した。
各被験者の末梢血を採取し、標準方法（例えばSambrook，J．Fritsch，E.F.，Maniatis T.（1989）Molecular Cloning．A laboratory manual，第２版，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Cold Spring Harbor，New Yorkに記載）により、ゲノムＤＮＡを抽出し、下記に示す方法によりナトリウム利尿ペプチドＡ型受容体遺伝子のエキソン３の多型部位を増幅した。
200ngの上記ゲノムＤＮＡ、下記の配列を有する濃度10 pmol/μｌのＦプライマー溶液及びＲプライマー溶液各々0.8μｌ、ヌクレオチド三リン酸（Takara社製造）各々２５mM、２．５ｍＭのＭｇＣｌ２４μl、TaqＤＮＡポリメラーゼ（Takara社製）０．２Ｕ／４０μl、水２５．０μl及び１０倍緩衝液（Takara社製）４μlの混合物計４０μｌの系にて、ＰＣＲ装置（PerkinElmer GeneAmp9700）を用いて増幅した。ＰＣＲ条件は、９５℃で３分間、続いて９８℃２５秒間、６３℃で１分間、７２℃で１分間のサイクルを３０サイクル、その後、７２℃で１０分間の後、４℃に保温とした。
【００１６】
プライマー配列
Ｆプライマー：cccacagtactagggaatagtcagc （配列番号：２）
Ｒプライマー：taggaaggatggaggctggcagagg （配列番号：３）
得られたＰＣＲ産物をエタノール沈殿により精製し、dry upペレットにした後、制限酵素溶液（１０ｘ緩衝液（第一化学）５μl、水４４μl及び制限酵素Taq I（第一化学）１μlと反応させ、１．５％アガロースゲル電気泳動にかけた。
制限酵素Taq Iの認識配列はtcgaであり、上記配列番号１の配列の塩基番号１０２の部位の塩基がcである場合は切断され、gである場合は切断されない。
上記の方法により、各試料を分析したところ、下記の表に示す結果が得られた。表中、ｇは上記配列番号１の配列の塩基番号１０２の部位がｇである遺伝子型を意味し、ｃは、該塩基がｃである遺伝子型を意味する。なお、被験者は全て日本人である。
【００１７】
【表１】
従って、配列番号１の塩基番号１０２の遺伝子型がｃ／ｃである場合及びｃアレルを有する場合に循環器疾患の発症の危険性が高いと判定することができる。
【００１９】
【発明の効果】
本発明の方法により、循環器疾患の遺伝的要素を有するか否かが判定でき、これにより循環器疾患の危険性を予測することができる。さらに、その結果に基づき、食餌内容等の生活習慣の改善により循環器疾患の環境的要因を最低限に押さえる指導を行い、循環器疾患の予防または治療を行うことができる。
【配列表】
[Technical field to which the invention belongs]
The present invention relates to a method for detecting a genetic factor of cardiovascular disease and an oligonucleotide used therefor.
[0002]
[Prior art]
It is considered that several genetic factors and non-genetic factors such as lifestyle habits are involved in the onset of cardiovascular diseases.
Therefore, if genetic factors that are highly likely to cause cardiovascular disease are clarified, they will play a major role in elucidating the mechanism of the disease, and are highly likely to suffer from cardiovascular disease by determining the genetic factors. It is considered that patients can be instructed to minimize non-genetic factors such as lifestyle habits, and the risk of disease development can be significantly reduced.
The inventor of the present invention has found that a polymorphism in exon 3 of a human natriuretic peptide type A receptor gene having 22 exons is associated with the onset of cardiovascular disease, and has completed the present invention.
[0003]
[Problems to be solved by the invention]
Accordingly, an object of the present invention is to provide a method for determining a genetic factor of cardiovascular disease by analyzing a polymorphism of a human natriuretic peptide type A receptor gene.
[0004]
[Means for Solving the Problems]
First, the present invention relates to the following method.
(1) A nucleic acid is extracted from a sample, and the site of base number 102 of exon 3 (in the sequence, s represents g or c) of the human natriuretic peptide type A receptor gene shown in SEQ ID NO: 1 in the sequence listing A method for determining a genetic factor of cardiovascular disease, comprising amplifying a sequence comprising and determining whether the site of base number 102 is g or c by analyzing the obtained amplification product.
The sequence shown in SEQ ID NO: 1 is the entire sequence of exon 3 of the human natriuretic peptide type A receptor gene. In the method of the present invention, whether the base at base number 102 of the sequence is g or c. When it is c / c and has the c allele, it is determined that there is a high possibility of suffering from cardiovascular disease.
The present invention also relates to the following oligonucleotides.
(2) A part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (in the sequence, s represents g or c), which hybridizes to a sequence of at least 10 bases including the site of base number 102 of SEQ ID NO: 1 An oligonucleotide used as a probe in the method of (1) to be obtained.
(3) To amplify a sequence of at least 10 bases that is a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (wherein s represents g or c) and includes the site of base number 102 of SEQ ID NO: 1. The oligonucleotide used for the method of (1) which can function as a forward primer or a reverse primer.
(4) A sequence of at least 10 bases that is a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (wherein s represents g or c) and includes the site of base number 102 of SEQ ID NO: 1 is 1 base Or a forward primer for amplification by introducing a substitution, deletion, or addition of several bases so that a recognition sequence by a specific restriction enzyme is generated only when 102 site is either g or c, or The oligonucleotide used for the method of (1) which can function as a reverse primer.
(5) A pair of oligonucleotides functioning as a forward primer and a reverse primer used in the method of (1), wherein one of the forward primer and the reverse primer is the sequence of SEQ ID NO: 1 (in the sequence, s is g or c) and can hybridize to a continuous sequence including the site of base number 102 of SEQ ID NO: 1, and the other hybridizes to the other part of the sequence of SEQ ID NO: 1. A set of oligonucleotides that can
Furthermore, the present invention relates to a DNA chip used in the method (1) in which at least one or more of the oligonucleotide (2) is immobilized on a substrate.
[0005]
The present invention also relates to a kit used in the method (1) comprising at least one or more of the oligonucleotides (2) to (5) and / or the DNA chip.
In the above, the oligonucleotide may be appropriately labeled.
[0006]
DETAILED DESCRIPTION OF THE INVENTION
In the present invention, “determining genetic factors of cardiovascular disease” means determining whether or not the subject has an allele type indicating that the risk of developing cardiovascular disease is high.
That is, in the method of the present invention, it is detected whether the base at the base number 102 of the sequence is g or c, and in particular, when the genotype is c / c and has the c allele, the circulatory organ It is determined that the disease is likely to develop. In the present invention, “cardiovascular diseases” include ischemic heart diseases such as essential hypertension, cerebral infarction, myocardial infarction and angina pectoris.
In the determination method of the present invention described above, the analysis of the polymorphism in the human natriuretic peptide type A receptor gene (hereinafter referred to as NPRA gene) is performed by, for example, amplifying the sequence of the portion containing the polymorphism, It consists of analyzing. Further, it may be genomic DNA analysis or cDNA or mRNA analysis.
The sample used in the present invention can be any biological sample, such as blood, hair, tissue pieces, urine, and the like.
[0007]
(amplification)
Amplification of the portion containing the polymorphism is performed by PCR, for example, but may be performed by other known amplification methods such as NASBA, LCR, RCR and the like.
Selection of a primer can be performed, for example, so as to amplify a sequence of 10 bases or more including a polymorphic part. The sequence to be amplified can be 10 to 100 bases, preferably 10 to 50 bases.
In addition, as for the primer, one of the forward primer (hereinafter referred to as “F primer”) or the reverse primer (hereinafter referred to as “R primer”) is a polymorphic site so that it is amplified only when the sample is of one allele type. You may choose to hybridize.
The primer can be labeled by appropriate means such as fluorescence or RI as required.
[0008]
(Analysis of polymorphism)
Analysis of polymorphism can be performed by appropriately selecting a known method. Examples of analysis methods are shown below.
a. Hybridization polymorphism analysis can be performed by hybridization with a probe specific for one allele.
The probe can be labeled by an appropriate means such as fluorescence or RI as required.
The probe is, for example, an oligonucleotide that can hybridize to a sequence of 10 bases or more including a polymorphic part, preferably 10 to 100 bases, more preferably 10 to 50 bases. In addition, it is preferable to select the probe so that the polymorphic site is present at substantially the center of the probe.
In the present invention, hybridization conditions are sufficient to distinguish allelic types. For example, the conditions are such that the sample hybridizes if it is one allelic type but does not hybridize if it is another allelic type, eg, stringent conditions.
In the method of the present invention, a DNA chip in which one end of the probe is immobilized on a substrate may be used.
[0009]
b. Method of Using Restriction Fragment Length Polymorphism Analysis of polymorphism can also be performed using restriction fragment length polymorphism. This method involves digesting a sample nucleic acid with a restriction enzyme that can be cleaved by a restriction enzyme depending on which genotype the polymorphic site takes, and examining the size of the digested fragments. This is a method for examining whether or not a sample nucleic acid has been cleaved by the restriction enzyme, thereby analyzing the polymorphism of the sample.
In this case, even if there is no restriction site in the original sequence, a primer is selected so that one or several bases are substituted in the amplification step, and when s is either g or c in the above sequence, Restriction sites may be provided in the amplification product.
c. Sequencing polymorphism analysis may be performed by sequencing the amplification product.
Sequencing can be performed by known methods such as the dideoxy method and the Maxam-Gilbert method.
d. Denaturing gradient gel electrophoresis Sample DNA or RNA amplification products can also be analyzed by subjecting to denaturing gradient gel electrophoresis.
e. In addition, a single-strand conformation polymorphism (SSCP) method, an Allele Specific PCR method, or the like can also be used for polymorphism analysis.
[0010]
The present invention includes a method comprising determining the possibility of suffering from a cardiovascular disease by combining the result of analysis by the polymorphism analysis method with other polymorphism analysis and / or other test results as desired. It also relates to a method for diagnosing organ diseases. The present invention also relates to a diagnostic method comprising determining whether a cardiovascular disease such as essential hypertension, cerebral infarction, myocardial infarction, angina pectoris or the like is related to a natriuretic peptide type A receptor. Also provide. In the above method, it is also possible to use a combination of polymorphism analysis of several human natriuretic peptide type A receptor genes. In addition, other polymorphism analyzes related to cardiovascular diseases can be used in combination in the above method.
Further, the present invention provides a more precise examination, determination of a medicine to be administered, treatment of cardiovascular disease, and / or diet contents, etc., based on the result of diagnosis by the above diagnostic method. Also provided is a method for preventing or treating cardiovascular disease including instructing lifestyle improvement.
[0011]
In the method of the present invention, the primer is a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (in the sequence, s represents g or c), and includes at least a continuous region including the site of base number 102 of SEQ ID NO: 1. An oligonucleotide capable of functioning as an F primer or R primer for amplifying a sequence of 10 bases, preferably 10-50 bases, for example 15-30 bases, or a set of primers consisting of F and R primers, One of the F primer and the R primer is a part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (in the sequence, s represents g or c), and includes at least 10 bases including the site of base number 102 of SEQ ID NO: 1, Preferably it hybridizes to a sequence of 10-50 bases, for example 15-30 bases, the other being at least one of the other parts of the sequence of SEQ ID NO: 1 Bases, preferably 10 to 50 bases, can be used a pair of primers that hybridize to a sequence, for example 15 to 30 bases.
[0012]
In this case, the PCR conditions can be, for example:
Primer concentration: 0.1 to 1.0 μM
MgCl 2 concentration: 0.7 to 1.5 μM
dNTP concentration: 100-200 μM each
Optimum enzyme amount: 0.5 to 2.5 U / 50 μl
Template genomic DNA amount: 50-500 ng
Number of cycles: 25-35 cycles
denature temperature: 94 ° C-99 ° C
denature time: 20-30 seconds
Annealing temperature: 55-65 ° C
Annealing time: 20-60 seconds
extension temperature: 72-75 ℃
extension time: 20-180 seconds agarose gel concentration: 0.4-2.0%
[0013]
The oligonucleotide as the primer may have a sequence complementary to a part of the sequence of SEQ ID NO: 1, and as long as it can function as the primer, one or several substitutions or deletions in the sequence are possible. Loss and / or additions may be included.
In the above method, at least 10 bases that are part of the sequence of SEQ ID NO: 1 (wherein s represents g or c) as a probe and includes the site of base number 102 of SEQ ID NO: 1, preferably Can use oligonucleotides that hybridize to sequences of 10-50 bases, for example 15-30 bases.
The oligonucleotide may have a sequence complementary to the target site of the sequence of SEQ ID NO: 1 and hybridizes with the target allelic sequence as long as it can function as a probe. As long as it hybridizes under conditions that do not hybridize with other allelic sequences, the sequence may contain one or several substitutions, deletions and / or additions. This probe can also be used as a DNA chip having one end fixed to a substrate. In this case, only a probe corresponding to one allele type (that is, s is g or c) may be fixed to the DNA chip, or probes corresponding to both allele types may be fixed. A probe for analyzing a polymorphism different from the polymorphism that can be detected by the present invention can be immobilized on the DNA chip.
[0014]
The present invention also relates to a cardiovascular disease diagnosis kit including the primer described above, the oligonucleotide as the probe, and / or the DNA chip.
The kit further includes other elements necessary for carrying out the method of the present invention, such as restriction enzymes, polymerases, nucleoside triphosphates, means for labeling, buffers, etc. used in the restriction fragment length polymorphism method. You may go out.
The primers and probes used in the present invention can be synthesized by a commercially available DNA synthesizer or the like. In the present invention, hybridization is performed in Sambrook, J. et al. Fritsch, EF, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York. The PCR method can be performed with reference to the following literature: PCR Technology, JA. Ehrlich, Stockholm Press, New York (1989); Molecular Methods for Virus Detection, DL. Wiedbrauk and DH. Farkas, Academic Press, New York (1995). Nucleic Acid Hybridisation, BD. Hames and SJ. (Higgins, IRL Press, Oxford, Washington DC (1985)).
In this specification, the base number is based on the attached sequence listing.
[0015]
【Example】
Hereinafter, the present invention will be described in more detail with reference to examples. However, these do not limit the present invention.
Example 1
In order to investigate the association between polymorphism of exon 3 and cardiovascular disease, 300 patients diagnosed with essential hypertension, 138 patients diagnosed with cerebral infarction, 187 patients diagnosed with myocardial infarction and 114 healthy persons Names were selected by age matching.
Peripheral blood was collected from each subject and standard methods (eg Sambrook, J. Fritsch, EF, Maniatis T. (1989) Molecular Cloning. A laboratory manual, 2nd edition, Cold Spring Harbor Laboratory Press, Cold Spring Harbor, New York Described), and the polymorphic site of exon 3 of the natriuretic peptide type A receptor gene was amplified by the method described below.
200 ng of the above genomic DNA, F primer solution and R primer solution having the following sequences at a concentration of 10 μmol / R primer each 0.8 μl, nucleotide triphosphate (manufactured by Takara) 25 mM each, 2.5 mM MgCl 2 4 μl, Taq DNA polymerase Amplification was performed using a PCR apparatus (PerkinElmer GeneAmp9700) in a system of 40 μl of a mixture of 0.2 U / 40 μl (Takara), 25.0 μl of water and 4 μl of 10-fold buffer (Takara) 4 μl. PCR conditions were 95 ° C. for 3 minutes, followed by 30 cycles of 98 ° C. for 25 seconds, 63 ° C. for 1 minute, 72 ° C. for 1 minute, then 72 ° C. for 10 minutes, and then kept at 4 ° C. .
[0016]
Primer sequence F primer: cccacagtactagggaatagtcagc (SEQ ID NO: 2)
R primer: taggaaggatggaggctggcagagg (SEQ ID NO: 3)
The obtained PCR product was purified by ethanol precipitation, made into a dry up pellet, and then reacted with a restriction enzyme solution (10 μl buffer (first chemistry) 5 μl, water 44 μl and restriction enzyme Taq I (first chemistry) 1 μl, It was subjected to 1.5% agarose gel electrophoresis.
The recognition sequence of the restriction enzyme Taq I is tcga. When the base at the site of base number 102 in the sequence of SEQ ID NO: 1 is c, it is cleaved, and when it is g, it is not cleaved.
When each sample was analyzed by the above method, the results shown in the following table were obtained. In the table, g means a genotype in which the site of base number 102 in the sequence of SEQ ID NO: 1 is g, and c means a genotype in which the base is c. All subjects are Japanese.
[0017]
[Table 1]
Therefore, when the genotype of base number 102 of SEQ ID NO: 1 is c / c and has the c allele, it can be determined that the risk of developing cardiovascular disease is high.
[0019]
【The invention's effect】
By the method of the present invention, it can be determined whether or not it has a genetic component of cardiovascular disease, and thereby the risk of cardiovascular disease can be predicted. Furthermore, based on the results, it is possible to provide guidance for minimizing environmental factors of cardiovascular diseases by improving lifestyle habits such as food content, and prevent or treat cardiovascular diseases.
[Sequence Listing]
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