JP5559188B2 - フィトケミカルとして使用するための植物抽出物 - Google Patents

Description

本発明は、病原体、特に真菌および卵菌によって引き起こされる植物病害の治療および予防のための薬剤としてのブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）種子抽出物の使用に関する。

したがって、本発明は、病原体、特に真菌または卵菌に冒されたまたは冒されやすい植物に施用するためのブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）抽出物を含む殺真菌組成物を提供する。

発明の背景
真菌、糸状菌、卵菌、細菌およびウイルスなどの病原体によって引き起こされるいくつかの植物病害が知られている。これらの病害の多くは、通常、その発症および拡散に好都合な気候条件と関係して劇的な結果をもたらし、特に病害が流行状態を呈する場合に、農業経済に深く、時に破滅的な影響をもたらしうる作物の収量の減少を引き起こす。

壊滅的な結果をもたらす植物病害の歴史的に注目すべき例は、１８４０年代後半のアイルランド大飢饉の原因であるＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓによるジャガイモ感染症（葉枯れ病）である。

別の卵菌、ぶどうべと病Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａは、ワイン生産者およびブドウ栽培者に影響を及ぼし、莫大な損害を与え、生産収量や品質に悪影響を及ぼす最も広範な感染症の１つである、いわゆるべと病の原因である。

うどんこ病と呼ばれる同様のブドウの病害は、Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒとしても知られている真菌Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒによって引き起こされる。

同様の感染症は、ダイズ、ヒマワリ、レタス、トマト、ジャガイモ、オーク、観賞植物、果実植物、タバコ、ウリ科植物などの他の植物に影響を及ぼす。

植物病害に対する包括的な総説は、Ｅｕｒｏｐｅａｎ Ｈａｎｄｂｏｏｋ ｏｆ Ｐｌａｎｔ Ｄｉｓｅａｓｅｓ、Ｉ．Ｍ．Ｓｍｉｔｈら編、１９８８、ＢｌａｃｋｗｅｌｌＳｃｉｅｎｔｉｆｉｃ Ｐｕｂｌｉｃａｔｉｏｎｓに報告されている。

いくつかの天然および合成の薬剤が提案されており、上記植物病害を治療するために利用可能である。

硫黄および銅の塩または錯体に加えて、農薬利用のための合成殺真菌剤は、非常に広範で異なる化学分類（フェニルアミド、ベンズイミダゾール誘導体、ジカルボキシイミド、カルバマート、カルバニラート、ジチオカルバマート、ジニトロアニリンなど）に属する。前記合成薬剤の使用は、周知の耐性現象、ならびにヒトおよび動物において前記薬剤によって誘導されうる毒性作用および環境汚染の可能性によって制限されている。

それゆえ、耐性現象および／または環境への影響を減らすために、既知の合成殺真菌剤の代わりをすることができる、または少なくともそれらと組み合わせて使用することができる、可能なかぎり天然由来の、環境により優しい殺真菌剤を開発するための研究努力がなされている。

有効な殺真菌剤として、シナモン精油、ローズマリーオイルおよびニームオイルなどのいくつかのオイルが知られている。

さらに、ＵＳ６１７４９２０は、うどんこ病の感染を防除するためのホホバワックスの使用を開示している。

ホホバ抽出物は、ＣＡ２１０３０１４においてブドウへのうどんこ病の感染を予防するための前処理としても報告されており、一方でＵＳ２００７／００７１８３１は、ワイン製造過程に由来する澱の部分的または完全な中和によって得られる、感染症の予防および／または治療のための生成物を開示している。

ＷＯ２００６／００６８７８は、任意で大豆オイル、オリーブオイルおよびココナッツオイルの１つまたは複数と組み合わせて無水乳脂肪を含む殺真菌組成物を開示している。

発明の説明
ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）の種子または種子を含む搾りかすの抽出物が、植物病原体、特に真菌および卵菌の防除に有効であることが分かった。

したがって、本発明は、有効成分としてブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）の種子または種子を含む搾りかすの抽出物を含む植物性医薬組成物を提供する。

本発明は、抽出後に常に可能である石油回収、蒸留、バイオマスの燃焼または堆肥化による熱産生などの別の既存の物価安定政策の前に、ワイナリーの廃棄物を再利用することによってもたらされる新たな物価安定政策によって、世界中の経済に関する非常に深い関心を有する。

本発明の組成物は、前記病原体に感染しやすいブドウおよび他の作物植物を含む植物の病原性生物による感染症の治療および／または予防に有用である。

本発明は、有効量のブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）の種子または種子を含む搾りかす抽出物を治療する植物に施用することを含む、真菌または卵菌による植物感染症を予防または治療する方法にも関する。

以下に報告する実験的試験は、最も一般的なブドウの病原体の２つ、すなわちブドウべと病菌およびＥｒｙｓｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒに対するブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）種子抽出物の著しい活性を示している。しかし、本発明は、これら２つの病原体によるブドウ感染症の治療のみに限定されず、むしろ対象となる他の植物に影響を及ぼす種々の他の真菌および卵菌に適用可能であることを理解すべきである。

以下は対象となる植物に影響を及ぼす代表的な病原体の一覧表である。

１−うどんこ病
Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒ＝Ｕｎｃｉｎｕｌａ ｎｅｃａｔｏｒ（ブドウ）
Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｇｒａｍｉｎｉｓ（穀物）
Ｐｏｄｏｓｐｈａｅｒａ ｌｅｕｃｏｔｒｉｃｈａ（樹木作物、果樹）
Ｓｐｈａｅｒｏｔｈｅｃａ ｐａｎｎｏｓａ（バラ植物）
２−べと病
Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ（ブドウ）
Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｈｅｌｉａｎｔｈｉ（ヒマワリ）
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓ（ジャガイモ）
Ｐｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｐａｒａｓｉｔｉｃａ（トマト）。

３−果樹黒星病
Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｉｎａｅｑｕａｌｉｓ（リンゴの木）
Ｖｅｎｔｕｒｉａ ｐｉｒｉｎａ（ナシの木）
４−モモ縮葉病
Ｔａｐｈｒｉｎａ ｄｅｆｏｒｍａｎｓ。

５−セプトリオーシス（Ｓｅｐｔｏｒｉｏｓｉｓ）
Ｓｅｐｔｏｒｉａ ｎｏｄｏｒｕｍおよびＳｅｐｔｏｒｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ（穀物）
Ｓｅｐｔｏｒｉａ菌種（セイヨウアブラナ）
６−さび病
Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｇｒａｍｉｎｉｓ、Ｐｕｃｃｉｎｉａ ｒｅｃｏｎｄｉｔａおよびＰｕｃｃｉｎｉａ ｓｔｒｉｉｆｏｒｍｉｓ（穀物）。

７−黒穂病
Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｔｒｉｔｉｃｉ（コムギ）
Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｍａｙｄｉｓ（トウモロコシ）
Ｕｓｔｉｌａｇｏ ｈｏｒｄｅｉ（オオムギ）
８−なまぐさ黒穂病
Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｔｒｉｔｉｃｉ、Ｔｉｌｌｅｔｉａ ｃａｒｉｅｓおよびＴｉｌｌｅｔｉａ ｆｏｅｔｉｄａ（穀物）。

９−頸領腐れ病（Ｃｏｌｌａｒ ｒｏｔ）
Ｐｈｏｍａ ｌｉｎｇａｍ（アブラナ科植物、セイヨウアブラナ）
Ｒｈｉｚｏｃｔｏｎｉａ ｓｏｌａｎｉ（ジャガイモ）
Ｓｃｌｅｒｏｔｉｎｉａ ｓｃｌｅｒｏｔｉｏｒｕｍ（トマト）
１０−炭疸病
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｇｌｏｅｏｓｐｏｒｉｏｉｄｅｓ（エンドウ）
Ｃｏｌｌｅｔｏｔｒｉｃｈｕｍ ｌｉｎｄｅｍｕｔｈｉａｎｕｍ（インゲン）
１１−灰色かび病
Ｂｏｔｒｙｔｉｓ ｃｉｎｅｒｅａ（ブドウ）。

特に興味深いのは、１、２、３、４、９、１０および１１に列挙する病原体に対する本発明の抽出物の効果である。

ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）抽出物によって効果的に防除することができる別の病原体の例は、例えば、ジャガイモ、トマトおよびいくつかの観賞植物などのナス科の種々の構成植物に感染するＰｈｙｔｏｐｈｔｈｏｒａ ｉｎｆｅｓｔａｎｓである。

本発明によるブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）の種子または種子を含む搾りかすの抽出物は、生鮮のまたは乾燥した種子または種子を含む搾りかすを、種々の抽出パラメータおよび技術で、水、アセトン、酢酸エチル、エタノール、ブタノールまたはこれらの混合物などの種々の溶媒で抽出および精製することによって調製することができる。

多くの抽出物が知られており、市販されている。例えば、水−エタノール混合物による抽出によって得られるブドウ種子抽出物は、ＷＯ２００７／０１７０３７に開示されている。

当然、水およびエタノールなどの溶媒の使用は、これらの溶媒が安価で低毒性である点から好ましい。本発明による使用に特に適した抽出物は、
− 熱水によるブドウ種子の抽出、
− 水不溶性画分の除去、
− 吸着樹脂カラムでの精製、
− 濃縮、
− 噴霧乾燥
を含む方法によって得ることができることも分かった。

前記方法によって得ることができる抽出物は、５から３０％のカテキンおよびエピカテキン含量（ＨＰＬＣ）、９０から１１０％に及ぶ総ポリフェノール含量（フォリン−チオカルト分光測定法(Folin-Ciocalteau's spectrophotometricmethod)）を有している。前記抽出物は新規であり、本発明のさらなる目的である。

ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）種子抽出物は、植物への施用に適した担体に適当に溶解または懸濁するなどして使用することができ、あるいは例えば、湿潤剤、補助剤などの適当な添加剤または他の有効成分、例えば既知の殺真菌剤、銅化合物、油などと組み合わせて製剤化することができる。

組成物中のブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）種子抽出物の量は、５から２５ｇ／リットルに及びうるが、この範囲は、前記組成物、治療する病原体、保護する植物および処理技術に応じて調整することができる。

組成物は、任意の適当な技術、例えば従来装置による噴霧により植物に投与することができ、処理は毎週、または気候条件、感染の程度、感染している生物の病原性、他のフィトケミカルの使用などのいくつかの因子に応じて栽培者が決定する時間順によって行うことができる。

例として、べと病に冒された場合、ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）種子抽出物を、一般的に、早春から晩夏まで、収穫期まででさえ、１から３週毎に、植物当たりおよび処理当たり０．１から１０グラムに及ぶ量を、葉の上および下に噴霧するであろう。当然、正確な量は植物密度に依存し、植物密度は地理的地域およびブドウの品種に応じて非常に可変性で、例えば、トスカーナでは約３０００植物／ｈａ、シャンパーニュでは約７５００植物／ｈａまたはブルゴーニュでは約１００００植物／ｈａである。さらに、植物に噴霧される「使用準備済の」溶液の総容積は、生成物および技術に応じて変わり、５ｇ／ｌ×３００ｌ／ｈａ／１００００植物／ｈａ＝０．１５ｇ／植物に相当する３００から７５０リットル／ｈａから、最大３０００植物／ｈａに相当する２５ｇ／ｌ×７５０ｌ／ｈａ＝６．２５ｇ／植物までであろう。

本発明を、以下の例でより詳細に説明する。

例１−ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）種子の水抽出物の調製：ＶＩＴＩＶＡＣ
乾燥ブドウ種子１０００ｇを、攪拌器を備えたジャケットのついた静止型パーコレーターまたはジャケットのついた反応器中で４時間、７５℃の熱水で覆う。

次いで、７５℃の熱水でバイオマスを浸出させ、回収した浸出液を７．５リットルの総容積になるまで連続的に排出する。浸出流は、理想的には毎時約１リットルである。

総回収浸出液を２０℃に冷却し、５０ミクロンのフィルターで濾過して微粒子を除去する。

次いで、水溶液を、１リットルの予め再生し水で満たしたＲｈｏｍ ａｎｄ Ｈａａｓ ＡＭＢＥＲＬＩＴＥ（登録商標） ＸＡＤ ７ＨＰ樹脂または同等物を含むクロマトグラフィーカラムの頂部まで連続的に充填する。カラムの底から排出する水の伝導率を追跡する。

固定ステップの最後で、樹脂を理想的には４リットルの水ですすぎ、次いで理想的には４リットルの７０％ｖ／ｖエタノールで連続的に溶出し、再び４リットルの水で継続的にすすぐ。カラムの底から排出する水の伝導率を追跡する。

得られたエタノール溶液を真空下で回収、濃縮し、水で洗浄してエタノールを除去する。

次いで、溶液を真空下で濃縮し、８５℃未満の温度で噴霧乾燥する。

得られた粉末を混合、制御し、気密で不透明な袋に詰める。

標準収量は９３ｇで、出発物質に基づく収量９．３０％ｗ／ｗに相当する。しかし、この収量は使用するバイオマスに応じて変化しうる。

この生成物は、８．５％のカテキン（カテキン＋エピカテキン）ＨＰＬＣ含量および９８％の総ポリフェノール含量を有する。

例２−ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）種子抽出物：ＶＩＴＩＶＡＣの殺真菌活性
植物
ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）の感受性品種であるシャルドネ種を使用して、べと病に対する殺真菌剤の効果を調査した。植物は種子から栽培し（０．１〜１ポット当たり１植物）、生育箱（日中２３℃／夜１９℃、１００〜１２０μＥ・ｍ^−２・ｓ^−１、１日当たり１６時間の光）に入れた。週に２度、０．１リットルの０．２ｇ／ｌのＮ−Ｐ−Ｋ肥料（２０−２０−２０）を実生に与えた。ＶＩＴＩＶＡＣの生物活性を調査するために、少なくとも４枚の完全展開葉を有する８週齢の実生を使用した。

病原体
フランスのシャンパーニュ地方に位置するブドウ園の感染植物から２００７年に得た、ブドウべと病菌の分離株Ｐｖ１を、「シャルドネ」の切断した表面を殺菌した葉の上に保持した。その葉をペトリ皿に置き、生育箱（日中２３℃／夜１９℃、１００〜１２０μＥ・ｍ^−２・ｓ^−１、１日当たり１６時間の光）に入れた。接種菌液は、接種後８〜１２日に、新たに胞子形成している葉から得た。胞子嚢を４℃の蒸留水に懸濁し、血球計算器を用いて５×１０^５胞子嚢・水ｍｌ^−１の濃度に調整した。

殺真菌剤処理
例１に記載のように調製した天然生成物（ＶＩＴＩＶＡＣ）を、実験の間を通して、２５ｇ／ｌの割合で使用した。ＶＩＴＩＶＡＣの効果は、製剤化された製品４．０ｋｇ／ｈａの割合で使用したホセチル（Ｆｏｓｅｔｙｌ）−Ａｌ（５００ｇ／ｋｇ）＋ホルペル（Ｆｏｌｐｅｌ）（２５０ｇ／ｋｇ）の基準殺真菌剤混合物（Ｍｉｋａｌ Ｆｌａｓｈ ＷＧ、Ｂａｙｅｒ ＣｒｏｐＳｃｉｅｎｃｅ）の効果と比較した。

「シャルドネ」の表面を殺菌した葉を、背軸側を上にして、水８ｍｌで湿らせた濾紙をそれぞれ含む直径１４ｃｍのプラスチックペトリ皿に置いた。２バールの気圧で、１つの円錐ノズル（Ｔｅｅｊｅｔ ＸＲ １１００１５ ＶＳ）を備える実験室用噴霧器（Ｅｕｒｏ−Ｐｕｌｖｅ）を使用して、葉に噴霧した。殺真菌剤調製は、Ｍｉｋａｌ ＦｌａｓｈおよびＶＩＴＩＶＡＣそれぞれについて４００および７２０ｌ・ｈａ^−１の容積を適用した。各々の試験は、３度繰り返した。データは、ニューマン−クールズテスト（Newman-Keuls test）（ＸＬＳ−Ｓｔａｔ、Ａｄｄｉｎｓｏｆｔ）を用いて統計学的に分析した。

葉の背軸面に施用した殺真菌剤を乾燥させるために、処理した葉を３０分間層流下に置いた。乾燥後、処理または未処理（対照）の葉を含むペトリ皿を、２４時間生育箱（日中２３℃／夜１９℃、１００〜１２０μＥ・ｍ^−２・ｓ^−１、１日当たり１６時間の光）中に保った。

ブドウべと病菌の接種
処理または未処理（対照）の葉それぞれからコルクボーラーで１０枚のリーフディスク（それぞれ直径１０ｍｍ）を切り取り、背軸側を上にして、滅菌蒸留水４ｍｌで湿らせた濾紙を含む直径９ｃｍのプラスチックペトリ皿に置いた。接種菌液（５×１０^５胞子嚢・ｍｌ^−１）１滴（２０μｌ）を置くことによって、ディスクに接種した。接種後、１０枚のリーフディスクを含むペトリ皿を、暗所で２４時間、１９℃でインキュベートし、次いで、発病のために生育箱（日中２３℃／夜１９℃、１００〜１２０μＥ・ｍ^−２・ｓ^−１、１日当たり１６時間の光）中に保った。実験の最後に、ペトリ皿を暗所で２４時間、１９℃に保ち、胞子形成を誘発した。

接種１０日後、それぞれのモダリティ(modality)を試験するために、べと病の発病を示しているリーフディスクの数を測定した（感染の頻度）。次いで、白色様の胞子嚢を伴ったべと病の病斑を、Ｒｅｕｖｅｎｉによって以前記載された、０〜４スケールによって評価した（感受性品種における葉齢、ペルオキシダーゼおよびｂ１−３グルカナーゼ活性とべと病に対する耐性との間の関係、1998、Journal of Phytopathology 146、525〜530）。０は病斑なし、１はリーフディスク面積の１〜１０％が感染し胞子形成している、２は１１〜２５％、３は２６〜５０％、そして４は５０％を超える（感染の強度）。リーフディスク上に作られた胞子嚢の数を推定した。１０枚のリーフディスクから、胞子嚢を、０．０１％のＴｗｅｅｎ８０を含む既知の容積の滅菌蒸留水中で洗浄し、血球計算器を用いて数えた（１０枚のリーフディスク当たり６カウント）。リーフディスク面積１平方センチメートル当たりに作られた胞子嚢の数を計算した（胞子形成の強度）。実験は各々の処理につき３枚のペトリ皿を用いて、１回行った。

結果を以下の表で報告する。

Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒに感染した葉を処理することによっても同様に好ましい結果が得られた。手順は、ペトリ皿の上に汚染された葉を振とうすることによってＥｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒによる感染を誘発したこと以外は実質的に同一であった。この場合、本発明の処理が、表面単位(ｃｍ^２)当たりの分生子(ブドウべと病菌)の数として定義される胞子形成強度を減少させるのに特に有効であることが分かった。

以下は、植物医薬組成物の例である
例３
ブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）抽出物 ２５０ｇ
Ｓｏｑｕａｂｉｏｌ（登録商標） ２００ｍｌ
脱イオン水 １００ｌ
例４
ブドウ抽出物 ５００ｇ
Ｓｔｉｃｍａｎ（登録商標） ４０ｍｌ
脱イオン水 １００ｌ

Claims (5)

1. 有効成分としてブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）の種子または種子を含む搾りかすの抽出物を含む、ブドウべと病（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）またはブドウうどんこ病（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒ）予防用または治療用組成物。
2. 前記抽出物が水／エタノールまたは水抽出物である、請求項１に記載の組成物。
3. 殺真菌活性を有する他の有効成分をさらに含む、請求項１または２に記載の組成物。
4. 有効量のブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）種子抽出物を処置する植物に施用することを含む、ブドウべと病（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）またはブドウうどんこ病（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒ）を予防または治療する方法。
5. 熱水によるブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）種子の抽出、
   水不溶性画分の除去、
   吸着樹脂カラムでの精製、
   濃縮および微粒化、
   噴霧乾燥
   を含む方法によって得ることができる、ブドウべと病（Ｐｌａｓｍｏｐａｒａ ｖｉｔｉｃｏｌａ）またはブドウうどんこ病（Ｅｒｙｓｉｐｈｅ ｎｅｃａｔｏｒ）を予防または治療するためのブドウ（Ｖｉｔｉｓ ｖｉｎｉｆｅｒａ）種子の抽出物。