CN102016567B

CN102016567B - 液体混合物的制备

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Publication number: CN102016567B
Application number: CN200980114860.5A
Authority: CN
Inventors: L·比约克斯坦; E·卡雷达诺; G·马尔姆奎斯特; G·罗德里戈; N·斯塔夫斯特伦
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2008-04-21
Filing date: 2009-04-20
Publication date: 2014-05-14
Anticipated expiration: 2029-04-20
Also published as: EP2269055B1; CN102016567A; US20110039712A1; US9446329B2; DK2269055T3; JP5497005B2; EP2269055A4; BRPI0911221B1; WO2009131524A1; ES2374210T3; EP2269055A1; BRPI0911221A2; JP2011518328A; ATE533048T1; BRPI0911221B8

Abstract

一种确定以下各个中的至少一个的相对组分比例、以便提供具有预先限定的pH和离子强度的液体混合物的方法：缓冲剂；酸或碱；溶剂；以及可选的盐，其中，使用德拜-休克尔方程来确定相对组分比例，其中，德拜-休克尔方程中的离子大小参数α确定为对液体混合物的离子强度有贡献的所有物类的加权平均离子大小，且其中，各个物类的离子强度用作加权参数。还可在提供液体混合物的方法中应用本方法。另外，提供了一种缓冲剂制备装置。

Description

液体混合物的制备

技术领域

本发明涉及产生具有受控的pH和离子强度的液体混合物的方法，并且涉及可在这种方法中应用的设备。本发明大体关注需要精确的缓冲剂制备的任何情况。

背景技术

在许多情况下，如当使用具有规定的pH且可选地还具有离子强度的缓冲剂时，获得具有确知的成分的液体是重要的。另外，在许多情况下，液体的成分不仅应当在各个时刻为确知和受控制的，而且还应当以精确且受控的方式随时间而变化。

其中液体的成分极为重要的一种应用是在液相层析中，并且更具体而言，是当通过梯度洗提来执行洗提(即从层析基质中释放隔离的目标分子)时。例如，在离子交换层析(它是用于分离和净化生物分子的常用方法)中，有时使用梯度洗提来(例如)寻找使得能够实现使用逐步洗提的工业过程的设计的最优洗提条件。众所周知，洗提液包含惰性盐，并且通过改变这个盐的浓度来执行梯度。众所周知，盐浓度(即离子强度)的改变还影响pH，并且已经充分记录了洗提液的pH和离子强度是控制离子交换树脂上的蛋白质分离的选择性的两个最重要的参数。

美国专利No.5,112,949(Vukovich)涉及一种用于使用梯度来执行分离的自动化系统。具有逐渐改变的梯度的这种手动和自动化系统的问题在于，如果使梯度浅了，就要花很多时间来执行洗提，而如果使梯度陡了，则代替所关注的各个生物分子依次被洗提，生物分子的洗提会交迭。这会导致若干种类的生物分子被收集在各个部分中，而不是各个物类的生物分子被收集在其本身的单独的部分中。

美国专利7,138,051(DeLamotte)涉及一种用于分离生物分子的层析系统、方法和软件。更具体而言，这个专利涉及从层析柱中洗提的生物分子的分离的优化，在层析柱中，添加到洗提缓冲剂的组分的浓度被改变，以便形成具有浓度逐渐改变的所述添加的组分的洗提缓冲剂溶液。

Okamoto(Hirokazu Okamoto等人，Pharmaceutical Research(药物研究).Vol.14，No.3，1997：Theory and Computer Programs for CalculatingSolution pH，Buffer formula，and Buffer Capacity for MultipleComponent System at a Given ionic strength and Temperature(用于在给定离子强度和温度处计算多组分系统的溶液pH、缓冲剂配方和缓冲容量的理论和计算机程序))描述了用以在给定离子强度和温度处计算溶液pH、缓冲剂配方和缓冲容量的计算机程序。但是，由Okamoto等人制备的缓冲剂溶液显示了随着增加的盐浓度(甚至是在诸如0.3M的低浓度处)而增加的pH变化。因此，Okamoto方法不足以提供也包含盐的具有恒定的pH的缓冲剂溶液。

梯度形成的传统方式涉及小心地制备包括惰性盐以及具有预定的pH的缓冲剂的洗提液，以在恒定的pH处实现离子强度梯度。已经通过改变惰性盐梯度的斜率以及/或者用具有不同的pH的一种缓冲剂系统代替该缓冲剂系统来实现蛋白质的分离的优化。

在早期的现有技术中，优化包括制备具有预定的pH和盐浓度的许多缓冲剂溶液，必须对缓冲剂溶液进行小心的滴定，以使分离可重现。显然，这种方法即耗时又不方便。

在文献中记录了用于在中等离子强度(直至100mM)处计算缓冲剂pH的方法，并且这些方法基于存在于缓冲剂溶液中的各种带电及不带电的物类之间的平衡方程的基于代数或计算机的解决方案。

对于与对应的酸性物类(其分别可为共轭酸BH⁺或酸HA)处于平衡状态的特定的碱性物类(其可为碱B或共轭碱A^-)，平衡方程可写作：

H⁺+碱性物类<＝＝>酸性物类⁺ 方程1.1

对应的平衡常量K_a定义为

K_a＝(H⁺)(碱性物类)/(酸性物类⁺) 方程1.2

其中，括号表示各个物类的活度。对方程1.2的两边取对数，并且在pH定义为-log(H⁺)的情况下进行求解得到

pH＝pKa+log{(碱性物类)/(酸性物类)}方程1.3

这有时称为亨德森-哈塞尔巴赫(Henderson-Hasselbach)方程。将活度而非对应的浓度用于方程1.2中的原因是，由于主要是静电的相互作用，相关的离子倾向于变得与环境屏蔽开。但是，尽管pH度量是对质子的活度的直接观测，例如通过对它们的量和体积进行称重、移液或泵送所观测到的是浓度而非缓冲剂离子的对应的活度。各个离子的活度通过活度系数

与对应的浓度相关

方程1.4

在无限稀释的理想状态下，变为1，并且每个离子的活度变成等于对应的浓度。但是，在真实情况下，离子强度不同于0，并且不同的物类的活度系数变得小于1。

在所谓的德拜-休克尔(Debye-Huckel)理论中，已经发展出了针对这些偏差的良好地确立的模型，已知为：

方程1.5

其中，A是常量，或者是温度依赖参数～-0.51。使用众所周知的数据，可将A的值准确地计算为A＝0.4918+0.0007*T+0.000004*T^2，其中，T是以摄氏度表示的温度。Z是离子的电荷，数量为α，在德拜和休克尔的原始论文中，水合离子的半径(以

表示)描述为“接近(approach)离子的(正的或负的)的平均距离”。

在Kielland的上述文章中呈现的表中，显示了这个参数(也已知为离子大小参数)对于不同的离子物类是不同的。I是离子强度

I = 1 / 2 Σ (C_{i} {Z_{i}}^{2})

(包括所有离子) 方程1.6

C_i是浓度，而Z_i是存在于溶液中的离子的电荷(以电子电荷为单位)。

将方程1.4代入方程1.3中关于浓度而非活度给出了pH：

方程1.7

其中，

方程1.8

是允许使用不同的缓冲剂物类的浓度的可测值的表观(apparent)pK_a值。可通过将方程1.5代入方程1.8中来计算pK_a′的值，将方程1.5代入方程1.8中给出了：

pK_a′＝pK_a+(AZ_a ²I^0.5)/(1+0.33*10⁸a_aI^0.5)-(AZ_b ²I^0.5)/(1+0.33*10⁸a_bI^0.5)方程1.9其中，下标a和b的引入是必要的，以规定分别对应于酸和碱的参数。因此，

Z_a＝酸性物类的电荷

Z_b＝碱性物类的电荷

α_a＝酸性物类的离子大小参数

α_b＝酸性物类的离子大小参数

应用于pH计算，德拜-休克尔理论导致缓冲剂的pK_a值(称为热力学pK_a值)修改成由方程1.9给出的对应的pK_a′值。方程1.9中的大部分参数是直截了当地估计的。最具挑战性的参数是α。

Guggenheim&Schindler(见GuggenheimEA&SchindlerTD.(1934)J.Phys.Chem.(物理化学杂志)33.533)已经提出了对于所有缓冲剂分子使参数α设定近似为

从而导致稍微简化的公式

pK_a′＝pK_a+(AZ_a ²I^0.5)/(1+I^0.5)-(AZ_b ²I^0.5)/(1+I^0.5)方程1.10上面的方程110是在文献中常见的用于离子强度修正的公式。有时将修正项添加到这个方程的右手边，以补偿各种缓冲剂在更高的离子强度处的准确度损失。但是，当离子强度高达1M(这在例如离子交换层析和HIC中的梯度洗提中通常使用的范围内)时，这样做所获得的准确度是较差的。

Kielland(Jacob Kielland，Activity Coefficients of Ions in AqueousSolutions(水溶液中的离子的活度系数)，1937年9月)已经研究了液体中的离子的活度系数，并且提供了离子活度系数的扩展表，考虑了水合离子的直径。使用四个不同的模型来获得Kielland所提供的用于水合离子大小参数a_i的数据：Bonino的模型，其考虑了晶体半径和可塑性；众所周知的方程108a_i＝182z_i/l_∞，其考虑了离子迁移率；Brull对上述方程的经验性修正；以及最后是Ulrich熵不足(entropydeficiency)方法。使用了所述四个模型的圆整平均值来获得那个研究中报导的数据。Kielland提出的a_i值呈现较大的变化(从2.5至多达11)，并且取决于离子的性质基于这个变化对活度系数提出非常规模型，即针对无机离子的一个方程和针对有机离子的一个不同的方程。

US 6,221,250(Stafstróm)涉及一种制备液体混合物的方法，其有利地使用了参数α的上述近似。更具体而言，所公开的制备混合物的方法包括以下组分：(i)一个或多个缓冲物类；(ii)酸或(备选地)碱；(iii)(可选地)盐；以及(iv)溶剂。组分(i)至(iv)的比例以这样的方式伴随性地变化：即，以便考虑液体混合物的pH和离子强度的相互关系，以在各个时刻获得混合物的预先选择的pH，并且该方法基于使用修改的且重复性的Guggenheim-Schindler(1.10，见下文)方程，其中，使用对缓冲剂而言专有的修正因子来沿着梯度获得恒定的pH。因此，在某些情况下，这个方法的一个缺点可为：如果需要引入新的缓冲剂，则需要再次进行计算。

其中必须制备具有受控的pH和离子强度的液体混合物的另一个应用是在高吞吐量(throughput)筛选(HTS)中，HTS是一种用于常用于药物发现但是还与生物和化学领域相关的科学实验的方法。通过结合现代机器人技术、数据处理和控制软件、液体处理装置和敏感的探测器，HTS允许研究者在短时期内有效地进行数百万次的生物化学、基因或药理学测试。通过这个过程，人们可快速地辨识调整特定的生物分子路径的活性化合物、抗体或基因。这些实验的结果可(例如)为药物设计以及为理解生物学中的特定的生物化学过程的相互作用或角色提供起点。

自动化在HTS的有用性方面是重要的元素。专用机器人通常负责单个化验盘的寿命中的许多过程，从产生直到最终分析。HTS机器人通常可同时制备和分析许多盘，从而进一步加速数据收集过程。但是，为了使这些机器人准确地起作用，液体混合物(例如具有精确地受控的pH以及离子强度的缓冲剂)的制备再次是必要的。

在HTS领域内的、正变得越来越有价值的一种应用是高吞吐量过程开发(HTPD)，其中，pH和离子强度的角色在它们控制目标(一个或多个)和污染物(一个或多个)的结合行为时非常重要。通过成功地设计这种高吞吐量过程，可准确地预测关于高的质量转移速率及因此过程经济性以及还有最优的洗提和因而最高的回收的条件。但是，这种成功的设计将需要自动的缓冲剂制备或至少通过自动的缓冲剂制备来获得较大的改进，从而允许在短的时间间隔中准备许多条件，例如pH和I。

精确且良好地受控的缓冲剂制备的另一个需要出现在微型盘和其它实验室设备格式中。基于微型盘和过滤器盘的化验中的许多步骤易于通过使用例如用于处理的多个吸液管和真空块以及用于探测结果的盘阅读器来平行进行。通常不存在对更高水平的自动化-即盘的自动化运送的需要。甚至对于许多“吞吐量应用”这也是有效的，因为首先就已经通过盘结合获得了该多个实验中的因子96或384。但是，存在涉及在盘中缓慢地制备单独的井的情况。虽然专用的小占地面积(footprint)的盘阅读器被想当然地用于探测和分析单独的井，但是对于在一个微型盘中的单独的井中的缓冲剂制备来说，不存在类似的专用的、价格合理的、小占地面积的解决方案。TECAN是已经通过编写软件而使用它们的实验室自动操作平台在微型盘中提供缓冲剂制备来解决该问题的公司。乍一看可能认为这是上等的解决方案，但是其导致为了相对简单的任务而在装备优良的自动化实验室中占用昂贵的自动化基础设施达若干个小时。此外，为了使小型实验室从TECAN解决方案中获益，需要巨大的投资。

因此，还存在对这样的自动分配装置-例如独立单元的需要：其可与自动化解决方案一起用作工作站，例如以减少主要自动化基础设施中的工作量。

发明简述

本发明的一方面是提供一种精确且准确地控制液体混合物的pH和离子强度的方法。简要而言，这可通过提供一种制备诸如缓冲剂的液体混合物的方法来实现，该方法考虑了有机离子以及无机离子的大小和电荷两者。这可如所附的权利要求中的一个或多个所限定的那样来实现。

本发明的另一个目标是提供一种改进的缓冲剂制备方法，其中，首先计算确切的成分，并且随后在单个步骤中制备缓冲剂。

本发明的一个具体的方面是提供用于缓冲剂制备的工具，其中，通过计算缓冲容量，存在各个相应的缓冲剂的有保证的pH范围。

本发明的另一方面是提供一种基于期望的pH和/或离子强度和缓冲容量根据缓冲剂物类、缓冲剂浓度和/或盐浓度来限定液体混合物的成分的方法。因此，从液体混合物的期望的pH并且可选地还有期望的离子强度和缓冲容量开始，本发明将限定适当的缓冲剂物类以及缓冲剂和盐浓度的适当的值，以获得所述pH和离子强度以及缓冲容量。

最后，本发明的另一方面是在自动分配装置中使用本缓冲剂限定方法来在微型盘和其它实验室设备中智能地制备缓冲剂。这可通过引入基于上述的模型的软件来实现。在一个具体方面中，该装置包括用于自动化的接口。

根据后面的详细描述和权利要求书，本发明的另外的方面和优点将显现出来。

定义

在本文，“缓冲剂”的意思是不管是否添加了大量的酸和/或碱都在液体溶液中保持几乎恒定的pH值的组分或化合物。在本文中，用语“计算机程序”与用语“软件”可互换地使用。

附图说明

图4公开了表1，表1显示了三种不同方法的实验pH值之间以及计算pH值和实验pH值之间的均方根差异。

发明详述

在第一方面，本发明涉及一种确定以下各个中的至少一个的相对组分比例、以便提供具有预先限定的pH和离子强度的液体混合物的方法：

缓冲剂；

酸或碱；

溶剂；以及可选地

盐，

其中，使用德拜-休克尔方程来确定相对组分比例，其中，德拜-休克尔方程中的离子大小参数a确定为对液体混合物的离子强度有贡献(即起作用)的所有物类的加权平均离子大小，且其中，各个物类的离子强度用作加权参数。

因此，提供了可应用于包括有机缓冲剂物类和无机物类的液体混合物的一般方法。如上所述，这种缓冲的液体混合物广泛用于许多化学和生物领域中。本方法允许相对组分比例的改进的预计(确定)，以便实现具有预先限定的pH和离子强度的液体混合物(尤其是在高的缓冲剂和/或盐浓度处)，这得到了以下的实验结果的支持。还应当注意到，可以以相反的方式使用本方法，以确定具有特定组成的液体混合物的所得到的pH和离子强度。

如上所述，广泛地使用德拜-休克尔方程的不同的近似解，以便确定缓冲剂溶液等的相对组分比例，但是到目前为止它们都在较高的缓冲剂和/或盐浓度处提供较差的精度。提出的方法通过将离子大小参数α确定为对液体混合物的离子强度有贡献的所有物类的加权平均离子大小来克服了这些问题，且其中，各个物类的离子强度用作加权参数。

根据一个实施例，液体混合物的离子大小参数α计算为

a = \frac{Σ I_{i} a_{i}}{I}

方程1.11

其中，Ii是离子强度，而a_i是物类i的离子大小参数，而I是上面的方程1.6中定义的总的离子强度。从所述方程开始，然后：

I_{i} = \frac{1}{2} {Z_{i}^{2} C}_{i}

方程1.12

物类i的离子大小参数a_i是通过实验建立的值或通过实验近似的值，并且一些缓冲剂和盐的a_i值的实例在实例2的表2中列出。

贯穿本公开，用语“物类”覆盖了对液体混合物的离子强度有贡献的任何和所有离子或分子，并且更具体而言，一个组分，例如，诸如弱酸的缓冲剂系统，可对应于两个或更多个具有不同电荷的物类，各个具有相关联的a_i值。由于在具体环境中a_i与“离子大小”相关，已经发现，一个具体物类的a_i值对于组分(例如缓冲剂、盐等)的不同组合可为不同的。例如，已经发现，与醋酸盐缓冲剂相比，当与磷酸盐缓冲剂混合时，NaCl的a_i值不同，如下面的表2中所示。但是，已经发现，使用本方法，对于被测的组分组合，a_i值在宽的pH和离子强度的范围上均有效，从而导致本质上在整个范围上的改进的可预测性。实例2的图5显示了基于以上方法制备的大量的缓冲剂样本的计算的pHvs测得的pH的图示。根据这个图，显而易见的是，所公开的方法能够在很宽的pH范围上限定相关的相对组分比例。

根据一个实施例，已经进一步发现，德拜-休克尔方程中的离子大小参数α可近似为

a＝0.5*(mass)^1/3+shell 方程1.13

其中，α的确定需要较少的处理容量。在这个方程中，项“shell(外层)”可通过另外的层来激发，另外的层可认为是离子的“水合层”。关于这个实施例，已经发现，如果“shell”设定在具体的、固定的值处，则德拜-休克尔方程中的称为“常量”的项等于0.5，如例如在图4中呈现的表1中所显现的那样。

因此，在一个实施例中，对于带正电荷的离子物类，“shell”固定在一个具体值处，而对于带负电荷的离子物类，“shell”固定在另一个不同的值处。在一个实施例中，对于带正电荷的离子物类(shellpos＝4)，“shell”在3.8-4.2的范围中，例如3.9-4.1或4。在另一个具体实施例中，对于带负电荷的离子物类(shellneg＝0)，“shell”在0-0.2的范围中，例如0-0.1或0。

与诸如上述Okamoto的现有技术方法相比，本发明的一个优点是，本发明使得不仅能够在低的盐浓度处而且还能够在更高的盐浓度(例如高于1M，高于2M或甚至高于5M)处制备液体混合物，例如缓冲剂。

因此，在一个具体实施例中，本发明是一种提供诸如缓冲剂的液体混合物的方法，其中，盐浓度直至1M，特别是在1-2M的范围中，或更特别地高于2M。

根据一个实施例，使用迭代过程来确定相对组分比例。

根据一个具体实施例，如果1示意性地显示，迭代过程包括：

(a)确定10相对组分比例，其中，液体混合物的预先限定的离子强度根据物类之间的预先限定的分布针对这些物类来分配(address)20；

(b)基于在前述步骤中确定的相对组分比例，计算30混合物中的各个物类的离子强度；

(c)确定40新的一组相对组分比例；考虑在(b)中计算的离子强度，以及

(d)重复步骤(b)和(c)，直到满足50预定的收敛标准。

在步骤(a)中，液体混合物的预先限定的离子强度在物类之间的分配预先限定，以便实现迭代过程的适当的起始点，以便实现快速收敛，以及避免假收敛。根据一个实施例，液体混合物的预先限定的离子强度针对盐物类来分配，因为盐物类通常是对包括盐组分的缓冲剂的总的离子强度的主要贡献者。对于不具有任何盐组分的液体混合物，分配液体混合物的预先限定的离子强度。

在步骤(b)中，使用在前述步骤(即第一次迭代中的步骤(a)和随后的迭代中的步骤(c))中确定的相对组分比例来计算混合物中的各个物类的离子强度。因此，使用如相对组分比例所限定的各个物类的浓度来计算更准确的离子强度分布，该离子强度分布随后用来确定更准确的相对组分比例(步骤(c))等等，直到收敛为止。

预定的收敛标准可选择为确保以合理的计算工作量将相对组分比例限定成具有足够的精度的任何适合的标准。根据一个实施例，当最后一组相对组分比例和紧接在前面的步骤中发现的组之间的偏差不超过预先限定的最大水平时，收敛标准可选择为迭代步骤，然后在以给定的盐浓度产生具有选定的pH的混合物时保留这个最后一组相对组分比例。在备选实施例中，收敛标准可(例如)选择为固定数量的迭代或其它适合的关系。在一个具体实施例中，以上过程迭代不到10次，优选地不到8次，更优选地4-6次，例如5次。

根据图2中示意性地显示的一个实施例，可在用于提供具有预先限定的pH和离子强度70的液体混合物的方法中使用确定液体混合物的相对组分比例的方法，该方法包括：

提供80以下各个中的至少一个的组分储备溶液：

缓冲剂；

酸或碱；

溶剂；以及可选地

盐，

使用上述方法来确定90待混合的各个组分储备溶液的相对比例，混合100储备溶液。

在备选实施例中，可用所述组分的固相储备源来代替一个或多个组分储备溶液，由此，在混合组分之后，溶解相对比例的固相。

通过这个方法，响应于预先限定的pH和离子强度，可以以高的精度来制备大范围的缓冲剂溶液或其它液体混合物。

根据一个实施例，该方法可用来制备这样的液体混合物：其中，通过组合伴随性地变化的比例的组分储备溶液，离子强度随时间(即随体积)而逐渐改变，且其中，液体流的pH值可保持基本相同。如果需要，可制备具有pH梯度或甚至pH梯度与离子强度梯度的组合的液体混合物。

本发明可用来确定诸如包括两个或多个缓冲物类的缓冲剂(通常称为多缓冲剂物类液体)的液体混合物的相对组分比例。因此，在一个实施例中，本发明是如以上所论述的方法，其中，制备了两种或更多种储备溶液，该储备溶液包括不同的缓冲物类。在一个备选实施例中，提供了包括至少两种(例如三种、四种或更多)缓冲物类的储备溶液。

在一个实施例中，确定相对组分比例的本方法可称为用于缓冲剂限定的方法，其限定选自由获得具有期望的pH值和/或期望的离子强度和缓冲容量的缓冲剂所需要的缓冲剂物类、缓冲剂浓度以及盐浓度组成的组的参数中的一个或多个。在一个实施例中，在一个具体时间点处获得缓冲剂限定。在一个备选实施例中，以连续过程在线获得本缓冲剂限定。缓冲剂限定的方法可包括上面在制备液体混合物的背景中论述的元素中的一个或多个。

如上所述，使用本方法制备的液体混合物可为缓冲剂，其可用于诸如高吞吐量筛选应用的各种应用中及应用于层析中。在层析中，根据本方法制备的液体有利地是洗提液，其相应地将包括逐渐改变的离子强度(也称为盐梯度)。这种梯度可逐渐增大或减小。

在另一方面，本发明涉及能够执行上述计算的计算机程序。

根据一个具体实施例，提供了一种用于确定以下各个中的至少一个的相对组分比例、以便根据确定相对组分比例的以上方法来提供具有预先限定的pH和离子强度的液体混合物的计算机程序：

缓冲剂；

酸或碱；

溶剂；以及可选地

盐，

其中，将确定的组分混合比例显示给用户，以进行评价，以及/或者使用该确定的组分混合比例来控制液体混合器装置。

可在诸如磁盘或记忆棒(stick)的存储器装置上提供的或者作为控制装置的一部分提供的、根据本发明的计算机程序，对于以自动化的方式制备具有受控的pH和离子强度的液体混合物(优选液体流)来说是有用的。

在根据上面所述的、确定相对组分比例以提供具有预先限定的pH和离子强度的液体混合物的方法的基于计算机的实现的一个实施例中，各个物类的离子大小参数α_i存储在可访问的数据库、表等中，以在计算中使用。这种表的一个实例参照实例2在表2中显示。

在一个具体实施例中，计算机程序可在设计模式中运行，这意味着程序将计算接收物(即滴定剂、滴定剂、水和盐的量)，以获得具有给定的pH和离子强度(或者盐浓度而非离子强度)的溶液。在一个备选实施例中，计算机程序可在pH计算模式中运行，这意味着程序将计算在混合一定量的缓冲剂组分时获得的pH和离子强度。

在图3中示意性地显示的第三方面中，提供了一种缓冲剂制备装置190，包括：

液体混合器装置200，包括混合液体出口端口210，以及连接到以下各个中的至少一个的组分源230上的多个入口端口220：

缓冲剂；

酸或碱；

溶剂；以及可选地

盐，

混合器控制单元240，其布置成以便控制通过混合器装置的入口端口供应的相对组分比例，从而在出口端口提供具有预先限定的pH和离子强度的液体混合物，混合器控制单元布置成以便使用德拜-休克尔方程来确定相对组分比例，其中，德拜-休克尔方程中的离子大小参数a确定为对液体混合物的离子强度有贡献的所有物类的加权平均离子大小，其中，各个物类的离子强度用作加权参数。

根据一个实施例，缓冲剂制备装置包括一个或多个可控阀250、泵260等，以对混合器装置提供相关联的组分的相对比例。在所公开的实施例中，阀250和泵260示意性地显示为结合在液体混合器装置中，但是备选地，它们可作为分开的构件来提供。

根据一个实施例，缓冲剂制备装置结合成液相层析系统的一部分。因此，缓冲剂制备装置有利地用于层析中，如上述美国专利6,221,250中详细论述的那样，该专利由此通过引用而包括在本文中。

在一个具体实施例中，缓冲剂制备装置包括多端口入口阀，例如4入口快速开关阀；用于缓冲剂滴定的机构；实际缓冲剂混合率的显示器；用于独立于离子强度和温度而保持pH的机构；用于缓冲容量的自动检查的机构。四元(quaternary)阀将打开一个端口较短的时间，且然后打开下一个端口等等。不同的储备溶液体积段(segment)将在混合器中完全混合，以形成所选择的缓冲剂。打开时间由算法控制，以获得正确的pH。

缓冲剂滴定可用对应的酸/碱或强酸/碱两者来完成。实际缓冲剂混合率可通过软件(例如UNICORN(GE医疗)的修正版)显示和/或控制。独立于离子强度和温度获得制备好的溶液的稳定的pH。可存在缓冲容量的自动检查。可在方法中设定缓冲剂浓度和pH。

在又一方面，提供了提供流体流的机器人操作的液体处理器，其中，在改变离子强度时，pH保持基本相同。根据这个实施例的机器人操作的液体处理器可用于(例如)在高吞吐量筛选过程中控制缓冲剂成分；用于质量控制；用于DNA定量和归一化；用于PCR中等。在一个有利的实施例中，机器人操作的本处理器组成允许在96井格式中进行完全自动化的缓冲剂制备的系统的一部分，以实现高吞吐量过程开发。在这种系统中，根据本发明的计算机程序以容易引入到机器人装置中的格式提供输出设计。

最后，本发明还涉及在自动分配装置中使用上述确定相对组分比例的方法，以在(例如)微型盘或其它格式中以及可能在其它实验室设备中进行智能缓冲剂制备。根据本发明的方法的一个优点在于在高达1M或更高的离子强度值处的pH预测的精确性。在一个实施例中，该方法尤其适用于具有带正电荷的缓冲剂离子的缓冲剂系统。根据本发明的独立的缓冲剂制备装置可用于涉及化学、生物、生物化学、用于类似于高吞吐量过程开发的应用的医学研究和开发、用于晶化条件的筛选、用于结合条件的筛选等的任何实验室，以及大体用于需要以μl-ml尺度平行地进行的缓冲剂制备的任何应用中。取决于所包括的软件，该装置也可针对需要相同的单元操作的其它应用容易地进行定制。

附图详述

图4是显示了三种不同的方法的实验pH值之间和计算pH值与实验pH值之间的均方根差异的表。这些方法在离子强度的pKa值的类型修正方面是不同的：根据Guggenheim&Schindler方程1.10的修正和根据这个方法的方程1.9与方程1.11的修正。括号中的数字给出了大于0.1pH单位的差异的数量。还以pH单位给出了均方根差异(r.m.s.d)值。N_OK是每pH单位具有处于或高于0.01摩尔的强酸/碱的缓冲容量(logβ＞-2)的实验的数量。呈灰色的Shell的值没有影响。

图2公开了通过四入口快速开关阀进行的、根据本发明的缓冲剂制备的一个具体实施例。缓冲剂滴定可与对应的酸/碱或强酸/碱两者一起进行。实际的缓冲剂混合率通过软件显示，在这种情况下，软件为UNICORN(GE医疗)的特别修改版本。独立于离子强度和温度来获得制备好的溶液的稳定的pH。存在缓冲容量的自动检查。缓冲剂浓度和pH可在方法中设定。四元阀将打开一个端口较短的时间，然后打开下一个端口等。不同的储备溶液体积段将在混合器中完全混合，以形成所选择的缓冲剂。打开时间由算法控制，以获得正确的pH。在运行期间使用的实际比例在UNICORN中的System Control(系统控制器)中以及Evalution(评价系统)中显示为曲线圆锥(Conc)Q1至Q4中的百分比。

实验部分

仅出于说明性目的给出了下面的实例，并且它们不应当被理解为限制所附的权利要求书限定的本发明。

实例1-软件开发

材料/研究的单元

所有编程都在具有奔腾4处理器和windows XP操作系统的个人计算机中进行。

方法

在开发工作的第一部分中，使用了Borland′s C++Builder的版本5，并且使用了Visual C++编译器的较后来的4.2版本。

接受标准

在这个实验的开始，决定该方法应当以0.2pH单位的精度给出正确的pH。因为所使用的泵和阀系统的规格是0.5％，并且正常的储备浓度将是0.2M，在给定的为0.01的最小缓冲容量(见下文)的情况下，约0.1将对应于比例的精度，而0.1对应于算法的精度。在缓冲容量定义为|dn/dpH|时，得到最小的缓冲容量，其中，dn是在pH中引起(小)变化dpH的强酸/碱的量(以摩尔为单位)的(小)变化。通过与缓冲剂溶液的实验pH度量比较来估计算法的精度。在试验阶段的开始时估计吸液误差，并且同与实验pH确定(数据未显示)相关的其它误差相比，可认为吸液误差很小。因此，通过使用具有不同类型的电极的两个不同的pH仪表来测量各个缓冲剂样本的pH来估计实验误差，不同类型的电极导致了两个不同的pH值(在本文中表示为pHExp和pHExp1)。根据以下公式计算各个实验序列(数据集)的均方根差(r.m.s.e.)

r.m.s.e.＝Sqrt(∑(pHExp-pHExp1)²/N_OK)方程2.1

其中，获得对应的缓冲容量大于0.01的情况下的那些pH值的和，且其中，N_OK是这种情况(仅考虑其缓冲容量(β)的对数(底为10)大于-2的情况的结果)的数量。如果发现r.m.s.e.大于0.05pH单位，则拒绝数据集(对应于一个pH仪表)中的至少一半，在这种情况下，与文献中发现的缓冲常量(pKa和pKa的温度依赖)的已确定的值更相符的数据集保持和用于离子强度补偿参数的优化。在存在与来自文献的缓冲剂常量的已确定的值相符的另一个数据集的情况下，甚至可拒绝数据集中相符的一半。通过实验获得作为缓冲容量的更低的限值的值0.01(log-2.0)，因为观测到在这个限值以下，对于大多数缓冲剂系统(数据未显示)，r.m.s.e.增加超过0.05。作为比较，在上述美国专利6,221,250(Stafstróm)中使用的对应的值是0.0063(log-2.2)。在文献中未发现对“通常接受的值”的引用。

结果

程序“Buffalo”以Visual C++编写，并且可在Windows中运行，以在高达1M的离子强度处准确计算缓冲剂pH。

程序的结构

可在两种模式中运行程序“Buffalo”：设计模式和计算_pH模式。设计模式用于实验的设计和理论滴定曲线的计算，可在实验的设计之前使用理论滴定曲线，以便确定适当的pH范围。计算_pH模式用于在给定一组成对的pH度量的情况下进行参数优化。两种模式中的程序的输入是缓冲剂体积(buff_vol)、温度(TT)、缓冲剂浓度(buff_conc)、盐浓度(salt_conc)、缓冲物质(buff_choice)和滴定物质(titrate_choice)。除此之外，在设计模式中，需要期望的pH(pH)作为输入，而在计算_pH模式中，需要实验pH(pHExp)、对应的复制(pHExp1)和用于实验中的滴定剂的摩尔数量(滴定_摩尔_实验)。此外，在两种模式中，可行的是考虑一定数量(n_buffs＝1，2或3)的缓冲剂buff_choice(1)、buff_choice(2)、buff_choice(3)的混合，而非由单种缓冲物质组成的缓冲剂(已经针对最大数量的三种缓冲物质实现了该程序，但是该程序可容易地修改成包括更多种缓冲物质)。在这种情况下，对应的缓冲剂浓度应当提供为buff_conc(1)，buff_conc(2)，buff_conc(3)。

一元缓冲剂vs多元缓冲剂

可用亨德森-哈塞尔巴赫方程(方程1.3或方程1.7)来预测一元缓冲剂的pH。

碱物类和酸物类的浓度通过缓冲剂浓度和滴定剂浓度确定。在给定这些和一元缓冲剂的pKa的情况下，可获得(对应于计算pH模式)pH，或者，在给定期望pH和缓冲剂浓度的情况下，可获得滴定剂的摩尔量(对应于设计模式)。当许多使用的缓冲剂是多元的时候，即它们的缓冲剂分子可接受和释放对应于不止一个pKa值的不止一个质子时，可引起复杂化。这种缓冲剂系统中的物类的数量始终比pKa值的数量(nr_of_pKa)大一。为了简化程序的实现，实现了三托品(tritropic)缓冲剂的一般模型(甚至更多个pKa值的扩展应当是直接的，但并非不重要的，并且必须实现)。定义了四种质子化状态或物类(s1、s2、s3和s4)，但是参数nr_of_pKa(其可为1、2或3)限制了计算，使得对于例如一元缓冲剂，s1对应于酸性物类，s2对应于碱性物类，而s3和s4的浓度设定为0。

两种模式之间的差异和相似性

两种模式使用实质上相同的方法来工作-即，求解在给定缓冲剂浓度处获得给定的pH需要的滴定剂的摩尔量。在这样做之前，需要求解可能的数量的质子化状态(或物类)中的各个中的缓冲剂的摩尔量。模式之间的差异在于，在设计模式中，过程仅进行两次(kmax＝2)：一次针对期望的pH，而另一次针对pH+pH_step(见下文)，以便在数字上估计缓冲容量。然后，针对期望的pH获得的滴定剂的摩尔量是设计模式的输出。另一方面，在计算pH模式中，在整个pH尺度上重复该过程(1-13，kmax＝2600)，产生与实验中使用的滴定剂的摩尔量最一致的滴定剂的摩尔量的pH值是计算的pH值。pH_step(0.005)限制了pH和缓冲容量计算的精度。发现有利的是在两种模式中使用相同的算法，因为这样会使误差和不必要的差异最小化。

平衡方程

各个质子化物类中的摩尔量的计算等于利用具有多一个和/或少一个质子的“相邻”的物类且利用氢原子浓度(pH)来求解各个物类的平衡方程。换句话说，直接从方程1.7推导出三个方程(对应于三个pKa值)

xx[i]＝10^(pH-pKaprime[i])方程3.1

其中，各个i对应于各个pKa(i)值(i＝1，2，3)，而xx[i]是对应的碱和对应的酸的浓度之间的比例，即，xx[1]＝[s2]/[s1]，xx[2]＝[s3]/[s2]，xx[3]＝[s4]/[s3]。

除了这三个方程之外，因为质量守恒而产生方程式：

[s1]+[s2]+[s3]+[s4]＝buff_conc 方程3.2

且因为电荷守恒而产生方程式

[H⁺]-[OH^-]+∑spec_chrg(s_i)-titrant_charge*[titrant]-

spec_chrg(start_species)*[start_species]＝0方程3.3

通过起始物类(start species)来表示在混合前的缓冲物质的物类，即在罐或储备溶液中的缓冲剂的质子化状态。这个质子化状态通过每个缓冲剂分子的抗衡离子的量确定，因为宏观目标，罐或储备溶液必须是电中性的。[OH^-]前面的负号是由于OH离子的电荷的负号的原因，而两个最后项前面的负号分别是由于滴定剂和起始物类的抗衡离子的电荷的原因。

最后，水离解平衡方程

[OH^-][H⁺]＝10^-14方程3.4

方程3.1-3.4意味着，对于3个pKa值的情况，存在具有六个未知数(四个[si]、[OH^-]和[H⁺])的六个方程。在这里实现求解的方式中，假设pH为已知，之后是[H⁺]，并且通过方程3.4配平[OH^-]，并且作为代替，将求解的是滴定剂浓度。五个剩下的方程对应于五个未知数(四个[si]和[titrant])。

滴定剂的摩尔量的计算

一旦已知在平衡状态下的各个物类[si]的浓度，就可使用方程3.3来求解滴定剂浓度。取决于滴定剂的类型，存在要考虑强酸/碱和对应的酸/碱的两种情况。但是，不管是哪种情况下，在方程3.3中求解滴定剂浓度得到

[titrant]＝(-[H⁺]+[OH^-]-∑spec_chrg(s_i)*[s_i]+

spec_chrg(start_species)*[start_species])/proton_step方程3.10其中

proton_step＝-titrant_charge(强酸/碱)方程3.11a或

proton_step＝spec_charge(start_species)-titrant_charge(对应的酸/碱)方程3.11b

换句话说，对于HCl，参数proton_step为-1，而对于NaOH，为+1，在弱酸或碱滴定剂的情况下，滴定剂的proton_step根据方程3.11b或下面的等价方程而取决于缓冲剂的起始物类：

proton_step＝titr_species-start_species 方程3.12

这个过程重复许多次，只要存在缓冲剂组分，并且最终的titrate_mol是来自各个组分的滴定剂的摩尔量的和(见下文)。

在大多数情况下(pH在约3.5和10.5之间)，[H⁺](在低pH值处)或[OH^-](在高pH值处)对电荷平衡的贡献可忽略，并且可在方程3.10中设定为零。

滴定剂的选择

滴定剂可为强性的(HCl或NaOH)。这两者之间的唯一差别是它们贡献的质子的数量的标号。另外，滴定剂可为弱性的，在这种情况下，应当提供滴定剂质子化状态(在罐或储备溶液中)。或者，可给出酸性质子的数量。这两者之间的关系是

titr_species＝Nr_of_pKa+1-Nr_of_Acidic_Protons 方程3.13

离子强度迭代循环

当根据所有离子的浓度计算离子强度时，必须在准确计算离子强度之前知道这些浓度。但是，这些浓度本身是来自平衡方程的解的输出，平衡方程需要pKaprime[i]，并且pKaprime[i]又是根据pKa(所谓的在25℃和0离子强度处的热力学pKa值)、温度和离子强度来计算的。因此，必须执行迭代过程。在这种过程的第一阶段，仅将离子强度设定成等于盐浓度。在第二个迭代步骤中，使用了从第一次循环获得的离子强度，等等。发现这个过程非常迅速地收敛。例如，发现五次迭代就远远不止足以获得期望精度(数据未显示)。因此，对于所有情况，迭代数量设定为5。

在离子强度的计算中的分开的电荷

发现在计算具有不只一个电荷且其中电荷被良好地分开(如在电荷之间具有4个和5个碳原子的柠檬酸盐离子的情况下那样)的离子的离子强度时，获得了好得多的精度(如果将电荷看作分开的而非单个点电荷的话)。这导致标记变量separate_charge的引入，对于柠檬酸盐，separate_charge设定为真，而对于所考虑的所有其它缓冲剂，separate_charge设定为假。

对缓冲剂组分的数量、缓冲剂参数的循环

对于各个缓冲剂物类，需要以下参数。缓冲物质的质量(Mbuff)，pKa值的数量(No of_pKa)、pKa值(pKa[i])、各个pKa值对温度的依赖的值(dpKadT[i])，最基本的形式的电荷(be)以及罐或储备溶液中的缓冲剂质子化状态(start_species)。或者，可给出酸性质子的数量。这两者之间的关系是

start species＝Nr of pKa+1-Nr of Acidic Protons 方程3.14

除了这些之外，还需要离子强度修正参数(konst，shellpos andshellneg)。

滴定剂的总摩尔数(titrate_mol)等于各个缓冲剂组分所需的滴定剂的摩尔数的和，以便在期望的pH处建立平衡，而且，使用这个循环来计算这个和。在循环期间计算的其它和是各个缓冲剂组分的抗衡离子的数量，以及还有在平衡状态下的各个组分对离子强度的贡献。对不同的质子化状态的循环、pKa的温度修正

对于各个质子化状态，计算了以下中的各个：电荷(spec_chrg[j])、电荷的平方(qsq[j])、外层(shell[j])、常量(konst[j])和温度修正后的pKa值(pKaT[j])。后者根据以下公式计算

pKaT＝pKa[i]+(TT-25)*dpKadT[i]方程3.15

其中，TT是以摄氏度为单位的温度。还计算了仅依赖于质量的离子大小参数α的部分aaa[i](我们可称之为非水合半径aaa[i])

aaa[i]＝konst[i]*(Mbuff)^1/3方程3.16

对pKa值的循环、pKa′的计算

根据以下公式计算对应于各个pKa值的酸性和碱性物类的活度系数(或更确切地讲，它们的对数)。

logfiBase＝-A*(qsq[i+1])*rool/(1+0.33*(aaa[i+1]+shell[i+1])*rootI)

方程3.17a

logfiAcid＝-A*(qsq[i])*rootI/(1+0.33*(aaa[i]+shell[i])*rootI)

方程3.17b

其中，root1是离子强度的平方根。方程1的参数α对应于数量aaa[j]+shell[j]。

根据这些活度系数，pKaprimes计算为

pKaprime[i]＝pKaT+logfiBase-logfiAcid 方程3.18

[H⁺]和[OH^-]对电荷平衡的影响

在非常低和非常高的pH值处，[H⁺](在低pH值处)或[OH^-](在高pH值处)对电荷平衡的贡献不再是可忽略的。因此，由于[H⁺]和[OH^-]的原因而包括对titrate_mol的修正的可行性在版本5.07和以后的版本中实现，尤其当对于低pH范围(低于2.5)中的磷酸盐缓冲剂，始终观测到计算值和测得值之间的差异时。这实现成使得通过添加两项来在对缓冲剂组分的数量循环结束时修正滴定剂的摩尔量：用以电中和[H+]的

-10^-{pH}/(proton_step*buff_vol)

和用以电中和[OH^-]的

+10^{pH-14}/(proton_step*buff_vol)

计算值与实验值的比较

这里记录了总共31个缓冲剂系统(标准滴定剂和tirant(滴定剂)的组合)。已经执行了约2100个实验，其中817个由于拒绝标准(2.3节)的原因而被拒绝。已经执行了强酸/碱以及对应的酸/碱滴定以及两种缓冲剂混合。在图4表1中记录了不是混合物的缓冲剂系统的列表。与根据Guggenheim&Schindler(方程1.10)的德拜-休克尔公式解释相比以及还有与实验差异相比，在表中还呈现了应用这个方法(程序Buffalo版本6.00)的结果的误差统计。在表中显示的所有情况下，已经包括了由于[H⁺]和[OH^-]的贡献(节3.13)而作出的修正。仅在考虑低pH的情况下，这个修正才产生精度的较大改进。在剩余的情况下，差异是可忽略的。

仅呈现了非拒绝数据中的缓冲容量(β)的对数(底为10)大于-2的结果。作为实验误差的估计，还包括来自根据两个不同的pH仪表的相同的缓冲剂混合物的两个度量的均方根差(r.m.s.e.)(方程2.1)。

缓冲剂混合物

考虑了两种混合物。用于阳离子交换层析(pH 2.5-7.2CIEX)的混合物和用于阴离子交换层析(pH 5.3-9.5AIEX)的混合物。

AIEX混合物(AIEX-mix)通过混合0.1M Tris和0.1M Bis-Tris制成。被测的pH范围是5.3-9.5。第一数据集组成单个pH度量。第二AIEX数据集的r.m.s.e.是0.08，所以它的序列中的(不止)一个被拒绝。

对于这个方法，第一数据集和第二数据集的非拒绝序列的结果是27个可能的值中有1个在0.1限值(r.m.s.e.0.06)之外，与此相比，关于由于Guggenheim&Schindler(r.m.s.e.0.10)的原因而获得的离子强度修正，27个中有10个可能偏出。

CIEX混合物(CIEX-mix)通过混合0.0375M Na2HPO4、0.0125Na-FORMATE和0.025M Na-ACETATE来制成。被测的pH范围是2.5-7.2。实验r.m.s.e是0.02，104个中有0个可能的(NrOK)大于0.1的差异。对于这个方法，pH计算的结果是104个中有4个可能在0.1限值以外的值(r.m.s.e.0.05)，与此相比，对于由于Guggenheim&Schindler(0.1)的原因而获得的离子强度修正，102个中有36个可能偏出。

实例2

材料/研究的单元

如实例1中的那样。

方法

使用了visual C++的版本4.2。

结果

程序″Buffalo+″以Visual C++编写，并且可在Windows中运行，以在高达1M(对于以下缓冲剂系统：磷酸盐、柠檬酸盐、醋酸盐和缓冲生理盐水(Tris))的离子强度和缓冲剂浓度处准确计算缓冲剂pH。

程序结构

如实例1那样，还有一个补充：该程序还可在第三种模式“优化参数”中运行，第三种模式用来使用牛顿-拉夫逊(Newton Raphson)方法来同时优化参数(各个缓冲剂系统的带不同电荷的物类的半径)。

一元缓冲剂vs多元缓冲剂

如实例1中的那样。

模式之间的差异和相似性

如实例1那样，但是计算_pH模式和优化参数模式kmax＝3。

滴定剂的选择

如实例1中的那样。

离子强度迭代循环

如实例1中的那样。

对缓冲剂组分的数量、缓冲剂参数的循环

如实例1中的那样。

对pKa值的循环、pKa的温度修正和pKa′的计算

根据以下公式，计算对应于各个pKa值的酸性物类和碱性物类的活度系数(或更确切地讲是它们的对数)

logfiBase＝-A(qsq[i+1])*rootI/(1+0.33*ion_rad*rootI)

logfiAcid＝-A(qsq[i])*rootI/(1+0.33*ion_rad*rootI)

其中，rootI是离子强度的平方根。qsq[i]和qsq[i+1]是分别对应于pKa值的酸和碱的电荷的平方。

pKaT＝pKa[i]+(TT-25)*dpKadT[i]

其中，TT是以摄氏度为单位的温度，而dpKadT[i]是在考虑pKa[i]的情况下pKa值的温度系数。

pKaprime[i]＝pKaT+logfiBase-logfiAcid。

平衡方程

如实例1中的那样。

离子大小参数的计算

如所描述的那样，这个计算为各个物类的半径的离子强度加权平均。表2显示了磷酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐缓冲剂系统中的物类的确立的离子大小参数a_i，以及NaCl的相关联的离子大小参数a_i。在表2中，仅列出了带电荷的物类的离子大小参数，并且“离子大小2”指的是最低电荷的离子物类。因此，“离子大小1”将指的是非离子物类，但是因为这样的物类的电荷为零，它们不对总的离子大小参数α有贡献，如上所述。因为醋酸盐是一元酸，所以仅列出了一个单个a_i值。如上所述，已经发现，至少一些盐(例如NaCl)的离子大小参数a_i取决于在表2中显示的缓冲剂系统。

表2

滴定剂的摩尔量的计算

如实例1中的那样。

[H⁺]和[OH^-]对电荷平衡的影响

如实例1中的那样。

计算值与实验值的比较

图5显示了155pH度量vs使用Buffalo+计算的对应的预测值的图示。所研究的缓冲剂系统包括磷酸盐、柠檬酸盐和醋酸盐。

Claims

1.一种确定以下各个中的至少一个的相对组分比例、以便提供具有预先限定的pH和离子强度的液体混合物的方法：

缓冲剂；

酸或碱；

溶剂；以及

盐，

其中，使用德拜-休克尔方程来确定所述相对组分比例，其中，德拜-休克尔方程中的离子大小参数α确定为对所述液体混合物的离子强度有贡献的所有物类的加权平均离子大小，且其中，各个物类的离子强度被用作加权参数。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于，使用迭代过程来确定所述相对组分比例。

3.根据权利要求2所述的方法，其特征在于，所述迭代过程包括：

(a)确定相对组分比例，其中，所述液体混合物的所述预先限定的离子强度根据物类之间的预先限定的分布针对所述物类来分配；

(b)在前述步骤中确定的相对组分比例的基础上，计算所述混合物中各个物类的离子强度；

(c)确定新的一组相对组分比例；考虑(b)中计算出的离子强度，以及

(d)重复步骤(b)和(c)，直到满足预定的收敛标准为止。

4.根据权利要求3所述的方法，其特征在于，在步骤(a)中，所述液体混合物的所述预先限定的离子强度针对盐物类来分配。

5.根据权利要求1至4中的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，德拜-休克尔方程的离子大小参数α确定为

其中，I_i是物类i的离子强度，α_i是物类i的离子大小参数，且I是总的离子强度。

6.根据权利要求1至4中的任一项权利要求所述的方法，其特征在于，在德拜-休克尔方程中的离子大小参数α近似为：

α＝0.5*(mass)^1/3+shell。

7.根据权利要求6所述的方法，其特征在于，对于带正电的物类，“shell”固定在一个值处，而对于带负电的物类，“shell”固定在不同的值处。

8.根据权利要求7所述的方法，其特征在于，对于带正电的离子物类，“shell”固定在3.8-4.2的范围中的值处；而对于带负电的离子物类，“shell”固定在0-0.2的范围中的值处。

9.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，对于带正电的离子物类，“shell”固定在4.0处。

10.根据权利要求8所述的方法，其特征在于，对于带负电的离子物类，“shell”固定在0处。

11.一种提供具有预先限定的pH和离子强度的液体混合物的方法，包括：

提供以下各个中的至少一个的组分储备溶液：

缓冲剂；

酸或碱；

溶剂；以及

盐，

使用权利要求1至10中的任一项权利要求所述的方法来确定待混合的各个组分储备溶液的相对比例，

混合所述储备溶液。

12.根据权利要求11所述的方法，其特征在于，通过组合所述组分储备溶液的伴随性地变化的比例来逐渐改变离子强度，且其中，液体流的pH值保持基本相同。

13.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，制备了两种或更多种组分储备溶液，所述组分储备溶液包括不同的缓冲物类。

14.根据权利要求11或12所述的方法，其特征在于，在提供组分储备溶液的步骤中，提供了包括至少两种缓冲物类的组分储备溶液。

15.一种高吞吐量筛选过程，其中，如权利要求11至14中任一项权利要求所限定的那样制备缓冲剂。

16.一种液相层析过程，其中，洗提液是如权利要求11至14中任一项权利要求所述的那样制备的液体流。

17.一种用于确定以下各个中的至少一个的相对组分比例、以便根据前述权利要求中任一项权利要求来提供具有预先限定的pH和离子强度的液体混合物的装置：

缓冲剂；

酸或碱；

溶剂；以及

盐，

该装置包括：

显示器，其对用户显示确定的组分混合比例以便进行评估，和/或混合器控制单元，其用于控制液体混合器装置。

18.一种缓冲剂制备装置，包括：

液体混合器装置，包括混合液体出口端口，以及连接到以下各个中的至少一个的组分源上的多个入口端口：

缓冲剂，

酸或碱，

溶剂，以及

盐；

混合器控制单元，布置成以便控制通过所述混合器装置的所述入口端口供应的相对组分比例，从而在所述出口端口处提供具有预先限定的pH和离子强度的液体混合物，所述混合器控制单元布置成以便使用德拜-休克尔方程来确定相对组分比例，其中，德拜-休克尔方程中的离子大小参数α确定为对所述液体混合物的离子强度有贡献的所有物类的加权平均离子大小，其中，各个物类的离子强度被用作加权参数。

19.根据权利要求18所述的缓冲剂制备装置，其特征在于，所述缓冲剂制备装置包括至少一个可控阀，以供应所述组分中的至少一个的相对比例。

20.根据权利要求18所述的缓冲剂制备装置，其特征在于，所述缓冲剂制备装置包括至少一个可控泵，以供应所述组分中的至少一个的相对比例。

21.一种液相层析系统，包括根据权利要求18至20中任一项权利要求的缓冲剂制备装置。