ES2374210T3

ES2374210T3 - Preparación de mezclas líquidas.

Info

Publication number: ES2374210T3
Application number: ES09734212T
Authority: ES
Inventors: Lennart BJÖRKESTEN; Enrique Carredano; Gunnar Malmquist; Gustav Rodrigo; Nils STAFSTRÖM
Original assignee: GE Healthcare Bio Sciences AB
Current assignee: Cytiva Sweden AB
Priority date: 2008-04-21
Filing date: 2009-04-20
Publication date: 2012-02-14
Anticipated expiration: 2029-04-20
Also published as: JP2011518328A; JP5497005B2; BRPI0911221A2; ATE533048T1; CN102016567B; EP2269055B1; WO2009131524A1; DK2269055T3; EP2269055A4; US20110039712A1; CN102016567A; BRPI0911221B8; US9446329B2; EP2269055A1; BRPI0911221B1

Abstract

Un método para determinar las proporciones relativas de los componentes de al menos uno entre cada: - un amortiguador de pH. - un ácido o una base, - un disolvente, y opcionalmente - una sal, para proporcionar una mezcla líquida de pH y fuerza iónica predefinidos, en el que las proporciones relativas de los componentes se determinan usando la ecuación de Debye-Hückel, en el que el parámetro del tamaño iónico a en la ecuación de Debye-Hückel se determina como la media ponderada del tamaño iónico de todas las especies que contribuyen a la fuerza iónica de la mezcla líquida, y en el que la fuerza iónica de cada especie se usa como parámetro de ponderación.

Description

Preparaci6n de mezclas liquidas

Campo tecnico

La presente invenci6n se refiere a un metodo para generar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica controlados, asi 5 como a un dispositivo aplicable a dicho metodo. La invenci6n es de interes general en cualquier situaci6n en la que se necesite una preparaci6n exacta de un amortiguador de pH.

Antecedentes

La obtenci6n de liquidos de composici6n conocida de forma precisa es importante en muchos casos, como cuando se usan disoluciones tamp6n que tienen un pH, y opcionalmente tambien una fuerza i6nica, especificados. Ademas,

10 en muchos casos, la composici6n del liquido no deberia solo ser conocida y controlada de forma precisa en cada momento, sino que tambien deberia variar con el tiempo de forma precisa y controlada.

Una aplicaci6n en la que la composici6n de los liquidos es de suma importancia es en cromatografia liquida y mas especificamente cuando la eluci6n, es decir la liberaci6n de moleculas diana aisladas de la matriz cromatografica, se realiza por eluci6n en gradiente. Por ejemplo, en cromatografia de intercambio i6nico, que es un metodo usado 15 frecuentemente para la separaci6n y purificaci6n de biomoleculas, se usa a veces eluci6n en gradiente, por ejemplo para encontrar las condiciones de eluci6n 6ptimas que permiten el diseno de un procedimiento industrial usando eluci6n escalonada. Como es bien conocido, el eluyente contiene entonces una sal inerte y el gradiente se realiza variando la concentraci6n de esta sal. Es bien conocido que un cambio en la concentraci6n de la sal, es decir en la fuerza i6nica, afecta tambien al pH, y ha sido bien documentado que el pH y la fuerza i6nica del eluyente son los dos

20 parametros mas importantes que controlan la selectividad de las separaciones de proteinas en resinas de intercambio i6nico.

La patente estadounidense N° 5.112.949 (Vukovich) se refiere a un sistema automatico para realizar una separaci6n usando un gradiente. Un problema con dichos sistemas manuales y automaticos con gradientes que cambian gradualmente es que si el gradiente es suave toma mucho tiempo realizar la eluci6n y si el gradiente se hace brusco

25 entonces en lugar de que las biomoleculas de interes sean eluidas una por una, se produciran solapamientos en la eluci6n de las biomoleculas. Esto lleva a que varias especies de biomoleculas sean recogidas en cada fracci6n en lugar de que cada especie de molecula se recoja en su propia fracci6n separada.

La patente estadounidense N° 7.138.051 (De Lamotte) se refiere a un sistema, metodo y software cromatografico para la separaci6n de biomoleculas. Mas especificamente, esta patente se refiere a la optimizaci6n de la separaci6n

30 de biomoleculas eluidas de una columna cromatografica en la que la concentraci6n de un componente anadido a una disoluci6n tamp6n de eluci6n se varia con el fin de formar una disoluci6n tamp6n de eluci6n en la que la concentraci6n de dicho componente anadido varie gradualmente.

Okamoto (Hirokazu Okamoto et al., Pharmaceutical Research, Vol. 14, N° 3, 1997: Theory and Computer Programs for Calculating Solution pH, Buffer formula and Buffer Capacity for Multicomponent System at a Given Ionic Strength

35 and Temperature) describe programas de ordenador para calcular el pH de la disoluci6n, la f6rmula del amortiguador de pH y la capacidad del amortiguador de pH para una fuerza i6nica y temperatura dadas. Sin embargo, los amortiguadores de pH preparados por Okamoto et al. muestran una variaci6n del pH que aumenta al aumentar la concentraci6n de la sal, incluso para concentraciones tan bajas como 0,3M. Por lo tanto, los metodos de Okamoto no son suficientes para proporcionar disoluciones tamp6n de pH constante que tambien contengan una sal.

40 La forma tradicional de formaci6n de gradiente ha implicado la preparaci6n cuidadosa de eluyentes que comprenden sales inertes asi como disoluciones tamp6n de pH determinado previamente para producir un gradiente de fuerza i6nica a pH constante. La optimizaci6n de la separaci6n de las proteinas se ha realizado cambiando la pendiente del gradiente de la sal inerte y/o cambiando el sistema amortiguador de pH por uno con pH diferente.

En la tecnica anterior inicial, la optimizaci6n incluia la preparaci6n de numerosas disoluciones tamp6n con pH y

45 concentraciones salinas predeterminados que debian ser valoradas meticulosamente para que las separaciones fueran reproducibles. Obviamente, dichos metodos eran poco practicos y requerian mucho tiempo.

Los metodos para el calculo del pH de la disoluci6n tamp6n para fuerzas i6nicas moderadas (hasta 100mM) estan documentados en la bibliografia y se basan en la soluci6n algebraica o por ordenador de las ecuaciones de equilibrio entre las diferentes especies cargadas y no cargadas presentes en el amortiguador de pH.

50 Para una especie basica particular (que puede ser una base B o una base conjugada A-) en equilibrio con las especies acidas correspondientes (que pueden ser un acido conjugado BH+ o un acido HA, respectivamente), el equilibrio se puede escribir:

H+ + especie basica < ==> especie acida+ Ec. 1.1

La constante de equilibrio, Ka, correspondiente se define como:

Ka = (H+) (especie basica) I (especie acida) Ec. 1.2

donde los parentesis indican las actividades de cada especie. Tomando logaritmos en ambos miembros de la ecuaci6n 1.2 y despejando el pH definido como -log (H+) se obtiene:

pH = pKa + log {(especie basica) I (especie acida)} Ec 1.3

que a veces se denomina ecuaci6n de Henderson-Hasselbach. La raz6n por la que se usan las actividades en la ecuaci6n 1.2 en lugar de las correspondientes concentraciones es que, debido a las interacciones electrostaticas, los iones implicados tienden a apantallarse en el medio. Sin embargo, mientras que las medidas de pH son observaciones directas de la actividad de los protones, generalmente son las concentraciones y no las actividades correspondientes las que se observan, por ejemplo por pesada, pipeteo o bombeo de sus cantidades y volumenes. La actividad de cada i6n se relaciona con la concentraci6n correspondiente mediante el coeficiente de actividad :

(especie) = [especie] Ec. 1.4

En el estado ideal de diluci6n infinita, se hace 1 y la actividad de cada i6n se hace igual a la concentraci6n correspondiente. Sin embargo, en los casos reales, la fuerza i6nica es diferente de 0 y los coeficientes de actividad de las diferentes especies se hace menor que 1.

Para estas desviaciones se ha desarrollado un modelo bien establecido en la denominada teoria de Debye Huckel, conocido como:

log = (AZ 2 I 5) I (1 + 33*1 8 I 5) Ec. 1.5

donde A es una constante, o mas bien un parametro dependiente de la temperatura ∼0,51. Usando datos bien conocidos, el valor de A se puede calcular exactamente como A = 0,4918 + 0,0007*T + 0,000004*T 2 donde T es la temperatura en grados Celsius. Z es la carga del i6n y la cantidad a, el radio de los iones hidratados (en A), se describe como la "distancia media de aproximaci6n de los iones, positivos o negativos" en el trabajo original de Debye y Huckel.

En una tabla presentada en el articulo de Kielland mencionado anteriormente se ha mostrado que este parametro, tambien conocido como el parametro del tamano i6nico, es diferente para especies i6nicas diferentes. I es la fuerza i6nica:

I = % (C iZi2) (incluidos todos los iones) Ec. 1.6

Ci es la concentraci6n y Zi es la carga del i6n presente en la disoluci6n (en unidades de carga electrica).

Introduciendo la ecuaci6n 1.4 en la ecuaci6n 1.3 se obtiene el pH en funci6n de la concentraci6n en lugar de las actividades:

pH = pKa + log { b[especie basica] I ( a[especie acida])} =

= pKa + log b - log a + log {[especie basica] I [especie acida]} =

= pKa' + log {[especie basica] I ([especie acida]} Ec. 1.7

donde:

pKa' = pKa+log b- log a Ec. 1.8

es un valor de pKa aparente que permite utilizar los valores medibles de las concentraciones de las diferentes especies del amortiguador de pH. El valor de pKa' puede calcularse introduciendo la ecuaci6n 1.5 en la ecuaci6n 1.8, dando:

pKa' = pKa + (A Za2 I 5) I (1 + 33*1 8 I 5) (A Zb2 I 5) I (1 + 33*1 8 I 5) Ec. 1.9

donde la introducci6n de los subindices a y b fue necesaria para especificar los parametros correspondientes al acido y la base. Por lo tanto:

Za = carga de la especie acida

Zb = carga de la especie basica

aa = parametro del tamano i6nico de la especie acida

ab = parametro del tamano i6nico de la especie basica

Aplicada a los calculos del pH, la teoria de Debye-Huckel produce la modificaci6n de los valores de pKa de los amortiguadores de pH (denominados valores termodinamicos de pKa) en los valores de pKa' correspondientes dados por la ecuaci6n 1.9. La mayoria de los parametros en la ecuaci6n 1.9 se pueden estimar de forma sencilla. El parametro que supone un mayor reto es a.

Guggenheim y Schindler (vease Guggenheim, E. A. y Schindler, T. D. (1934) J. Phys. Chem. 33, 533), han sugerido una aproximaci6n del parametro a a 3 A para todas las moleculas del amortiguador de pH lo que lleva a la f6rmula algo simplificada:

pKa' = pKa + (A Za2 I 5) I (1 + I 5) (A Zb2 I 5) I (1 + I 5) Ec. 1.1

La ecuaci6n 1.10 anterior es la f6rmula de la correcci6n de la fuerza i6nica que se encuentra generalmente en la bibliografia. A veces los terminos de la correcci6n se anaden en el lado derecho de esta ecuaci6n para compensar la perdida de exactitud a valores mayores de la fuerza i6nica para varios amortiguadores de pH. Sin embargo, la exactitud obtenida haciendo esto es pequena cuando la fuerza i6nica es tan alta como 1M, que esta en los intervalos usados generalmente en la eluci6n en gradiente, por ejemplo en la cromatografia de intercambio i6nico y HIC.

Kielland (Jacob Kielland en Activity Coefficients of Ions in Aqueous Solutions, Septiembre 1937) ha estudiado los coeficientes de actividad de iones en liquidos y proporciona una extensa tabla de coeficientes de actividad i6nica, considerando el diametro de los iones hidratados. Los datos presentados por Kielland para el parametro del tamano del i6n hidratado ai se obtuvieron usando cuatro modelos diferentes: el modelo de Bonino que tiene en cuenta el radio del cristal y su deformabilidad; la ecuaci6n bien conocida 108ai = 182zi / I∞, que tiene en consideraci6n las movilidades i6nicas; la modificaci6n empirica de la teoria de Brull y, finalmente, el metodo de la deficiencia de entropia de Ulrich. Los valores medios redondeados de dichos cuatro modelos se usaron para obtener los datos recogidos en dicho estudio. Los valores de ai presentados por Kielland presentan una variaci6n considerable, de 2,5 hasta tanto como 11, y se han sugerido modelos no generales para el coeficiente de actividad basados en esta variaci6n dependiente de la naturaleza de los iones, es decir una ecuaci6n para los iones inorganicos y una ecuaci6n diferente para los iones organicos.

La patente estadounidense US 6.221.250 (Stafstr6m) se refiere a un metodo de preparaci6n de mezclas liquidas que usa ventajosamente la aproximaci6n del parametro a indicada anteriormente. Mas especificamente, el metodo de preparaci6n de una mezcla descrito comprende los siguientes componentes: (i) uno o mas especies amortiguadoras del pH; (ii) un acido o alternativamente una base; (iii) opcionalmente una sal; y (iv) un disolvente. Las proporciones de los componentes (i) a (iv) se varian de forma concomitante de forma que se tiene en cuenta las interrelaciones del pH y la fuerza i6nica de la mezcla liquida para obtener en cada momento un pH preseleccionado de la mezcla, y el metodo se basa en el uso de una ecuaci6n modificada y repetitiva de Guggenheim-Schindleer (Ec. 1.10, anterior) en la que los factores de correcci6n especificos para el amortiguador de pH se usan para obtener un pH constante con el gradiente. Por lo tanto, en algunas ocasiones, una desventaja de este metodo puede ser que si se necesita introducir un nuevo amortiguador de pH los calculos deben realizarse de nuevo.

Otra aplicaci6n en la que es esencial preparar mezclas liquidas de pH y fuerza i6nica controlada es en el metodo de selecci6n de alto rendimiento (HTS por sus iniciales en ingles: high throughput screening), que es un metodo de experimentaci6n cientifica usado frecuentemente en el descubrimiento de farmacos pero tambien adecuado en los campos de la biologia y la quimica. Mediante una combinaci6n de modem rob6tico, programas de procesamiento de datos y control, dispositivos de manipulaci6n de liquidos y detectores sensibles, el HTS permite a los investigadores realizar eficazmente millones de ensayos bioquimicos, geneticos o farmacol6gicos en un corto periodo de tiempo. A traves de este procedimiento se pueden identificar rapidamente compuestos activos, anticuerpos o genes que modulan una via biomolecular determinada. Los resultados de estos experimentos pueden proporcionar, por ejemplo, puntos iniciales para el diseno de farmacos y para comprender la interacci6n o el papel de un procedimiento bioquimico particular en biologia. La automatizaci6n es un elemento importante en la utilidad del HTS. Un robot especializado es responsable a menudo de la mayor parte del procedimiento durante el tiempo de duraci6n de una sola placa de ensayo, desde la creaci6n hasta el analisis final. Un robot de HTS puede preparar y analizar generalmente muchas placas simultaneamente, acelerando adicionalmente el procedimiento de recogida de datos. Sin embargo, para que estos robots funcionen de forma exacta, es esencial de nuevo la preparaci6n de mezclas liquidas tales como amortiguadores de pH que tengan controlado de forma precisa el pH asi como la fuerza i6nica.

Una aplicaci6n en el area del HTS que esta teniendo un valor en aumento es el desarrollo de procedimientos de alto rendimiento (HTPD, por sus iniciales en ingles: high throughput process development), en el que los papeles del pH y de la fuerza i6nica son muy importantes ya que controlan el comportamiento del enlace de la(s) diana(s) y el(los) contaminante(s). Mediante el diseno con exito de dichos procedimientos de alto rendimiento, las condiciones para tasas de transferencia de masa elevadas y, por lo tanto, para la economia del procedimiento, y tambien para la eluci6n 6ptima, y en consecuencia elevada recuperaci6n, pueden predecirse de forma exacta. Sin embargo, dicho diseno exitoso requeriria, o al menos mejoria mucho, con la preparaci6n automatica de los amortiguadores de pH, permitiendo la preparaci6n de numerosas condiciones tales como pH e I en cortos intervalos de tiempo.

Otra necesidad para la preparaci6n de amortiguadores de pH de forma precisa y bien controlada aparece en las microplacas y otros formatos de laboratorio. Muchas etapas en los ensayos basados en microplacas y en placas

filtrantes se pueden realizar facilmente en paralelo usando, por ejemplo, multipipetas y bloques de vacio para el procesamiento y lectores de placas para la detecci6n de los resultados. A menudo es necesario un alto nivel de automatizaci6n, por ejemplo en el transporte automatico de placas. Esto es valido incluso para muchas "aplicaciones de alto rendimiento" ya que se gana un factor de 96 6 384 en el numero de experimentos mediante la integraci6n de la placa en el primer lugar. Sin embargo, hay casos que implican la preparaci6n tediosa de pocillos individuales en la placa. Aunque se da por descontado el uso de lectores de placa compactos dedicados para la detecci6n y analisis de pozos individuales, no existen soluciones similares dedicadas, de precio razonable y compactas para la preparaci6n de amortiguadores de pH en pocillos en una microplaca. TECAN es una compania que ha abordado el problema de escribir un software para proporcionar la preparaci6n de un amortiguador de pH en microplacas usando su plataforma de automatizaci6n para laboratorios. Esto se podria percibir a simple vista como una soluci6n elegante, pero ocasiona la ocupaci6n de una infraestructura de automatizaci6n cara durante horas para una tarea relativamente sencilla en un laboratorio de automatizaci6n bien equipado. Ademas, es necesaria una inversi6n grande para que un laboratorio pequeno aproveche la soluci6n TECAN.

Por lo tanto, tambien se necesita un dispositivo dispensador automatico, tal como una unidad independiente, que pueda usarse como una estaci6n de trabajo junto con soluciones automaticas, por ejemplo, reducir la carga de trabajo en una infraestructura de automatizaci6n primaria.

Breve descripcian de la invencian

Un aspecto de la presente invenci6n es proporcionar un metodo de control preciso y exacto del pH y la fuerza i6nica en una mezcla liquida. Brevemente, esto puede obtenerse proporcionando un metodo de preparaci6n de una mezcla liquida, tal como un amortiguador de pH, cuyo metodo tiene en cuenta tanto el tamano como la carga de los iones organicos como de los inorganicos. Esto se puede obtener como se define en una o mas de las reivindicaciones adjuntas.

Un objetivo adicional de la invenci6n es proporcionar un metodo mejorado de preparaci6n de un amortiguador de pH en el que primero se calcula la composici6n exacta y subsiguientemente se prepara el amortiguador de pH en una unica etapa.

Un aspecto especifico de la invenci6n es proporcionar las herramientas para la preparaci6n de un amortiguador de pH en la que se garantiza el intervalo de pH para cada amortiguador de pH respectivo calculando la capacidad del amortiguador de pH.

Otro aspecto de la presente invenci6n es proporcionar un metodo para definir la composici6n de una mezcla liquida en funci6n de las especies del amortiguador de pH, la concentraci6n del amortiguador de pH y/o la concentraci6n de la sal, basado en un pH y/o fuerza i6nica deseados, y la capacidad del amortiguador de pH. Asi, comenzando por el pH deseado de una mezcla liquida, y opcionalmente tambien la fuerza i6nica deseada y la capacidad del amortiguador de pH, la presente invenci6n definira las especies apropiadas del amortiguador de pH asi como los valores apropiados del amortiguador de pH asi como la concentraci6n de la sal para obtener dichos pH y fuerza i6nica y dicha capacidad del amortiguador de pH.

Finalmente, otro aspecto de la invenci6n es usar el presente metodo de definici6n del amortiguador de pH en un dispositivo auto-dispensador para la preparaci6n inteligente de un amortiguador de pH en microplacas y otro material de laboratorio. Esto se puede obtener introduciendo un software basado en el modelo presentado anteriormente. En un aspecto especifico, el dispositivo comprende una interfase para la automatizaci6n.

Aspectos y ventajas adicionales de la presente invenci6n apareceran a partir de la descripci6n detallada y las reivindicaciones siguientes.

Definiciones

Un "amortiguador de pH" significa en la presente memoria un componente o compuesto que en disoluci6n liquida mantiene un valor de pH practicamente constante a pesar de la adici6n de cantidades considerables de acido y/o base. El termino "programa de ordenador" se usa en la presente memoria de forma intercambiable con el termino "software".

Breve descripcian de los dibujos

La figura 4 describe una tabla 1 que muestra la raiz cuadratica media del error entre los valores de pH experimentales y entre los valores de pH calculados y experimentales por tres metodos diferentes.

Descripcian detallada de la invencian

En un primer aspecto, la presente invenci6n se refiere a un metodo para determinar las proporciones relativas de los componentes de al menos uno entre cada:

-: un amortiguador de pH.

-: un acido o una base,

-: un disolvente,

y opcionalmente

-: una sal,

para proporcionar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predefinidos,

en el que las proporciones relativas de los componentes se determinan usando la ecuaci6n de Debye-Huckel, en el que el parametro del tamano i6nico en la ecuaci6n de Debye-Huckel se determina como la media ponderada del tamano i6nico de todas las especies que contribuyen a la fuerza i6nica de la mezcla liquida, y en el que la fuerza i6nica de cada especie se usa como parametro de ponderaci6n.

Por lo tanto, se proporciona un metodo general aplicable a mezclas liquidas que comprende especies amortiguadoras del pH organicas asi como inorganicas. Como se ha indicado anteriormente, dichas mezclas liquidas amortiguadas se usan ampliamente en muchos campos de la quimica y la biologia. El presente metodo permite la predicci6n (determinaci6n) mejorada de las proporciones relativas de los componentes con el fin de obtener una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predefinidas, especialmente para concentraciones elevadas del amortiguador de pH y/o de la sal, lo que se confirma por los resultados experimentales siguientes. Tambien se deberia tener en cuenta que el presente metodo se puede usar, por el contrario, para determinar el pH y la fuerza i6nica resultantes de una mezcla liquida de una constituci6n especifica.

Como se ha indicado anteriormente, las diferentes aproximaciones de la ecuaci6n de Debye-Huckel se usan ampliamente con el fin de determinar las proporciones relativas de los componentes de las disoluciones amortiguadoras de pH, etc. pero hasta ahora todas ellas proporcionan baja exactitud y concentraciones mas altas de amortiguador de pH y/o de sal. El metodo proporcionado supera estos problemas mediante la determinaci6n del parametro del tamano i6nico a como el tamano i6nico medio ponderado de todas las especies que contribuyen a la fuerza i6nica de la mezcla liquida, y en el que la fuerza i6nica de cada especie se usa como parametro ponderado.

Segun un modo de realizaci6n, el parametro de tamano i6nico a para la mezcla liquida se calcula como:

∑ 1. .

= Ec. 1.111

donde Ii es la fuerza i6nica y ai el parametro de tamano i6nico de la especie i, e I la fuerza i6nica total definida por la ecuaci6n 1.6 anterior. A partir de dicha ecuaci6n, por lo tanto,

1. = Z C. Ec. 1.12

El parametro de tamano i6nico ai de la especie i es un valor establecido experimentalmente o de forma aproximada, y ejemplos de los valores de ai para algunos amortiguadores de pH y sales se recogen en la tabla 2 del ejemplo 2.

A lo largo de esta memoria descriptiva, el termino "especie" incluye cualquiera y todos los iones o moleculas que contribuyen a la fuerza i6nica de la mezcla liquida, y mas especificamente un componente, por ejemplo un sistema amortiguador de pH tal como un acido debil puede corresponder a dos o mas especies de carga diferente, cada una de ellas con un valor de ai asociado. Debido al hecho de que ai esta relacionado con el "tamano i6nico" en un medio especifico, se ha encontrado que el valor ai de una especie especifica puede ser diferente para diferentes combinaciones de componentes, por ejemplo amortiguador de pH, sal, etc. Por ejemplo, se ha encontrado que los valores de ai para el NaCl son diferentes cuando se mezcla con un amortiguador de pH de fosfato en comparaci6n con un amortiguador de pH de acetato, como se muestra en la tabla 2 siguiente. Sin embargo, se ha encontrado que los valores de ai son validos para las combinaciones de componentes ensayadas en un amplio intervalo de pH y de fuerza i6nica usando el presente metodo, lo que resulta en una previsibilidad aumentada esencialmente en todos los intervalos. La figura 5 del ejemplo 2 muestra una grafica del pH calculado frente al pH medido para un numero elevado de muestras de amortiguadores de pH preparadas basandose en el metodo anterior. A partir de esta grafica es evidente que el metodo descrito es capaz de definir las proporciones de los componentes relativos pertinentes en un intervalo de pH muy amplio.

Segun un modo de realizaci6n, se ha encontrado adicionalmente que el parametro de tamano i6nico a en la ecuaci6n de Debye-Huckel se puede aproximar como:

= 5 * (masa)1I3 + capa Ec. 1.13

donde la determinaci6n de a requiere menor capacidad de procesamiento. En esta ecuaci6n el termino "capa" se debe a una capa adicional que puede ser considerada como una "capa de hidrataci6n" del i6n. Con respecto a este

modo de realizaci6n, se encontr6 que si la "capa" se fijaba a un valor especifico fijo, entonces el termino denominado "constante" en la ecuaci6n de Debye-Huckel era igual a 0,5, como aparece por ejemplo en la tabla 1 presentada en la figura 4.

Por lo tanto, en un modo de realizaci6n, la "capa" se fija a un valor especifico para una especie i6nica cargada positivamente y la "capa" se fija a otro valor diferente para una especie i6nica cargada negativamente. En un modo de realizaci6n, la "capa" esta en el intervalo de 3,8-4,2, tal como 3,9-4,1 o 4, para una especie i6nica cargada positivamente (capa pos = 4). En otro modo de realizaci6n especifico, la "capa" esta en el intervalo de 0-0,2, tal como 0-0,1 o 0, para una especie i6nica cargada negativamente (capa neg = 0).

Una ventaja de la presente invenci6n, en comparaci6n con los metodos de la tecnica anterior, tal como el de Okamoto presentado anteriormente, es que la presente invenci6n permite la preparaci6n de mezclas liquidas tales como amortiguadores de pH no solo para concentraciones bajas de sal, sino tambien para concentraciones mayores de sal, como por encima de 1M, por encima de 2M o incluso por encima de 5M.

Por lo tanto, en un modo de realizaci6n especifico, la presente invenci6n es un metodo para proporcionar una mezcla liquida tal como un amortiguador de pH en la que la concentraci6n de sal es hasta 1M, especificamente en el intervalo de 1-2M o mas especificamente por encima de 2M.

Segun un modo de realizaci6n, las proporciones relativas de los componentes se determinan usando un procedimiento iterativo.

Segun un modo de realizaci6n especifico mostrado esquematicamente en la figura 1, el procedimiento iterativo comprende:

(a): determinar, 10, las proporciones relativas de los componentes en la que la fuerza i6nica predefinida de la mezcla liquida se refiere 20 a las especies segun una distribuci6n predefinida entre las especies;

(b): en funci6n de las proporciones relativas de los componentes determinadas en la etapa precedente calcular, 30, la fuerza i6nica de cada especie en la mezcla;

(c): determinar, 40, una nueva serie de proporciones relativas de los componentes; teniendo en cuenta la fuerza i6nica calculada en (b), y

(d): repetir las etapas (b) y (c) hasta que se obtiene un criterio de convergencia, 50, predeterminado.

El abordaje de la fuerza i6nica predefinida de la mezcla liquida entre las especies, en la etapa (a), se predefine como la obtenci6n de un punto inicial adecuado para el procedimiento iterativo con el fin de obtener una convergencia rapida y de evitar una convergencia falsa. Segun un modo de realizaci6n, la fuerza i6nica predeterminada de la mezcla liquida se refiere a las especies salinas, ya que normalmente son contribuyentes dominantes a la fuerza i6nica total de un amortiguador de pH que comprende un componente salino. Para mezclas liquidas, sin ningun componente salino, se refiere a la fuerza i6nica predefinida de la mezcla liquida.

En la etapa (b), las proporciones relativas de los componentes determinadas en la etapa precedente, es decir en la etapa (a) en la primera iteraci6n y en la etapa (c) en las iteraciones subsiguientes, se usan para calcular la fuerza i6nica de cada especie en la mezcla. Por lo tanto, la concentraci6n de cada especie definida por las proporciones relativas de los componentes se usa para calcular una distribuci6n de fuerza i6nica mas correcta, que subsiguientemente se usa para determinar proporciones relativas de los componentes mas correctas (etapa (c)) y asi sucesivamente, hasta la convergencia.

Los criterios de convergencia predeterminados se pueden elegir para que sea cualquier criterio adecuado que asegure que las proporciones relativas de los componentes se definen con suficiente exactitud, con un esfuerzo computacional razonable. Segun un modo de realizaci6n, los criterios de convergencia se deben elegir para ser la etapa de iteraci6n cuando la desviaci6n entre la ultima serie de proporciones relativas de los componentes y la serie encontrada en la etapa inmediatamente precedente no excede un nivel maximo predefinido, reteniendo esta ultima serie de proporciones relativas de los componentes como la que permite obtener la mezcla con el pH predefinido para una concentraci6n dada de la sal. En un modo de realizaci6n alternativo, los criterios de convergencia se pueden elegir, por ejemplo, como un numero fijo de iteraciones y otras relaciones adecuadas. En un modo de realizaci6n especifico, el procedimiento anterior se itera menos de 10 veces, preferiblemente menos de 8 veces y mas preferiblemente 4-6 veces, tal como 5 veces.

Segun un modo de realizaci6n, esquematicamente mostrado en la figura 2, el metodo para determinar las proporciones relativas de los componentes de una mezcla liquida se puede usar en un metodo para proporcionar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predefinidos 70, que comprende:

• proporcionar, 80, disoluciones madre de los componentes de al menos uno entre cada:

o un amortiguador de pH,

: o un acido o una base,

: o un disolvente,

y opcionalmente

o una sal

•: determinar, 90, la proporci6n relativa de cada disoluci6n madre del componente que se debe mezclar usando el metodo anterior,

•: mezclar, 100, las disoluciones madre.

En modos de realizaci6n alternativos, una o mas disoluciones madre de los componentes pueden ser sustituidas por una fuente en fase s6lida de dicho componente, con lo que la proporci6n relativa de la fase s6lida se disuelve durante la mezcla de los componentes.

Mediante este metodo, se puede preparar una gran cantidad de disoluciones amortiguadoras de pH u otras mezclas liquidas con gran exactitud, en respuesta a un pH y una fuerza i6nica predefinidos.

Segun un modo de realizaci6n, el metodo se puede usar para preparar mezclas liquidas en las que la fuerza i6nica cambia gradualmente con el tiempo (por ejemplo, con el volumen) combinando concomitantemente proporciones variantes de las disoluciones madre de los componentes y en las que el valor del pH o del flujo liquido se puede mantener esencialmente constante. Si se desea, se pueden preparar mezclas liquidas con un gradiente de pH o incluso combinaciones de gradientes de pH y de fuerza i6nica.

La presente invenci6n es util para determinar las proporciones relativas de los componentes para mezclas liquidas tales como amortiguadores de pH que comprenden dos o mas especies amortiguadoras de pH, a menudo reconocidas como especies liquidas amortiguadoras de pH multiples. Por lo tanto, en un modo de realizaci6n, la presente invenci6n es un metodo como se ha descrito anteriormente, en el que se preparan dos o mas disoluciones madre, cuyas disoluciones madre comprenden diferentes especies amortiguadoras de pH. En un modo de realizaci6n alternativo, se proporciona una disoluci6n madre que comprende al menos dos, tales como tres, cuatro o mas, especies amortiguadoras de pH.

En un modo de realizaci6n, el presente metodo para determinar las proporciones relativas de los componentes se puede denominar como un metodo para la definici6n del amortiguador de pH que define uno o mas de los parametros elegidos entre el grupo que consiste en especies amortiguadoras depH, concentraci6n del amortiguador de pH, y concentraci6n de sal necesarias para obtener un amortiguador de pH que tenga un valor de pH deseado y/o una fuerza i6nica deseada y capacidad de amortiguaci6n del pH. En un modo de realizaci6n, la definici6n del amortiguador de pH se obtiene en un momento temporal especifico. En un modo de realizaci6n alternativo, la presente definici6n del amortiguador de pH se obtiene en un procedimiento continuo en linea. El metodo de definici6n del amortiguador de pH puede incluir uno o mas de los elementos indicados anteriormente en el contexto de la preparaci6n de una mezcla liquida.

Como se ha indicado anteriormente, la mezcla liquida preparada usando el presente metodo puede ser un amortiguador de pH que es util en varias aplicaciones tales como aplicaciones de selecci6n con alto rendimiento y en cromatografia. En cromatografia, el liquido preparado segun el presente metodo es ventajosamente el eluyente que consecuentemente comprendera una fuerza i6nica que cambia gradualmente, tambien denominado gradiente salino. Dicho gradiente puede ser creciente o decreciente.

En otro aspecto, la presente invenci6n se refiere a un programa de ordenador capaz de realizar los calculos descritos anteriormente.

Segun un modo de realizaci6n especifico, se proporciona un programa de ordenador para determinar las proporciones relativas de los componentes de al menos uno entre cada:

-: un amortiguador de pH.

-: un acido o una base,

-: un disolvente,

y opcionalmente

-: una sal,

para proporcionar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predefinidos segun el metodo anterior para determinar las proporciones relativas de los componentes, en el que las proporciones de mezcla de los componentes

determinadas pueden ser visualizadas por un usuario para su evaluaci6n y/o usadas para controlar un dispositivo de mezcla de liquidos.

El programa de ordenador segun la invenci6n que puede ser presentado en un dispositivo de memoria tal como un disco o un lapiz de memoria; o como parte de un dispositivo de control, es util para la preparaci6n automatizada de mezclas liquidas, preferiblemente flujos liquidos, que tienen un pH y una fuerza i6nica controlados.

En un modo de realizaci6n de una implementaci6n del metodo para determinar las proporciones relativas de los componentes para proporcionar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predeterminados segun se ha indicado anteriormente, el parametro del tamano i6nico ai para cada especie se almacena en una base de datos, tabla o similar accesible, para que pueda ser usada en los calculos. Un ejemplo de dicha tabla se muestra en la tabla 2 con referencia al ejemplo 2.

En un modo de realizaci6n especifico, el programa de ordenador puede funcionar en un modo de diseno que significa que el programa calculara la receta (es decir, las cantidades de agente valorante, agua y sal) para obtener una disoluci6n de un pH y fuerza i6nica dados (alternativamente, concentraci6n de la sal en lugar de fuerza i6nica). En un modo de realizaci6n alternativo, el programa de ordenador puede funcionar en un modo de calculo de pH, que significa que el programa calculara el pH y la fuerza i6nica obtenidos cuando se mezclan determinadas cantidades de componentes del amortiguador de pH.

En un tercer aspecto, mostrado esquematicamente en la figura 3, se proporciona un dispositivo 190 para la preparaci6n de amortiguadores de pH que comprende:

• un dispositivo 200 de mezcla de liquidos que comprende un puerto de salida 210 del liquido mezclado y varios puertos de entrada 220 conectados con las fuentes 230 de los componentes de al menos uno entre cada:

: o un amortiguador de pH,

: o un acido o una base,

: o un disolvente,

y opcionalmente

o una sal

• una unidad 240 de control de la mezcla dispuesta para controlar las proporciones relativas de los componentes suministrados a traves de los puertos de entrada del dispositivo de mezcla que proporciona una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predefinidos al puerto de salida, estando la unidad de control de la mezcla dispuesta para determinar las proporciones relativas de los componentes usando la ecuaci6n de Debye-Huckel, en la que el parametro del tamano i6nico a en la ecuaci6n de Debye-Huckel se determina como la media ponderada del tamano i6nico de todas las especies que contribuyen a la fuerza i6nica de la mezcla liquida, donde la fuerza i6nica de cada especie se usa como parametro de ponderaci6n.

Segun un modo de realizaci6n, el dispositivo de preparaci6n del amortiguador de pH comprende una o mas valvulas 250, bombas 260 o dispositivos similares que pueden controlarse para suministrar al dispositivo de mezcla las proporciones relativas de los componentes asociados. En el modo de realizaci6n descrito se muestran esquematicamente una valvula 250 y una bomba 260 como integradas en el dispositivo de mezcla de liquidos, pero alternativamente se pueden proporcionar como componentes separados.

Segun un modo de realizaci6n, la preparaci6n del amortiguador de pH se integra como una parte de un sistema de cromatografia liquida. Por lo tanto, el dispositivo de preparaci6n del amortiguador de pH se usa ventajosamente en cromatografia como se ha indicado detalladamente en el documento US 6.221.250 senalado anteriormente.

En un modo de realizaci6n especifico, el dispositivo de preparaci6n del amortiguador de pH comprende una valvula de entrada multipuerto, tal como una valvula de 4 entradas de conmutaci6n rapida; medios para la valoraci6n del amortiguador de pH; una pantalla de visualizaci6n de la relaci6n de mezcla real del amortiguador de pH; medios para mantener el pH independiente de la fuerza i6nica y la temperatura; medios para el control automatico de la capacidad del amortiguador de pH. La valvula cuaternaria abrira un puerto durante un tiempo corto y a continuaci6n abre el siguiente puerto y asi sucesivamente. Los segmentos de volumen de las diferentes disoluciones madre se mezclaran completamente en el mezclador para formar el amortiguador de pH elegido. El tiempo de apertura se controla mediante un algoritmo para obtener el pH correcto.

La valoraci6n del amortiguador de pH se puede hacer bien con el correspondiente acido/base o bien con un acido/base fuerte. Las relaciones de mezcla reales del amortiguador de pH pueden visualizarse y/o controlarse mediante un software, tal como la versi6n modificada de UNICORN (GE Healthcare). Se obtiene un pH estable de las disoluciones preparadas independientemente de la fuerza i6nica y la temperatura. Puede haber un control

automatico de la capacidad del amortiguador de pH. En el metodo es posible ajustar el pH y la concentraci6n del amortiguador de pH.

En todavia otro aspecto, se proporciona un manipulador de liquidos rob6tico que proporciona un flujo de liquido en el que el pH se mantiene esencialmente constante aunque la fuerza i6nica cambie. Un manipulador de liquidos rob6tico segun este modo de realizaci6n se puede usar, por ejemplo, en el control de la composici6n del amortiguador de pH en procedimientos de selecci6n de alto rendimiento; en control de calidad; en cuantificaci6n y normalizaci6n de ADN; en PCR; etc. En un modo de realizaci6n ventajoso, el presente manipulador rob6tico constituye una parte de un sistema que permite la preparaci6n totalmente automatizada en un formato de 96 pocillos para el desarrollo de un procedimiento de alto rendimiento. En dicho sistema, el programa de ordenador segun la invenci6n proporciona un diseno de salida en un formato que se importa facilmente en el dispositivo rob6tico.

Finalmente, la invenci6n tambien se refiere al uso del metodo para determinar las proporciones relativas de los componentes senalado anteriormente en un dispositivo de autodispensaci6n para la preparaci6n inteligente del amortiguador de pH, tal como en microplacas u otros formatos, y posiblemente otro material de laboratorio. Una ventaja del metodo segun la invenci6n es la precisi6n de las predicciones del pH para valores de la fuerza i6nica tan altos como 1M y mayores. En un modo de realizaci6n, el metodo es especial para sistemas amortiguadores de pH con iones amortiguadores de pH cargados positivamente. Un dispositivo independiente de preparaci6n de amortiguadores de pH segun la invenci6n se puede usar en cualquier laboratorio implicado en investigaciones y desarrollo en quimica, biologia, bioquimica, medicina para aplicaciones tales como el desarrollo de procedimientos de alto rendimiento, selecci6n de condiciones de cristalizaci6n, selecci6n de condiciones de enlace, etc. y, en general, cualquier aplicaci6n que necesite la preparaci6n de amortiguadores de pH en paralelo a una escala de L mL. Dependiendo del software incluido, el dispositivo se puede adaptar facilmente tambien para otras aplicaciones que necesiten las mismas operaciones unitarias.

Descripcian detallada de los dibujos

La figura 4 es una tabla que muestra el error cuadratico medio de las diferencias (RMSD por sus iniciales en ingles: root mean squared differences) entre los valores de pH calculados y los experimentales para tres metodos diferentes. Los metodos se diferencian en el tipo de correcci6n del valor de pKa para la fuerza i6nica: la correcci6n segun la ecuaci6n 1.10 de Guggenheim y Schilndler y la correcci6n segun las ecuaciones 1.9 y 1.11 de este metodo. Los numeros entre parentesis dan el numero de diferencias mayores de 0,1 unidades de pH. Los valores de RMSD tambien se dan en unidades de pH. NOK es el numero de experimentos en los que la capacidad del amortiguador de pH es igual o mayor a 0,01 moles de acido/base fuerte por unidad de pH (log > -2). Los valores de la capa en gris no tienen efecto.

La figura 2 describe un modo de realizaci6n especifico de la preparaci6n del amortiguador de pH segun la invenci6n realizado mediante una valvula de cuatro entradas de conmutaci6n rapida. La valoraci6n del amortiguador de pH se puede realizar bien con el acido/base correspondiente o con un acido/base fuerte. Las relaciones de mezcla reales del amortiguador son mostrados por el software, en este caso una versi6n especificamente modificada del UNICORN (GE Healthcare). Se obtiene un pH estable de las disoluciones preparadas, independiente de la fuerza i6nica y de la temperatura. La valvula cuaternaria abrira un puerto durante un tiempo corto y a continuaci6n abre el siguiente puerto y asi sucesivamente. Los segmentos de volumen de las diferentes disoluciones madre se mezclaran completamente en el mezclador para formar el amortiguador de pH elegido. El tiempo de apertura se controla mediante un algoritmo para obtener el pH correcto. Las proporciones reales usadas durante un experimento se representan como porcentaje en las curvas de concentraci6n 01 a 04 en el Control del Sistema, asi como en

Evaluacian en UNICORN

PARTE EXPERIMENTAL

Los siguientes ejemplos se dan unicamente con prop6sito de ilustraci6n y no deberian ser considerados como limitantes de la invenci6n, tal como se define en las reivindicaciones adjuntas.

Ejemplo 1. Desarrollo del software

MaterialesIUnidades investigadas

Toda la programaci6n se realiz6 en ordenadores personales con un procesador Pentium 4 y sistema operativo Windows XP.

Metodos

En la primera parte del trabajo de desarrollo se us6 la versi6n 5 del C++ Builder de Borland y la ultima versi6n 4.2 del compilador Visual C++.

Criterios de aceptacian

Al inicio del experimento se decidi6 que el metodo deberia dar el pH correcto con una exactitud de 0,2 unidades de pH. Como las especificaciones de la bomba y del sistema de valvulas es 0,5% y la concentraci6n de una disoluci6n madre normal seria 0,2M, dado un minimo de capacidad del amortiguador de pH1 de 0,01 (vease mas adelante), aproximadamente 0,1 corresponderia a la exactitud de la dosificaci6n y 0,1 a la exactitud del algoritmo. La capacidad del amortiguador de pH minima se tom6 como la capacidad de amortiguador de pH definida como [dn/dpH], donde dn es el cambio (pequeno) en la cantidad (en moles) de acido/base fuerte que produce un cambio (pequeno) dpH en el pH. La exactitud del algoritmo se estim6 por comparaci6n de las medidas experimentales del pH de las disoluciones tamp6n. Los errores de pipeteo se estimaron al principio de la fase experimental y se consideraron muy pequenos en comparaci6n con otros errores relacionados con la determinaci6n experimental del pH (datos no mostrados). Por lo tanto, el error experimental se estim6 midiendo el pH de cada muestra de disoluci6n tamp6n usando dos pH-metros diferentes con diferentes tipos de electrodos, produciendo dos valores de pH diferentes, denominados aqui pHExp y pHExp1. Para cada serie de experimentos (serie de datos) se calcul6 el error cuadratico medio (r.m.s.e.) segun la siguiente f6rmula:

r.m.s.e. = Raiz cuadrada ( (pHExp -pHExp1)2 I Nok) Ec. 2.1

donde la suma se toma para aquellos valores de pH con una capacidad correspondiente de amortiguador de pH mayor que 0,01 y donde Nok es el numero de dichos casos (solo se toman en consideraci6n los resultados en los que el logaritmo (en base 10) de la capacidad ( ) del amortiguador de pH es mayor que -2). Cuando se encontr6 que el r.m.s.e. era mayor que 0,05 unidades de pH, entonces al menos una mitad de la serie de datos (los correspondientes a un pH-metro) se rechaz6, en cuyo caso la serie de datos que era mas consistente con los valores establecidos para las constantes del amortiguador de pH (pKa y dependencia de pKa con la temperatura) encontrados en la bibliografia, se mantuvo y se us6 para la optimizaci6n de los parametros de compensaci6n de la fuerza i6nica. Incluso la mitad consistente de la serie de datos podria rechazarse en caso de que hubiera otra serie de datos consistente con los valores establecidos de las constantes del amortiguador de pH en la bibliografia. El valor de 0,01 (log -2,0) como limite inferior para la capacidad del amortiguador de pH se obtuvo experimentalmente al observarse que por debajo de este limite, el r.m.s.e. aumentaba por encima de 0,05 para la mayoria de los sistemas amortiguadores de pH (datos no mostrados). A modo de comparaci6n, el valor correspondiente usado en el documento US 6.221.250 (Stafstr6m) indicado anteriormente fue de 0,0063 (log -2,2). En la bibliografia no se encontr6 ninguna referencia a un "valor normalmente aceptado".

Resultados

El programa "Buffalo" se escribi6 en Visual C++ y se puede ejecutar en Windows para el calculo exacto del pH del amortiguador de pH para fuerzas i6nicas tan elevadas como 1M.

Estructura del programa

El programa "Buffalo" se puede ejecutar en dos modos: modo Diseno y modo Calc pH. El modo Diseno se usa para disenar experimentos y para el calculo de las curvas te6ricas de valoraci6n que se pueden usar antes del diseno de los experimentos para determinar el intervalo de pH apropiado. El modo Calc pH se usa para la optimizaci6n de parametros dada una serie de medidas de pH emparejadas. Las entradas del programa en ambos modos son el volumen de amortiguador de pH (vol amort), la temperatura (TT), la concentraci6n del amortiguador de pH (conc amort), la concentraci6n de sal (conc sal), la sustancia amortiguadora de pH (amort selec) y el agente valorante (valorante selec). Ademas de esto, en el modo Diseno, es necesario incluir el pH deseado (pH) como entrada, mientras que en el modo Calc pH son necesarios el pH experimental (pHExp), el correspondiente replicado (pHExp1) y el numero de moles de agente valorante (moles valorante exp) usados en los experimentos. Ademas, en ambos modos es posible considerar un mezcla de un numero (n amort = 1, 2 6 3) de amortiguadores de pH, amort selec (1), amort selec (2) y amort selec (3), en lugar de un amortiguador de pH que consiste en una unica sustancia amortiguadora de pH (el programa ha sido implementado para un numero maximo de tres sustancias amortiguadoras de pH para se podria modificar facilmente para incluir mas). Siendo este el caso, se deben proporcionar las correspondientes concentraciones de amortiguador de pH, conc amort (1), conc amort (2) y conc amort (3).

Amortiguadores de pH monopraticos vs. polipraticos

El pH de un amortiguador de pH monopr6tico puede predecirse con la ecuaci6n de Henderson-Hasselbach (Ec. 1.3

o Ec. 1.7).

La concentraci6n de la especie basica o acida se determina mediante la concentraci6n del amortiguador de pH y la concentraci6n del agente valorante. Dadas estas concentraciones y la pKa del amortiguador de pH monopr6tico se puede obtener el pH (corresponde al modo Calc pH), alternativamente dado el pH deseado y la concentraci6n del amortiguador de pH se puede obtener la cantidad de moles de agente valorante (corresponde al modo Diseno). Una complicaci6n surge cuando se usan varios amortiguadores de pH polipr6ticos, es decir sus moleculas amortiguadoras de pH pueden aceptar y dar mas de un prot6n, correspondiendo a mas de un valor de pKa. El numero de especies en dicho sistema amortiguador de pH es siempre mas que el numero de valores de pKa

(n de pKa). Para simplificar la implementaci6n del programa, se implement6 un modelo general para un amortiguador de pH tripr6tico (una extensi6n a incluso mas valores de pKa deberia ser directa aunque no trivial y debe ser implementada). Si se definen cuatro estados o especies de protonaci6n (s1, s2, s3 y s4), sin embargo, el parametro n de pKa (que puede ser 1, 2 6 3) limita los calculos de forma que para un amortiguador de pH monopr6tico, por ejemplo, s1 corresponde a la especie acida, s2 a la especie basica y la concentraci6n de s3 y s4 se ajustan a 0.

Diferencias y similitudes entre los dos modelos

Los dos modelos funcionan usando esencialmente el mismo metodo principalmente para resolver la cantidad de moles de agente valorante necesaria para obtener un pH dado para una concentraci6n de amortiguador de pH dada. Antes de hacer esto es necesario resolver la cantidad de moles de amortiguador de pH en cada uno de los posibles numeros o estados (o especies) de protonaci6n. La diferencia entre los modos es que en el modo Diseno, el procedimiento se hace solo dos veces (kmax = 2): una vez para el pH deseado y la otra para el pH + etapa pH (vease mas adelante) con el fin de estimar numericamente la capacidad del amortiguador de pH. La cantidad de moles de agente valorante obtenida para el pH deseado es entonces la salida del modo Diseno. Por otra parte, en el modo Calc pH, el procedimiento se repite a lo largo de la escala de pH completa (1-13, kmax = 2600), el valor de pH que permite obtener la cantidad de moles de agente valorante que concuerda mejor con la cantidad de moles de agente valorante usada en el experimento es el valor del pH calculado. El parametro etapa pH (0,005) limita la exactitud de los calculos del pH y de la capacidad del amortiguador de pH. Se encontr6 ventajoso usar el mismo algoritmo en ambos modos ya que de esta forma se minimizaban los errores y discrepancias innecesarias.

Las ecuaciones de equilibrio

El calculo de la cantidad de moles en cada una de las especies de protonaci6n es equivalente a resolver las ecuaciones de equilibrio de cada una de las especies con las especies contiguas con un prot6n mas y/o menos y con la concentraci6n de atomos de hidr6geno (el pH). En otras palabras, las tres ecuaciones (correspondientes a tres valores de pKa) se obtienen directamente a partir de la ecuaci6n 1.7.

xx[1] = 1 A(pH -pKaprima[i]) Ec. 3.1

donde cada i corresponde a cada valor de pKa(i) (i = 1, 2, 3) y xx[i] son las relaciones entre la concentraci6n de la base correspondiente y el acido correspondiente, es decir xx[1] = [s2]/ [s1], xx[2] = [s3]/ [s2], xx[3] = [s4]/ [s3].

Ademas de estas tres ecuaciones, otra ecuaci6n surge debido a la conservaci6n de la masa:

[s1] + [s2] + [s3] + [s4] = conc amort Ec. 3.2

y la conservaci6n de la carga:

[H+] - [OH ] + carga espec (s i) -carga valorante*[valorante]

carga espec (espec inic)*[espec inic] = Ec. 3.3

Por especie inicial se entiende la especie de la sustancia amortiguadora de pH antes de la mezcla, es decir el estado de protonaci6n del amortiguador de pH en el recipiente o en la disoluci6n madre. Este estado de protonaci6n se determina por la cantidad de contraiones por molecula del amortiguador de pH porque el objeto macrosc6pico, recipiente o disoluci6n madre, debe ser electricamente neutro. El signo menos delante de [OH-] es debido al signo menos de la carga de los iones OH, mientras que el signo menos delante de los dos ultimos terminos es debido a la carga de los contraiones del agente valorante y de las especies iniciales respectivamente.

Finalmente, el equilibrio de disociaci6n del agua:

[H+] [OH] = 1 14 Ec. 3.4

Las ecuaciones 3.1-3.4 implican que hay seis ecuaciones con seis inc6gnitas (las cuatro [si], [OH-] y [H+]) para el caso de 3 valores de pKa. De la forma en que se ha implementado la soluci6n, se supone que el pH es conocido y, por lo tanto, [H+] y mediante la ecuaci6n 3.4 incluso [OH-] y en cambio es la concentraci6n de agente valorante la que debe ser resuelta. Las cinco ecuaciones restantes corresponden a las cinco inc6gnitas (las cuatro [si] y [agente valorante]).

Calculo de la cantidad de moles de agente valorante

Una vez que las concentraciones de cada especie [si] en el equilibrio son conocidas, se puede calcular la concentraci6n de agente valorante usando la ecuaci6n 3.3. Hay dos casos que hay que considerar dependiendo del tipo de agente valorante, acido/base fuerte y acido/base correspondiente. Sin embargo, independientemente del caso de que se trate, el calculo de la concentraci6n de agente valorante en la ecuaci6n 3.3 da:

[agente valorante] = ( [H+] + [OH ] carga espec (s i)*[si] +

donde:: carga espec (espec inic)*[espec inic]) I etapa protan Ec. 3.1

o: etapa protan = carga valorante (acidoIbase fuerte) Ec. 3.11a

etapa protan = carga espec (espec inic)

- carga valorante (acidoIbase correspondiente): Ec. 3.11b

En otras palabras, el parametro etapa prot6n es -1 para el HCl y +1 para el NaOH, en el caso de un agente valorante acido o base debil, el valor de etapa prot6n para el agente valorante depende de la especie inicial del amortiguador de pH segun la ecuaci6n 3.11b o la siguiente ecuaci6n equivalente:

etapa protan = espec valorante - espec inic Ec. 3.12

Este procedimiento se repite tantas veces como sean los componentes del amortiguador de pH y el valor de mol valorante final es la suma de la cantidad de moles de agente valorante para cada componente (vease a continuaci6n).

En la mayoria de los casos (pH entre aproximadamente 3,5 y 10,5), la contribuci6n de [H+] (para valores de pH bajos) o de [OH-] (para valores de pH altos) al balance de carga es despreciable y se puede considerar cero en la ecuaci6n 3.10.

Eleccian del agente valorante

El agente valorante puede ser fuerte (HCl o NaOH). La unica diferencia entre estos dos en el signo del numero de protones con los que contribuyen. Ademas, el agente valorante puede ser debil en cuyo caso se debe proporcionar el estado de protonaci6n del agente valorante (en el recipiente o en la disoluci6n madre). Alternativamente, se puede dar el numero de protones acidos. La relaci6n entre los dos es:

espec valorante = n de pKa + 1 -n de protones acidos Ec. 3.13

Bucle de iteracian de la fuerza ianica

Como la fuerza i6nica se calcula a partir de las concentraciones de todos los iones, es necesario conocer estas concentraciones antes de que se calcule la fuerza i6nica de forma exacta. Sin embargo, estas concentraciones son ellas mismas una variable de salida de la soluci6n de las ecuaciones de equilibrio que requieren pKaprima[i], que a su vez se calculan a partir de pKa (denominados valores termodinamicos de pKa a 25°C y fuerza i6nica 0), la temperatura y la fuerza i6nica. Por lo tanto, fue necesario implementar un procedimiento iterativo. En la primera etapa de dicho procedimiento, la fuerza i6nica se ajusta simplemente igual a la concentraci6n de la sal. En una segunda etapa de iteraci6n, se usa la fuerza i6nica obtenida en el primer ciclo, etc. Se encontr6 que este procedimiento converge rapidamente. Por ejemplo, se encontr6 que cinco interacciones fueron mas que suficientes para obtener la exactitud deseada (datos no mostrados). El numero de iteraciones se ajust6 por lo tanto a 5 en todos los casos.

Cargas separadas en el calculo de la fuerza ianica

Se encontr6 que el calculo de la fuerza i6nica para iones con mas de una carga y en los que las cargas estaban bien separadas (como en el caso de los iones citrato con 4 y 5 atomos de carbono entre las cargas) se obtuvo una exactitud significativamente mejor si se consideraban las cargas como separadas en lugar de una carga puntual unica. Esto llev6 a la introducci6n de una variable de senalizaci6n cargas separadas a la que se le dio el valor verdadero para el citrato y falso para todos los otros amortiguadores de pH

Bucle sobre el numero de componentes del amortiguador de pH parametros del amortiguador de pH

Para cada especie del amortiguador de pH se necesitan los siguientes parametros. La masa de la sustancia amortiguadora de pH (M amort), el numero de valores de pKa (n de pKa), los valores de pKa (pKa[i]), los valores de la dependencia con la temperatura de cada valor de pKa (dpKadT[i]), la carga de la forma mas basica (cb) y el estado de protonaci6n del amortiguador de pH (espec inic) en el recipiente o en la disoluci6n madre. Alternativamente, se puede dar el numero de protones acidos. La relaci6n entre los dos es:

espec inic = n de pKa + 1 -n de protones acidos Ec. 3.14

Ademas de esto, se necesitan los parametros de correcci6n de la fuerza i6nica (const, cargapos y carganeg).

El numero total de moles de agente valorante (mol valorante) es igual a la suma del numero de moles de agente valorante necesario para cada componente del amortiguador de pH con el fin de establecer el equilibrio al pH deseado y este bucle se usa para calcular esta suma. Otras sumas que se calculan mediante el bucle son el numero de contraiones de cada uno de los componentes del amortiguador de pH y tambien la contribuci6n de cada componente a la fuerza i6nica en el equilibrio.

Bucle sobre los diferentes estados de protonacian correccian del pKa con la temperatura

Para cada estado de protonaci6n se calculan cada uno de los siguientes parametros: la carga (carga espec[j]), el cuadrado de la carga (qsq[j]), la capa (capa[j]), la constante (const[j]) y el valor de pKa corregido con la temperatura (pKaT[j]). Este ultimo se calcula siguiendo la f6rmula:

pKaT = pKa[i] + (TT -25) * dpKadT[i] Ec. 3.15

donde TT la temperatura en grados Celsius. Tambien se calcula la parte aaa[i] del parametro del tamano i6nico a que depende solo de la masa (se le puede denominar radio no hidratado aaa[i]):

aaa[i] = const[i] * (Mamort)1I3 Ec. 3.16

Bucle sobre los valores de pKa calculo de pKa'

Los coeficientes de actividad (o mas bien sus logaritmos) de las especies acidas o basicas que corresponden a cada valor de pKa se calculan segun la siguiente f6rmula:

logfiBase = A * (qsq [i+1]) * raiz I I (1 + 33 * (aaa[i+1] + capa[i+1]) * raiz I) Ec. 3.17a

logfiAcido = A * (qsq [i]) * raiz I I (1 + 33 * (aaa[i] + capa[i]) * raiz I) Ec. 3.17b

Donde raiz I es la raiz cuadrada de la fuerza i6nica. El parametro a de la ecuaci6n I corresponde a la cantidad aaa[j]

+ capa [j].

A partir de estos coeficientes de actividad los valores de pKaprima se calculan como:

pKaprima[i] = pKaT + logfiBase -logfiAcido ec. 3.18

Influencia de [H+] y [OH] en el equilibrio de cargas

A valores muy bajos y muy altos de pH, la contribuci6n de [H+] (para los valores bajos) y [OH-] (para los valores altos de pH) en el equilibrio de cargas deja de ser despreciable. Por lo tanto, en la versi6n 5.07 y posteriores se introdujo la posibilidad de incluir una correcci6n en el numero de moles del agente valorante (mol valorante) debida a [H+] y [OH-], especialmente cuando se observaron consistentemente discrepancias para la disoluci6n tamp6n de fosfato en el intervalo de pH bajo (por debajo de 2,5). Esto se implement6 de forma que la cantidad de moles del agente valorante se corrigi6 al final del bucle sobre el numero de componentes del amortiguador de pH anadiendo dos terminos:

1 A {pH} I (etapa protan * vol amort)

para neutralizar electricamente [H+] y

+1 A {pH 14} I (etapa protan * vol amort)

para neutralizar electricamente [OH-].

Comparacian de los valores calculados con los valores experimentales

En la presente memoria se presentan un total de 31 sistemas amortiguadores de pH (combinaciones de valorante y valorado). Se han realizado aproximadamente 2100 experimentos de los que se han rechazado 817 debido a los criterios de rechazo (secci6n 2.3). Se ha realizado la valoraci6n con acido/base fuerte asi como con el acido/base correspondiente, asi como dos mezclas de amortiguadores de pH. La lista de sistemas de amortiguadores de pH que no son mezclas se recogen en la figura 4, tabla 1. Las estadisticas de los errores de los resultados de la aplicaci6n de este metodo (programa Buffalo versi6n 6.00) en comparaci6n con la interpretaci6n de la f6rmula de Debye-Huckel segun Guggenheim y Schindler (ec 1.10) y en comparaci6n tambien con las diferencias experimentales se presentan igualmente en la tabla. En todos los casos mostrados en la tabla se ha incluido la correcci6n debida a la contribuci6n de [H+] y [OH-] (secci6n 3.13). Solo en los casos en los que se considera un pH bajo, esta correcci6n produce una mejora significativa de la exactitud. En los restantes casos, la diferencia es despreciable.

Solo se presentan los resultados para los que el logaritmo (base 10) de la capacidad ( ) del amortiguador de pH es mayor que -2 a partir de los datos rechazados. Como estimaci6n del error experimental tambien se incluye el error cuadratico medio (r.m.s.e.) (ec. 2.1) a partir de dos medidas de la misma mezcla amortiguadora de pH segun dos diferentes pH-metros.

Mezclas amortiguadoras de pH

Se consideraron dos mezclas. Una mezcla para la cromatografia de intercambio cati6nico (pH 2,5-7,2 CIEX) y una mezcla para la cromatografia de intercambio ani6nico (pH 5,3-9,5 AIEX).

La mezcla AIEX se hizo mezclando Tris 0,1M y Bis-Tris 0,1M. El intervalo de pH ensayado fue de 5,3-9,5. La primera serie de datos consisti6 en medidas sencillas de pH. El r.m.s.e. para una segunda serie de datos de AIEX fue de 0,80 por lo que una de sus series fue rechazada.

El resultado para la primera serie de datos y la serie no rechazable de la segunda fue de 1 de 27 posibles valores fuera de los limites de 0,1 (r.m.s.d 0,06) para este metodo en comparaci6n con 10 de 27 violaciones posibles para la correcci6n de la fuerza i6nica segun Guggenheim y Schindler (r.m.s.d. 0,10).

La mezcla CIEX se hizo mezclando Na2HPO4 0,037M, Na-formato 0,0125M y Na-acetato 0,025M. El intervalo de pH analizado fue de 2,5-7,2. El valor experimental de r.m.s.e. fue de 0,02 con 0 de 104 posibles (NrOK) diferencias mayor que 0,1. El resultado de los calculos de pH fue de 4 de los 104 valores posibles fuera de los limites de 0,1 para este metodo (r.m.s.d. 0,05) en comparaci6n con 36 de 102 violaciones posibles para la correcci6n de la fuerza i6nica segun Guggenheim y Schindler (0,1).

Ejemplo 2 MaterialesIUnidades investigadas

Como en el ejemplo 1.

Metodos

Se us6 la versi6n 4.2 del compilador de Visual C++.

Resultados

El programa "Buffalo Plus" se escribi6 en Visual C++ y se puede ejecutar en Windows para el calculo exacto del pH de la disoluci6n tamp6n para fuerzas i6nicas y concentraciones de amortiguador de pH tan elevadas como 1M para los siguientes sistemas tamp6n: fosfato, citrato, acetato y Tris.

Estructura del programa

Como en el ejemplo 1 con una adici6n: el programa tambien se puede ejecutar en un tercer modo "�ptimizaci6n de par�metros" que se usa para optimizar simultaneamente los parametros (radios de las diferentes especies cargadas de cada sistema amortiguador de pH) usando el metodo de Newton Raphson.

Amortiguadores de pH monopraticos vs. polipraticos

Como en el ejemplo 1.

Diferencias y similitudes entre los modos

Como en el ejemplo 1, pero en los modos Calc pH y �ptimizaci6n de par�metros, kmax = 3.

Eleccian del agente valorante

Como en el ejemplo 1.

Bucle de iteracian de la fuerza ianica

Como en el ejemplo 1.

Bucle sobre los valores de pKa correccian del pKa con la temperatura y calculo del pKa'

Los coeficientes de actividad (o mas bien sus logaritmos) de las especies acidas y basicas que corresponden a cada valor de pKa se calculan segun las f6rmulas siguientes:

logfiBase = A * (qsq [i+1]) * raiz I I (1 + 33 * rad ion * raiz I)

logfiAcido = A * (qsq [i]) * raiz I I (1 + 33 * rad ion * raiz I)

donde raiz I es la raiz cuadrada de la fuerza i6nica, qsq[i] y qsq[i+1] son el cuadrado de la carga del acido y de la base, respectivamente, correspondientes a cada valor de pKa.

5 pKaT = pKa[i] + (TT -25) * dpKadT[i]

donde TT es la temperatura en grados Celsius y dpKadT[i] es el coeficiente de temperatura para el valor de pKa considerando pKa[i].

pKaprima[i] = pKaT + logfiBase logfiAcido

Ecuaciones de equilibrio

10 Como en el ejemplo 1.

Calculo del parametro de tama�o ianico

Este se calcula como se ha descrito, como la media ponderada de la fuerza i6nica de los radios de cada especie. La tabla 2 muestra los parametros del tamano i6nico ai establecidos para las especies en los sistemas amortiguadores de pH de fosfato, citrato y acetato y los parametros del tamano i6nico ai asociados para el NaCl. En la tabla 2, solo 15 se recogen los parametros de tamano i6nico para las especies cargadas y el "tamano i6nico 2" se refiere a las especies i6nicas con la menor carga. Consecuentemente, el "tamano i6nico 1"se referiria a las especies no i6nicas, pero como la carga de dichas especies es cero no contribuyen al parametro de tamano i6nico total a como se ha indicado anteriormente. Como el acetato es un acido monopr6tico solo se lista un unico valor de ai. Como se ha mencionado anteriormente, se ha encontrado que el parametro de tamano i6nico ai para al menos algunas sales, por

20 ejemplo NaCl, depende del sistema amortiguador de pH que se ha mostrado en la tabla 2.

Tabla 2

Tamano i6nico 2: Tamano i6nico 3 Tamano i6nico 4 Tamano i6nico Na Tamano i6nico Cl

Acetato: 18,989 ----- ---- 2,42126 0,241586

Citrato: 3,13131 7,62849 6,37154 1,00106 3,13131

Fosfato: 1,64864 6,25134 7,91443 1,64026 1,09941

Calculo de la cantidad de moles de agente valorante

Como en el ejemplo 1.

25 Influencia de [H+] y [OH] sobre el equilibrio de carga Como en el ejemplo 1. Comparacian de los valores calculados con los valores experimentales La figura 5 muestra una grafica de 155 medidas de pH frente a los valores predichos correspondientes calculados usando Buffalo Plus. Los sistemas amortiguadores de pH investigados incluyen fosfato, citrato y acetato.

Claims

REIVINDICACIONES

1.-Un metodo para determinar las proporciones relativas de los componentes de al menos uno entre cada: -un amortiguador de pH. -un acido o una base,

5 -un disolvente, y opcionalmente

-

una sal, para proporcionar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predefinidos, en el que las proporciones relativas de los componentes se determinan usando la ecuaci6n de Debye-Huckel, en el

10 que el parametro del tamano i6nico a en la ecuaci6n de Debye-Huckel se determina como la media ponderada del tamano i6nico de todas las especies que contribuyen a la fuerza i6nica de la mezcla liquida, y en el que la fuerza i6nica de cada especie se usa como parametro de ponderaci6n.
2.-Un metodo segun la reivindicaci6n 1, en el que las proporciones relativas de los componentes se determinan usando un procedimiento iterativo. 15 3.-Un metodo segun la reivindicaci6n 2, en el que el procedimiento iterativo comprende:

(a)

determinar las proporciones relativas de los componentes en la que la fuerza i6nica predefinida de la mezcla liquida se refiere a las especies segun una distribuci6n predefinida entre las especies;

(b)

basandose en las proporciones relativas de los componentes determinadas en la etapa precedente, calcular la fuerza i6nica de cada especie en la mezcla;

20 (c) determinar una nueva serie de proporciones relativas de los componentes, teniendo en cuenta la fuerza i6nica calculada en (b), y

(d) repetir las etapas (b) a (c) hasta que se obtiene el criterio de convergencia predeterminado.
4.-Un metodo segun la reivindicaci6n 3, en el que, en la etapa (a), la fuerza i6nica predefinida de la mezcla liquida se refiere a las especies salinas.

25 5.-Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el parametro de tamano i6nico a de la ecuaci6n de Debye-Huckel se determina como:

en la que Ii es la fuerza i6nica y ai es el parametro de tamano i6nico de la especie i, e I es la fuerza i6nica total.
6.-Un metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el parametro de tamano i6nico a en la 30 ecuaci6n de Debye-Huckel se aproxima como:

= 5 * (masa)1I3 + capa

en la que "capa" se fija opcionalmente a un valor para una especie cargada positivamente y se fija a un valor diferente para una especie cargada negativamente, y opcionalmente se fija a un valor en el intervalo de 3,8-4,2, tal como 4,0, para las especies i6nicas cargadas positivamente; y "capa" se fija a un valor en el intervalo de 0-0,2, tal

35 como 0, para las especies i6nicas cargadas negativamente.
7.-Un metodo para proporcionar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predefinidos, que comprende:

• proporcionar disoluciones madre de los componentes de al menos uno entre cada:

o un amortiguador de pH,

o un acido o una base,

40 o un disolvente, y opcionalmente

o una sal

• determinar la proporci6n relativa de cada disoluci6n madre del componente que se debe mezclar usando el metodo segun cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6,

• mezclar las disoluciones madre. 5 8.-Un metodo segun la reivindicaci6n 7, en el que la fuerza i6nica se cambia gradualmente combinando

concomitantemente proporciones variables de las disoluciones madre del componente, y en el que el valor del pH del flujo liquido se mantiene esencialmente constante. 9.-Un metodo segun las reivindicaciones 7 u 8, en el que se preparan dos o mas disoluciones madre de los

componentes, cuyas disoluciones madre de los componentes comprenden diferentes especies amortiguadoras de

10 pH. 10.-Un metodo segun una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 9, en el que se proporciona una disoluci6n madre del componente que comprende al menos dos especies amortiguadoras de pH.
11.-Un procedimiento de selecci6n de alto rendimiento o un procedimiento de cromatografia liquida, en el que el amortiguador de pH se prepara como se ha definido en una cualquiera de las reivindicaciones 7 a 10. 15 12.-Un programa de ordenador para determinar las proporciones relativas de los componentes de al menos uno entre cada: -un amortiguador de pH, -un acido o una base, -un disolvente, 20 y opcionalmente

-

una sal, para proporcionar una mezcla liquida de pH y fuerza i6nica predefinidas segun una cualquiera de las reivindicaciones precedentes, en el que las proporciones de mezcla de un componente determinados se visualizan por un usuario para su evaluaci6n y/o se usan para controlar un dispositivo de mezcla de liquidos.

25 13.-Un dispositivo de preparaci6n de un amortiguador de pH, que comprende: -un dispositivo de mezcla de liquidos que comprende un puerto de salida del liquido mezclado y varios puertos de entrada conectados con las fuentes de los componentes de al menos uno de:

o un amortiguador de pH,

o un acido o una base,

30 o un disolvente, y opcionalmente

o una sal

-

una unidad de control de la mezcla dispuesta para controlar las proporciones relativas de los componentes suministrados a traves de los puertos de entrada del dispositivo de mezcla que proporciona una mezcla liquida de

35 pH y fuerza i6nica predefinidos al puerto de salida, estando la unidad de control de la mezcla dispuesta para determinar las proporciones relativas de los componentes usando la ecuaci6n de Debye-Huckel, en la que el parametro del tamano i6nico a en la ecuaci6n de Debye-Huckel se determina como la media ponderada del tamano i6nico de todas las especies que contribuyen a la fuerza i6nica de la mezcla liquida, donde la fuerza i6nica de cada especie se usa como parametro de ponderaci6n.

40 14.-Un dispositivo de preparaci6n de un amortiguador de pH segun la reivindicaci6n 13, que comprende al menos una valvula controlable o una bomba controlable para suministrar las proporciones relativas de al menos uno de los componentes.
15.-Un sistema de cromatografia liquida que comprende un dispositivo de preparaci6n de un amortiguador de pH segun cualquiera de las reivindicaciones 13 a 14.