JP5539356B2 - 骨欠損関連疾患の処置および/または予防に有用な化合物の新規な同定方法 - Google Patents
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Description
本発明は、骨欠損に関連する疾患の分野、より具体的には、骨欠損に関連する疾患の処置および/または予防に有用な化合物を同定するための新規な方法に関する。
骨は、栄養および骨が持たなければならない荷重等の因子に依存して、生涯絶えず再建される動的な組織である。正常な骨形成は新しい骨の付加と古い骨の吸収の間の繊細なバランスに依存している。骨形成は骨芽細胞による骨基質の沈着と骨吸収(bone resorption)に基づき、より具体的には、脊椎動物における無機化組織(mineralized tissue)、もっぱら炭酸カルシウムおよびリン酸カルシウムの吸収は破骨細胞により達成される。一般に、正常成人では、これらのプロセスによって年間に骨の約5〜10%が置き換わる。
細胞においてDOCK5とRACタンパク質を同時発現させる工程(ここで、該DOCK5タンパク質は不活性RAC(この不活性RACはGDPに結合されている)の、活性RAC(この活性RACはGTPに結合されている)への変換を誘導する)、
該細胞を該化合物と接触させる、または接触させない工程、
該化合物の存在下または不在下で、不活性RACの活性RACへの変換、より具体的には、不活性RAC 1/2の活性RAC 1/2への変換を判定する工程、および
不活性RACの活性RACへの変換、より具体的には、不活性RAC 1/2の活性RAC 1/2への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法に向けられる。
細胞においてDOCK5とRACタンパク質を同時発現させる工程(該DOCK5タンパク質は不活性RAC(この不活性RACはGDPに結合されている)の、活性RAC(この活性RACはGTPに結合されている)への変換を誘導する)、
該細胞を該化合物と接触させる、または接触させない工程、
該化合物の存在下または不在下で、不活性RACの活性RACへの変換を判定する工程、
この変換は密封帯形成に関連しているので、不活性RACの活性RACへの変換を阻害する化合物を選択する工程、および
選択された化合物により、骨吸収の阻害を試験する(破骨細胞による無機化基質吸収を試験することに相当する)
を含んでなる方法に向けられる。
4−[5−(4−ブロモフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−1−イル]−4−オキソブタン酸;
2,2,2−トリクロロ−N−(1,1−ジオキシド−2,3−ジヒドロ−3−チエニル)−N−(4−メチルフェニル)アセトアミド;
3−(3−クロロフェニル)−7−メチル−4−メチレン−3,4−ジヒドロ−2(1H)−キナゾリノン;
3−[4−(3−ブロモベンジリデン)−3−メチル−5−オキソ−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−1−イル]安息香酸;
N−2,1,3−ベンゾチアジアゾール−4−イル−5−ブロモ−2−フラミド;
1−アセチル−4−(2−クロロ−4−ニトロフェニル)−2−メチルピペラジン;
3−(3−メトキシベンジリデン)−5−(4−メチルフェニル)−2(3H)−フラノン;
3−[5−(3,4−ジクロロフェニル)−2−フリル]アクリル酸;
(2−クロロ−4−{[5−(2−クロロフェニル)−6−(エトキシカルボニル)−7−メチル−3−オキソ−5H−[1,3]チアゾロ[3,2−a]ピリミジン−2(3H)−イリデン]メチル}−6−メトキシフェノキシ)酢酸;
4−{[4−(ジフェニルメチル)−1−ピペラジニル]スルホニル}−2,1,3−ベンゾチアジアゾール;
4−[4−フェニル−5−(2−チエニル)−1H−イミダゾール−2−イル]−1,2−ベンゼンジオール;
N−(3,4−ジメトキシフェニル)−4−[メチル(フェニルスルホニル)アミノ]ベンズアミド;
1−[(2−ヒドロキシフェニル)カルボノチオイル]−3−フェニル−5−(トリフルオロメチル)−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−5−オール;
4−[(4−tert−ブチルベンゾイル)アミノ]安息香酸2−メトキシエチル;
N−(2,3−ジクロロフェニル)−3−(5−メチル−2−フリル)アクリルアミド;
N−(4−フルオロフェニル)−3−[3−(トリフルオロメチル)フェニル]アクリルアミド;
3−(2−フリルメチル)−2−(2−ヒドロキシフェニル)−2,3−ジヒドロ−4(1H)−キナゾリノン;
N−(4−エトキシフェニル)−2−{[5−(4−メトキシフェニル)−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル]チオ}アセトアミド;
5−(4−ニトロベンジリデン)−2−チオキソ−3−[3−(トリフルオロメチル)フェニル]−1,3−チアゾリジン−4−オン;
(3,5−ジクロロフェニル)[(フェニルスルホニル)カルボニル]アミン;
N−(2−ブロモフェニル)−3−(5−メチル−2−フリル)アクリルアミド;
2−(2−クロロフェノキシ)−N−[2−クロロ−5−(トリフルオロメチル)フェニル]アセトアミド;
N−[4−(4−アセチル−1−ピペラジニル)フェニル]プロパンアミド;
8−[(ジメチルアミノ)メチル]−9−ヒドロキシ−2−メチル−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−4−オン;
4−tert−ブチル−N−[1−{[(2−メトキシフェニル)アミノ]カルボニル}−2−(2−チエニル)ビニル]ベンズアミド;
2−クロロ−N−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)ベンズアミド;
2,6−ジ−tert−ブチル−4−(2,3−ジヒドロ−1H−ペリミジン−2−イル)フェノール;
3−ベンジル−2−(2,6−ジクロロフェニル)−2,3−ジヒドロ−4(1H)−キナゾリノン;
1−(3,4−ジクロロベンジル)−1H−インドール−3−カルバルデヒド;
N−[5−(1−アダマンチル)−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−N’−フェニル尿素;
N−(3,4−ジクロロフェニル)−N’−{5−[(4−メチルフェノキシ)メチル]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル}尿素;
N−(2,3−ジヒドロ−1,4−ベンゾジオキシン−6−イル)−2−(1−ナフチルオキシ)アセトアミド;
N−[4−(4−アセチル−1−ピペラジニル)フェニル]−4−エトキシ−3−ニトロベンズアミド;
N−(2−クロロフェニル)−3−(4−フルオロフェニル)アクリルアミド;
1−[(ジメチル−λ〜4〜−スルファニリデン)アミノ]−2−メトキシ−4−ニトロベンゼン;
5−ベンジリデン−1−(2−クロロフェニル)−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリオン;
4−エチル−5,6−ジメチル−2−フェニルピリミジン;
2−(3−クロロベンジリデン)−1H−インデン−1,3(2H)−ジオン;
5−{5−[(3−メチル−5−オキソ−1−フェニル−1,5−ジヒドロ−4H−ピラゾール−4−イリデン)メチル]−2−フリル}−1H−イソインドール−1,3(2H)−ジオン;
N−(2,5−ジメチルフェニル)−3−(4−メトキシフェニル)アクリルアミド;
2−({2−[(4−ニトロフェニル)アミノ]エチル}アミノ)エタノール;
N−(3−メトキシフェニル)−4−プロポキシベンズアミド;
2−(4−ヒドロキシフェニル)−3−フェニル−2,3−ジヒドロ−4(1H)−キナゾリノン;
4−メチル−1−(2−ニトロベンゾイル)ピペリジン;
2−ヒドロキシ−N’−[(2−メチルフェニル)スルホニル]ベンゾヒドラジド;
4−(1,3−ベンゾチアゾール−2−イル)ブタン酸;
4−(3−メチルベンジリデン)−1−フェニル−3,5−ピラゾリジンジオン;
4−(2,4−ジクロロフェノキシ)−N−(2−エトキシフェニル)ブタンアミド;
N−(2−メトキシフェニル)−N’−(フェニルスルホニル)ベンゼンカルボキシイミドアミド;
N−[2−(2−クロロ−5−ヨードフェニル)−1,3−ベンゾキサゾール−5−イル]−2−メチルプロパンアミド;
5−(4−ブトキシフェニル)−3−シクロヘキシル−1,2,4−オキサジアゾール;
N−(3,4−ジクロロフェニル)−N’−4H−1,2,4−トリアゾール−4−イル尿素;
6−クロロ−4−フェニル−3−[3−(3,4,5−トリメトキシフェニル)アクリロイル]−2(1H)−キノリノン;
6−ブロモ−4−フェニル−3−[3−(3,4,5−トリメトキシフェニル)アクリロイル]−2(1H)−キノリノン;および
N−(1H−1,2,3−ベンゾトリアゾール−1−イルメチル)−4−ニトロ−1,2,5−オキサジアゾール−3−アミン
からなる群において選択される。
4−[5−(4−ブロモフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−1−イル]−4−オキソブタン酸;
2,2,2−トリクロロ−N−(1,1−ジオキシド−2,3−ジヒドロ−3−チエニル)−N−(4−メチルフェニル)アセトアミド;
3−(3−クロロフェニル)−7−メチル−4−メチレン−3,4−ジヒドロ−2(1H)−キナゾリノン;
3−[4−(3−ブロモベンジリデン)−3−メチル−5−オキソ−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−1−イル]安息香酸;
N−2,1,3−ベンゾチアジアゾール−4−イル−5−ブロモ−2−フラミド;
1−アセチル−4−(2−クロロ−4−ニトロフェニル)−2−メチルピペラジン;
3−(3−メトキシベンジリデン)−5−(4−メチルフェニル)−2(3H)−フラノン;
3−[5−(3,4−ジクロロフェニル)−2−フリル]アクリル酸;
(2−クロロ−4−{[5−(2−クロロフェニル)−6−(エトキシカルボニル)−7−メチル−3−オキソ−5H−[1,3]チアゾロ[3,2−a]ピリミジン−2(3H)−イリデン]メチル}−6−メトキシフェノキシ)酢酸;
4−{[4−(ジフェニルメチル)−1−ピペラジニル]スルホニル}−2,1,3−ベンゾチアジアゾール;
4−[4−フェニル−5−(2−チエニル)−1H−イミダゾール−2−イル]−1,2−ベンゼンジオール;
N−(3,4−ジメトキシフェニル)−4−[メチル(フェニルスルホニル)アミノ]ベンズアミド;
1−[(2−ヒドロキシフェニル)カルボノチオイル]−3−フェニル−5−(トリフルオロメチル)−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−5−オール;
4−[(4−tert−ブチルベンゾイル)アミノ]安息香酸2−メトキシエチル;
N−(2,3−ジクロロフェニル)−3−(5−メチル−2−フリル)アクリルアミド;
N−(4−フルオロフェニル)−3−[3−(トリフルオロメチル)フェニル]アクリルアミド;
3−(2−フリルメチル)−2−(2−ヒドロキシフェニル)−2,3−ジヒドロ−4(1H)−キナゾリノン;
2,6−ジ−tert−ブチル−4−(2,3−ジヒドロ−1H−ペリミジン−2−イル)フェノール
3−ベンジル−2−(2,6−ジクロロフェニル)−2,3−ジヒドロ−4(1H)−キナゾリノン;
1−(3,4−ジクロロベンジル)−1H−インドール−3−カルバルデヒド;
N−(4−エトキシフェニル)−2−{[5−(4−メトキシフェニル)−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル]チオ}アセトアミド;
5−(4−ニトロベンジリデン)−2−チオキソ−3−[3−(トリフルオロメチル)フェニル]−1,3−チアゾリジン−4−オン;
(3,5−ジクロロフェニル)[(フェニルスルホニル)カルボニル]アミン;
N−(2−ブロモフェニル)−3−(5−メチル−2−フリル)アクリルアミド;
2−(2−クロロフェノキシ)−N−[2−クロロ−5−(トリフルオロメチル)フェニル]アセトアミド;
N−[4−(4−アセチル−1−ピペラジニル)フェニル]プロパンアミド;
8−[(ジメチルアミノ)メチル]−9−ヒドロキシ−2−メチル−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−4−オン;
4−tert−ブチル−N−[1−{[(2−メトキシフェニル)アミノ]カルボニル}−2−(2−チエニル)ビニル]ベンズアミド;
2−クロロ−N−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)ベンズアミド;
N−[5−(1−アダマンチル)−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−N’−フェニル尿素;
N−(3,4−ジクロロフェニル)−N’−{5−[(4−メチルフェノキシ)メチル]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル}尿素;
N−(2,3−ジヒドロ−1,4−ベンゾジオキシン−6−イル)−2−(1−ナフチルオキシ)アセトアミド;
N−[4−(4−アセチル−1−ピペラジニル)フェニル]−4−エトキシ−3−ニトロベンズアミド;
N−(2−クロロフェニル)−3−(4−フルオロフェニル)アクリルアミド;
1−[(ジメチル−λ〜4〜−スルファニリデン)アミノ]−2−メトキシ−4−ニトロベンゼン;
5−ベンジリデン−1−(2−クロロフェニル)−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリオン;および
4−エチル−5,6−ジメチル−2−フェニルピリミジン
からなる群において選択される。
細胞においてタンパク質DOCK5のDHR2ドメインを少なくとも含んでなるポリペプチドとRACタンパク質を同時発現させる工程(このポリペプチドは不活性RAC(この不活性RACはGDPに結合されている)の、活性RAC(この活性RACはGTPに結合されている)への変換を誘導する)、
該細胞を該化合物と接触させる、または接触させない工程、
該化合物の存在下または不在下で、不活性RACの活性RACへの変換、より具体的には、不活性RAC 1/2の活性RAC 1/2への変換を判定する工程、
不活性RACの活性RACへの変換、より具体的には、不活性RAC 1/2の活性RAC 1/2への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法に向けられる。
%は、最適にアラインされたこれら2つの配列を比較することにより決定され、アミノ酸配列は、これら2つの配列間の最適アライメントを得るために参照配列に対して付加または欠失を含めることができる。同一性%はこれら2つの配列間で同一の位置の数を決定し、この数を比較する位置の総数で割り、得られた結果に100を掛けて、これら2配列間の同一性%を得ることにより算出される。
a)試験化合物を、プロモーター(このプロモーターはDOCK5遺伝子のプロモーター配列またはその誘導体の全部または一部を含んでなる)の制御下に置かれたリポーターをコードする核酸配列を含んでなるリポーター核酸を発現する宿主細胞と接触させる工程、および
b)そのリポーターの発現レベルを測定する工程
を含んでなる方法を提供する。
a)試験化合物をELMO1タンパク質またはその誘導体と接触させる工程;
b)該試験化合物とELMO1タンパク質またはその誘導体の結合を測定する工程:および場合により、
c)不活性RAC 1/2の活性RAC 1/2への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法を提供する。
a)試験化合物をELMO1タンパク質またはその誘導体および少なくともDOCK5のSH3ドメインまたはその誘導体を含んでなるポリペプチドと接触させる工程;
b)該化合物の存在下または不在下で該ELMO1タンパク質と該ポリペプチドの間の結合を測定する工程;および場合により、
c)不活性RAC 1/2の活性RAC 1/2への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法を提供する。
種々のマウス組織においてDock5の発現を確立した。このため、DNアーゼIで処理した全RNAを、High pure RNA isolation kit (ROCHE DIAGNOSTICS)を抽出した。cDNAを作製するため、RNAを10マーのランダムプライマーでプライミングし、逆転写を、スーパースクリプトII逆転写酵素(INVITROGEN)を用いて触媒した。定量的PCRを、COELHO et al. (Proc. Natl. Acad. Sci. U.S.A., vol.102, p:11917-11922, 2005)に記載されているように、Light Cycler (ROCHE DIAGNOSTICS)またはMx3000mp PCR system (STRATAGENE)にて、PLATINIUM Taq DNAポリメラーゼ(INVITROGEN)およびSYBR GREEN I (BIOWITAKKER)を用い、Dock5についてはプライマーDock5−Up(TGGTGACACAGGGACAGTGG、配列番号5)とDock5−Do(CACCCCAACTAGCACGTGG、配列番号6)、そして対照としてのGapdhについてはGapdh−Up(ACAGTCCATGCCATCACTGCC、配列番号7)とGapdh−Do(GCCTGCTTCACCACCTTCTT、配列番号8)を用いて行った。
ウサギポリクローナル抗体は、マウスDOCK5由来のアミノ酸1658〜1869に相当するマウスDOCK5C末端ペプチドに対して作製し、免疫親和性により精製した。実際、これらのアミノ酸配列はサブグループDOCK−Aの異なるメンバー間で有意に異なる。
図2Cの分析組織は次の通りである:Ey:眼、Sp:脾臓、St:胃、Te:精巣、Pl:胎盤、Lu:肺、Br:脳、He:心臓、Li:肝臓、Ki:腎臓;Mu:筋肉。
図2Aの結果から、Dock5が主として破骨細胞、精巣および胎盤で発現されることが確認される。
マウスDock5オープンリーディングフレームにおいてShRNA標的配列を選択し、DNAオリゴヌクレオチドの65マーセンスおよびアンチセンス鎖をBRAZIER et al (上述、2006)に記載されているCLONTECH BIOINFORMATICS DATAに従って設計した。次に、オリゴヌクレオチドをINVITROGENにより合成し、アニーリングし、製造業者(CLONTECH)の説明書に従い、ピューロマイシン耐性選択マーカーを含むpSINREN−RETROQベクターにクローニングした。ホタルルシフェラーゼを標的とするpSIREN−RETROQ−Lucベクター(CLONTECH)を対照として用いた。Jet PI(QBIOGEN)を製造業者の説明書に従い、pSIREN−RETROQベクター、Friend MLVに基づくGag−Pol発現ベクターpC57GP(LASSAUX et al, J. Virol, vol.79, p:6560-6564, 2005)およびVSV−Gエンベロープ糖タンパク質発現ベクターpCSIG(BATTINI et al, Proc. Natl Acad. Sci., vol.96, p:1385-1390, 1999)を293T細胞に同時にトラスフェクトすることにより、レトロウイルスパッケージングを行った。トランスフェクション3日後にウイルス上清を採取し、0.45μm孔径フィルターで濾過した。
よって、本発明者らは、DOCK5タンパク質、より具体的にはそのDHR2ドメインがRhoファミリーの小GTPアーゼ、すなわち、RAC1/2およびcdc42を活性化することができるか否かを調べた。
293T細胞を、従前に記載されているように、ELMO1タンパク質をコードする、またはC末端から欠失させた(ΔT625)(GUMIENNY et al, Cell, vol.107, p:27-41, 2001)ベクターと、全長DOCK5タンパク質(FL)、DHR2ドメイン、(i)SH3ドメインとDHR1ドメインの半分を含むそのN末端のアミノ酸1〜559から欠失されたDOCK5タンパク質配列(ΔNter)、または(ii)SH3ドメインを含んでなるアミノ酸1〜82から欠失されたDOCK5タンパク質配列(ΔSH3)を含んでなるGFP融合タンパク質をコードするベクターとで同時にトランスフェクトした(図3E参照)。
従前と同様に、DOCK5タンパク質の種々のドメインの存在下で、さらにはELMO1タンパク質の同時存在下でRacのin vivo GTP負荷を測定した。
RANKLで刺激されたRAW264.7細胞系統を、従前に記載されているように、ホタルルシフェラーゼ(shLuc)またはdock5(shDock5)のいずれかに対する小ヘアピンRNAをコードするレトロウイルスに感染させた。
RAW264.7細胞系統を、従前に記載されているように、ホタルルシフェラーゼ(shLuc)またはdock5(shDock5)のいずれかに対する小ヘアピンRNAをコードするレトロウイルスに感染させた後、RANKLを用いて破骨細胞形成を刺激した。次に、得られた細胞をリン酸カルシウム培養基で培養し、アクチンリングの形成を誘導した。48時間後、細胞を固定し、ローダミン標識Phalloidinを用いてアクチンを染色し、密封帯を可視化した(図5)。
Dock5+/+およびDock5−/−マウスから単離されたBMM(骨髄マクロファージ)は、100ng/ml RANKLおよび10ng/ml M−CSFの存在下で破骨細胞へ分化された。0日目、3日目および4日目にTCL(全細胞抽出液)を調製し、Dock5およびβ−galに対する工程、そしてノーマライゼーションのためにチューブリンに対する抗体を用いてウエスタンブロットを行った。
さらに、5日目に、分化した破骨細胞を固定し、TRAPおよびHoeschstで染色し、MNC(多核細胞)の数を求めた。図7B(4回の独立した実験からの平均値およびSD**:有意差、p<0.01、マン・ホイットニー検定)は、TRAP陽性MNC形成の効率が、Dock5+/+と比較してDock5−/−BMMで低下し、破骨細胞は小さかったことを示す。
野生型ならびにDock5+/+もしくはDock5−/−動物、または対照およびDock5 shRNA発現RAW264.7細胞に由来するDock5欠損破骨細胞における破骨細胞マーカーのレベル。M−CSF単独の存在下(黒いバー)または破骨細胞を得るためにRANKLおよびM−CSFの存在下(白いバー)で5日間増殖させたDock5+/+およびDock5−/−BMMから全RNAを調製した。示された遺伝子mRNAの、Gapdh mRNAに対するレベルをRT−PCRにより決定した。
どの阻害剤が骨欠損関連疾患の処置に有用であり得るか、DOCK5阻害剤を同定するために、本発明者らはDE TOLEDO et al. (FEBS, vol.480, p:287-292, 200)およびWO2005/064007号公報に開示されているような酵母交換アッセイ(YEA)を用いる。
・n時点での、試験培地(−HIS)および毒性培地(+HIS)での増殖誘導体Cr(培地)=(OD600Tn−OD600T2)/Tn−T2。
・各時点および各プレートでの、Cr(−HIS)およびCr(+HIS)培地対照を対照として算出した。
・R(化合物)=Cr(−HIS)およびCr(+HIS)およびRを各プレートで算出した。
・阻害率は対照で割ることにより求めた 比I(化合物)=R(化合物)/R(対照)*。
・選択化合物は各時点で比I(化合物)<0.9を示すものである。
結果を表2に示す。
よって、55の化合物が、Dock5によりRAC1/2の活性化を阻害するものとして選択された。
次に、選択された化合物を破骨細胞前駆体に対するそれらの毒性に関して試験した。これらの細胞はDock5を発現しないので、Dock5阻害剤はそれらの増殖に影響を及ぼさない。破骨細胞阻害剤として用いたRAW264.7細胞を10〜100μMの化合物とともに72時間増殖させた。これらの細胞の増殖を、0.5%DMSOで増殖させた対照細胞と比較した。
これらの化合物を、上記で決定された濃度で、分化した破骨細胞に対するそれらの毒性に関して試験した。破骨細胞中、分化したRAW264.7細胞を供試化合物の存在下で72時間増殖させた。次に、酒石酸耐性酸性ホスファターゼ(TRAP)を破骨細胞において着色(SUDA et al, 1997)により可視化した。この破骨細胞特異的標識は、細胞形態の可視化を可能とする。その後、この細胞形態を0.5%DMSOの存在下で増殖させた対照細胞と比較した。そして、これらの化合物を3つのカテゴリーに分類した。
・72時間後に総ての破骨細胞の死滅を誘導する化合物(−)
・形態的異常および/または破骨細胞の一部の死滅を誘導する化合物(+/−)
・破骨細胞の目に見える変化を誘導しない化合物
結果を表2に示す。
同定された化合物を、リン酸カルシウムの無機化基質吸収表面(Osteologic Biocoat Clontech Reference 354609)に播種した破骨細胞に対して上記で定義されたものと同じ濃度で72時間用いた。次に、吸収された領域を示すため、この無機化基質を硝酸銀で染色した。これらの化合物を3つのカテゴリーに分類した。
・72時間、吸収を全面的に妨げる化合物(−)
・対照と比較して弱い吸収を誘導する化合物(+/−)
・対照と比較して破骨細胞の吸収活性を目に見えて変化させない化合物(+)
吸収カテゴリーが(+/−)および(−)の化合物は、骨吸収の新規な阻害剤に相当する。それらは10〜100μMの濃度で用いた。
これらの結果を確認するために、次に、化合物をin vivoにおいて、骨粗鬆症を示すマウスで試験した。
(1)DOCK5タンパク質によるRAC GTPアーゼの活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
細胞において少なくともDOCK5タンパク質のDHR2ドメインとRACタンパク質を同時発現させる工程(ここで、前記少なくともDOCK5タンパク質のDHR2ドメインは、不活性RAC(この不活性RACはGDPに結合されている)の、活性RAC(この活性RACはGTPに結合されている)への変換を誘導する)、
該細胞を該化合物と接触させる、または接触させない工程、
該化合物の存在下または不在下で、不活性RACの活性RACへの変換を判定する工程、
不活性RACの活性RACへの変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法。
(2)選択された化合物が骨欠損に関連する疾患を処置するのに有用である、(1)に記載の方法。
(3)前記骨欠損に関連する疾患が、骨粗鬆症、骨転移による骨減少症、特に、関節リウマチにおける関節周囲のびらん、原発性上皮小体機能亢進症、悪性の高カルシウム血症、パジェット骨病、歯周病、固定化誘導性骨減少症およびグルココルチコイド処置を含んでなる群から選択される、(2)に記載の方法。
(4)選択される化合物による骨吸収の阻害を試験する工程をさらに含んでなる、(1)〜(3)のいずれかに記載の方法。
(5)前記DOCK5タンパク質が、ハツカネズミ配列番号1由来のDOCK5タンパク質のアミノ酸1132〜1661に相当するタンパク質DOCK5のDHR2ドメインを含んでなるポリペプチドおよびその誘導体である、(1)〜(4)のいずれかに記載の方法。
(6)前記DOCK5タンパク質が、ヒトDOCK5タンパク質に相当する配列番号4に相当する、(1)〜(5)のいずれかに記載の方法。
(7)RACタンパク質が、配列番号2およびその誘導体に相当する、(1)〜(6)のいずれかに記載の方法。
(8)前記方法が、活性RACタンパク質と相互作用できるが、不活性RACタンパク質とは相互作用できない任意のタンパク質の発現をさらに含んでなる、(1)〜(7)のいずれかに記載の方法。
(9)前記細胞が、プロモーター配列の制御下にリポーター遺伝子をさらに含んでなり、前記活性RACおよび相互作用するタンパク質がそれぞれトランス活性化ドメインまたは前記プロモーター配列に特異的なDNA結合ドメインのいずれかと融合されており、活性RACと相互作用タンパク質の相互作用の結果、リポーター遺伝子の発現が誘導される、(8)に記載の方法。
(10)活性RACと相互作用するタンパク質が、配列番号3に相当するPAK1タンパク質およびその誘導体を含んでなる群から選択される、(8)または(9)に記載の方法。
(11)骨欠損に関連する疾患において、DOCK5遺伝子の発現レベルの低減を可能とする化合物の選択のための方法であって、
a)試験化合物を、プロモーター(このプロモーターは、DOCK5遺伝子のプロモーター配列またはその誘導体の全部または一部を含んでなる)の制御下に置かれたリポーターをコードする核酸配列を含んでなるリポーター核酸を発現する宿主細胞と接触させる工程、および
b)そのリポーターの発現レベルを測定する工程
を含んでなる方法。
(12)ELMO1とDOCK5のSH3ドメインの結合を阻害することにより、RAC 1/2 GTPアーゼの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
a)試験化合物をELMO1タンパク質またはその誘導体と接触させる工程;
b)該試験化合物とELMO1タンパク質またはその誘導体の結合を測定する工程:および場合により、
c)不活性RAC 1/2の活性RAC 1/2への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法。
(13)ELMO1とDOCK5のSH3ドメインの結合を阻害することにより、RAC 1/2 GTPアーゼの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
a)試験化合物を、ELMO1タンパク質またはその誘導体およびDOCK5のSH3ドメインまたはその誘導体を少なくとも含んでなるポリペプチドと接触させる工程;
b)該化合物の存在下または不在下で、該ELMO1タンパク質と該ポリペプチドの間の結合を測定する工程;および場合により、
c)不活性RAC 1/2の活性RAC 1/2への変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法。
(14)それを必要とする対象において骨欠損疾患を処置および/または予防するための化合物であって、
4−[5−(4−ブロモフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−1−イル]−4−オキソブタン酸;
2,2,2−トリクロロ−N−(1,1−ジオキシド−2,3−ジヒドロ−3−チエニル)−N−(4−メチルフェニル)アセトアミド;
3−(3−クロロフェニル)−7−メチル−4−メチレン−3,4−ジヒドロ−2(1H)−キナゾリノン;
3−[4−(3−ブロモベンジリデン)−3−メチル−5−オキソ−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−1−イル]安息香酸;
N−2,1,3−ベンゾチアジアゾール−4−イル−5−ブロモ−2−フラミド;
1−アセチル−4−(2−クロロ−4−ニトロフェニル)−2−メチルピペラジン;
3−(3−メトキシベンジリデン)−5−(4−メチルフェニル)−2(3H)−フラノン;
3−[5−(3,4−ジクロロフェニル)−2−フリル]アクリル酸;
(2−クロロ−4−{[5−(2−クロロフェニル)−6−(エトキシカルボニル)−7−メチル−3−オキソ−5H−[1,3]チアゾロ[3,2−a]ピリミジン−2(3H)−イリデン]メチル}−6−メトキシフェノキシ)酢酸;
4−{[4−(ジフェニルメチル)−1−ピペラジニル]スルホニル}−2,1,3−ベンゾチアジアゾール;
4−[4−フェニル−5−(2−チエニル)−1H−イミダゾール−2−イル]−1,2−ベンゼンジオール;
N−(3,4−ジメトキシフェニル)−4−[メチル(フェニルスルホニル)アミノ]ベンズアミド;
1−[(2−ヒドロキシフェニル)カルボノチオイル]−3−フェニル−5−(トリフルオロメチル)−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−5−オール;
4−[(4−tert−ブチルベンゾイル)アミノ]安息香酸2−メトキシエチル;
N−(2,3−ジクロロフェニル)−3−(5−メチル−2−フリル)アクリルアミド;
N−(4−フルオロフェニル)−3−[3−(トリフルオロメチル)フェニル]アクリルアミド;
3−(2−フリルメチル)−2−(2−ヒドロキシフェニル)−2,3−ジヒドロ−4(1H)−キナゾリノン;
N−(4−エトキシフェニル)−2−{[5−(4−メトキシフェニル)−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル]チオ}アセトアミド;
5−(4−ニトロベンジリデン)−2−チオキソ−3−[3−(トリフルオロメチル)フェニル]−1,3−チアゾリジン−4−オン;
(3,5−ジクロロフェニル)[(フェニルスルホニル)カルボニル]アミン;
N−(2−ブロモフェニル)−3−(5−メチル−2−フリル)アクリルアミド;
2−(2−クロロフェノキシ)−N−[2−クロロ−5−(トリフルオロメチル)フェニル]アセトアミド;
N−[4−(4−アセチル−1−ピペラジニル)フェニル]プロパンアミド;
8−[(ジメチルアミノ)メチル]−9−ヒドロキシ−2−メチル−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−4−オン;
4−tert−ブチル−N−[1−{[(2−メトキシフェニル)アミノ]カルボニル}−2−(2−チエニル)ビニル]ベンズアミド;
2−クロロ−N−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)ベンズアミド;
2,6−ジ−tert−ブチル−4−(2,3−ジヒドロ−1H−ペリミジン−2−イル)フェノール;
3−ベンジル−2−(2,6−ジクロロフェニル)−2,3−ジヒドロ−4(1H)−キナゾリノン;
1−(3,4−ジクロロベンジル)−1H−インドール−3−カルバルデヒド;
N−[5−(1−アダマンチル)−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−N’−フェニル尿素;
N−(3,4−ジクロロフェニル)−N’−{5−[(4−メチルフェノキシ)メチル]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル}尿素;
N−(2,3−ジヒドロ−1,4−ベンゾジオキシン−6−イル)−2−(1−ナフチルオキシ)アセトアミド;
N−[4−(4−アセチル−1−ピペラジニル)フェニル]−4−エトキシ−3−ニトロベンズアミド;
N−(2−クロロフェニル)−3−(4−フルオロフェニル)アクリルアミド;
1−[(ジメチル−λ〜4〜−スルファニリデン)アミノ]−2−メトキシ−4−ニトロベンゼン;
5−ベンジリデン−1−(2−クロロフェニル)−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリオン;
4−エチル−5,6−ジメチル−2−フェニルピリミジン;
2−(3−クロロベンジリデン)−1H−インデン−1,3(2H)−ジオン;
5−{5−[(3−メチル−5−オキソ−1−フェニル−1,5−ジヒドロ−4H−ピラゾール−4−イリデン)メチル]−2−フリル}−1H−イソインドール−1,3(2H)−ジオン;
N−(2,5−ジメチルフェニル)−3−(4−メトキシフェニル)アクリルアミド;
2−({2−[(4−ニトロフェニル)アミノ]エチル}アミノ)エタノール;
N−(3−メトキシフェニル)−4−プロポキシベンズアミド;
2−(4−ヒドロキシフェニル)−3−フェニル−2,3−ジヒドロ−4(1H)−キナゾリノン;
4−メチル−1−(2−ニトロベンゾイル)ピペリジン;
2−ヒドロキシ−N’−[(2−メチルフェニル)スルホニル]ベンゾヒドラジド;
4−(1,3−ベンゾチアゾール−2−イル)ブタン酸;
4−(3−メチルベンジリデン)−1−フェニル−3,5−ピラゾリジンジオン;
4−(2,4−ジクロロフェノキシ)−N−(2−エトキシフェニル)ブタンアミド;
N−(2−メトキシフェニル)−N’−(フェニルスルホニル)ベンゼンカルボキシイミドアミド;
N−[2−(2−クロロ−5−ヨードフェニル)−1,3−ベンゾキサゾール−5−イル]−2−メチルプロパンアミド;
5−(4−ブトキシフェニル)−3−シクロヘキシル−1,2,4−オキサジアゾール;
N−(3,4−ジクロロフェニル)−N’−4H−1,2,4−トリアゾール−4−イル尿素;
6−クロロ−4−フェニル−3−[3−(3,4,5−トリメトキシフェニル)アクリロイル]−2(1H)−キノリノン;
6−ブロモ−4−フェニル−3−[3−(3,4,5−トリメトキシフェニル)アクリロイル]−2(1H)−キノリノン;および
N−(1H−1,2,3−ベンゾトリアゾール−1−イルメチル)−4−ニトロ−1,2,5−オキサジアゾール−3−アミン
からなる群から選択される化合物。
(15)それを必要とする対象において骨欠損疾患を処置および/または予防するための医薬組成物であって、
4−[5−(4−ブロモフェニル)−3−(4−ニトロフェニル)−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−1−イル]−4−オキソブタン酸;
2,2,2−トリクロロ−N−(1,1−ジオキシド−2,3−ジヒドロ−3−チエニル)−N−(4−メチルフェニル)アセトアミド;
3−(3−クロロフェニル)−7−メチル−4−メチレン−3,4−ジヒドロ−2(1H)−キナゾリノン;
3−[4−(3−ブロモベンジリデン)−3−メチル−5−オキソ−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−1−イル]安息香酸;
N−2,1,3−ベンゾチアジアゾール−4−イル−5−ブロモ−2−フラミド;
1−アセチル−4−(2−クロロ−4−ニトロフェニル)−2−メチルピペラジン;
3−(3−メトキシベンジリデン)−5−(4−メチルフェニル)−2(3H)−フラノン;
3−[5−(3,4−ジクロロフェニル)−2−フリル]アクリル酸;
(2−クロロ−4−{[5−(2−クロロフェニル)−6−(エトキシカルボニル)−7−メチル−3−オキソ−5H−[1,3]チアゾロ[3,2−a]ピリミジン−2(3H)−イリデン]メチル}−6−メトキシフェノキシ)酢酸;
4−{[4−(ジフェニルメチル)−1−ピペラジニル]スルホニル}−2,1,3−ベンゾチアジアゾール;
4−[4−フェニル−5−(2−チエニル)−1H−イミダゾール−2−イル]−1,2−ベンゼンジオール;
N−(3,4−ジメトキシフェニル)−4−[メチル(フェニルスルホニル)アミノ]ベンズアミド;
1−[(2−ヒドロキシフェニル)カルボノチオイル]−3−フェニル−5−(トリフルオロメチル)−4,5−ジヒドロ−1H−ピラゾール−5−オール;
4−[(4−tert−ブチルベンゾイル)アミノ]安息香酸2−メトキシエチル;
N−(2,3−ジクロロフェニル)−3−(5−メチル−2−フリル)アクリルアミド;
N−(4−フルオロフェニル)−3−[3−(トリフルオロメチル)フェニル]アクリルアミド;
3−(2−フリルメチル)−2−(2−ヒドロキシフェニル)−2,3−ジヒドロ−4(1H)−キナゾリノン;
N−(4−エトキシフェニル)−2−{[5−(4−メトキシフェニル)−1,3,4−オキサジアゾール−2−イル]チオ}アセトアミド;
5−(4−ニトロベンジリデン)−2−チオキソ−3−[3−(トリフルオロメチル)フェニル]−1,3−チアゾリジン−4−オン;
(3,5−ジクロロフェニル)[(フェニルスルホニル)カルボニル]アミン;
N−(2−ブロモフェニル)−3−(5−メチル−2−フリル)アクリルアミド;
2−(2−クロロフェノキシ)−N−[2−クロロ−5−(トリフルオロメチル)フェニル]アセトアミド;
N−[4−(4−アセチル−1−ピペラジニル)フェニル]プロパンアミド;
8−[(ジメチルアミノ)メチル]−9−ヒドロキシ−2−メチル−4H−ピリド[1,2−a]ピリミジン−4−オン;
4−tert−ブチル−N−[1−{[(2−メトキシフェニル)アミノ]カルボニル}−2−(2−チエニル)ビニル]ベンズアミド;
2−クロロ−N−(3−クロロ−4−メトキシフェニル)ベンズアミド;
2,6−ジ−tert−ブチル−4−(2,3−ジヒドロ−1H−ペリミジン−2−イル)フェノール;
3−ベンジル−2−(2,6−ジクロロフェニル)−2,3−ジヒドロ−4(1H)−キナゾリノン;
1−(3,4−ジクロロベンジル)−1H−インドール−3−カルバルデヒド;
N−[5−(1−アダマンチル)−1,3,4−チアジアゾール−2−イル]−N’−フェニル尿素;
N−(3,4−ジクロロフェニル)−N’−{5−[(4−メチルフェノキシ)メチル]−1,3,4−チアジアゾール−2−イル}尿素;
N−(2,3−ジヒドロ−1,4−ベンゾジオキシン−6−イル)−2−(1−ナフチルオキシ)アセトアミド;
N−[4−(4−アセチル−1−ピペラジニル)フェニル]−4−エトキシ−3−ニトロベンズアミド;
N−(2−クロロフェニル)−3−(4−フルオロフェニル)アクリルアミド;
1−[(ジメチル−λ〜4〜−スルファニリデン)アミノ]−2−メトキシ−4−ニトロベンゼン;
5−ベンジリデン−1−(2−クロロフェニル)−2,4,6(1H,3H,5H)−ピリミジントリオン;
4−エチル−5,6−ジメチル−2−フェニルピリミジン;
2−(3−クロロベンジリデン)−1H−インデン−1,3(2H)−ジオン;
5−{5−[(3−メチル−5−オキソ−1−フェニル−1,5−ジヒドロ−4H−ピラゾール−4−イリデン)メチル]−2−フリル}−1H−イソインドール−1,3(2H)−ジオン;
N−(2,5−ジメチルフェニル)−3−(4−メトキシフェニル)アクリルアミド;
2−({2−[(4−ニトロフェニル)アミノ]エチル}アミノ)エタノール;
N−(3−メトキシフェニル)−4−プロポキシベンズアミド;
2−(4−ヒドロキシフェニル)−3−フェニル−2,3−ジヒドロ−4(1H)−キナゾリノン;
4−メチル−1−(2−ニトロベンゾイル)ピペリジン;
2−ヒドロキシ−N’−[(2−メチルフェニル)スルホニル]ベンゾヒドラジド;
4−(1,3−ベンゾチアゾール−2−イル)ブタン酸;
4−(3−メチルベンジリデン)−1−フェニル−3,5−ピラゾリジンジオン;
4−(2,4−ジクロロフェノキシ)−N−(2−エトキシフェニル)ブタンアミド;
N−(2−メトキシフェニル)−N’−(フェニルスルホニル)ベンゼンカルボキシイミドアミド;
N−[2−(2−クロロ−5−ヨードフェニル)−1,3−ベンゾキサゾール−5−イル]−2−メチルプロパンアミド;
5−(4−ブトキシフェニル)−3−シクロヘキシル−1,2,4−オキサジアゾール;
N−(3,4−ジクロロフェニル)−N’−4H−1,2,4−トリアゾール−4−イル尿素;
6−クロロ−4−フェニル−3−[3−(3,4,5−トリメトキシフェニル)アクリロイル]−2(1H)−キノリノン;
6−ブロモ−4−フェニル−3−[3−(3,4,5−トリメトキシフェニル)アクリロイル]−2(1H)−キノリノン;および
N−(1H−1,2,3−ベンゾトリアゾール−1−イルメチル)−4−ニトロ−1,2,5−オキサジアゾール−3−アミン
からなる群から選択される少なくとも1つの化合物と、所望により薬学上許容される支持体を含んでなる医薬組成物。
Claims (14)
- DOCK5タンパク質によるRAC GTPアーゼの活性化を阻害する化合物を同定する方法であって、
細胞において少なくともDOCK5タンパク質のDHR2ドメインとRACタンパク質を同時発現させる工程であって、前記少なくともDOCK5タンパク質のDHR2ドメインは、GDPに結合されている不活性RACの、GTPに結合されている活性RACへの変換を誘導する、工程、
該細胞を該化合物と接触させる、または接触させない工程、
該化合物の存在下または不在下で、不活性RACの活性RACへの変換を判定する工程、
不活性RACの活性RACへの変換を阻害する化合物を選択する工程
を含んでなる方法。 - 選択された化合物が骨欠損に関連する疾患を処置するのに有用である、請求項1に記載の方法。
- 前記骨欠損に関連する疾患が、骨粗鬆症、骨転移による骨減少症、関節リウマチにおける関節周囲のびらん、原発性上皮小体機能亢進症、悪性の高カルシウム血症、パジェット骨病、歯周病、固定化誘導性骨減少症およびグルココルチコイド処置を含んでなる群から選択される、請求項2に記載の方法。
- 選択される化合物による骨吸収の阻害を試験する工程をさらに含んでなる、請求項1〜3のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DOCK5タンパク質が、ハツカネズミ配列番号1由来のDOCK5タンパク質のアミノ酸1132〜1661に相当するタンパク質DOCK5のDHR2ドメインを含んでなるポリペプチドおよびその誘導体である、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記DOCK5タンパク質が、ヒトDOCK5タンパク質に相当する配列番号4に相当する、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- RACタンパク質が、配列番号2およびその誘導体に相当する、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が、活性RACタンパク質と相互作用できるが、不活性RACタンパク質とは相互作用できないタンパク質の発現をさらに含んでなる、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記細胞が、プロモーター配列の制御下にリポーター遺伝子をさらに含んでなり、前記活性RACおよび相互作用するタンパク質がそれぞれトランス活性化ドメインまたは前記プロモーター配列に特異的なDNA結合ドメインのいずれかと融合されており、活性RACと相互作用タンパク質の相互作用の結果、リポーター遺伝子の発現が誘導される、請求項8に記載の方法。
- 活性RACと相互作用するタンパク質が、配列番号3に相当するPAK1タンパク質およびその誘導体を含んでなる群から選択される、請求項8または9に記載の方法。
- ELMO1とDOCK5のSH3ドメインの結合を阻害することにより、RAC 1/2 GTPアーゼの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
a)試験化合物をELMO1タンパク質またはその誘導体と接触させる工程;および
b)該試験化合物とELMO1タンパク質またはその誘導体の結合を測定する工程
を含んでなる方法。 - c)不活性RAC 1/2の活性RAC 1/2への変換を阻害する化合物を選択する工程
をさらに含んでなる、請求項11に記載の方法。 - ELMO1とDOCK5のSH3ドメインの結合を阻害することにより、RAC 1/2 GTPアーゼの活性化を阻害する化合物を同定するための方法であって、
a)試験化合物を、ELMO1タンパク質またはその誘導体およびDOCK5のSH3ドメインまたはその誘導体を少なくとも含んでなるポリペプチドと接触させる工程;および
b)該化合物の存在下または不在下で、該ELMO1タンパク質と該ポリペプチドの間の結合を測定する工程
を含んでなる方法。 - c)不活性RAC 1/2の活性RAC 1/2への変換を阻害する化合物を選択する工程
をさらに含んでなる、請求項13に記載の方法。
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