JP5648948B2 - Genetic mutation screening method for hypophosphatasia - Google Patents
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Description
本発明は、低フォスファターゼ症の遺伝子変異に基づく検出に関する。さらに、本発明は低フォスファターゼ症の遺伝子変異スクリーニングおよび遺伝子診断に関する。 The present invention relates to detection based on genetic mutations in hypophosphatasia. Furthermore, the present invention relates to genetic mutation screening and genetic diagnosis for hypophosphatasia.
低フォスファターゼ症は組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP）の遺伝子変異による遺伝性疾患で、症状の程度により５つの種類(病型)に分かれている。特に重症度の高い周産期型で全身の骨形成が出生前から障害され、呼吸筋を支える肋骨などが骨折するために呼吸不全で生後早期に死亡する。これまでに有効な治療方法がなかったが、近年、健常人の骨髄、間葉系細胞等を移植することにより、患者が救命されたというケースが報告された。また、文部科学省再生医療の実現化プロジェクトにおいて「重度先天性骨代謝疾患に対する遺伝子改変間葉系幹細胞移植治療法の開発」というテーマで患者自身の細胞からiPS細胞を樹立し、ALP遺伝子を導入した後、間葉系細胞に誘導あるいは、骨芽細胞に分化させ移植することで、低フォスファターゼ症患者の根治的治療をおこなうことを目的とする研究が開始された。 Hypophosphatasia is a hereditary disease caused by a gene mutation of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP), and is divided into five types (pathology) depending on the degree of symptoms. Especially in the perinatal period, which has a high degree of severity, bone formation throughout the body is impaired before birth, and the ribs that support the respiratory muscles break, resulting in respiratory failure and early death after birth. There have been no effective treatments so far, but in recent years a case has been reported in which a patient was saved by transplanting bone marrow, mesenchymal cells, etc. of a healthy person. Also, in the project for the realization of regenerative medicine by the Ministry of Education, Culture, Sports, Science and Technology, iPS cells were established from the patient's own cells under the theme of “Development of genetically modified mesenchymal stem cell transplantation treatment for severe congenital bone metabolic disease”, and the ALP gene was introduced. After that, research aimed at radical treatment of hypophosphatasia patients by inducing to mesenchymal cells or differentiating into osteoblasts and transplanting was started.
低フォスファターゼ症の診断としては、O脚の有無、骨折による骨痛などの身体的特徴、血液・尿検査の結果、血清ALP活性およびALPアイソザイム(ALPの型)活性が低下している場合、単純Ｘ線写真により骨幹端に骨端線の拡大、カッピング（盃状陥凹）、フレイング（毛ばだち）などのくる病様変化がみられるか否かなどによっている。しかし、骨幹端の変化のみでは、ビタミンＤ欠乏性くる病、低リン血症性くる病、骨幹端異形成症など他の骨系統疾患との区別は困難なため、これら疾患を血液、尿検査等により除外し、血清ALP低値を診断のポイントとするが、低フォスファターゼ症のどの臨床病型かを血清ALPから同定することは難しかった。さらに、本遺伝性疾患は常染色体劣性遺伝形式をとるため、実際に発症するのは数万人に1人という希少疾患である。しかしながら、この遺伝病では家族歴がなく、症状のない夫婦にとり突然妊娠中の児の骨形成がうまくいかないことで発見されるケースが多い。低フォスファターゼ症の小児型や良性の周産期型でも妊娠中に超音波上骨形成の不全を指摘されることが多く、両親のALP活性では児の状況を推定することは難しい。これまでの遺伝子変異解析から、遺伝子変異部位と病型との関連性が明らかになってきている。 Diagnosis of hypophosphatasia is simple if the presence or absence of O-leg, physical characteristics such as bone pain due to fracture, blood and urine test results, serum ALP activity and ALP isozyme (ALP type) activity are reduced It depends on whether or not there are rickets-like changes such as enlargement of the epiphyseal line, cupping (claw-shaped depression), and fling (hair bristle) at the metaphysis by X-ray photographs. However, changes in the metaphysis alone are difficult to distinguish from other bone system diseases such as vitamin D deficiency rickets, hypophosphatemic rickets, metaphyseal dysplasia, etc. However, it was difficult to identify the clinical type of hypophosphatasia from serum ALP. Furthermore, since this hereditary disease has an autosomal recessive inheritance format, only 1 in every tens of thousands actually develops this rare disease. However, this genetic disease is often found because the bone formation of a pregnant child suddenly fails for a couple with no family history and no symptoms. In children with hypophosphatasia and benign perinatal forms, it is often pointed out that osteogenesis is suspected to be a failure of bone formation during pregnancy, and it is difficult to estimate the child's condition based on the ALP activity of the parents. From the genetic mutation analysis so far, the relationship between the gene mutation site and the disease type has become clear.
TNSALPの遺伝子異常のうち、1559T欠失変異はホモに有すると周産期型低フォスファターゼ症を来すことが知られ日本人にのみ報告されている（非特許文献１を参照）。1559T欠失変異をヘテロで有する無症状の保因者は日本人に特に多いと予測されている。遺伝子変異部位は各エクソンに存在し、変異部位と疾患（病型）との関連は明らかになりつつある（非特許文献２を参照）。従来、遺伝子変異部位は、エクソンごとにPCRを行ない塩基配列を解析し同定したため時間を要していた。 Among the TNSALP gene abnormalities, it is known that the 1559T deletion mutation is homozygous and causes perinatal hypophosphatasia, which has been reported only to Japanese (see Non-Patent Document 1). Asymptomatic carriers with heterozygous 1559T deletion mutations are predicted to be particularly common in Japanese. The gene mutation site exists in each exon, and the relationship between the mutation site and the disease (pathology) is becoming clear (see Non-Patent Document 2). Conventionally, gene mutation sites require time because PCR was performed for each exon and the base sequence was analyzed and identified.
一方、従来より、遺伝子の変異を解析する方法として、DNA結合色素を用いた融解温度曲線解析法が知られていた（特許文献１を参照） On the other hand, conventionally, a melting temperature curve analysis method using a DNA-binding dye has been known as a method for analyzing gene mutation (see Patent Document 1).
本発明は、低フォスファターゼ症の遺伝子変異をスクリーニングする方法、低フォスファターゼ症を遺伝子変異に基づいて検出する方法および検出するためのキットの提供を目的とする。 An object of the present invention is to provide a method for screening a gene mutation for hypophosphatasia, a method for detecting hypophosphatasia based on a gene mutation, and a kit for detection.
本発明者は、低フォスファターゼ症を末梢血に存在する低フォスファターゼ症に関連する遺伝子の変異に基づいた検出方法を開発しようと鋭意検討を行った。 The present inventor has intensively studied to develop a detection method based on a mutation of a gene related to hypophosphatasia present in peripheral blood.
DNA配列における変異を分析する方法は、二つの一般的なカテゴリーに分類することができる。一つは、既知の配列変異の遺伝子型を特定することであり、二つ目は未知の変異を走査する（scanning）ことである。既知の配列変異の遺伝子型を特定するためには多くの方法が利用可能である。対照的に、未知の変異のための殆どの方法では、PCR後、ゲル電気泳動またはカラム分離が必要である。具体的には、既知の配列変異を遺伝子型特定するときには小さなアンプリコンまたは非標識化プローブを使用し、未知変異をスキャンするときには、大きなアンプリコンが必要となる。 Methods for analyzing mutations in DNA sequences can be divided into two general categories. One is to identify the genotype of a known sequence variation, and the second is to scan for an unknown variation. Many methods are available to identify the genotype of a known sequence variation. In contrast, most methods for unknown mutations require gel electrophoresis or column separation after PCR. Specifically, small amplicons or unlabeled probes are used when genotyping known sequence mutations, and large amplicons are required when scanning unknown mutations.
多くの遺伝病の遺伝子検査は、原因となっている変異が遺伝子の全体にわたって分散していることが多いため、困難なことがある。同時変異スキャニングおよび遺伝子型特定を使用してこれらの変異部分を検出することができる。具体的には、いずれかの特定の遺伝子に関しては、それぞれのエクソンを一般的なスプライス部位の外側でプライマーを使用して増幅する。高頻度で配列変化が見られる場合、最初に当該部位の遺伝子型を特定するか、追加のセットのプライマーを使用して、このより小さな遺伝子座を増幅することができる。特定の部位の変異スキャニングおよび遺伝子型特定は、別々の領域で実施することができるか、スキャニングが陽性の場合、産物を用いて塩基配列解析を行い、遺伝子変異部位を特定することができる。 Genetic testing for many genetic diseases can be difficult because the causative mutations are often distributed throughout the gene. Simultaneous mutation scanning and genotyping can be used to detect these mutated portions. Specifically, for any particular gene, each exon is amplified using primers outside the general splice site. If sequence changes are seen frequently, this smaller locus can be amplified by first identifying the genotype of the site or using an additional set of primers. Mutation scanning and genotyping of a specific site can be performed in different regions, or when scanning is positive, a base sequence analysis can be performed using the product to identify a gene mutation site.
低フォスファターゼ症の原因遺伝子であるTNSALPに対応するプライマー12ペアを作成した。このプライマーを用いて、原因遺伝子のターゲット領域をPCR法で増幅することができる。PCR後のサンプルの融解温度曲線High resolution melting curve (HRM)をLight Scanner（Idaho Technology Inc.；http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm）という遺伝子変異解析機器を用い測定することで、簡単に変異部位のスクリーニング、診断が可能になった。このことにより、現在知られていないTNSALPの遺伝子異常を簡便に発見することができ、低フォスファターゼ症の診断に役立つことが予測される。 We created 12 pairs of primers corresponding to TNSALP, the causative gene of hypophosphatasia. Using this primer, the target region of the causative gene can be amplified by PCR. High resolution melting curve (HRM) of samples after PCR is measured using a gene mutation analyzer called Light Scanner (Idaho Technology Inc .; http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm) By doing so, it became possible to screen and diagnose mutation sites easily. This makes it possible to easily detect a TNSALP gene abnormality that is not currently known, and is expected to be useful for the diagnosis of hypophosphatasia.
それに加えて、TNSALPの遺伝子異常のうち、1559T欠失変異はホモに有すると周産期型低フォスファターゼ症を来すことが知られ今回の疾病の重要な診断ポイントとなり得る。1559T欠失変異をヘテロで有する無症状の保因者は日本人に特に多いと予測されている。従って、1559T欠失変異のあるなしを調べることは、本疾患にとって重要なポイントとなる。そこで、1559T欠失の有無を迅速にスクリーニングする方法のためのプライマー１ペアを作成した（ALP SAG)。 In addition, among the TNSALP gene abnormalities, the homozygous 1559T deletion mutation is known to cause perinatal hypophosphatasia, which can be an important diagnostic point for this disease. Asymptomatic carriers with heterozygous 1559T deletion mutations are predicted to be particularly common in Japanese. Therefore, examining the presence or absence of the 1559T deletion mutation is an important point for this disease. Therefore, a pair of primers was prepared for a method of rapidly screening for the presence or absence of 1559T deletion (ALP SAG).
すなわち、本発明は以下のとおりである。
[１] 以下の12対のプライマー対を用いて低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を網羅的に検出する方法：
配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１４に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１６に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１８に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２０に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号２１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２２に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号２３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２４に示す塩基配列からなるプライマーの対。
That is, the present invention is as follows.
[1] A method of comprehensively detecting mutations in the tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene that is a causative gene of hypophosphatasia using the following 12 primer pairs:
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 2 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 4 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 6 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 8 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 10 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 12 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 14 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 16 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 18 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 20 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 22 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 24 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23.
[２] [１]の12対のプライマー対を用いて組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の12の断片を増幅し、得られた増幅物を用いて融解曲線解析により変異を検出する、[１]の変異を網羅的に検出する方法。
[３] 配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマー対を用いて低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の1559Tの欠失変異を検出する方法。
[2] Twelve pairs of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene are amplified using the 12 primer pairs of [1], and mutations are detected by melting curve analysis using the obtained amplification product. A method for comprehensively detecting the mutation of [1].
[3] Using a primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a primer pair consisting of the primer consisting of the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 26, the tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene that is the causative gene of hypophosphatasia A method for detecting a deletion mutation of 1559T.
[４] 配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマー対を用いて組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の断片を増幅し、得られた増幅物を用いて融解曲線解析により変異を検出する、[３]の欠失変異を検出する方法。
[５] 被験体から得た試料を用いて、[１]〜[４]のいずれかの方法により低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を検出し、遺伝子変異が存在する場合に、被験体が低フォスファターゼ症に罹患しているか、または低フォスファターゼ症に罹患するリスクが高いと判定するための検査方法。
[4] A tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene fragment was amplified using a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a primer pair consisting of the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26. A method for detecting a deletion mutation of [3], wherein the mutation is detected by melting curve analysis using the amplified product.
[5] Using a sample obtained from the subject, detecting a mutation in the tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene, which is a causative gene of hypophosphatasia, by any of the methods [1] to [4] A test method for determining that a subject is suffering from hypophosphatasia or has a high risk of suffering from hypophosphatasia when a genetic mutation is present.
[６] 以下の12対のプライマー対を含む、低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を網羅的に検出するためのキット：
配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１４に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１６に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１８に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２０に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号２１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２２に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号２３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２４に示す塩基配列からなるプライマーの対。
[6] A kit for comprehensively detecting mutations in a tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene, which is a causative gene for hypophosphatasia, including the following 12 primer pairs:
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 2 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 4 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 6 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 8 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 10 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 12 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 14 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 16 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 18 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 20 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 22 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 24 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23.
[７] 配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマー対を含む、低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を検出するためのキット。 [7] A tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene, which is a causative gene for hypophosphatasia, comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a primer pair consisting of the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 Kit for detecting mutations.
[８] [６]の12対のプライマー対を含む、低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を網羅的に検出し、被験体における低フォスファターゼ症を検出し、または低フォスファターゼ症に罹患するリスクを判定するためのキット。
[９] 配列番号２５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６に示す塩基配列からなるプライマーからなるプライマー対を含む、低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を検出し、被験体における低フォスファターゼ症を検出し、または低フォスファターゼ症に罹患するリスクを判定するためのキット。
[8] Comprehensive detection of mutations in tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene, the causative gene of hypophosphatasia, including the 12 primer pairs of [6], to detect hypophosphatasia in subjects Or a kit for determining the risk of suffering from hypophosphatasia.
[9] A tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene, which is a causative gene for hypophosphatasia, comprising a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 and a primer pair consisting of the primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26 A kit for detecting a mutation, detecting hypophosphatasia in a subject, or determining a risk of suffering from hypophosphatasia.
実施例に記載のように本発明のプライマーを用いることにより、低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異を網羅的にスクリーニングし解析することができ、また1559T欠失変異の有無を調べることができる。これらの遺伝子の変異の存在は、低フォスファターゼ症の罹患または発症のリスクが高いことを示すので、上記変異を検出することにより、低フォスファターゼ症の罹患の有無、発症のリスクを知ることができる。 By using the primer of the present invention as described in Examples, it is possible to comprehensively screen and analyze a mutation of a tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene that is a causative gene of hypophosphatasia. The presence or absence of a deletion mutation can be examined. The presence of these gene mutations indicates that there is a high risk of morbidity or onset of hypophosphatasia, and by detecting the above mutations, the presence or absence of morbidity of hypophosphatasia and the risk of onset can be known.
以下、本発明を詳細に説明する。
本発明においては、周産期型低フォスファターゼ症等の低フォスファターゼ症の原因遺伝子である組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異をスクリーニングする。本発明でいう変異は、野生型正常遺伝子を変異遺伝子のミスマッチが生じるすべての変異が含まれ、１つまたは複数の塩基の欠失、置換、付加、挿入等が挙げられ、一塩基多型（SNP）も含む。
Hereinafter, the present invention will be described in detail.
In the present invention, a mutation in a tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene, which is a causative gene of hypophosphatasia such as perinatal hypophosphatasia, is screened. The mutation referred to in the present invention includes all mutations that cause a mismatch between a wild-type normal gene and a mutant gene, and includes deletion, substitution, addition, insertion, etc. of one or more bases. SNP).
本発明においては、TNSALP遺伝子に対応する１２対のプライマー対を用いてTNSALP遺伝子の１４の断片を増幅し、増幅産物を得て変異を検出し、スクリーニングを行う。 In the present invention, 14 fragments of the TNSALP gene are amplified using 12 primer pairs corresponding to the TNSALP gene, amplification products are obtained, mutations are detected, and screening is performed.
TNSALP遺伝子に対応するプライマー対セットは、図１に示される配列番号１から２４の塩基配列からなるプライマーである。 The primer pair set corresponding to the TNSALP gene is a primer consisting of the nucleotide sequences of SEQ ID NOs: 1 to 24 shown in FIG.
本発明は上記のプライマー対の少なくとも１対を含み、さらに上記のプライマー対の少なくとも１対、好ましくは２対、好ましくは３対、好ましくは４対、好ましくは５対、好ましくは６対、好ましくは７対、好ましくは８対、好ましくは９対、好ましくは１０対、好ましくは１１対、さらに好ましくは１２対すべてを含むプライマー対を含む遺伝子変異検出のためのキットを包含する。 The present invention comprises at least one pair of the above primer pairs, and further comprises at least one pair, preferably two pairs, preferably three pairs, preferably four pairs, preferably five pairs, preferably six pairs, preferably six of the above primer pairs. Includes a kit for detecting a gene mutation comprising a primer pair comprising 7 pairs, preferably 8 pairs, preferably 9 pairs, preferably 10 pairs, preferably 11 pairs, more preferably all 12 pairs.
該キットはさらに、遺伝子増幅を行うための耐熱性ポリメラーゼや融解曲線解析を行うためのDNA結合色素を含んでいてもよい。前記キットは、低フォスファターゼ症の遺伝子診断キットとして用いることができる。 The kit may further contain a heat-resistant polymerase for performing gene amplification and a DNA-binding dye for performing melting curve analysis. The kit can be used as a genetic diagnosis kit for hypophosphatasia.
上記のプライマーセットを用いた遺伝子の増幅は、PCR等の公知の遺伝子増幅方法で行うことができる。PCR以外の遺伝子増幅法として、鎖置換増幅法（strand displacement amplification：SDA法）、等温キメラプライマー核酸増幅法（isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids：ICAN法）、NASBA法、カスケードローリングサークル増幅法（cascade rolling circle amplification：CRCA法）、Qベータレプリカーゼ媒介増幅法（Q beta replicase mediated amplification）、LAMP法、転写媒介性増幅法（transcription-mediated amplification：TMA法）等が挙げられる。 Amplification of the gene using the above primer set can be performed by a known gene amplification method such as PCR. As gene amplification methods other than PCR, strand displacement amplification (SDA method), isothermal and chimeric primer-initiated amplification of nucleic acids (ICAN method), NASBA method, cascade rolling circle amplification Examples include cascade rolling circle amplification (CRCA method), Q beta replicase mediated amplification method, LAMP method, transcription-mediated amplification (TMA method), and the like.
変異の検出は、一度に広範囲の領域の変異を検出する必要があるという理由から融解温度曲線（High resolution melting curve)解析法で行うのが望ましい。ただし、Direct sequencing method、Cel1 method、TGCE method等の他の変異検出法を用いることもできる。 It is desirable to detect mutations by a high resolution melting curve analysis method because it is necessary to detect mutations in a wide range at once. However, other mutation detection methods such as Direct sequencing method, Cel1 method, and TGCE method can also be used.
融解曲線解析は、DNAプローブをターゲットDNAにハイブリダイズさせた後、徐々に温度を上昇させ、この昇温中に、ハイブリッドの融解により変化するシグナルを測定し、シグナルの変化により、DNAプローブとターゲットDNAとのハイブリッドの融解曲線を解析する方法である。融解曲線の解析により得られる融解温度は、DNAプローブとターゲットDNAとの相同性を反映するため、この融解温度の決定により、ターゲットDNAの同一性が判別でき、その結果変異をスクリーニングすることができる。融解の過程は二本鎖DNAに特異的に結合する蛍光色素によって追跡することができる。二本鎖DNAの融解に伴い蛍光色素が解離するため、蛍光強度が減少するので、温度に対して蛍光強度をプロットすることで二本鎖DNAの融解過程を示す融解温度曲線が得られる。この温度上昇に伴う蛍光強度の変化により解析を行うことができ、DNAに欠失、置換、付加、挿入等の変異があるDNAの融解温度曲線は、野生型の融解温度曲線とは異なるので、解析機器を用いて融解温度曲線の差を識別し、変異をスクリーニングすることができる。 In melting curve analysis, after the DNA probe is hybridized to the target DNA, the temperature is gradually raised, and during this temperature rise, the signal that changes due to the melting of the hybrid is measured. This is a method for analyzing a melting curve of a hybrid with DNA. The melting temperature obtained by analyzing the melting curve reflects the homology between the DNA probe and the target DNA. Therefore, by determining the melting temperature, the identity of the target DNA can be determined, and as a result, mutations can be screened. . The melting process can be followed by a fluorescent dye that specifically binds to double-stranded DNA. Since the fluorescent dye is dissociated as the double-stranded DNA melts, the fluorescence intensity decreases. Therefore, by plotting the fluorescence intensity against the temperature, a melting temperature curve showing the melting process of the double-stranded DNA is obtained. Analysis can be performed by the change in fluorescence intensity accompanying this temperature rise, and the melting temperature curve of DNA with mutations such as deletion, substitution, addition, insertion, etc. in DNA is different from the melting temperature curve of the wild type, Analytical instruments can be used to identify differences in melting temperature curves and screen for mutations.
融解曲線解析は、例えば、Reed G et al., Clin Chem., 50 (2004) 1748-54や特表2008-51098号公報に記載の方法に従って行うことができ、解析は、例えば高分解能変異解析装置として知られているLightScannerやLS32/LightScanner (Idaho Technology社）を用いて行うことができる。後者の装置の場合、PCRから融解曲線解析までを一貫して行うことができる。融解曲線解析に用いる蛍光色素としては、二本鎖DNAに飽和して結合する色素（飽和dsDNA結合色素）が挙げられる。飽和して結合する色素とは、色素の非存在下でPCRにより通常、産生されるdsDNAの量、具体的には約10ng/μLに関して最大蛍光シグナルを与える濃度で存在するとき、有意にPCRを阻害しない色素をいう。本発明に用いられる好適な色素として、窒素を含む二個の複素環を結合する鎖の中に配置された一つ以上の二価部分 -C（R）= を含むシアニン色素が挙げられる。ここで、Rは水素もしくは任意の炭素置換基であり、置換されていてもよいC1-6アルキルを含むアルキルが挙げられる。シアニン色素中に２個以上の -C（R）= が存在する場合、Rはそれぞれ独立して選択されてもよい。そのようなシアニン色素は、本明細書中に記載する代表的な一般式より詳細に定義されるようなモノマーまたはダイマーであってもよい。このようなシアニン色素として、LCGreenPlus（商標）が挙げられる（特表2008-510698号公報）。ただし、SNPおよび他の小さな変化の検出が必要でない方法では、他の色素を使用できると考えられる。シアニン色素以外の色素としては、アクリジン-ベースの色素、フェナントリジニウムインターカレーター、フェナントロリン-ベースの金属インターカレーター（metallointercalator）等が挙げられ、例えばSYBR（登録商標）Green等がある。 Melting curve analysis can be performed according to the method described in, for example, Reed G et al., Clin Chem., 50 (2004) 1748-54 and Special Table 2008-51098, for example, high-resolution mutation analysis It can be carried out using LightScanner or LS32 / LightScanner (Idaho Technology) known as an apparatus. In the case of the latter apparatus, PCR to melting curve analysis can be performed consistently. Examples of fluorescent dyes used for melting curve analysis include dyes that saturate and bind to double-stranded DNA (saturated dsDNA binding dyes). Saturated and bound dyes are those that significantly increase PCR when present in a concentration that gives the maximum fluorescent signal for the amount of dsDNA normally produced by PCR in the absence of dye, specifically about 10 ng / μL. A pigment that does not inhibit. Suitable dyes for use in the present invention include cyanine dyes containing one or more divalent moieties -C (R) = disposed in a chain connecting two heterocycles containing nitrogen. Here, R is hydrogen or an arbitrary carbon substituent, and examples thereof include alkyl including C 1-6 alkyl which may be substituted. When two or more -C (R) = are present in the cyanine dye, each R may be independently selected. Such cyanine dyes may be monomers or dimers as defined in more detail than the representative general formulas described herein. An example of such a cyanine dye is LCGreenPlus (trademark) (Japanese Patent Publication No. 2008-510698). However, other dyes could be used in methods that do not require detection of SNPs and other minor changes. Examples of the dye other than the cyanine dye include an acridine-based dye, a phenanthridinium intercalator, a phenanthroline-based metallointercalator, and the like, for example, SYBR (registered trademark) Green.
サンプルとしては、被験体の末梢血、皮膚生検サンプル等、被験体のDNAが含まれるサンプルならば、いずれも用いることができるが、非侵襲性という点で、末梢血の利用が望ましい。被験体から得たサンプルを96ウェルや384ウェルのマイクロプレートに分注し、上記のプライマーセットを用いてそれぞれのウェル中のサンプルのDNAを増幅し、ウェル中で増幅したDNA（アンプリコン）を上記のLight Scanner等の解析装置を用いて融解曲線を解析し、データ解析を行えばよい。データ解析は、上記の融解曲線解析に用いる装置の附属しているCall-IT等のソフトウェアを用いて融解曲線を解析すればよい。さらに、本発明は、TNSALPの遺伝子の1559番目の塩基T（1559T)の欠失変異を検出するためのプライマー対を含む。該プライマーは図１の配列番号２５に示される塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２６に示される塩基配列からなるプライマーからなる。該プライマー対を用いて、TNSALPの1559番目の塩基を含む断片を増幅し、融解曲線解析により、TNSALPの1559Tの欠失変異をホモに有するか、ヘテロに有するか、あるいは変異を有しないかを判別し、検出することができる。本発明の方法によって、低フォスファターゼ症の発症の原因となり得る組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異をスクリーニングし、同定することができる。TNSALP遺伝子に変異の検出により、被験体の低フォスファターゼ症を検出することができ、また被験体の低フォスファターゼ症に罹患するリスクを判定、評価することができる。 As the sample, any sample containing the subject's DNA, such as the subject's peripheral blood and skin biopsy sample, can be used, but in view of noninvasiveness, the use of peripheral blood is desirable. Distribute the sample obtained from the subject to a 96-well or 384-well microplate, amplify the DNA of the sample in each well using the primer set described above, and amplify the DNA (amplicon) amplified in the well. Data analysis may be performed by analyzing the melting curve using an analysis apparatus such as the above-described Light Scanner. The data analysis may be performed by analyzing the melting curve using software such as Call-IT attached to the apparatus used for the above melting curve analysis. Furthermore, the present invention includes a primer pair for detecting a deletion mutation at the 1559th base T (1559T) of the TNSALP gene. The primer consists of a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 25 in FIG. 1 and a primer consisting of the base sequence shown in SEQ ID NO: 26. Using this primer pair, a fragment containing the 1559th base of TNSALP was amplified, and by melting curve analysis, it was determined whether the TNSALP 1559T deletion mutation was homozygous, heterozygous, or nonmutant. Can be determined and detected. By the method of the present invention, it is possible to screen and identify a mutation in a tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene that can cause the onset of hypophosphatasia. By detecting a mutation in the TNSALP gene, a subject's hypophosphatasia can be detected, and the subject's risk of suffering from hypophosphatasia can be determined and evaluated.
本発明を以下の実施例によって具体的に説明するが、本発明はこれらの実施例によって限定されるものではない。 The present invention will be specifically described by the following examples, but the present invention is not limited to these examples.
実施例１ TNSALP遺伝子の変異の網羅的解析
低フォスファターゼ症患者あるいはTNSALPの遺伝子変異の保因者と考えられる被験体から採取した末梢血より抽出したゲノムDNAをサンプルとし、サンプルを10 mMのTris-HCl（pH7.5）、0.1 mMのEDTA中に希釈して、図１に示すTNSALP遺伝子各エクソンに特異的プライマーで蛍光色素を加えポリメラーゼ連鎖反応（PCR）にかけた。PCR後のサンプルの融解温度曲線High resolution melting curve(HRM)をLight Scanner（Idaho Technology Inc.；http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm）という遺伝子変異解析機器を用い測定した。
Example 1 Comprehensive Analysis of TNSALP Gene Mutations Genomic DNA extracted from peripheral blood collected from hypophosphatasia patients or subjects considered to be carriers of TNSALP gene mutations was used as a sample, and the sample was treated with 10 mM Tris- After diluting in HCl (pH 7.5) and 0.1 mM EDTA, a fluorescent dye was added to each exon of the TNSALP gene shown in FIG. 1 with a specific primer and subjected to polymerase chain reaction (PCR). High resolution melting curve (HRM) of the sample after PCR was measured using a gene mutation analyzer called Light Scanner (Idaho Technology Inc .; http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm) did.
PCRは、各エクソン96ウェルプレートの１ウェルに対し全容積10μlで実施した。反応混合物は、10xExPCR buffer、それぞれ200μMのdATP、dGTP dCTP、およびdTTP、0.3 μMのプライマー(Forward, Reverse)、1μlのExTaqポリメラーゼ、および色素(10×LCGreen Plusを1/10)を含んでいた。エクソンによっては、10%DMSO 添加あるいは酵素をTakara Primer Star-CFX96に変えてPCRを行った。ポリメラーゼ連鎖反応は、PCR機器中、最初の変性を95℃で2分、続いて94℃で30秒、20℃/秒でエクソンごとの（アニーリング）温度（60℃〜72℃）まで冷却して30秒加熱するサイクルを45サイクルにより実施した。アンプリコンのサイズはエクソンごとに異なるが400bp以下とした。PCR後、サンプルを、94℃に30秒加熱し、次いで25℃に冷却した。 PCR was performed in a total volume of 10 μl per well of each exon 96 well plate. The reaction mixture contained 10 × ExPCR buffer, 200 μM dATP, dGTP dCTP, and dTTP, 0.3 μM primers (Forward, Reverse), 1 μl ExTaq polymerase, and dye (1/10 of 10 × LC Green Plus), respectively. Depending on the exon, PCR was performed by adding 10% DMSO or changing the enzyme to Takara Primer Star-CFX96. The polymerase chain reaction is performed in a PCR machine by first denaturing at 95 ° C for 2 minutes, followed by cooling to 94 ° C for 30 seconds, exon (annealing) temperature at 20 ° C / second (60 ° C to 72 ° C). A cycle of heating for 30 seconds was performed by 45 cycles. The size of the amplicon varies from exon to exon, but is 400 bp or less. After PCR, the sample was heated to 94 ° C. for 30 seconds and then cooled to 25 ° C.
次いでサンプルを高解像度DNA融解分析装置 Light Scanner（http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm）（Idaho Technology、ソルトレークシティ、UT）に移し96ウェルの融解曲線を同時に解析した。融解曲線解析は、実施例に記載の如く実施した。 Samples were then transferred to a high resolution DNA melting analyzer, Light Scanner (http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm) (Idaho Technology, Salt Lake City, UT), and 96 well melting curves were analyzed simultaneously. . Melting curve analysis was performed as described in the examples.
結果を図２−１から図２−３に示す。図２−１から図２−３は、それぞれエクソン７、９および１２−２のSNPの位置、ならびに検出に用いた増幅断片の融解曲線を示す。すべてのプライマー対において、PCR産物は単一バンドを示し、融解曲線も蛍光強度を来していることを確認できた。ここで、ホモ接合体SNP（図２−１の融解曲線）、ヘテロ接合体SNP（図２−２の融解曲線）、ヘテロ接合体欠失（図２−３の融解曲線）は、高解像度融解分析から検出した。
The results are shown in FIGS. 2-1 to 2-3. FIGS. 2-1 to 2-3 show the positions of the SNPs of
実施例２ TNSALP遺伝子の1559Tの欠失変異の検出
日本人において頻度の高いTNSALP遺伝子の1559Tの欠失変異の既知の配列変異の遺伝子型を特定する手法として、Small amplicon genotyping(SAG)法 (Gundry CN et al. Nucleic Acids Res. 2008, Vol. 36, 3401-3408)を用いて条件を設定した。増幅フラグメントが短く（50-100 bp）なるよう、1559Tの欠失変異にすぐ隣接した位置にプライマーを設計した。PCRは、96ウェルプレートの１ウェルに対し全容積10μlで実施した。反応混合物は、2.5x High Sensitivity Genotyping master mix、それぞれ200μMのdATP、dGTP dCTP、およびdTTP、0.3 μMのプライマー(Forward, Reverse)、1μlのExTaqポリメラーゼ、および色素(10×LCGreen Plusを1/10 )を含んでいた。ポリメラーゼ連鎖反応は、PCR機器中、最初の変性を95℃で2分、続いて94℃で30秒、20℃/秒でエクソンごとの（アニーリング）温度（60℃〜72℃）まで冷却して30秒加熱するサイクルを45サイクルにより実施した。アンプリコンのサイズはエクソンごとに異なるが400bp以下とした。PCR後、サンプルを、94℃に30秒加熱し、次いで25℃に冷却した。次いでサンプルを高解像度DNA融解分析装置 Light Scanner（http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm）（Idaho Technology、ソルトレークシティ、UT）に移し96ウェルの融解曲線を同時に解析した。融解分析は、実施例に記載の如く実施した。
Example 2 Detection of 1559T deletion mutation of TNSALP gene Small amplicon genotyping (SAG) method (Gundry) is a technique for identifying genotypes of known sequence mutations of the 1559T deletion mutation of TNSALP gene, which is common in Japanese. CN et al. Nucleic Acids Res. 2008, Vol. 36, 3401-3408). Primers were designed at positions immediately adjacent to the 1559T deletion mutation so that the amplified fragment was short (50-100 bp). PCR was performed in a total volume of 10 μl per well of a 96 well plate. The reaction mixture is 2.5x High Sensitivity Genotyping master mix, 200 μM dATP, dGTP dCTP, and dTTP, 0.3 μM primer (Forward, Reverse), 1 μl ExTaq polymerase, and dye (1/10 of 10 × LC Green Plus) Was included. The polymerase chain reaction is performed in a PCR machine by first denaturing at 95 ° C for 2 minutes, followed by cooling to 94 ° C for 30 seconds, exon (annealing) temperature at 20 ° C / second (60 ° C to 72 ° C). A cycle of heating for 30 seconds was performed by 45 cycles. The size of the amplicon varies from exon to exon, but is 400 bp or less. After PCR, the sample was heated to 94 ° C. for 30 seconds and then cooled to 25 ° C. Samples were then transferred to a high resolution DNA melting analyzer, Light Scanner (http://www.jki.co.jp/product/LightScanner.htm) (Idaho Technology, Salt Lake City, UT), and 96 well melting curves were analyzed simultaneously. . Melting analysis was performed as described in the examples.
具体的な結果を図３に示す。ホモ接合体欠失、ヘテロ接合体欠失は、高解像度融解分析から検出した。 Specific results are shown in FIG. Homozygous and heterozygous deletions were detected from high resolution melting analysis.
本発明の方法により、被験体の低フォスファターゼ症に関連する組織非特異型アルカリフォスファターゼ（TNSALP)遺伝子の変異をスクリーニングすることができ、変異の存在により低フォスファターゼ症罹患の有無および発症リスクを判定、評価することができる。 According to the method of the present invention, it is possible to screen a tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene mutation associated with hypophosphatasia in a subject, and determine the presence and risk of developing a low phosphatase disease based on the presence of the mutation. Can be evaluated.
配列番号１〜２６ プライマー SEQ ID NO: 1-26 Primer
Claims (4)
配列番号１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号４に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号６に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号８に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１０に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１２に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１４に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１５に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１６に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１７に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号１８に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号１９に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２０に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号２１に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２２に示す塩基配列からなるプライマーの対；
配列番号２３に示す塩基配列からなるプライマーおよび配列番号２４に示す塩基配列からなるプライマーの対。 A method for comprehensive screening of tissue non-specific alkaline phosphatase (TNSALP) gene mutations that cause hypophosphatasia using the following 12 primer pairs by melting temperature curve analysis :
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 2 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 1;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 4 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 3;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 6 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 5;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 8 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 7;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 10 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 9;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 12 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 11;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 14 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 13;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 16 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 15;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 18 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 17;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 20 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 19;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 22 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 21;
A pair of plug i Mar consisting of the nucleotide sequence shown in primers and SEQ ID NO: 24 comprising the nucleotide sequence shown in SEQ ID NO: 23.
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