JP5493295B2 - ヒト型Fcレセプター発現細胞、及びそれを用いたヒト型Fcレセプターの製造方法 - Google Patents
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Description
(1)可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIをコードするDNA配列を含む発現プラスミドを形質転換することにより得られる、可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIを安定的に発現するCHO細胞。
(2)可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIをコードするDNA配列が、ヒト型FcレセプターFcγRIの全DNA配列のうち膜貫通領域を除去した配列であることを特徴とする、(1)に記載の細胞。
(3)可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIをコードするDNA配列が、ヒト型FcレセプターFcγRIの全DNA配列のうち膜貫通領域を除去した配列中の少なくとも1塩基が他のヌクレオチドに置換、および/または欠失、および/または付加されている配列であることを特徴とする、(1)に記載の細胞。
(4)発現プラスミドがSV40プロモーター系に由来するDNA配列を含んでいることを特徴とする、(1)から(3)に記載の細胞。
(5)発現プラスミドがさらにジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含んでいることを特徴とする、(4)に記載の細胞。
(6)(1)から(5)に記載の細胞を用いることを特徴とする、ヒト型FcレセプターFcγRIの製造方法。
1.可溶性ヒト型FcγRIをコードするDNA配列
本発明の細胞を取得する際に用いる、可溶性ヒト型FcγRIをコードするDNA配列は、報告されているヒト型FcγRIをコードするDNA配列に適当な修飾を加えることで、本来なら膜タンパク質であるFcγRIを細胞外に分泌させることが可能なDNA配列である。前記適当な修飾法としては、終止コドンを細胞外領域あるいは膜貫通領域に挿入する方法、膜貫通領域を除去する方法が例示できるが、膜貫通領域を除去する方法が好ましい。配列番号1にはヒト型FcγRIの全アミノ酸配列およびそれをコードするDNA配列が示されており、このアミノ酸中、細胞外領域はアミノ酸番号1から277番のアミノ酸配列に相当し、膜貫通領域は278番から299番目のアミノ酸配列に相当する(略図を図1に示す)。前記細胞外領域あるいは膜貫通領域に終止コドンを挿入することは、インビトロミュータジェネシス(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)のような、DNAに突然変異を挿入するための市販のキットを用いて行なうことができ、前記膜貫通領域を除去することも、前記市販のキットを用いて行なうことができる。また、適当なオリゴヌクレオチドを作製しPCR法により、前記細胞外領域あるいは膜貫通領域に終止コドンを挿入したもの、または前記膜貫通領域を除去したものを調製してもよい。
2.発現プラスミド
本発明の細胞を取得する際に用いる可溶性ヒト型FcγRIをコードするDNAを発現させる、すなわち可溶性ヒト型FcγRIを発現し得る複製可能な発現プラスミドは、前項で説明した可溶性ヒト型FcγRIをコードするDNA配列、前記DNA配列を発現させるためのDNA配列および宿主中でプラスミドDNAを複製するための複製起点を有し、かつ、選定された宿主を形質転換できるものであれば、適宜選定し使用できる。前記DNA配列を発現させるためのDNA配列としては、乳糖プロモータ系、トリプトファンプロモータ系、GAL4プロモータ系、SV40プロモータ系、アデノウイルスプロモータ系に由来する配列が例示でき、宿主との関係において適宜選定すればよいが、本発明の細胞株を取得する際に用いるプロモータ系としては、SV40プロモータ系に由来する配列が好ましい。また、これらのプラスミドを用いて形質転換する操作にあたり、プラスミドが導入されなかった宿主と導入された宿主との選別を可能にするために、発現プラスミド中にアンピシリンといった薬剤に対する耐性を宿主に付与するためのDNA配列を含んでいるのが好ましい。
3.宿主
本発明の宿主としては、安定的にタンパク質を発現可能なCHO細胞(チャイニーズハムスターの卵巣細胞)が好ましい。
4.可溶性FcγRIの精製
本発明の細胞を用いて提供される、遺伝子工学的方法により生産された可溶性ヒト型FcγRIは、生産に用いた培養液、あるいは培養上清中から、通常の生理活性タンパク回収法によって分離精製することができる。分離回収方法としては、市販のHPLC、カラムクロマトグラフィーを例示することできる。また、培養液中から前記タンパクを生産する際に、培養液中の他のタンパク質の減少、例えば、培養細胞を無血清培地で培養して前記タンパクを発現させることにより分離回収の効率を高めることができる。
可溶性ヒト型FcγRI発現プラスミドの作製は、以下の方法で行なった。
(1)可溶性ヒト型FcγRIをコードするDNAを以下の方法で調製した。
(1−1)Human cDNA clone SC119841プラスミド(Origene社製)をテンプレートとし、配列番号2(5’−GA[AGATCT]ATGTGGTTCTTGACAACTCTGCTCC−3’:角かっこ部分は制限酵素BglIIサイト)と配列番号3(5’−CG[TCTAGA]CTAGTGGTGGTGGTGGTGGTGGACAGGAGTTGGTAACTGGAGGC−3’:角かっこ部分は制限酵素XbaIサイト)のオリゴヌクレオチドをPCRプライマーとして使用した。なお、FcγRIタンパク質の調製および定量を行なうために、発現タンパク質のC末端側にポリヒスチジンタグが付加されるようにPCRプライマーを作製した。
(1−2)PCR反応を、94℃・5分の熱処理後、94℃・30秒間の第一ステップ、65℃・30秒間の第二ステップ、72℃・1分間の第三ステップを25サイクル行ない、最後に、72℃・7分の条件で行なった。反応液組成を表1に示す。
(1−4)目的産物に相当するDNAバンドをアガロースゲルから抽出(QIAquick Gel extraction kit:キアゲン社製)し、可溶性ヒト型FcγRIをコードするDNAを調製した。
(2)(1)で調製したDNAを制限酵素BglIIとXbaIにより消化し、これらの制限酵素により事前に消化したプラスミドpECEdhfr(非特許文献5)とライゲーションし(Ligation Kit Ver.2、タカラバイオ社製)、50μg/mLの抗生物質カルベシニリンを添加したLB寒天培地を用いて大腸菌JM109株に形質転換した。
(3)(2)の形質転換体を50μg/mLの抗生物質カルベシニリンを含むLB培地により培養(37℃、18時間)し、QIAprep Spin Miniprep Kit(キアゲン社製)によりプラスミドを抽出した。
(4)抽出プラスミドを制限酵素BglIIとXbaIにより消化し、0.9%のアガロース電気泳動に供した。
実施例1で作製したpECEFcRdhfrプラスミド(図2)に挿入されている、可溶性ヒト型FcγRIをコードするDNA配列をチェーンターミネータ法に基づくBig Dye Terminator v3.1 Cycle Sequencing kit(PEアプライドバイオシステム社製)を用いてサイクルシークエンス反応に供し、全自動DNAシークエンサーABI Prism 310 DNA analyzer(PEアプライドバイオシステム社製)において解析した。なお、配列番号4(5’−AGCTGTATGGGGTCACTTCG−3’)と配列番号5(5’−TTTTTCCACTGGAATTCTAACC−3’)と配列番号6(5’−AGTGGGGATGTCACAGATGC−3’)と配列番号7(5’−AGGAACACATCCTCTGAATACC−3’)に示すオリゴヌクレオチドをシークエンス用プライマーとして使用した。
pECEFcRdhfrプラスミド(図2)をリポフェクトアミン(インビトロジェン社製)によりCOS7細胞に導入し、10% FCSを含むD−MEM培地(GIBCO社製)で培養することで(37℃、3日間)、一過的に細胞外へヒト型FcγRIを発現させ、培養後、培養液を回収した。回収した培養上清の抗体結合活性を以下の方法でELISA法により評価した。
(1)96穴のELISAプレート(Nunc社製)に100μg/mLから段階的に希釈したガンマグロブリン製剤(化学及血清療法研究所製)を各ウェルに100μLずつ添加し、4℃で18時間静置することによりガンマグロブリンを固相に固定化した。
(2)TBS緩衝液(0.2%(w/v)Tween 20、150mM NaClを含むTris−HCl緩衝液(pH8.0))で洗浄後、Starting Block Blocking Buffers(PIERCE社製)によりブロッキング操作を行なった。
(3)TBS緩衝液で洗浄後、調製した培養上清を100μL添加し、(1)で固定化したヒトガンマグロブリンと反応させた(30℃、2時間)。
(4)(3)の反応終了後、TBS緩衝液で洗浄し、His−probe(H−15)HRP抗体(Santa Cruz Biotechnology社製)を添加した。
(5)(4)の反応終了後、TBS緩衝液で洗浄し、TMB Peroxidase Substrate(KPL社製)を添加し450nmの吸光度を測定した。
pECEFcRdhfr(図2)をChenらの方法(非特許文献6)により、dhfr遺伝子欠損CHO細胞株DBX−11(非特許文献7)に導入することで可溶性ヒト型FcγRIを発現するCHO細胞を作製し、MTX(メソトレキセート)を用いて前記細胞のスクリーニングを行なった。
(1)上記発現プラスミドが導入されたDBX−11株を5nMのMTXを含む培地で培養し、増殖した細胞株をモノクローナル化し実施例3と同様な方法で活性を評価した。
(2)最も活性の強い株について、さらに、50nM MTXを含む培地で培養し、耐性を獲得した増殖株の活性を評価した。
(3)(2)の操作を繰り返すことにより、最終的に初期のMTX濃度に対して1000倍となる5μM MTX存在下においても増殖する細胞宿主、すなわち、MTX耐性を獲得することと連動してFcγRI遺伝子が高度に集積された細胞株を分離した。
実施例4の細胞のうち、ヒト型FcγRI発現量が最も多いM5u−12D株を用いて、以下の方法でヒト型FcγRI生産を行なった。
(1)M5u−12D株を高密度培養システムBelloCell(CESCO社製)を用いて、5% 透析牛胎児血清入りD−MEM/F12培地(GIBCO社製)で細胞が密な状態まで培養した。
(2)培養後、培地を除き、5% 透析牛胎児血清を含むD−MEM(GIBCO社製)/ExCell302(SAFCバイオサイエンス社製)の1対1混合培地で培養した。(3)栄養源が枯渇する前に培養上清を回収し、新たな培地と交換した。
(4)(2)から(3)の操作を繰り返して合計10Lの可溶性FcγRI含有培養上清を得た。
実施例5で得られた可溶性FcγRI培養上清を、以下の方法で分離精製した。
(1)実施例5で得られた可溶性FcγRI培養上清10Lを、20mM酢酸緩衝液(pH5.2)で透析し脱塩処理を施した。
(2)20mM酢酸緩衝液(pH5.2)で平衡化した300mLのStreamline SPゲル(GEヘルスケアバイオサイエンス社製)を備えた吸着流動床システム(GEヘルスケバイオサイエンス社製)に添加し、同緩衝液で洗浄後、10%グリセロール、1M NaClを含む20mMリン酸緩衝液(pH7.4)により溶出し、可溶性ヒト型FcγRI濃縮画分を調製した。
(3)(2)で得られた可溶性ヒト型FcγRI濃縮画分を、20mM イミダゾール、0.5M NaClを含む20mM リン酸緩衝液(pH7.4)に透析し、同緩衝液で平衡化したHisTrap HSカラム(GEヘルスケバイオサイエンス社製)に添加し、洗浄後、500mM イミダゾール、0.5M NaClを含む20mM リン酸緩衝液(pH7.4)で溶出することで、可溶性FcγRI精製標品を10mg得た。なお、タンパク質濃度の定量は、イムノグロブリンを標準タンパク質としてブラッドフォード法に基づくプロテインアッセイキット(Bio−Rad社製)を用いて行なった。
Claims (4)
- 可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIをコードするDNA配列およびSV40プロモーター系に由来するDNA配列を含む発現プラスミドを形質転換することにより得られる、可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIを安定的に発現するCHO細胞。
- 可溶性ヒト型FcレセプターFcγRIをコードするDNA配列が、ヒト型FcレセプターFcγRIの全DNA配列のうち膜貫通領域を除去した配列であることを特徴とする、請求項1に記載の細胞。
- 発現プラスミドがさらにジヒドロ葉酸レダクターゼ遺伝子を含んでいることを特徴とする、請求項2に記載の細胞。
- 請求項1から3のいずれか一項に記載の細胞を用いることを特徴とする、ヒト型FcレセプターFcγRIの製造方法。
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