JP5497005B2 - 液体混合物の調製 - Google Patents

Description

本発明は、制御されたｐＨ及びイオン強度の液体混合物の生成方法及びかかる方法に適用できる装置に関する。本発明は、正確な緩衝液の調製が必要とされるあらゆる状況で遍く有用である。

所定のｐＨと適宜所定のイオン強度を有する緩衝液が用いられる場合のように、正確な組成が分かった液体を得ることが重要であることが多い。さらに、多くの場合、液体の組成は、各瞬間に正確に知り制御すべきものであるだけでなく、時間の経過と共に精密に、且つ制御された形で変化すべきものでもある。

液体の組成が極めて重要な１つの応用例は、液体クロマトグラフィであり、より具体的には、クロマトグラフィマトリックスからの単離標的分子の溶出すなわち放出が勾配溶出によって実施される応用例である。例えば、生体分子を分離し浄化する場合に使用されることの多い方法であるイオン交換クロマトグラフィでは、例えば、段階的な溶出を利用する工業プロセスの設計を可能にする最適な溶出条件を見つけるために、勾配溶出が使用されることがある。公知のように、この場合、溶出液は不活性塩を含有し、勾配は、この塩の濃度を変化させることによって実現される。塩濃度、すなわちイオン強度が変化するとｐＨも影響を受けることが公知であり、溶出液のｐＨ及びイオン強度が、イオン交換樹脂上でのタンパク質分離の選択性を制御する２つの最も重要なパラメータであることが多くの文献に記載されている。

米国特許第５１１２９４９号（Ｖｕｋｏｖｉｃｈ）は、勾配を使用して分離を実施する自動化システムに関する。勾配が徐々に変化するこのような手動システム及び自動化システムに関する問題は、勾配が浅くなった場合に、溶出を実施するのに時間がかかり、勾配が険しくなった場合に、注目の各生体分子が溶出するのではなく、生体分子の溶出が重なり合うことである。このため、各生体分子種が分離されたそれ自体の画分として収集されるのではなく、数種の生体分子が各画分として収集されることになる。

米国特許第７１３８０５１号（Ｄｅ Ｌａｍｏｔｔｅ）は、生体分子を分離するためのクロマトグラフィシステム、方法、及びソフトウェアに関する。詳細には、この特許は、溶出緩衝液に添加される成分の濃度を、添加される成分の濃度が徐々に変化する溶出緩衝液を形成するように変化させる、クロマトグラフィカラムから溶出される生体分子の分離の最適化に関する。

岡本（Ｈｉｒｏｋａｚｕ Ｏｋａｍｏｔｏ ｅｔ ａｌ，Ｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌ Ｒｅｓｅａｒｃｈ．Ｖｏｌ．１４，Ｎｏ．３，１９９７：Ｔｈｅｏｒｙ ａｎｄ Ｃｏｍｐｕｔｅｒ Ｐｒｏｇｒａｍｓ ｆｏｒ Ｃａｌｃｕｌａｔｉｎｇ Ｓｏｌｕｔｉｏｎ ｐＨ，Ｂｕｆｆｅｒ ｆｏｒｍｕｌａ，ａｎｄ Ｂｕｆｆｅｒ Ｃａｐａｃｉｔｙ ｆｏｒ Ｍｕｌｔｉｐｌｅ Ｃｏｍｐｏｎｅｎｔ Ｓｙｓｔｅｍ ａｔ ａ Ｇｉｖｅｎ Ｉｏｎｉｃ Ｓｔｒｅｎｇｔｈ ａｎｄ Ｔｅｍｐｅｒａｔｕｒｅ）は、所与のイオン強度及び温度での溶液ｐＨ、緩衝液処方、及び緩衝能を算出するコンピュータプログラムを発表した。しかし、岡本等によって調製された緩衝液は、０．３Ｍのような低い濃度であっても塩濃度が高くなるにつれてｐＨの変化が激しくなる。従って、岡本の方法は、やはり塩を含む、ｐＨが一定の緩衝液を生成するのに十分な方法ではない。

従来の勾配形成方法では、一定のｐＨでのイオン強度勾配が得られるように不活性塩と所定のｐＨを有する緩衝液とを含んでなる溶出液が慎重に調製されている。タンパク質の分離の最適化は、不活性塩勾配の勾配を変化させ且つ／或いは緩衝系をｐＨの異なる緩衝系と交換することによって実現されている。

この初期の従来技術では、最適化において所定のｐＨ及び塩濃度を有する多数の緩衝液が調製されており、この場合、分離が再現可能になるように慎重に滴定を行う必要があった。このような方法が、時間がかかると共に厄介な方法であることは明らかである。

適度のイオン強度（最大１００ｍＭ）での緩衝液ｐＨを算出する方法が文献に記載されており、この方法は、緩衝液に存在する様々な荷電種及び非荷電種間の平衡についての数式を代数計算又はコンピュータによって解くことに基づく方法である。

ある塩基性種（塩基Ｂ又は共役塩基Ａ^-）が対応する酸性種（それぞれ共役酸ＢＨ⁺又は酸ＨＡ）と平衡であれば、平衡は次のように記載できる。

Ｈ⁺＋塩基性種＜＝＝＞酸性種⁺ 式１．１
対応する平衡定数Ｋ_aは次の通り定義される。

Ｋ_a＝（Ｈ⁺）（塩基性種）／（酸性種⁺） 式１．２
式中、括弧は各種の活量を示す。数式１．２の両辺の対数をとり、−ｌｏｇ（Ｈ⁺）として定義されたｐＨを求めると、次式が与えられる。

ｐＨ＝ｐＫａ＋ｌｏｇ｛（塩基性種）／（酸性種）｝ 式１．３
上式は、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ式と呼ばれることもある。活量を対応する濃度ではなく数式１．２で使用する理由は、主として静電相互作用のために、関連するイオンが環境から遮断される傾向があることである。しかし、ｐＨ測定値はプロトンの活量の直接観測値であるが、例えばイオンの量及び体積の計量、ピペット測定、又はポンピング測定によって、緩衝液イオンの対応する活量ではなく濃度が観察される。各イオンの活量は、活量係数φによって対応する濃度に関係付けられる。

（種）＝φ［種］ 式１．４
無限希釈の理想的な状態では、φは１になり、あらゆるイオンの活量は対応する濃度に等しくなる。しかし、実際のケースでは、イオン強度は零とは異なり、様々な種の活量係数が１未満になる。

いわゆるＤｅｂｙｅ Ｈｕｃｋｅｌ理論において、次式として知られる、上記の逸脱に関する十分に確立されたモデルが開発されている。

−ｌｏｇφ＝（ＡＺ²Ｉ^0.5）／（１＋０．３３^*１０⁸ａＩ^0.5） 式１．５
式中、Ａは定数、より厳密に言えば温度依存パラメータ〜０．５１である。公知のデータを使用して、Ａの値をＡ＝０．４９１８＋０．０００７^*Ｔ＋０．０００００４^*Ｔ＾２として正確に算出することができる。ここで、Ｔは摂氏単位の温度である。Ｚは、イオンの電荷であり、数量ａ、すなわち水和イオンの半径（Å単位）は、Ｄｅｂｙｅ及びＨｕｃｋｅｌの原論文では「正又は負のイオン平均接近距離」と記載されている。

Ｋｉｅｌｌａｎｄによる上述の論文に示されている表には、イオン径パラメータとも呼ばれるこのパラメータが、様々なイオン種についてそれぞれ異なるように示す。Ｉは、次式のようにイオン強度である。

Ｉ＝１／２Σ（Ｃ_iＺ_i ²）（全てのイオンを含む） 式１．６
Ｃ_iは濃度であり、Ｚ_iは溶液中に存在するイオンの電荷である（電子電荷単位）。

数式１．３に数式１．４を挿入すると、活量ではなく濃度に関してｐＨが与えられる。

ｐＨ＝ｐＫ_a＋ｌｏｇ｛φ_b［塩基性種］／φ_a［酸性種］｝
＝ｐＫ_a＋ｌｏｇφ_b−ｌｏｇφ_a＋ｌｏｇ｛［塩基性種］／［酸性種］｝
＝ｐＫ_a’＋ｌｏｇ｛［塩基性種］／［酸性種］｝ 式１．７
式中、
ｐＫ_a’＝ｐＫ_a＋ｌｏｇφ_b−ｌｏｇφ_a 式１．８
は、様々な緩衝液種の測定可能な濃度値を使用できるようにする見掛けのｐＫ_a値である。 ｐＫ_a’の値は、数式１．８に数式１．５を挿入して次式を得ることによって算出することができる。

ｐＫ_a’＝ｐＫ_a＋（ＡＺ_a ²Ｉ^0.5）／（１＋０．３３^*１０⁸ａ_aＩ^0.5）−（ＡＺ_b ²Ｉ^0.5）／（１＋０．３３^*１０⁸ａ_bＩ^0.5） 式１．９
式中、それぞれ酸及び塩基に対応するパラメータを指定するのに下付き文字ａ及びｂを導入する必要があった。従って、以下のように定義される。
Ｚ_a＝酸性種の電荷
Ｚ_b＝塩基性種の電荷
ａ_a＝酸性種のイオン径パラメータ
ａ_b＝酸性種のイオン径パラメータ。

デバイ−ヒュッケル（Ｄｅｂｙｅ−Ｈｕｃｋｅｌ）理論をｐＨ計算に適用すると、緩衝液のｐＫ_a値（熱力学的ｐＫ_a値と呼ばれる）が、数式１．９によって与えられる対応するｐＫ_a’値に修正される。数式１．９のパラメータの大部分は容易に推定することができる。最も厄介なパラメータはａである。

Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍ ＆ Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ（Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍ ＥＡ ＆ Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ ＴＤ．（１９３４）Ｊ．Ｐｈｙｓ．Ｃｈｅｍ．３３．５３３参照）は、全ての緩衝液分子について３Åに設定されたパラメータａを近似することによっていくらか簡略化された公式を得ることを提案した。

ｐＫ_a’＝ｐＫ_a＋（ＡＺ_a ²Ｉ^0.5）／（１＋Ｉ^0.5）−（ＡＺ_b ²Ｉ^0.5）／（１＋Ｉ^0.5） 式１．１０
上記の数１．１０は、通常文献に見られるイオン強度補正に関する公式である。場合によっては、この数式の右辺に補正項が追加され、様々な緩衝液についてより高いイオン強度での精度損失が補償される。しかし、こうすることによって得られる精度は、イオン強度が高く、例えばイオン交換クロマトグラフィ及びＨＩＣにおける勾配溶出で一般に使用されている範囲内である１Ｍ程度であるときには不十分である。

Ｋｉｅｌｌａｎｄ（Ｊａｃｏｂ Ｋｉｅｌｌａｎｄ ｉｎ Ａｃｔｉｖｉｔｙ Ｃｏｅｆｆｉｃｉｅｎｔｓ ｏｆ Ｉｏｎｓ ｉｎ Ａｑｕｅｏｕｓ Ｓｏｌｕｔｉｏｎｓ，Ｓｅｐｔｅｍｂｅｒ １９３７）は、液体におけるイオンの活量係数を研究し、水和イオンの直径を考慮したイオン活量係数の拡張表を作成している。Ｋｉｅｌｌａｎｄによって提示されたデータは、４つの異なるモデル、すなわち、結晶半径及び変形性を考慮したＢｏｎｉｎｏのモデル、イオン移動度を考慮した公知の数式１０８ａ_i＝１８２ｚ_j／ｌ∞、Ｂｒｕｌｌによる上記の数式の経験的修正形、最後にＵｌｒｉｃｈエントロピー欠損法を使用して得られたデータである。この４つのモデルの四捨五入された平均値を使用して、この研究で報告されたデータが得られた。Ｋｉｅｌｌａｎｄによって提示されたａ_i値は、２．５から１１までかなりばらつきがあり、イオンの性質に依存するこのばらつきに基づく活量係数について非一般モデル、すなわち無機イオンに関する１つの数式と有機イオンに関する異なる１つの数式が提案されている。

米国特許第６２２１２５０号（Ｓｔａｆｓｔｒｏｍ）は、パラメータａの前述の近似を有利に利用した、液体混合物を調製する方法に関する。より具体的には、混合物を調製する開示された方法は、以下の成分、すなわち（ｉ）１種以上の緩衝種、（ｉｉ）酸又は塩基、（ｉｉｉ）任意成分としての塩、及び（ｉｖ）溶媒を含む。液体混合物のｐＨ及びイオン強度の相互関係を考慮して、混合物の所定のｐＨが各瞬間に得られるように成分（ｉ）〜（ｉｖ）の比率を同時に変化させる。この方法は、緩衝液固有の補正係数を使用して勾配に沿った一定のｐＨを実現する、修正された反復Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍ−Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ（以下の数式１．１０）式の使用に基づく方法である。従って、ある種の状況では、この方法の欠点は、新しい緩衝液を導入する必要がある場合に再び計算を行う必要があることである。

制御されたｐＨ及びイオン強度の液体混合物を調製することが必須である他の応用例は、ハイスループットスクリーニング、すなわち創薬で使用されることが多いが生物学及び化学の分野にも関連する科学的実験方法である。現代のロボット工学、データ処理、並びに制御ソフトウェア、液体処理装置、及び高感度検出器を組み合わせることにより、ＨＴＳによって、研究者は、数百万の生化学的試験、遺伝子検査、又は薬理試験を短時間で効果的に実施することができる。このプロセスによって、特定の生体分子経路を変調する活性化合物、抗体、又は遺伝子を迅速に同定することができる。これらの実験の結果は、例えば薬物設計、及び生物学における特定の生化学プロセスの相互作用又は役割の理解のための出発点となる。

ＨＴＳの有用性における重要な要素は自動化である。単一のアッセイプレートの寿命を通じたプロセス、すなわちアッセイプレートの作製から最後の分析に至るまでのプロセスの大部分を専用のロボットが実施することが多い。ＨＴＳロボットは通常、多数のプレートを同時に準備して分析し、さらにデータ収集プロセスを高速化する。しかし、このようなロボットを正確に機能させるには、やはりｐＨとイオン強度が精密に制御される緩衝液等の液体混合物を調製することが必須である。

ますます重要になりつつあるＨＴＳ分野内の１つの応用例は、ｐＨ及びイオン強度が標的及び汚染物質の結合挙動を支配するためｐＨ及びイオン強度の役割が非常に重要であるハイスループットプロセス開発（ＨＴＰＤ）である。このようなハイスループットプロセスを首尾よく設計することによって、質量移動速度が速く、従ってプロセスコストが低く、且つ溶出が最適であり、従って回復速度が最高になる条件を正確に予測することができる。しかし、設計をこのように首尾よく行うには、ｐＨやＩのような多数の条件を短時間で準備するのを可能にする自動的な緩衝液調製が必要であるか、或いは自動的な緩衝液調製によって設計が少なくとも大幅に改善される。

精密且つ十分に制御された緩衝液調製が必要になる他の応用例は、マイクロプレート及び他の実験機器形態である。マイクロプレート及びフィルタプレートによるアッセイにおける多数の段階は、例えばマルチピペット及び真空ブロックを処理に使用し、プレートリーダを結果の検出に使用することによって容易に並列化される。より高いレベルの自動化、すなわちプレートの自動搬送は必要とされないことが多い。このことは多数の「スループット応用例」にも当てはまる。なぜなら、実験の数における係数９６又は３８４が、既に最初の段階でプレート統合によって実現されるからである。しかし、プレートに個々のウェルを準備する退屈な作業を伴う場合がある。個々のウェルの検出及び分析には当然、専用の省スペースプレートリーダが使用されるが、１枚のマイクロプレートの個々のウェルにおける緩衝液の調製用に、同様な専用の、手頃な価格の省スペース解決策はない。ＴＥＣＡＮは、その実験室自動化プラットフォームを使用してマイクロプレートにおいて緩衝液を調製するためのソフトウェアを作成することによってこの問題に対処している会社である。これは一見して的確な解決手段のように見えるが、装備の整った自動化実験室での比較的単純な作業に高価な自動化インフラストラクチャが数時間にわたって占有されることになる。さらに、小さな実験室がＴＥＣＡＮの解決手段から利益を得るのに多額の資金が必要になる。

従って、例えば一次自動化インフラストラクチャにおける作業負荷を低減させるために、自動化解決手段と一緒に作業ステーションとして使用することのできる、独立型ユニットのような自動分配装置も必要である。

国際公開第９７３１６９２号

本発明の一態様は、液体混合物のｐＨ及びイオン強度を精密且つ正確に制御する方法を提供する態様である。簡潔にいうと、これは、有機イオンと無機イオンの径と電荷の両方を考慮した、緩衝液等の液体混合物を調製する方法を提供することによって実現することができる。これは、添付の請求項のうちの１以上に定義されているように実施することができる。

本発明の他の目的は、緩衝液を調製する改良された方法であって、まず厳密な組成を算出し、その後単一の段階で緩衝液を調製する方法を提供することである。

本発明の特定の態様は、緩衝液を調製するツールであって、緩衝液の容量を算出することによってそれぞれの緩衝液のｐＨ範囲が確保されるツールを提供する態様である。

本発明の他の態様は、所望のｐＨ並びに／又はイオン強度及び緩衝能に基づいて緩衝液種、緩衝液濃度、及び／又は塩濃度に関して液体混合物の組成を定める方法を提供する態様である。従って、本発明は、液体混合物の所望のｐＨ、並びに適宜所望のイオン強度及び緩衝能から、適切な緩衝液種と緩衝液の適切な値と塩濃度を定めてｐＨ並びにイオン強度及び緩衝能を求める。

最後に、本発明の他の態様は、マイクロプレート及び他の実験室機器において緩衝液をインテリジェントに調製する自動分配装置で、緩衝液を定める本発明の方法を利用する態様である。これは、上述のモデルに基づくソフトウェアを導入することによって実現することができる。特定の態様では、この装置は、自動化用のインタフェースを備える。

本発明の他の態様及び利点は、以下の詳細な説明及び特許請求の範囲から明らかになろう。

定義
本明細書における「緩衝液」は、溶液において、かなりの量の酸及び／又は塩基が添加されるにもかかわらずｐＨ値をほぼ一定に維持する成分又は化合物を意味する。用語「コンピュータプログラム」は、本明細書では用語「ソフトウェア」とほとんど同じ意味に使用される。

相対組成比を求めるための反復手順を示すフローチャート図。 液体混合物の相対組成比を求める方法を示すフローチャート図。 緩衝液調製装置の概略を示す図。 ３つの異なる方法についての実験ｐＨ値間の二乗平均平方根差及び計算ｐＨ値と実験ｐＨ値との二乗平均平方根差を示す表１を示す図。 ３つの異なる方法についての実験ｐＨ値間の二乗平均平方根差及び計算ｐＨ値と実験ｐＨ値との二乗平均平方根差を示す表１を示す図。 ｐＨ測定値とＢｕｆｆａｌｌｏ Ｐｌｕｓで算出したｐＨ予測値のプロットを示す図。

第１の態様では、本発明は、所定のｐＨ及びイオン強度を有する液体混合物を提供するため、緩衝液、酸又は塩基、溶媒及び任意成分としての塩の各々１種以上の相対組成比を求める方法であって、デバイ−ヒュッケルの式を用いて相対組成比を求め、デバイ−ヒュッケル式におけるイオン径パラメータａを、液体混合物のイオン強度に寄与する全ての種の加重平均イオン径として求め、各種のイオン強度を重み付けパラメータとして使用する方法に関する。

従って、有機緩衝液種と無機種とを含んでなる液体混合物に適用可能な一般的な方法が提供される。上述のように、このような緩衝液体混合物は、化学及び生物学の多数の分野で広く使用されている。本発明の方法は、相対組成比の改良された予測（相対組成比を求めること）を可能にして、特に高い緩衝液及び／又は塩濃度において、所定のｐＨ及びイオン強度を有する液体混合物を得る。このことは、以下の実験結果によって支持される。本発明の方法を逆の状態で使用して、特定の構成の液体混合物の結果として得られるｐＨ及びイオン強度を求めることができることにも留意されたい。

上述のように、緩衝液の相対組成比を求めるとき等にデバイ−ヒュッケル式の様々な近似式が広く使用されているが、今までのところどの近似式も緩衝液及び／又は塩のより高い濃度での精度が不十分である。提案される方法は、イオン径パラメータａを液体混合物のイオン強度に寄与する全ての種の加重平均イオン径として求めることによって上記のような問題を解消し、この場合、各種のイオン強度が重み付けパラメータとして使用される。

一実施形態によれば、液体混合物のイオン径パラメータａは次式のように算出される。

式中、Ｉｉはイオン強度であり、ａ_iは種ｉのイオン径パラメータであり、Ｉは上記の数式１．６で定義された総イオン強度である。上記の数式から次式が得られる。

種ｉのイオン径パラメータａ_iは、実験によって確定された値又は近似値であり、いくつかの緩衝液及び塩のａ_i値の例が実施例２の表２に示す。

本開示全体にわたって、用語「種」は、液体混合物のイオン強度に寄与するありとあらゆるイオン又は分子を対象としており、より具体的には、１つの成分、例えば弱酸等の緩衝系は、異なる電荷を有し、各々が関連するａ_i値を有する２種以上の種に相当する。ａ_iが特定の環境で「イオン径」と関係するため、特定の種のａ_i値が、成分、例えば緩衝液や塩等の様々な組み合わせについて異なることが判明した。例えば、以下の表２に示されているように、ＮａＣｌのａ_i値は、リン酸塩緩衝液に混合されたときには酢酸塩緩衝液に混合されたときと異なることが判明している。しかし、ａ_i値が、本方法を使用して広範囲のｐＨ及びイオン強度にわたって試験された成分の組み合わせについて有効であり、ほぼ全範囲にわたって予測可能性が向上することが判明した。実施例２の図５は、上記の方法に基づいて調製された多数の緩衝液例についての計算ｐＨ値と測定ｐＨ値のプロットを示している。このプロットから、開示される方法が、非常に広いｐＨ範囲にわたって関連する相対組成比を定めることができることは明白である。

一実施形態によれば、デバイ−ヒュッケル式におけるイオン径パラメータａを次式のように近似できることがさらに判明した。
ａ＝０．５^*（質量）^1/3＋シェル 式１．１３
これによって、ａを求めるのに必要な処理容量が少なくなる。この数式では、用語「シェル」は、イオンの「水和層」とみなすことができる追加の層に基づく語である。この実施形態に関して、「シェル」を特定の一定の値に設定した場合、例えば図４に示されている表１から明らかなように、デバイ−ヒュッケル式において「定数」と呼ばれる項が０．５に等しくなることが分かった。

従って、一実施形態では、「シェル」は、正に荷電されたイオン種については特定の値に固定され、負に荷電されたイオン種については他の異なる値に固定される。一実施形態では、「シェル」は、正に荷電されたイオン種については、３．９〜４．１又は４のような３．８〜４．２の範囲である（ｓｈｅｌｌｐｏｓ＝４）。他の特定の実施形態では、「シェル」は、負に荷電されたイオン種については、０〜０．１又は０のような０〜０．２の範囲である（ｓｈｅｌｌｎｅｇ＝０）。

上述の岡本のような従来技術の方法とは異なり、本発明の利点として、本発明は、低塩濃度だけでなく１Ｍを超える濃度、２Ｍを超える濃度、又は場合によっては５Ｍを超える濃度のような高塩濃度でも緩衝液等の液体混合物の調製を可能にする。

従って、特定の実施形態では、本発明は、緩衝液等の液体混合物を生成する方法であって、塩濃度が最大で１Ｍ、具体的には１〜２Ｍの範囲、又はより具体的には２Ｍを超える濃度である方法である。

一実施形態によれば、相対組成比は反復手順を使用して求められる。

図１に概略的に示されている特定の一実施形態によれば、反復手順は、
（ａ）相対組成比を求め（１０）、液体混合物の所定のイオン強度を各種間の所定の分布に従って各種にアドレス指定し（２０）、
（ｂ）前段階で求められた相対組成比に基づいて、混合物中の各種のイオン強度を算出し（３０）、
（ｃ）（ｂ）で算出したイオン強度を考慮して新しい１組の相対組成比を求め（４０）、
（ｄ）所定の収束基準が満たされる（５０）まで段階（ｂ）及び（ｃ）を繰り返すことを含んでなる。

段階（ａ）における、液体混合物の所定のイオン強度の各種間でのアドレス指定は、収束を迅速化し、且つ偽収束を回避するために反復プロセスの適切な開始点を実現するように予め定められる。一実施形態によれば、液体混合物の所定のイオン強度は塩種にアドレス指定される。なぜなら、塩種は通常、塩成分を含んでなる緩衝液の総イオン強度に主として寄与する種であるからである。塩成分を含まない液体混合物の場合、液体混合物の所定のイオン強度はアドレス指定される。

段階（ｂ）で、前段階、すなわち最初の反復における段階（ａ）及び後続の反復における段階（ｃ）で求められた相対組成比を使用して混合物中の各種のイオン強度を算出する。従って、相対組成比によって定められた各種の濃度を使用してより正しいイオン強度分布を算出し、その後、このイオン強度分布を使用してより正しい相対組成比を算出し（段階（ｃ））、これを収束が生じるまで繰り返す。

所定の収束基準としては、相対組成比が妥当な計算作業によって十分な精度で定められるようにする任意の適切な基準を選択することができる。一実施形態によれば、最後の１組の相対組成比と直前の段階で得られた１組の相対組成比との偏差が所定の最大レベルを超えないときの反復段階を収束基準として選択することができ、この最後の１組の相対組成比を次に、所与の塩濃度で選択されたｐＨの混合物を生成する相対組成比として保持することができる。他の実施形態では、収束基準を、例えば一定数の反復又は他の適切な関係として選択することができる。特定の実施形態では、上記の手順を１０回未満、好ましくは８回未満、より好ましくは４〜６回、例えば５回反復する
図２に概略的に示されている一実施形態によれば、液体混合物の相対組成比を求める方法は、所定のｐＨ及びイオン強度を有する液体混合物を生成する（７０）方法であって、
緩衝液、酸又は塩基、溶媒及び任意成分としての塩のうちの１種以上のそれぞれの成分原液を準備し（８０）、
・上記の方法を使用して混合すべき各成分原液の相対比を求め（９０）、
・原液を混合する（１００）ことを含んでなる方法で使用することができる。

他の実施形態では、１種以上の成分原液をこの成分の固相供給源で置き換えることができ、それによって、相対比分の固相は各成分の混合時に溶解する。

この方法によって、所定のｐＨ及びイオン強度に応じて広範囲の緩衝液又は他の液体混合物を高精度に調製することができる。

一実施形態によれば、この方法を使用して液体混合物を調製することができ、この場合、比率を同時に変化させる成分原液を組み合わせることによってイオン強度を時間の経過と共に徐々に変化させ、液体流のｐＨ値をほぼ同じ値に維持することができる。必要に応じて、ｐＨ勾配又は場合によってはｐＨ勾配とイオン強度勾配との組み合わせを有する液体混合物を調製することができる。

本発明は、複数の緩衝液種液体として認識されることが多い２種以上の緩衝種を含んでなる緩衝液等の液体混合物の相対組成比を求めるのに有用である。従って、一実施形態では、本発明は上述のような方法であり、それぞれの異なる緩衝種を含んでなる２種以上の原液が準備される。他の実施形態では、３つ又は４種以上のような２種以上の緩衝種を含んでなる原液を準備する。

一実施形態では、相対組成比を求める本発明の方法は、所望のｐＨ値並びに／又は所望のイオン強度及び緩衝能を有する緩衝液を得るのに必要な緩衝液種、緩衝液濃度、及び塩濃度からなる群から選択される１以上のパラメータを定める、緩衝液を定める方法と呼ぶことができる。一実施形態では、緩衝液を定めることは特定の一時点で行われる。他の実施形態では、本発明による緩衝液の調製は、連続プロセスにおいて直列的に実施される。緩衝液を定める方法は、液体混合物の調製に関して上述の要素のうちの１種以上を含んでよい。

上述のように、本発明の方法を使用して調製される液体混合物は、ハイスループットスクリーニング応用例やクロマトグラフィのような様々な応用例で有用な緩衝液であってよい。クロマトグラフィでは、本発明の方法によって調製される液体は、有利なことに、本発明によって、塩勾配とも呼ばれる徐々に変化するイオン強度を有する溶出液である。このような勾配は大きくなることも或いは小さくなることもできる。

他の態様では、本発明は、上述の計算を実施することのできるコンピュータプログラムに関する。

特定の実施形態によれば、相対組成比を求める上記の方法に従って、
緩衝液、酸又は塩基、溶媒及び任意成分としての塩の各々１種以上の相対組成比を求め、所定のｐＨ及びイオン強度を有する液体混合物を生成するコンピュータプログラムであって、求められた成分混合比がユーザに対して表示され、評価され、且つ／或いは液体ミキサ装置を制御するのに使用されるコンピュータプログラムが提供される。

本発明によるコンピュータプログラムは、ディスクやスティック等のメモリ装置上に或いは制御装置の一部として設けることができ、ｐＨ及びイオン強度が制御される液体混合物、好ましくは液体流を自動的に調製するうえで有用である。

上記のように、相対組成比を求めて所定のｐＨ及びイオン強度を有する液体混合物を生成する方法をコンピュータに基づいて実施する一実施形態では、各種のイオン径パラメータａ_iは、アクセス可能なデータベース、テーブル等に格納され、計算に使用される。このようなテーブルの一例が、実施例２に関する表２に示す。

特定の実施形態では、コンピュータプログラムを設計モードで動作させることができ、すなわち、プログラムは、受け入れた量（すなわち滴定剤、滴定剤、水、及び塩の量）を算出して所与のｐＨ及びイオン強度（或いはイオン強度の代わりに塩強度）を有する溶液を得る。他の実施形態では、コンピュータプログラムをｐＨ計算モードで動作させることができ、すなわち、プログラムは、ある量の緩衝液成分が混合される際に得られるｐＨ及びイオン強度を算出する。

図３に概略的に示されている第３の態様では、緩衝液調製装置１９０であって、
・混合液体出口ポート２１０、並びに
緩衝液、酸又は塩基、溶媒及び任意成分としての塩のうちの１種以上のそれぞれの成分供給源２３０に連結された複数の入口ポート２２０を備える液体ミキサ装置２００と、
・ミキサ装置の入口ポートを通じて供給される相対組成比を制御し、所定のｐＨ及びイオン強度を有する液体混合物を出口ポートの所で生成するように構成され、デバイ−ヒュッケルの式を用いて相対組成比を求めるように構成され、デバイ−ヒュッケル式におけるイオン径パラメータａが、液体混合物のイオン強度に寄与する全ての種の加重平均イオン径として求められ、各種のイオン強度が重み付けパラメータとして使用されるミキサ制御ユニット２４０とを備える緩衝液調製装置１９０が提供される。

一実施形態によれば、緩衝液調製装置は、相対比分の関連する成分をミキサ装置に供給する１以上の制御可能な弁２５０、ポンプ２６０等を備える。開示される実施形態では、弁２５０及びポンプ２６０は、液体ミキサ装置に組み込まれるように概略的に示されているが、別個の構成部材として設けることもできる。

一実施形態によれば、緩衝液調製装置は液体クロマトグラフィシステムの一部として組み込まれる。従って、緩衝液調製装置は、引用によって本明細書に含まれる上述の米国特許第６２２１２５０号で詳細に論じられているようにクロマトグラフィで使用されることが有利である。

特定の一実施形態では、緩衝液調製装置は、４入口高速切り替え弁等のマルチポート入口弁と、緩衝液滴定手段と、実緩衝液混合比のディスプレイと、イオン強度及び温度とは無関係にｐＨを維持する手段と、緩衝能を自動的に検査する手段とを備える。４つ組弁は、短時間の間１つのポートを開いた後、次のポートを開き、以後同様の動作を繰り返す。様々な原液体積セグメントがミキサ内で完全に混合され、選択した緩衝液が形成される。開時間は、正しいｐＨが得られるようにアルゴリズムによって制御される。

緩衝液の滴定は、対応する或いは強い酸／塩基によって行うことができる。実緩衝液混合比は、ＵＮＩＣＯＲＮ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の修正バージョン等のソフトウェアによって表示し且つ／或いは制御することができる。調製された溶液のｐＨは、イオン強度及び温度とは無関係に安定する。緩衝能を自動的に検査することができる。緩衝液濃度及びｐＨは、方法の実施中に設定することができる。

さらに他の態様では、イオン強度が変更される間ｐＨがほとんど同じ値に維持される液体流を生成するロボット液体ハンドラが提供される。例えば、ハイスループットスクリーニング手順、品質制御、ＤＮＡ量子化及び正規化、ＰＣＲ等で緩衝液組成を制御する際に、この実施形態によるロボット液体ハンドラを使用することができる。有利な実施形態では、本発明のロボットハンドラは、ハイスループットプロセス開発用の９６ウェルフォーマットにおいて完全に自動化された緩衝液の調製を可能にするシステムの一部を構成する。このようなシステムでは、本発明によるコンピュータプログラムは、ロボット装置に容易にインポートされるフォーマットでの出力構成を実現する。

最後に、本発明は、マイクロプレート又は他の形態、及び場合によっては他の実験機器のようなインテリジェント緩衝液調製用の自動分配装置における上述の相対組成比を求める方法の使用にも関する。本発明による方法の１つの利点は、１Ｍ以上の高いイオン強度値でｐＨが正確に予測されることである。一実施形態では、この方法は、特に、正に荷電された緩衝液イオンを有する緩衝液系に使用される。本発明による独立型緩衝液調製装置は、ハイスループットプロセス開発、結晶化条件のスクリーニング、結合条件のスクリーニング等の応用例、一般的にはμｌ〜ｍｌ規模で並行して緩衝液を調製する必要のある応用例向けの化学的、生物学的、生化学的、医学的研究開発に関連するあらゆる実験室で使用することができる。装置は、含められるソフトウェアに応じて、同じユニット動作を必要とする他の応用例向けにも容易に調整することができる。

図面の詳細な説明
図４は、３つの異なる方法についての実験ｐＨ間の二乗平均平方根差及び計算ｐＨ値と実験ｐＨ値との二乗平均平方根差を示す表である。これらの方法はそれぞれ、イオン強度のｐＫ_a値に対するタイプ補正、Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍ ＆ Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒの数式１．１０による補正、及びこの方法の数式１．９と数式１．１１による補正の点で異なる。括弧内の数は、０．１ｐＨ単位よりも大きい差の数を示す。ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．値もｐＨ単位で示されている。Ｎ_OKは、ｐＨ単位当たり強酸／塩基が０．０１モル以上である緩衝能を有する実験の数である（ｌｏｇβ＞−２）。グレーのシェル値は無効である。

図２は、４入口高速切り替え弁によって実施された本発明による緩衝液の調製の特定の実施形態を示している。緩衝液の滴定は、対応する或いは強い酸／塩基によって実施することができる。実緩衝液混合比は、ソフトウェア、この場合はＵＮＩＣＯＲＮ（ＧＥ Ｈｅａｌｔｈｃａｒｅ）の特定的に修正されたバージョンによって表示される。調製された溶液のｐＨは、イオン強度及び温度とは無関係に安定する。緩衝能を自動的に検査することができる。緩衝液濃度及びｐＨは、方法の実施中に設定することができる。４つ組弁は、短時間の間１つのポートを開いた後、次のポートを開き、以後同様の動作を繰り返す。様々な原液体積セグメントがミキサ内で完全に混合され、選択した緩衝液が形成される。開時間は、正しいｐＨが得られるようにアルゴリズムによって制御される。動作時に使用される実比率は、ＵＮＩＣＯＲＮのＳｙｓｔｅｍ ＣｏｎｔｒｏｌとＥｖａｌｕａｔｉｏｎに曲線Ｃｏｎｃ Ｑ１〜Ｑ４における百分率として表示される。

以下の実施例は、例示のためのみに記載されており、添付の特許請求の範囲によって定義される本発明を制限するものとみなすべきではない。

実施例１
ソフトウェア開発
材料／検査ユニット
Ｐｅｎｔｉｕｍ（登録商標）４プロセッサ及びＷｉｎｄｏｗｓ（登録商標）ＸＰオペレーティングシステムを有するパーソナルコンピュータで全てのプログラミングを実施した。

方法
開発作業の最初の部分では、ＢｏｒｌａｎｄのＣ＋＋Ｂｕｉｌｄｅｒのバージョン５を使用し、その後Ｖｉｓｕａｌ Ｃ＋＋コンパイラのバージョン４．２を使用した。

合格基準
この実験の開始時に、この方法では、精度が０．２ｐＨ単位の正しいｐＨを示す必要があると決定した。使用されるポンプ及び弁システムの仕様は０．５％であり、通常の原液濃度は０．２Ｍであるため、最小緩衝能¹を０．０１（以下を参照されたい）とすると、約０．１が定量の精度に相当し、且つ０．１がアルゴリズムの精度に相当する。緩衝能を｜ｄｎ／ｄｐＨ｜として定義したときの最小緩衝能を求めた。この場合、ｄｎは、ｐＨの（僅かな）変化ｄｐＨを生じさせる強酸／塩基の量（モル単位）の（僅かな）変化である。実験による緩衝液のｐＨ測定値との比較によってアルゴリズムの精度を推定した。実験段階の初めに分配誤差を推定し、このような誤差は、実験によるｐＨ測定値に関する他の誤差（データは示さず）と比べて非常に小さいとみなした。従って、本明細書ではｐＨＥｘｐ及びｐＨＥｘｐ１として示される２つの異なるｐＨ値を生じさせる異なる種類の電極を有する２つの異なるｐＨメータを使用して各緩衝液サンプルのｐＨを測定することによって、実験誤差を推定した。以下の公式に従って各実験シリーズ（データセット）ごとに二乗平均平方根誤差（ｒ．ｍ．ｓ．ｅ．）を算出した。
ｒ．ｍ．ｓ．ｅ．＝Ｓｑｒｔ（Σ（ｐＨＥｘｐ−ｐＨＥｘｐ１）²／Ｎ_OK） 式２．１
式中、０．０１よりも大きい対応する緩衝能を伴うｐＨ値の和が求められ、この場合、Ｎ_OKは、このようなケースの数である（緩衝能（β）の対数（基底１０）が−２よりも大きい結果のみを検討する）。ｒ．ｍ．ｓ．ｅが０．０５ｐＨ単位よりも大きいことが分かった場合、データセットの少なくとも半分（１つのｐＨメータに相当する）を不合格とし、その場合、文献に記載されている緩衝液定数（ｐＫａ及びｐＫａの温度依存性）の確立された値とより整合するデータセットを維持し、イオン強度方法補償パラメータの最適化に使用した。文献による緩衝液定数の確立された値に整合する他のデータセットがある場合には、整合する半分のデータセットを不合格にすることもある。緩衝能の下限としての値０．０１（ｌｏｇ−２．０）は、この限界よりも小さな値では、たいていの緩衝液系においてｒ．ｍ．ｓ．ｅ．が０．０５を超える（データは示さず）ことが実験によって分かったことによって得られた値である。比較として、上述の米国特許第６２２１２５０号（Ｓｔａｆｓｔｒｏｍ）で使用された対応する値は０．００６３（ｌｏｇ−２．２）である。文献には「通常認められる値」の引用は見つからなかった。

結果
プログラム「Ｂｕｆｆａｌｏ」はＶｉｓｕａｌ Ｃ＋＋で書かれており、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で動作して１Ｍ程度の高いイオン強度での緩衝液ｐＨを正確に算出することができる。

プログラムの構造
プログラム「Ｂｕｆｆａｌｏ」は、２つのモード、すなわち設計モード及びＣａｌｃ＿ｐＨモードで動作することができる。設計モードは、実験の構成、及び実験の構成の前に、適切なｐＨ範囲を判定するために使用することができる理論滴定曲線の算出に使用される。Ｃａｌｃ＿ｐＨモードは、１組の数対のｐＨ測定値が与えられた場合にパラメータの最適化に使用される。どちらのモードでもプログラムに入力されるのは、緩衝液体積（ｂｕｆｆ＿ｖｏｌ）、温度（ＴＴ）、緩衝液濃度（ｂｕｆｆ＿ｃｏｎｃ）、塩濃度（ｓａｌｔ＿ｃｏｎｃ）、緩衝液物質（ｂｕｆｆ＿ｃｈｏｉｃｅ）、及び滴定剤物質（ｔｉｔｒａｔｅ＿ｃｈｏｉｃｅ）である。この他に、設計モードでは、入力として所望のｐＨ（ｐＨ）が必要であり、一方、Ｃａｌｃ＿ｐＨモードでは、実験によるｐＨ（ｐＨＥｘｐ）、対応する複製（ｐＨＥｘｐ１）、及び実験で使用される滴定剤のモル数（ｔｉｔｒａｔｅ＿ｍｏｌ＿ｅｘｐ）が必要である。さらに、どちらのモードでも、単一の緩衝液物質からなる緩衝液ではなくいくつかの（ｎ＿ｂｕｆｆｓ＝１、２、又は３）緩衝液ｂｕｆｆ＿ｃｈｏｉｃｅ（１）、ｂｕｆｆ＿ｃｈｏｉｃｅ（２）、ｂｕｆｆ＿ｃｈｏｉｃｅ（３）の混合物を検討することが可能である（プログラムは、最大数の３つの緩衝液物質について実施されているが、これよりも多くの緩衝液物質を含むように容易に修正することができる）。このことは、対応する緩衝液濃度ｂｕｆｆ＿ｃｏｎｃ（１）、ｂｕｆｆ＿ｃｏｎｃ（２）、ｂｕｆｆ＿ｃｏｎｃ（３）が与えられた場合には緩衝液濃度にも当てはまる。

一塩基緩衝液と多塩基緩衝液
一塩基緩衝液のｐＨは、Ｈｅｎｄｅｒｓｏｎ−Ｈａｓｓｅｌｂａｃｈ式によって予測することができる（数式１．３又は数式１．７）。

塩基性種及び酸性種の濃度は、緩衝液濃度及び滴定剤濃度によって求められる。これらの濃度及び一塩基緩衝液のｐＫ_aが与えられた場合、ｐＨを導くことができ（Ｃａｌｃ＿ｐＨモードに相当する）、或いは、所望のｐＨ及び緩衝液濃度が与えられた場合、滴定剤のモル量を導くことができる（設計モードに相当する）。使用する緩衝液の多くが多塩基性であるときに問題が生じ、すなわち、緩衝液分子は、複数のｐＫ_a値に対応する複数のプロトンを受け入れ且つ手放すことができる。このような緩衝液系における種の数は常に、ｐＫ_a値の数（ｎｒ＿ｏｆ＿ｐＫａ）よりも１だけ多い。プログラムの実施を簡略化するために、三塩基緩衝液の一般的なモデルを実施した（ずっと大きなｐＫ_a値に拡張することは、容易ではあるが、自明ではなく実施する必要がある）。パラメータｎｒ＿ｏｆ＿ｐＫａ（１、２、又は３であってよい）がどのように計算を制限するかにかかわらず４つのプロトン化状態又は種（ｓ１、ｓ２、ｓ３、及びｓ４）が定義され、従って、例えば一塩基緩衝液の場合、ｓ１は酸性種に相当し、ｓ２は塩基性種に相当し、ｓ３及びｓ４の濃度は０に設定される。

２つのモード間の差異及び類似性
２つのモードは、ほとんど同じ方法を使用して働き、すなわち所与の緩衝液濃度で所与のｐＨを得るのに必要な滴定剤のモル量の値を求める。そうする前に、考えられる数のプロトン化状態（又は種）の各々で緩衝液のモル量を求めておく必要がある。モード間の差異は、設計モードでは、緩衝能の値を数値計算によって推定するための手順が、所望のｐＨについての１回とｐＨ＋ｐＨ＿ｓｔｅｐ（以下を参照されたい）についての１回の２回しか実施されない（ｋｍａｘ＝２）ことである。この場合、所望のｐＨについて得られた滴定剤のモル量が設計モードの出力になる。一方、Ｃａｌｃ＿ｐＨモードでは、ｐＨスケール全体にわたって手順が繰り返される（１〜１３、ｋｍａｘ＝２６００）、実験で使用された滴定剤のモル量に最も厳密に一致する滴定剤のモル量を生成するｐＨ値が計算ｐＨ値になる。ｐＨ＿ｓｔｅｐ（０．００５）は、ｐＨ及び緩衝能の計算の精度を制限する。どちらのモードでも誤差として同じアルゴリズムを使用すると有利であることが分かっており、このようにして不要な差異が最小限に抑えられた。

平衡式
各プロトン化種におけるモル量の計算は、各種の、プロトンが１つ多く且つ／或いは１つ少なく、水素原子の濃度（ｐＨ）を有する「近傍の」種との平衡についての式を解くことと等価である。換言すれば、数式１．７から直接導かれる３つの数式（３つのｐＫａ値に相当する）と等価である。

ｘｘ［ｉ］＝１０＾（ｐＨ−ｐＫａｐｒｉｍｅ［ｉ］） 式３．１
式中、各ｉは各ｐＫａ（ｉ）値（ｉ＝１、２、３）に相当し、ｘｘ［ｉ］は、対応する塩基及び対応する酸の濃度間の比であり、すなわち、ｘｘ［１］＝［ｓ２］／［ｓ₁］、ｘｘ［２］＝［ｓ₃］／［ｓ₂］、ｘｘ［３］＝［ｓ₄］／［ｓ₃］である。

この３つの数式に加え、質量保存のために以下の数式が得られる。
［ｓ₁］＋［ｓ₂］＋［ｓ₃］＋［ｓ₄］＝緩衝液濃度 式３．２
電荷保存のために以下の数式が得られる。
［Ｈ⁺］−［ＯＨ^-］＋Σ種電荷（ｓ_i）−滴定剤電荷^*［滴定剤］−種電荷（開始種）^*［開始種］＝０ 式３．３
開始種とは、混合の前の緩衝液物質の種、すなわち貯蔵液又は原液中の緩衝液のプロトン化状態を意味する。このプロトン化状態は、緩衝液分子当たり対イオン量によって判定される。これは、巨視的な物体、すなわち貯蔵液又は原液が電気的に中立であるためである。［ＯＨ^-］の前のマイナス符号は、ＯＨイオンの電荷のマイナス符号によるものであり、一方、最後の２つの項の前のマイナス符号はそれぞれ滴定剤及び開始種の対イオンの電荷によるものである。

最後に、水解離平衡は次式の通りである。
「ＯＨ^-」［Ｈ⁺］＝１０^-14 式３．４
数式３．１〜３．４は、ｐＫ_a値が３つである場合に６つの未知の要素（４つの［ｓ_i］、［ＯＨ^-］、及び［Ｈ⁺］）を有する６つの式があることを意味する。ｐＨを既知であると仮定され、さらに［Ｈ⁺］、場合によっては数式３．４によって［ＯＨ^-］も既知であると仮定し、その代わりに、滴定剤濃度を求める。５つの残りの数式は５つの未知の要素（４つの［ｓ_i］及び［滴定剤］）に相当する。

滴定剤のモル量の計算
平衡状態での各種の濃度［ｓ_i］が判明した後、数式３．３を使用して滴定剤濃度を求めることができる。滴定剤の種類に応じて考慮すべき２つのケース、すなわち、強い酸／塩基のケースと対応する酸／塩基のケースとがある。しかし、どちらのケースであるかとは無関係に、数式３．３において滴定剤濃度を求めると次式が与えられる。
［滴定剤］＝（−［Ｈ⁺］＋［ＯＨ^-］−Σ種電荷（ｓ_i）^*［ｓ_i］＋種電荷（開始種）^*［開始種］）／プロトン段階 式３．１０
式中、
プロトン段階＝−滴定剤電荷（強い酸／塩基） 式３．１１ａ
又は
プロトン段階＝種電荷（開始種）−滴定剤電荷（対応する酸／塩基） 式３．１１ｂ
が成立する。

換言すれば、パラメータｐｒｏｔｏｎ＿ｓｔｅｐは、ＨＣｌについては−１であり、ＮａＯＨについては＋１であり、弱い酸又は塩基滴定剤の場合、滴定剤のｐｒｏｔｏｎ＿ｓｔｅｐは、数式３．１１ｂ又は以下の等価数式による緩衝液の開始種によって決まる。
プロトン段階＝滴定剤種−開始種 式３．１２
この手順は、緩衝液成分の数と同じ回数だけ繰り返され、最後のｔｉｔｒａｔｅ＿ｍｏｌは、各成分から得た滴定剤のモル量の和である（以下を参照されたい）。

たいていの場合（ｐＨが約３．５から１０．５の間）、荷電平衡に対する［Ｈ⁺］（低ｐＨ値）又は［ＯＨ^-］（高ｐＨ値）の寄与は、無視することができ、数式３．１０では零に設定することができる。

滴定剤の選択
滴定剤は強い（ＨＣｌ又はＮａＯＨ）であってよい。この２つの物質の唯一の差異は、２つの物質が寄与するプロトンの数の符号である。さらに、滴定剤の濃度は低くてよく、その場合、滴定剤の（貯蔵液又は原液中の）プロトン化状態を確立する必要がある。或いは、酸性プロトンの数を指定することができる。この２つの数の関係は次式の通りである。
滴定剤種＝プロトンの数＋１−酸性プロトンの数 式３．１３
イオン強度反復ループ
イオン強度は全てのイオンの濃度から算出されるので、イオン濃度を正確に算出する前にこれらの濃度を知っておく必要がある。しかし、これらの濃度はそれ自体が、ｐＫａ（２５℃及び０イオン強度でのいわゆる熱力学ｐＫａ値）、温度、及びイオン強度から算出されるｐＫａｐｒｉｍｅ［ｉ］を必要とする平衡式の解から出力される。従って、反復手順を実施する必要があった。このような手順の第１の段階では、イオン強度を単に塩濃度に等しい値に設定する。第２の反復段階では、第１のサイクルから得られたイオン強度を使用する。以後、同様の手順を繰り返す。この手順は非常に急速に収束することが判明した。例えば、所望の精度を得るには５回の反復で十分過ぎることが判明している（データは示さず）。従って、全ての場合に反復の数を５に設定した。

イオン強度の計算における別個の電荷
２以上の電荷を有するイオン強度の計算において、（電荷間に４つ及び５つの炭素原子を有するクエン酸塩イオンと同様に）電荷同士が十分に分離されている場合、電荷が単一の点電荷としてではなく別々の電荷とみなされる場合には著しく良好な精度が得られることが分かった。このため、クエン酸塩には真が設定され、検討中の他の全ての緩衝液については偽が設定されるフラグ変数ｓｅｐａｒａｔｅ＿ｃｈａｒｇｅｓが導入された。

緩衝液成分に対するループ、緩衝液パラメータ
各緩衝液種ごとに以下のパラメータが必要である。すなわち、緩衝液物質の質量（Ｍｂｕｆｆ）、ｐＫａ値の数（Ｎｏ ｏｆ＿ｐＫａ）、ｐＫａ値（ｐＫａ［ｉ］）、各ｐＫａ値の温度依存性の値（ｄｐＫａｄＴ［ｉ］）、塩基性度が最も高い形態の電荷（ｂｃ）、及び貯蔵液又は原液中の緩衝液プロトン化状態（ｓｔａｒｔ＿ｓｐｅｃｉｅｓ）が必要である。或いは、酸性プロトンの数を指定することができる。この２つの数の関係は次式の通りである。

開始種＝プロトンの数＋１−酸性プロトンの数 式３．１４
この他に、イオン強度補正パラメータ（ｋｏｎｓｔ、ｓｈｅｌｌｐｏｓ、及びｓｈｅｌｌｎｅｇ）が必要である。

滴定剤の総モル数（ｔｉｔｒａｔｅ＿ｍｏｌ）は、各緩衝液成分に必要な滴定剤のモル数の和に等しく、所望のｐＨで平衡を確立し、このループはこの輪を算出するために使用される。ループの間に算出される他の和は、各緩衝液成分の対イオンの数、さらに、平衡状態でのイオン強度に対する各成分の寄与である。

様々なプロトン化状態に対するループ、ｐＫａの温度補正
各プロトン化状態ごとに、電荷（ｓｐｅｃ＿ｃｈｒｇ［ｊ］）、電荷の二乗（ｑｓｑ［ｊ］）、シェル（ｓｈｅｌｌ［ｊ］）、定数（ｋｏｎｓｔ［ｊ］）、及び温度補正ｐＫａ値（ｐＫａＴ［ｊ］）が算出される。温度補正ｐＫａ値は以下の公式に従って算出される。
ｐＫａＴ＝ｐＫａ［ｉ］＋（ＴＴ−２５）^*ｄｐＫａｄＴ［ｉ］ 式３．１５
式中、ＴＴは摂氏単位の温度である。イオン径パラメータａの、次式で表される、質量のみに依存する部分ａａａ［ｉ］（非水和半径ａａａ［ｉ］と呼ぶことができる）も算出する。

ａａａ［ｉ］＝ｋｏｎｓｔ［ｉ］^*（Ｍｂｕｆｆ）^1/3 式３．１６
ｐＫａに対するループ、ｐＫａ’の計算
各ｐＫ_a値に対応する酸性種及び塩基性種の活量係数（より厳密に言えば活量係数の対数）は、以下の公式に従って算出される。
ｌｏｇｆｉＢａｓｅ＝−Ａ^*（ｑｓｑ［ｉ＋１］）^*ｒｏｏＩ／（１＋０．３３^*（ａａａ［ｉ＋１］＋ｓｈｅｌｌ［ｉ＋１］）^*ｒｏｏｔＩ） 式３．１７ａ
ｌｏｇｆｉＡｃｉｄ＝−Ａ^*（ｑｓｑ［ｉ］）^*ｒｏｏｔＩ／（１＋０．３３^*（ａａａ［ｉ］＋ｓｈｅｌｌ［ｉ］）^*ｒｏｏｔＩ） 式３．１７ｂ
式中、ｒｏｏｔＩはイオン強度の平方根である。数式１から得られるパラメータａは、数量ａａａ［ｊ］＋ｓｈｅｌｌ［ｊ］に相当する。

これらの活量係数からｐＫａｐｒｉｍｅは次式のように算出される。

ｐＫａｐｒｉｍｅ［ｉ］＝ｐＫａＴ＋ｌｏｇｆｉＢａｓｅ−ｌｏｇｆｉＡｃｉｄ 式３．１８
荷電平衡に対する［Ｈ ⁺ ］及び［ＯＨ ^- ］の影響
ｐＨ値が非常に小さいときと非常に大きいときには、荷電平衡に対する［Ｈ⁺］（低ｐＨ値）又は［ＯＨ^-］（高ｐＨ値）の寄与はもはや無視できない。従って、［Ｈ⁺］及び［ＯＨ^-］によるｔｉｔｒａｔｅ＿ｍｏｌの補正を含める可能性をバージョン５．０７以降で実現した。というのは、リン酸塩緩衝液の場合に低ｐＨ範囲（ｐＨが２．５より低い範囲）で計算値と測定値の差が一貫して観測されたからである。これは、２つの項、すなわち［Ｈ⁺］を電気的に中和させる
−１０＾−｛ｐＨ｝／（プロトン段階^*緩衝液体積）と、
［ＯＨ^-］を電気的に中和させる
＋１０＾｛ｐＨ−１４｝／（プロトン段階^*緩衝液体積）
とを加算することによって、緩衝液成分の数に亘るループの終了時に滴定剤のモル量が補正されるように実施された。

計算値と実験値の比較
ここでは合計で３１個の緩衝液系（滴定液と被滴定液の組み合わせ）を報告する。約２１００回の実験を実施し、そのうち８１７は不合格基準のために不合格になっている（第２．３節）。強い酸／塩基と対応する酸／塩基を２つの緩衝液混合物と共に実施した。混合物ではない緩衝液系のリストが図４の表１に示す。Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍ ＆ Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒ（数式１．１０）に従ったデバイ−ヒュッケル公式の解釈と対比すると共に、実験による差と対比した、この方法（プログラムＢｕｆｆａｌｏバージョン６．００）の適用結果の誤差統計も表に示す。表に示されている全ての場合に、［Ｈ⁺］及び［ＯＨ^-］の寄与（第３．１３節）による補正も含まれている。低ｐＨが考慮される場合にのみ、この補正によって精度が著しく向上する。残りの場合には、差を無視することができる。

合格になったデータのうちで、緩衝能（β）の対数（基底１０）が−２よりも大きい結果のみを示す。実験誤差の推定値として、２つの異なるｐＨメータによる同じ緩衝液混合物の２つの測定値から得た二乗平均平方根誤差（ｒ．ｍ．ｓ．ｅ．）（数式２．１）も含められる。

緩衝液混合物
２つの混合物、すなわち、陽イオン交換クロマトグラフィ用の混合物（ｐＨ２．５〜７．２ＣＩＥＸ）と陰イオン交換クロマトグラフィ用の混合物（ｐＨ５．３〜９．５ＡＩＥＸ）を検討した。

０．１Ｍトリスと０．１Ｍビス−トリスを混合することによってＡＩＥＸ混合物（ＡＩＥＸ−ｍｉｘ）を生成した。試験したｐＨ範囲は５．３〜９．５であった。第１のデータセットは単一ｐＨ測定値で構成した。第２のＡＩＥＸデータセットのｒ．ｍ．ｓ．ｅ．は０．０８であり、従ってそのシリーズの１つは不合格となった。

第１のデータセット及び第２のデータセットのうちの合格となったシリーズについての結果として、この方法では、２７個の値のうちの１つが０．１限界の範囲外と考えられる値であり（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．０．０６）、これに対して、Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍ ＆ Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒによるイオン強度補正については、２７個のうち１０個が違反と考えられる値であった（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．０．１０）。

０．０３７５Ｍ Ｎａ２ＨＰＯ４、０．０１２５ギ酸ナトリウム、及び０．０２５Ｍ酢酸ナトリウムを混合することによってＣＩＥＸ混合物（ＣＩＥＸ−ｍｉｘ）を生成した。試験したｐＨ範囲は２．５〜７．２であった。実験ｒ．ｍ．ｓ．ｅ．は０．０２であり、１０４個（ＮｒＯＫ）の考えられる差のうちで０．１よりも大きい値はなかった。ｐＨ計算の結果として、この方法では、１０４個の値のうちの４つが０．１限界の範囲外と考えられる値であり（ｒ．ｍ．ｓ．ｄ．０．０５）、これに対して、Ｇｕｇｇｅｎｈｅｉｍ ＆ Ｓｃｈｉｎｄｌｅｒによるイオン強度補正については、１０２個のうち３６個が違反と考えられる値であった（０．１）。

実施例２
材料／検査ユニット
実施例１と同様。

方法
ｖｉｓｕａｌ Ｃ＋＋コンパイラのバージョン４．２を使用した。

結果
リン酸塩、クエン酸塩、酢酸塩、トリスの緩衝液系について１Ｍ程度の高いイオン強度及び緩衝液濃度での緩衝液ｐＨを正確に算出できるように、プログラム「Ｂｕｆｆａｌｏ Ｐｌｕｓ」をＶｉｓｕａｌ Ｃ＋＋で作成し、Ｗｉｎｄｏｗｓ（登録商標）で動作できるようにした。

プログラムの構造
実施例１と同様であるが１つのモードを追加した。すなわち、このプログラムは、Ｎｅｗｔｏｎ Ｒａｐｈｓｏｎ法を使用してパラメータ（各緩衝液系の様々な荷電種の半径）を同時に最適化するのに使用される第３のモード「パラメータ最適化」で動作することもできる。

一塩基緩衝液と多塩基緩衝液
実施例１と同様。

モード間の差異及び類似性
実施例１と同様であるが、Ｃａｌｃ＿ｐＨモード及びパラメータ最適化モードではｋｍａｘ＝３であった。

滴定剤の選択
実施例１と同様。

イオン強度反復ループ
実施例１と同様。

ｐＫａ値に対するループ、ｐＫａの温度補正、及びｐＫａ’の計算
以下の公式に従って各ｐＫａ値に対応する酸性種及び塩基性種の活量係数（より厳密に言えば活量係数の対数）を算出する。
ｌｏｇｆｉＢａｓｅ＝−Ａ（ｑｓｑ［ｉ＋１］）^*ｒｏｏｔＩ／（１＋０．３３^*ｉｏｎ＿ｒａｄ^*ｒｏｏｔＩ）
ｌｏｇｆｉＡｃｉｄ＝−Ａ（ｑｓｑ［ｉ］）^*ｒｏｏｔＩ／（１＋０．３３^*ｉｏｎ＿ｒａｄ^*ｒｏｏｔＩ）
式中、ｒｏｏｔＩは、イオン強度の平方根である。ｑｓｑ［ｉ］及びｑｓｑ［ｉ＋１］は、それぞれｐＫａ値に対応する酸及び塩基の電荷の二乗である。
ｐＫａＴ＝ｐＫａ［ｉ］＋（ＴＴ−２５）^*ｄｐＫａｄＴ［ｉ］
式中、ＴＴは摂氏単位の温度であり、ｄｐＫａｄＴ［ｉ］は、検討中のｐＫａ値ｐＫａ［ｉ］の温度係数である。
ｐＫａｐｒｉｍｅ［ｉ］＝ｐＫａＴ＋ｌｏｇｆｉＢａｓｅ−ｌｏｇｆｉＡｃｉｄ
平衡式
実施例１と同様。

イオン径パラメータの計算
これは、上述のように各種の半径のイオン強度加重平均として算出される。表２は、リン酸塩、クエン酸塩、及び酢酸塩緩衝液系中の各種の確立されたイオン径パラメータａ_i並びにＮａＣｌの関連するイオン径パラメータａ_iを示している。表２では、荷電種のイオン径パラメータのみが示されており、「イオン径２」は、電荷が最低のイオン種を指す。従って、「イオン径１」は非イオン種を指すが、かかる種の電荷は、零であるため、上述のように総イオン径パラメータａに寄与することはない。酢酸塩は一塩基性酸であるため、単一のａ_i値しか示されていない。上述のように、少なくともいくつかの塩、例えばＮａＣｌのイオン径パラメータａ_iは、表２に示されている緩衝液系によって決まることが判明した。

滴定剤のモル量の計算
実施例１と同様。

荷電平衡に対する［Ｈ ⁺ ］及び［ＯＨ ^- ］の影響
実施例１と同様。

計算値と実験値の比較
図５は、１５５のｐＨ測定値とＢｕｆｆａｌｌｏ Ｐｌｕｓを使用して算出された対応する予測値のプロットを示している。検査した緩衝液系は、リン酸塩、クエン酸塩、及び酢酸塩を含む。

２４０ ミキサ制御ユニット
２５０ 弁
２６０ ポンプ
ａ イオン径パラメータ
ｓ１、ｓ２、ｓ３、ｓ４ 種

Claims (15)

1. 所定のｐＨ及びイオン強度を有する液体混合物を提供するため、緩衝液、酸又は塩基、溶媒及び任意成分としての塩の各々１種以上の相対組成比を求める方法であって、デバイ−ヒュッケルの式を用いて上記相対組成比を求めるに当たり、デバイ−ヒュッケル式におけるイオン径パラメータａを、上記液体混合物のイオン強度に寄与するすべての種の加重平均イオン径として求め、各々の種のイオン強度を重み付けパラメータとして使用する、方法。
2. 前記相対組成比が反復手順を用いて求められる、請求項１記載の方法。
3. 前記反復手順が、
   （ａ）前記相対組成比を求める段階であって、前記液体混合物の所定のイオン強度を各種間の所定の分布に従って各々の種にアドレス指定する、段階、
   （ｂ）前段階で求められた前記相対組成比に基づいて、前記混合物中の各種のイオン強度を算出する段階、
   （ｃ）（ｂ）で算出した前記イオン強度を考慮して新しい１組の相対組成比を求める段階、及び
   （ｄ）所定の収束基準が満たされるまで段階（ｂ）及び（ｃ）を繰り返す段階
   を含んでなる、請求項２記載の方法。
4. 段階（ａ）で、前記液体混合物の前記所定のイオン強度を前記塩種にアドレス指定する、請求項３記載の方法。
5. 前記デバイ−ヒュッケル式の前記イオン径パラメータａが次式で算出される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
   式中、Ｉ_iはイオン強度であり、ａ_iは種ｉのイオン径パラメータであり、Ｉは総イオン強度である。
6. 前記デバイ−ヒュッケル式における前記イオン径パラメータａが次式で近似される、請求項１乃至請求項４のいずれか１項記載の方法。
   ａ＝０．５^*（質量）^1/3＋シェル
   式中、「シェル」は、正に荷電されたイオン種についてはある値に固定され、負に荷電されたイオン種については異なる値に固定され、「シェル」は、正に荷電されたイオン種については３．８〜４．２の範囲内の値に固定され、且つ「シェル」は、負に荷電されたイオン種については０〜０．２の範囲内の値に固定される。
7. 所定のｐＨ及びイオン強度を有する液体混合物を生成する酸又溶媒及び任意成分としての塩のうちの１種以上のそれぞれの成分原液を準備する段階と、
   請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法を使用して混合すべき各成分原液の相対比を求める段階と、
   前記原液を混合する段階と
   を含んでなる方法。
8. 比率を同時に変化させる前記成分原液を組み合わせることによって前記イオン強度を徐々に変化させ、液体流のｐＨ値をほぼ同じ値に維持する、請求項７記載の方法。
9. それぞれ異なる緩衝剤種を含んでなる２種以上の成分原液を準備する、請求項７又は請求項８記載の方法。
10. ２種以上の緩衝剤種を含んでなる成分原液を準備する、請求項７乃至請求項９のいずれか１項記載の方法。
11. 前記緩衝液を請求項７乃至請求項１０のいずれか１項記載のように調製する、ハイスループットスクリーニング法又は液体クロマトグラフィ法。
12. 請求項１乃至請求項６のいずれか１項記載の方法をコンピュータに実行させるためのコンピュータプログラム。
13. 混合液体出口ポートと、緩衝液、酸又は塩基、溶媒及び任意成分としての塩のうちの１種以上のそれぞれの成分供給源に連結された複数の入口ポートとを備える液体ミキサ装置、及び
    前記ミキサ装置の前記入口ポートを通じて供給される相対組成比を制御し、所定のｐＨ及びイオン強度を有する液体混合物を前記出口ポートの所で生成するように構成されたミキサ制御ユニットであって、デバイ−ヒュッケルの式を用いて前記相対組成比を求めるように構成され、前記デバイ−ヒュッケル式におけるイオン径パラメータａが、前記液体混合物の前記イオン強度に寄与するすべての種の加重平均イオン径として求められ、各種の前記イオン強度が重み付けパラメータとして使用されるミキサ制御ユニット
    を備える緩衝液調製装置。
14. 相対的比率の１種以上の前記成分を供給する１以上の制御可能なポンプを備える、請求項１３記載の緩衝液調製装置。
15. 請求項１３又は請求項１４記載の緩衝液調製装置を備える液体クロマトグラフィシステム。