JP5475010B2 - マイクロ流体単一粒子解析に関する指型電極 - Google Patents

Description

本発明は、粒子の調査の分野に関し、より詳細には、例えば粒子を輸送する搬送液体を囲む測定チャネルにおけるインピーダンス分光法による、粒子、例えば生物細胞の区別に関する。本発明は、マイクロ製造流動血球計算器において使用されることができる。

使い捨てのカートリッジ及びより小さなデバイスを用いるポイントオブケアデバイスに対するヘルスケアの傾向は、既存の流体ベースの試験の小型化への要求を形成する。結果として生じるより小さな流体ボリュームを分析するための必要性は、単一の粒子に基づかれる溶液における粒子の特性を測定するマイクロ流体チップの発展をもたらした。

電気的粒子分析に関する現在の原理は、クールターカウンタである。ここで、電解溶液における粒子は、電流が流れる２つの電極を切り離す小さな開口を通り引かれる。開口にわたり印加される電圧は、「感知ゾーン」を作成する。開口を通り進む粒子は、電解質のそれらの自身のボリュームを変位させ、従って開口のインピーダンスを変化させる。インピーダンスにおけるこの変化は、粒子のサイズに特徴的であるパルスを生み出す。この装置は、流体における粒子のサイズ配布及び濃度を決定することを可能にする。クールターカウンタは、マイクロ流体フォーマットにおいても実現された。

マイクロ流体工学は、横道的な態様でチャネルにおけるインピーダンスを探索することも可能にする。チャネル内部の対向する又は隣接する電極により流体を探索することが、結果的に提案された。マクロ流体工学において、開口内部において複数の電極ペアを持つ類似する構造が提案された。

Cheungらは、「Impedance Spectroscopy Flow Cytometry: On-Chip Label-Free Cell Differentiation、Cytometry Part A 65 A: 124-132 (2005)」において、図１に示される狭いマイクロ流体チャネル１２内部における２つのペアの電極１０ａ、１１ａ及び１０ｂ、１１ｂを使用するマイクロ流体チップを記載する。ここで、電極ペアの１つは、粒子を検出し、他のペアは、リファレンスとして機能する。

頂部電極１１ａ、１１ｂは共に、同じＡＣ又はＤＣ入力信号（Ａ＝Ｂ）に接続され、底部電極１０ａ、１０ｂは、接地（信号Ｃ）に接続される。左右の電極ペアの間のマイクロ流体チャネル１２における流体を通る電流が測定され、及び、左右の電極ペアの間の対応するインピーダンスが、決定され、増幅され、それらの違いが、標準的なアナログ電子機器によりとられる。結果として生じるＡＣ信号の同相及び位相外れの一部は、標準的なロックイン技術を用いて測定される。電極１０ａ、１１ａ；１０ｂ、１１ｂを通過する粒子がない場合、決定された差分信号は、好ましくは、だが必ずしもそうである訳ではないが、ゼロである（実際、電子要素の不正確さが原因で、常にオフセットが存在することができる）。左からくる粒子１３がまず左の電極ペア１０ａ、１１ａを通過する場合、電極ペアの間のインピーダンス差を検出するとき、正のほぼガウス形状の信号が生み出される。粒子１３がその後右の電極ペア１０ｂ、１１ｂを通過する場合、電極ペアの間のインピーダンス差を検出するとき、負のガウス形状信号が生み出される。結果として生じる反対称のダブルガウス信号形状が、図１の下部に見られることができる。

前述の参照文献においても説明されるように、測定を分析する標準的な方法は、粒子イベントを見つけるために閾値化アルゴリズムを使用することである。ダブルガウス信号の振幅だけが使用される。それは、単に信号曲線の最大及び最小間の差をとることにより決定される。最大と最小との間の時間遅延Ｔが、粒子１３の速度を決定するために用いられることができる。

本発明の実施形態の目的は、良い感度で粒子調査を実行するためのデバイス及び方法を与えることである。

上記目的は、本発明によるデバイス及び方法により実現される。

本発明の特定のかつ好適な側面が、付随する独立及び従属請求項に記載される。請求項において単に明示的な記載がなくとも、従属項からの特徴は、独立項の特徴、及び他の従属項の特徴と適切に組み合わされることができる。

第１の側面において、本発明は、搬送液体に懸濁される粒子を調査する測定デバイスを与える。この測定デバイスは、上記粒子の電気的測定を行う測定電極の第１のペアを少なくとも有し、上記測定電極のペアの少なくとも１つの電極が、複数のフィンガーを持つ指型電極である。

本発明の実施形態において、電極ペアの両方の電極は指型電極である。本発明の別の実施形態において、電極ペアの１つの電極は、指型電極であり、一方、他の電極は、例えば電極プレートといった非指型電極である。

本発明の実施形態において、電極ペアの両方の電極は、マイクロ流体チャネルの両側に配置される。別の実施形態において、電極ペアの電極は、マイクロ流体チャネルの同じ側に配置される。

搬送液体に懸濁される粒子の調査は、斯かる粒子の区別をもたらすことができる。例えば、１つのタイプの粒子が、別のタイプの粒子と区別されることができる。

本発明の特定の実施形態において、電気的測定は、インピーダンス測定とすることができる。

測定電極で得られた測定信号は、標準的な信号処理技術により整理されることができる。

本発明の実施形態による指型電極のパターンは、１つの測定電極フィンガー及び基準電極フィンガーを用いて、従来技術の測定デバイスを用いて得られる信号形状より長く及びより複雑な信号形状をつくる。基準電極フィンガーは、ダブルガウス分布信号形状を生成する。得られたより長い信号形状は、測定感度におけるかなりの改良をもたらす。信号形状の長さ及び複雑さは、１つのペアの指型電極におけるフィンガーの数、及び測定電極のペアの数に依存する。

本発明の実施形態による測定デバイスに関する１つの適用は、血球に関するインピーダンス測定の測定感度を大幅に向上させることである。これは、例えば白血球といった粒子の異なるタイプの間のより良好な分化をもたらす。より良い測定感度は、例えば血小板又は微粒子といったより小さな粒子の測定及びより高いスループットを可能にする。更に、マイクロ流体デバイスの最大流体流速は、検出器の感度により制限される。より良い感度は、より高い速度、及び従ってより高いスループットをも可能にする。従って、より感度の良いデバイスは、より高速に結果を提供することができる。速度は、医療デバイスに関して、特に携帯用デバイスにおいて、最も重要な販売要素の１つである。

別の利点は、本発明の実施形態による測定デバイスを用いて、重なり合う粒子の検出さえ可能である点にある。重なり合う粒子は、電極間の検出ゾーンに同時に存在する粒子である。従って、測定された信号は、両方の粒子からの別々の信号の重ね合せである。これは、粒子が必ずしも同時に検出ゾーンに入らなければならないことを意味するものでもないし、同じ速度を持つことを意味するものでもない。指型電極構成は、両方の粒子が類似する時間に検出ゾーンにある場合であっても、これらを検出することをより容易にする。これは、信号の持続時間が長く、自己相関関数が鋭く、粒子が互いに１つの電極フィンガーより離れているか（同じ速度である場合）、又は明らかに異なる速度である場合であっても、粒子が区別されることができるためである。重なり合う粒子は、従来の粒子カウンタにおける共通の問題である。既知のクールターカウンタといった従来の電気的方法は、重なり合う粒子を避けるため外筒フローといった複雑な流体フローシステムを使用するか、又はこうした粒子を説明する統計方法を使用する。これらは、費用及び大きさをシステムに加える。サンプルのより高い希釈化は、この問題を減らすが、測定時間及び使用する試薬の大きさを上昇させる。より低いサンプル希釈化が使用されることができる点が本発明の実施形態の利点である。これは、実行される試験に関する時間を減らし必要とされる試薬の大きさを低下させる。これらは、小さくかつ高速であることを必要とするポイントオブケアデバイスに関して重要な利点である。

本発明の実施形態による測定デバイスにおいて、フィンガーは、良好な自己相関特性を定めるシーケンスコードを定めるパターンを持つように収容されることができる。良好な自己相関特性は、最大が常に１であるよう、及びシフトされるときの相関値が少ないよう、正規化される。シフトされるときの相関値と最大との比率は、信号対ノイズ比ゲインを定める。フィンガーのパターンは、疑似乱数シークエンスに対応することができる。

本発明の実施形態による測定デバイスは更に、測定電極の第２のペアを有することができる。測定電極の斯かる第２のペアは、測定信号におけるオフセットを取り除く基準として使用されることができる。本発明の実施形態において、２つ以上の測定電極ペアが与えられることができる。

本発明の実施形態において、測定電極の第２のペアは、少なくとも１つが指型電極である、電極のペアとすることもできる。本発明の実施形態において、電極の第１のペアの１つの電極のフィンガーは、電極の第２のペアの１つの電極のフィンガーと互いに嵌合されることができる。これは、測定信号が、可能な３つの値、−１、０、１を持つという利点を持つ。

本発明の実施形態において、両方の電極ペアの第２の電極は、結合された電極とすることができる。即ち、それらは、両方の電極ペアに対する１つの同じ電極、例えばプレート電極とすることができる。

第２の側面において、本発明は、本発明の実施形態による測定デバイスを有するマイクロ流体システムを与える。本発明の実施形態による測定デバイスは、一体化されたマイクロ流体ラボオンチップデバイスの要素とすることができる。それは、例えば、ポイントオブケア及び／又は携帯デバイスに一体化されることができる。

更なる側面において、本発明は、本発明の実施形態によるマイクロ流体システムを有する細胞ソーターを与える。

本発明の実施形態による測定デバイスは、例えば血液、唾液又は尿といった体液の分析に使用されることができる。粒子ソート構造と組み合わせることは容易である。例は、希少細胞強化である。

更に別の側面において、本発明は、搬送液体に懸濁される粒子を調査する方法を与える。この方法は、少なくとも１つの測定電極ペアを用いて少なくとも１つの粒子に関する電気的測定処理を行い、測定信号を生成するステップであって、上記電極ペアの少なくとも１つの電極が、複数のフィンガーを持つ指型電極である、ステップと、上記搬送液体における粒子の存在を上記測定信号から決定するステップとを有する。粒子の調査は、粒子の区別をもたらすことができる。

本発明の実施形態において、電気的測定処理を実行するステップが、インピーダンス測定を行うステップを有することができる。電気的測定処理を実行するステップが、インピーダンス分光法を行うステップを有することができる。

本発明の実施形態による方法は、基準測定を行うステップと、上記測定信号と上記基準測定の結果とを比較するステップとを更に有することができる。

本発明の実施形態による方法において、上記搬送液体における粒子の存在を上記測定信号から決定するステップが、上記少なくとも１つの測定電極ペアの上記フィンガー間の粒子の通過を表すモデル曲線を上記測定信号のセクションと相関させるステップを有することができる。

上図は、従来技術による測定及び基準電極ペア間を進むサンプルセルを示すマイクロ流体チャネルの図式的な側面表示を示す図であり、下図は、両方の電極ペアの間の電流差を測定するロックイン増幅器の出力であるセル信号を示す図である。 ブロック図において示されるように信号発生器及び測定回路に結合される、本発明の実施形態によるマイクロ流体チャネルの概略的な３Ｄ表示を示す図である。 本発明の実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、図２におけるラインＡ−Ａ'に基づかれる底面図であり、粒子が左から右へこの構造体を通り流れる図である。 本発明の実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、図２におけるラインＢ−Ｂ'に基づかれる断面側面図である。 本発明の実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、結果として生じる理想的なロックイン出力信号を示す図である。 本発明の実施形態で使用されることができる互いに嵌合された指の電極構造体の実施形態を示す図であり、この互いに嵌合された指の電極構造体が長さ７のバーカーコードに基づき構成される図である。 本発明の追加的な実施形態による指型の電極構造体を概略的に示す図であり、粒子が左から右へこの構造体を通り流れるような上面図を示す図である。 本発明の追加的な実施形態による指型の電極構造体を概略的に示す図であり、断面側面図を示す図である。 本発明の追加的な実施形態による指型の電極構造体を概略的に示す図であり、結果として生じる理想的なロックイン出力信号を示す図である。 実験的なトレースのフィットを示す図である。 複数のＲＢＣイベント及び１つの受け入れられたＰＬＴイベントの測定結果を示す図である。 本発明の追加的な実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、図２におけるラインＡ−Ａ'に基づかれる底面図であり、粒子が左から右へこの構造体を通り流れる図である。 本発明の追加的な実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、図２におけるラインＢ−Ｂ'に基づかれる断面側面図である。 本発明の追加的な実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、結果として生じる理想的なロックイン出力信号を示す図である。 本発明の追加的な実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、電極フィンガー間のスペースを変化させることによりコードが変化され、図２におけるラインＡ−Ａ'に基づかれる底面図であり、粒子が左から右へこの構造体を通り流れる図である。 本発明の追加的な実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、電極フィンガー間のスペースを変化させることによりコードが変化され、図２におけるラインＢ−Ｂ'に基づかれる断面側面図である。 本発明の追加的な実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、電極フィンガー間のスペースを変化させることによりコードが変化され、結果として生じる理想的なロックイン出力信号を示す図である。 本発明の追加的な実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、電極フィンガーの幅を変化させることによりコードが変化され、図２におけるラインＡ−Ａ'に基づかれる底面図であり、粒子が左から右へこの構造体を通り流れる図である。 本発明の追加的な実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、電極フィンガーの幅を変化させることによりコードが変化され、図２におけるラインＢ−Ｂ'に基づかれる断面側面図である。 本発明の追加的な実施形態による互いに嵌合された電極構造体を概略的に示す図であり、電極フィンガーの幅を変化させることによりコードが変化され、結果として生じる理想的なロックイン出力信号を示す図である。 本発明の実施形態による指型電極構造体を概略的に示す図であり、全ての電極がチャネルの同じ側にあり、底面図であり、粒子が左から右へこの構造体を通り流れる図である。 本発明の実施形態による指型電極構造体を概略的に示す図であり、全ての電極がチャネルの同じ側にあり、断面側面図であり、垂直スケールが水平スケールに比べて誇張される図である。 本発明の実施形態による指型電極構造体を概略的に示す図であり、全ての電極がチャネルの同じ側にあり、結果として生じる理想的なロックイン出力信号を示す図である。

本発明の上記及び他の態様が、以下に説明される実施形態より明らとなり、これらの実施形態を参照して説明されることになる。

図面は、概略的なものに過ぎず非限定的なものである。図面において幾つかの要素の大きさが誇張されている場合があり、説明目的のため実際のスケール通りに描かれていない場合がある。

異なる図面において、同じ参照符号は、同じ又は類似する要素を参照する。請求項における任意の参照符号は、発明の範囲を限定するものとして解釈されるべきではない。

１つの側面において、本発明は、搬送液体において懸濁される粒子を調査する、例えば識別する測定デバイスに関する。本発明の実施形態において、懸濁された粒子は、例えば赤血球、白血球又は血小板といった生体細胞とすることができる。しかしながら、本発明は、血球又は他の生体細胞に限定されるものではなく、添付の請求の範囲により規定される本発明の要旨を逸脱することなく、非生物学的性質の粒子と共に使用されることができる。

図２に概略が示され、その断面が例えば図３Ａ及びＢに示されるように、本発明の実施形態による測定デバイスはマイクロ流体チャネル２０を有する。マイクロ流体チャネル２０は、懸架された粒子を含む搬送液体がそこを通り流れることを可能にするよう構成される。このため、マイクロ流体チャネル２０は、搬送液体及び懸架された粒子を受ける入口２１及び搬送液体及び懸架された粒子を排出する放出口２２を具備する。

マイクロ流体チャネル２０は、例えば標準的なＣＭＯＳ技術の処理といった標準的な半導体処理を用いて製造されることができる。マイクロ流体チャネル２０は、例えばガラス基板といった適切な基板２３上に製造されることができる。この基板上には、例えば金属電極といった導電性電極の少なくとも１つのペア２４ａ、２４ｂ；２５ａ、２５ｂが、例えばリフトオフによりパターン化される。本発明の実施形態において、電極は、例えばチタン又はプラチナといった生物学的に不活性な物質から作られる。電極の少なくとも１つのペアは、第１の測定電極ペアを少なくとも有する。図示される実施形態における測定電極ペアの電極２４ａ、２４ｂは、マイクロ流体チャネル２０の反対側に配置される。本発明の実施形態によれば、第１の測定電極ペアの両方の電極２４ａ、２４ｂは、指型電極である。本発明の実施形態において、指型電極は、マイクロ流体チャネル２０を通る搬送液体の流れ方向において、１つの電極における指が互いに隣接して空間的に不規則に配置されるようなものとすることができる。「空間的に不規則に配置される」というのは、１つの電極における電極フィンガーが、空間的に規則的なパターンでは配置されないことを意味する。これは、特定の電極の電極フィンガーを持つと予想されるが、その電極の実際の電極フィンガーが与えられないような少なくとも１つの位置が存在することを意味する。こうして、電極フィンガーが、シーケンスコードを定めるパターンに基づき与えられる。本発明の実施形態によれば、電極フィンガーのシーケンスコードは、良好な自己相関特性のために選択される。最大が常に１であるよう、良好な自己相関特性は正規化される、シフトされるときこの値は小さい。最大値とシフトされるときの値との比は、信号対ノイズ比ゲインを定める。従って、これは通常、ｍビットシーケンスに対して約１／ｍとなる。斯かる良好な自己相関特性は、疑似乱数シーケンスに対応するフィンガーのパターンを与えることにより得られることができる。

本発明の実施形態において、少なくとも第１の測定電極ペア２４ａ、２４ｂと、第２の測定電極ペア２５ａ、２５ｂという測定電極の少なくとも２つのペアが与えられる。第１の測定電極ペアの少なくとも１つの電極は、指型電極である。本発明の実施形態において、第１の測定電極ペアの少なくとも１つの電極及び第２の測定電極ペアの少なくとも１つの電極は、指型電極とすることができる。一方、測定電極ペアの他の電極は、指型である必要はない。本発明の実施形態において、第１の測定電極ペアの１つの電極及び第２の電極ペアの１つの電極は、指型電極である、両方の測定電極ペアの第２の電極が、指型であるというわけではない。両方の測定電極ペアの第２の電極は、１つの同じ電極とさえすることができる。斯かる実施形態は、図８に示される。

本発明の別の実施形態において、図３に示されるように、第１の測定電極ペア２４ａ、２４ｂの電極及び第２の測定電極ペア２５ａ、２５ｂの電極は共に、指型電極である。第１の測定電極ペア２４ａ、２４ｂの電極及び第２の測定電極ペア２５ａ、２５ｂの電極は、互いに嵌合された電極とすることができる。

電極のパターン化後、側壁２６が、基板２３上でパターン化されることができる。側壁は、例えばポリイミド又はＳＵ８のようなエポキシ又は防腐剤といった任意の適切な物質から作られることができる。それぞれが基板、電極及び側壁を有する２つの類似するウェーハが、クローズ型のチャネル２０を作るためフェーストゥフェースで結合されることができる。このチャネルは、上壁及び下壁２３上に電極２４ａ、２４ｂ及びオプションで電極２５ａ、２５ｂを持つ。チップが、ウェハーペアからさいの目切りにされることができる。その結果、例えばばね付勢コネクタを使用することにより、両サイドで、電極２４ａ、２４ｂ；２５ａ、２５ｂに対する導電性接点がアクセスされることができる。

測定電極ペアの第１の電極２４ａ、２５ａは、結果として生じる測定信号を測定する、例えば感知電子機器といった感知デバイス２７に接続される。測定信号は、例えば電流信号又は電圧信号といった電気信号とすることができる。測定デバイスは、測定電極ペアの電極間に存在する電流又は電圧差を測定することができる。信号を検出して、改善された感度を示すために、標準的な解析技術が使用されることができる。

本発明の実施形態による測定デバイスはオプションで、測定信号を増幅するアンプ２８に接続されることができる。測定信号は、増幅の前か後で、電極ペア２４ａ、２４ｂ；２５ａ、２５ｂの電極間のインピーダンス不整合を決定するのに使用されることができる。粒子２８が電極ペアの電極フィンガー間を進む場合、この決定されたインピーダンス不整合が変化する。

本発明の実施形態によるデバイスは更に、その雑音が多い環境から測定信号を抽出するため、ロックイン増幅器３１を有することができる。本発明の実施形態によるデバイスは更に、決定されたインピーダンス信号を評価するため、信号評価器２９を有することができる。決定されたインピーダンス信号の評価は、電極にわたり、又は、電極間を通過する粒子の調査、最終的には粒子の識別をもたらすことができる。

一旦測定信号が得られると、信号から得られる複数のパラメータ、例えば信号の振幅又は位相により、粒子が区別されることができる。低いＡＣ周波数に対して、例えばＤＣから５００ｋＨｚまでの周波数に対して、この振幅は例えば、細胞サイズと等しいとすることができる。異なる周波数を持つ２つの重畳されたＡＣ入力信号を持つ測定の場合、２つの周波数での振幅の比率は、内部の伝導率又は粒子の静電容量を決定することにより、同じ物理サイズの粒子を区別することができる。

本発明の実施形態による指型電極を使用することは、アナログ電子機器を単純化する。なぜなら、信号検出がより容易になるからである。これは、測定デバイスの製造費用を減少させる。

図３Ａ及びＢは、本発明の実施形態による測定デバイスの第１の実施形態の底面図及び断面側面図をそれぞれ図式的に示す。

この実施形態において、測定デバイスは、マイクロ流体チャネル２０及び２つの電極ペア２４ａ、２４ｂ；２５ａ、２５ｂを有する。図３Ａ及びＢで分かるように、各電極ペアの両方の電極は、指型電極である。各電極ペアの電極は、マイクロ流体チャネル２０の対向する側、例えば、図３Ｂに最適に示されるように上及び下に配置される。両方の電極ペアの指型電極は、所定パターンに基づき互いに嵌合される。図３に示される実施形態において、チャネル２０のそれぞれ上面及び底面にある指型電極２４ｂ、２５ｂ及び、２４ａ、２５ａのパターンは、等しい。これは、必ずしも必要でない。本発明の別の実施形態において、共通の信号により駆動される電極は、完全に、又は、部分的に、より大きな単一電極により置換されることができる。その例は、図８に示される。この実施形態において、互いに嵌合された電極構造体２４ａ、２５ａはチャネル２０の底部に与えられ、単一の電極８０はチャネル２０の上部に与えられる。

図３の実施形態において、マイクロ流体チャネル２０上部の２つの電極２４ｂ、２５ｂは、信号発生器３０（図３において図示省略）に接続される。これらは共に、同じ信号発生器に接続されることができる。図８の別の実施形態において、一つの上部電極８０が、信号発生器３０に接続される。図示される両方の実施形態において、マイクロ流体チャネルの底部の２つの電極は、感知デバイス２７、例えば感知電子機器に接続される。

図３の１つに対する構造に類似する、即ち測定電極の２つのペアを持つ別の実施形態において、マイクロ流体チャネル上部に配置される第１の測定電極ペアの第１の電極は、信号発生器に接続されることができ、マイクロ流体チャネルの底部に配置される第１の測定電極ペアの第２の電極は、感知デバイスに接続されることができる。マイクロ流体チャネルの底部に配置される第２の測定電極ペアの第１の電極は、信号発生器に接続されることもでき、マイクロ流体チャネル上部に配置される第２の測定電極ペアの第２の電極は、感知デバイスに接続されることができる。これは、本発明の実施形態において、信号電極及び感知電極が逆にされることができ、異なる電極ペアに関してチャネルの同じ側にある必要がないことを意味する。

図３に示される実施形態において、測定信号は、第１及び第２の電極ペア２４ａ、２４ｂ；２５ａ、２５ｂの底部電極で測定される。両方の測定信号の差は、オプションでアンプ２８において増幅されることができ、ロックイン増幅器３１に与えられることができる。

ロックイン増幅器３１は、オプションでアンプ２８により増幅される例えば測定信号といった入力信号を取り、（内部発振器又は外部ソースから与えられる）既知の信号形状を持つ基準信号によりそれを増倍して、ロックイン増幅器の帯域幅に基づき、通常数秒からマイクロ秒のオーダーの特定された時間にわたりこれを集積する。長い集積時間は、多くのノイズを拒絶するが、遅い信号だけを可能にする。即ち、イベントの測定が遅くなる。従って、ロックイン集積時間又は帯域幅の選択に関しては、速度とノイズとの間の基本的なトレードオフが存在する。

結果として生じる信号は、低い周波数信号である。ここで、基準信号と同じ周波数を持つ信号の異相要素だけでなく、基準信号と同じ周波数ではない任意の信号からの貢献が、基本的にゼロに減衰される（サイン関数が同じ周波数のコサイン関数に対して直交するからである）。これが、ロックイン増幅器が、位相感度が良い検出器である理由である。

サイン基準信号及び入力波形Ｕｉｎ（ｔ）に対して、ＤＣ出力信号Ｕｏｕｔ（ｔ）は、アナログロックイン増幅器に対して、

により算出されることができる。ここで、

は、ロックイン増幅器３１上でセットされることができる位相である（デフォルトではゼロにセットされる）。

実際的に、ロックイン増幅器の多くの用途は、基準信号に対する相対的な位相よりもむしろ信号振幅を回復することだけを必要とする。ロックイン増幅器は通常、信号の同相（Ｘ）及び異相（Ｙ）要素を両方測定して、それから大きさ（Ｒ）を算出することができる。

ロックイン増幅器３１から得られる結果として生じる理論的な同相信号が、図３Ｃに示される。この信号は、デジタルコードとして解釈されることができる。このコードは、値−１（第１の電極ペアのフィンガーと粒子が出会うとき）、０（電極ペアのフィンガーが与えられない位置で粒子が出会うとき）及び１（第２の電極ペアのフィンガーと粒子が出会うとき）からなる。異相信号は、類似するように見えるが、異なる振幅を持つ。

電気通信において、直接シーケンススペクトラム拡散（ＤＳＳＳ）は、既知の変調技術である。他のスペクトラム拡散技術と同様に、送信された信号は、変調される情報信号より多くの帯域幅を受け入れる。「スペクトラム拡散」という名前は、搬送波信号が、デバイスの送信周波数の完全な帯域幅（スペクトル）にわたり発生するという事実から来る。

直接シーケンス拡散スペクトル通信は、「ノイズ」信号により送信されるデータを増倍する。このノイズ信号は、オリジナル信号の周波数よりかなり高い周波数での、値１及び−１の疑似乱数のシーケンスである。これにより、オリジナル信号のエネルギーが非常に広いバンドへと拡散される。

結果として生じる信号は、「スタティック」である音声記録のような白色雑音に似ている。しかしながら、同じ疑似乱数のシーケンスによりそれを増倍することにより、このノイズのような信号は、受信側でオリジナルデータを正確に再構成するために用いられることができる（なぜなら、１ｘ１＝１であり、−１ｘ−１＝１だからである）。「逆拡散」としてこの処理は数学的に、受信機の設定されたシーケンスと送信されたＰＮ（擬似ノイズ）シーケンスとの相関を構成する。

逆拡散が正確に機能するには、送信及び受信シーケンスが同期化させられなければならない。これは、いくつかの種類のタイミング探索プロセスを介して、受信機がそのシーケンスを送信機シーケンスと同期化させることを必要とする。しかしながら、この見かけの欠点は、かなりの利点とすることができる。複数の送信機のシーケンスが互いに同期化される場合、受信機がそれらの間で行わなければならない相対的な同期は、相対的タイミングを決定するために用いられることができる。これは順に、送信機の位置が知られている場合、受信機の位置を算出するために用いられることができる。これは、多くの衛星ナビゲーションシステムの原理である。

チャネル上の信号対ノイズ比を強化するという結果として生じる効果は、処理ゲインと呼ばれる。この効果は、より長いＰＮシーケンスを使用することにより大きくされることができる。しかし、ＰＮシーケンスを生成するのに使用される物理デバイスは、達成できる処理ゲインに実際的な限度を課す。

望ましくない送信機が、同じチャネル上で、しかし異なるPNシーケンスを用いて（又は全くシーケンスなしで）送信する場合、逆拡散処理はその信号に関する処理ゲインを何ら生じさせない。この効果は、ＤＳＳＳのコード分割多重アクセス（ＣＤＭＡ）特性の原理である。これは、それらのPNシーケンスの相互相関特性の範囲内で複数の送信機が同じチャネルを共有することを可能にする。本発明の実施形態によれば、結果として生じる信号が直接シーケンススペクトラム拡散（ＤＳＳＳ）における疑似ノイズ（ＰＮ）コードに類似するよう、電極ペア２４ａ、２４ｂ；２５ａ、２５ｂのフィンガーが配置される。しかし、シーケンスが変化することができない点及び信号が同期化されない点が異なる。それは、単に１ビットのデータを送信するが、それが送信されたときの時間点を決定するようなものである。従って、本発明の実施形態によれば、信号の外観は、測定信号の移動部分に対してモデル曲線（図１Ｃにおける理論的な信号に類似する）にフィットさせることによりチェックされなければならない。

本発明の実施形態によれば、同じ粒子速度において、結果として生じる信号は、２つの非指型電極ペアを持つ従来技術に基づき得られる信号より一層長く、複雑である（より大きい帯域幅を持つ）。従って、本発明の実施形態に基づき測定される信号に適用される標準的な解析技術は、改善された感度を示す。

図３に関して上述されるように、コードシーケンスは、３レベルシークエンス（−１、０、１）とすることができる。なぜなら、正又は負のパルスを与えることになる電極だけでなく、電極間のすきまが使用されることができるからである。これは、コード最適化に関して更なるオプションを与える。別の実施形態では、２レベルシークエンスが得られることができる。

この技術のパフォーマンスは、マイクロ流体チャネル内部の流れプロファイルが放物線状であるという事実により複雑化される。従って、マイクロ流体チャネル２０の断面の異なる位置での粒子速度は異なることがありえる。これは、追加的なフィットパラメータをもたらす。追加的なフィットパラメータは、イベントの時間に加えて、イベントの速度とすることができる。無線システムでは、あらゆるものが光速と比較すると遅い。従って、時間におけるイベントだけを見つける必要がある。異なる速度での粒子は、時間において異なる態様で伸ばされる信号をもたらす。

ＤＳＳＳにおいてはノイズがコード長から独立しているが、本発明の実施形態では、探索された流体ボリュームと共にノイズが上がる。流体ボリュームが、（オプションで、互いに嵌合される）電極フィンガーの数（＝Ｎ）と共に上がるので、ノイズはｓｑｒｔ（Ｎ）で上がる。ノイズを拒絶する自己相関技術の能力は、ビット長Ｍと共に線形にスケール化される。これは、ゼロの包含が原因で、電極フィンガーの数Ｎより高くすることができる。従って、ノイズから信号を抽出する能力は、〜Ｍ／ｓｑｒｔ（Ｎ）により改善される。従って、例えば１３の電極シークエンスが、等しい数の適切に構成される隙間を持つ場合、有効な信号対ノイズにおいて〜７．２の有効なゲインを与える。コードシーケンスが長ければ長いほど、信号対ノイズ比における改善が大きくなる。したがって、指型電極においてより多くのフィンガーを持つことは、より有利である。

本発明の実施形態に基づき使用される擬似（ＰＮ）コードは、特定の数学的特性を必要とする。重要な特性は、シークエンスが時間においてそろえられるとき、良好な、例えば最大の自己相関を持つが、時間においてシフトされるとき、低い、例えば理想的にはゼロの自己相関を持つことである。これらの既知の例は、バーカーコード及びウィラードコードである。バーカーコードは、＋１及び１のＮ個の値ａ_ｊのシーケンスであり、ａ_ｊは、ｊ＝１...Ｎに対し、すべての

に関して、

となるようにされる。長さ７のバーカーコードの例は、＋１、＋１、＋１、−１、−１、＋１、−１である。これは、例えば図４に示される互いに嵌合された指型構造に対応する。

本発明の実施形態によるマイクロ流体工学にて用いられている技術に関して、異なる時間スケールで使用されるときこの信号が良好な自己相関特性を持つ場合、これは、コード最適化にとって更に有利である。この要件は、もし満たされる場合、複数の粒子が電極域にあるときでさえも異なる速度の粒子を区別することを可能にする。この要件は、コードシーケンスにおいてより多くのゼロを含める（即ち、フィンガー間の大部分はスペースであり、２、３の電極フィンガーだけが存在する）ことにより満たされることができる。これは、時間と空間との両方における自己相関特性がかなり良好であることをもたらす。不利な面は、物理的により長いチャネル２０を必要とすることである。これは、無線システムでは実際的ではない。なぜなら、各ビットを送信するのにより長い時間がかかるからである。従って、電極フィンガーがそれらの間の空間と比較して狭い場合には、例えば図９に示されるシーケンスは、本発明によるデバイスの良好な実施形態である。これは、電極フィンガーの間の空間をより大きくすることにより、又は、電極をより狭くすることにより得られることができる。実際には、電極長は好ましくは、チャネルの高さに類似し、従って、隙間を増加させることは、特に有利なソリューションである。

図５に示されるような、本発明の更なる実施形態において、第２の測定電極ペアを離した状態にすることが可能である。その場合、単一の測定電極ペア２４ａ、２４ｂだけが与えられる。図示される実施形態において、このペアの電極は、マイクロ流体チャネル２０の対向する側に配置される。本発明の実施形態によれば、電極ペアの両方の電極は指型である。この場合、コードは、平均してゼロになるわけではないが、平均は知られている。測定信号におけるオフセットは、粒子なしの流体の伝導率により与えられる。測定信号においてオフセットを取り除くために、電子手段が使用されることができる。例えば、平均を減算するため、例えばローパスフィルタリングされた信号をベースラインとして使用することにより、電子手段が使用される。チャネル２０のインピーダンスを測定する単一の指型電極ペア２４ａ、２４ｂに対して、これは、測定された信号が複数の後続の正のガウス分布状のピークになることを意味する。

ここで指型電極構造体を用いて、図５Ａ及び図５Ｂに示されるように特定のフィンガーを省く、即ちフィンガー間に隙間を作ると、上述したのと類似する手段により検出されることができる一つのガウス分布ピークの測定されたシークエンスがもたらされる。ここで、作成されたシークエンスは、値１と０とのシーケンスからなる純粋なバイナリコードに類似する。

本発明の更なる実施形態によれば、測定デバイスは、少なくとも１つの指型電極構造体を有することができる。この場合、電極構造体は、可変電極フィンガー幅及び／又は可変間隔幅を持つ。

例が、図９及び図１０に示され、図９では、電極フィンガー間のスペースを空間的に変化させることによりコードが変化され、図１０では、電極の幅を空間的に変化させることにより、コードが変化される。

本発明の更なる実施形態によれば、測定電極ペアの両方の電極は、チャネル２０の同じ側に配置されることができる。これは、図１１に示される。図示された実施形態において、第１の測定電極ペア２４ａ、８２及び第２の測定電極ペア２５、８２が与えられる。第１の電極２４ａ、２５ａは、互いに嵌合される指型電極である。第１及び第２の測定電極ペアの第２の電極は、両方のペアの互いに嵌合された第１の電極のフィンガー間を経由する共通電極８２である。

ロックイン増幅器３１から得られる結果として生じる理論的な同相信号が、図１１Ｃに示される。この信号は、−１（粒子が第２の電極ペアの第１の電極及び共通の第２の電極のフィンガー間に入るとき）、０（粒子が同じ電極の２つのフィンガー間の位置で出会うとき）及び１（粒子が第１の電極ペアの第１の電極及び共通の第２の電極のフィンガー間に入るとき）という値からなるデジタルコードとして解釈されることができる。

本発明の更に他の実施形態によれば（図示省略）、電子機器要素の不正確さによる測定信号におけるオフセットを取り除くため、基準電極が、粒子ストリームから物理的に保護される（従って、決して粒子はこのストリームを通過しない）マイクロ流体チャネル２０の一部に置かれることができる。指型電極である測定電極ペア２４ａ、２４ｂの少なくとも１つの電極を用いると、これは、測定された信号が正のガウス分布状ピークのシーケンスになるという同じ効果を持つ。

完全な血球算定（ＦＢＣ）は、赤血球（ＲＢＣ）及び様々な白血球（ＷＢＣ）だけでなく血小板（ＰＬＴｓ）の測定を含む。本発明の実施形態による方法を用いたＲＢＣ及びＷＢＣの測定は、比較的直接である。なぜなら、細胞が比較的大きく（＞７μｍ）、細胞が電極のフィンガーにわたり通過するとき生じる信号スパイクが、バックグラウンドノイズに対して容易に区別されることができるからである。しかしながら、血小板の平均直径は通常、赤血球の直径より２．４倍小さい。インピーダンス分光測定はボリュームに関連するので、典型的な血小板信号は、ＲＢＣ信号より１／１５小さい。チップ製造許容度及び（アナログの）電子的複雑さが最低限に保たれる低コストシステムにおいて、血小板スパイクは、信号のノイズレベル以下に落ちることができる。

インピーダンス測定による白血球の分析の特殊な場合において、信号対ノイズ比は、分化を３つの主な白血球タイプ、即ち、単球、顆粒白血球及びリンパ球に限定する。本発明の実施形態による新しいデバイスの設計は、５又は更にこれ以上の血球タイプ間の分化を可能にする。

従って、本発明の更なる実施形態によれば、テンプレートマッチング（相関）を使用することが提案される。イベントトリガーとしてテンプレートマッチを用いて（相関係数により測定される）、血小板イベントを記録する手段として、テンプレートパラメータによりイベントの受け入れ度を制限する。

本発明の実施形態による指型電極により規定される一連のガウス曲線により表される解析モデル曲線は、粒子を見つけるため、測定信号の部分と相関される。ここで、粒子は、特定の閾値を越える、結果として生じる相関係数により検出される。測定された信号のセクションだけが、ある時間でモデル曲線と相関され、選択されたセクションは、時間において測定された信号に沿って移動する。粒子の速度変動が原因で、各セクションは、複数の可能なモデル曲線と相関されなければならない。これは、モデル曲線パラメータを最適化することにより信号セクションにモデル曲線を基本的にフィットさせる手順に帰着する。結果として生じる相関係数は、このセクションがモデル曲線によりいかにうまく表されることができるかの尺度である。この方法は、信号の振幅のより正確な決定をもたらす。

上記の相互相関信号分析は、本発明による指型電極だけでなく、従来技術から知られるダブルガウス分布信号形状にも適用できる。その場合、２つの反対称のガウス曲線により表される解析曲線は、粒子を見つけるため、測定信号に対する第２の相関が行われる。この方法は、信号ノイズの更に下の粒子を検出するその能力だけでなく、この方法の感度を制限する信号の単純な（ダブルガウス分布）形状により制限される。

例として、この方法は、２つの反対称のガウス曲線を有する２つのピークケースに関して説明される。複数のピークへの拡張は、当業者の技術に含まれる。

テンプレート関数として、ｔ_０の周りの２つのポイントスプレッド関数が使用されることができる。この関数は、

によりセパレートされ、ここで、幅は

であり、非標準正規化係数は

である。

以下において、

の依存性が暗示されることになる。表記は単にｇとなる。また、パラメータω及びσが代替的に使用されることになる。これは、比較的任意の表記理由のためになされる。測定されたデータｆ（ｔ）に関するテンプレート関数の投影（又は、内積、たたみ込み、相関又は要素）は、

により与えられる。

ここで、

であることは明らかである。２次モーメント（又はＬ^２ノルム）に関して、

であることが分かる。

従って、Ｌ２ノルムは、

から独立している。

データにフィットする最良のテンプレート関数を見つける最小二乗法の問題は、

として定義される。ここで、αは、振幅スケーリング係数である。これを展開すると、

となる。

最初の２項は、

から独立しており、ちょうど

に対して式（９）の最小を見つけることは、最後のドット積項の最大を見つけることに等しい。書き下すと、

となる。

この最大及び

に対して、振幅に関する２次式が得られ、

により与えられる。

この放物線の最小が、

にある。

従って、４Ｄ（４つのパラメータ）検索において最小二乗法における最小を見つける方法、又は３Ｄ（３つのパラメータ）検索を用いて相関における最大を見つけ、その後、式（１０）を用いてこの相関から振幅を算出することは、等しい。

図６は、低周波数信号の同相の要素の典型的な跡を示す。表面は、

の値の範囲に関する

を示す。表面プロット線は、明確な最大を呈し、これは、トレースの始まりからの値ｔ_０＝１．２ｍｓに対応し、

が成り立つ。

を算出するのに使用される幅パラメータは、ω＝０．３にセットされた。測定されたトレースｆ（ｔ）及び最良のフィットである

が、挿入図に示される。見て分かるように、良好なフィットが得られる。

十分に小さなωに対して、ピーク対ピーク値は、

により与えられる。

上記において、相関は、最小二乗フィットに関するプロキシとして使用された。相関係数は、そのフィットの品質に関する尺度を与える。この数は、測定又はフィットを受け入れるか又は拒絶するために用いられることができる。統計において、２つの（確率的な）変数間の相関係数が、

により与えられる。

この場合は、測定ｆ（ｔ）及び最小二乗法フィット

は、Ｅ（ｆ）＝Ｅ（ｇ）＝０となる確率的な変数として解釈され、以下の式

が得られる。

記載される方法は、比較的雑音が多いシステム内の血小板イベントを測定するために用いられることができる。例えば、それは、Cheungらによる「Impedance spectroscopy flow cytometry: On-chip label- free cell differentiation」、Cytometry Part A vol 65A, pp.124-132, 2005にて説明されるように、測定と共に使用されることができる。

図７は、結果として生じるトレースを上の図において示す。ライン７０は、従来のイベント検出において使用されるトリガーレベルを示す。次の図は、０から１へのスケールで、最大相関係数（ｃｃ）レベルを示す。これは、ｔ_０の関数として

を変化させることにより実現されることができる。見て分かるように、ｃｃトレースは、ほとんどの時間において上の図におけるはっきり識別可能な（ＲＢＣ）イベントに対応するピークを示す。いくつかのイベント（７ｍｓ周辺）は、２倍又は３倍の細胞イベントとして解釈されることができる。特に興味深いのは２２ｍｓ周辺でのイベントである。相関係数は明確にピークを示すが、上の図では、何らイベントが見られることができない。３つ目のダイアグラムにおける振幅トレースもピークを示し、４つ目及び５つ目のダイアグラムにおけるω及びｔ_δパラメータも許容可能な値を示す。このイベントは、血小板イベントとして解釈される。

また、特筆すべきは、１２ｍｓ周辺でのイベントである。ここで、相関係数は、トリガーレベル７１を５０％以上超えて上昇するが、しかし、４つ目及び５つ目のダイアグラムにおける他のパラメータは、物理値に対応しない。例えば、ｔ_δは、現実の細胞又は粒子が、チャネルにおける電極の２つのセットの間の距離を横断するにはあまりに短く、又はωは、どんなに小さくても有限サイズの電極にわたり横断する粒子に対応するにはあまりに小さい。こうして、斯かるイベントは、ノイズに帰着され、拒絶される。

図７におけるトレースは、典型的な実験における何千ものトレースを表す。

本発明が図面及び前述の説明において詳細に図示され及び説明されたが、斯かる図示及び説明は、説明的又は例示的であると考えられ、本発明を限定するものではない。本発明は、開示された実施形態に限定されるものではない。

例えば、２つ以上の電極ペアが与えられる実施形態において本発明を作動させることが可能である。この実施形態は、検出電子機器におけるより大きな複雑さを代償にして生じる。

図面、開示及び添付された請求項の研究から、開示された実施形態に対する他の変形が、請求項に記載の本発明を実施する当業者により理解され、実行されることができる。請求項において、単語「有する」は他の要素又はステップを除外するものではなく、不定冠詞「ａ」又は「ａｎ」は複数性を除外するものではない。シングルプロセッサ又は他のユニットが、請求項に記載される複数のアイテムの機能を満たすことができる。特定の手段が相互に異なる従属項に記載されるという単なる事実は、これらの手段の組み合わせが有利に使用されることができないことを示すものではない。

本発明の特定の特徴又は側面を説明するときの特定の用語の使用が、この用語が関連付けられる本発明の特徴又は側面の任意の特定の特性を含むよう限定されるべく、この用語が本書において再定義されることを意味するものとし解釈されるべきではない点に留意されたい。

Claims (14)

1. 搬送液体に懸濁される粒子を調査する測定デバイスであって、前記粒子の電気的測定を行う測定電極の第１のペアを少なくとも有し、前記測定電極のペアにおける少なくとも１つの電極が、複数のフィンガーを持つ指型電極であり、前記フィンガーが、空間的に不規則なパターンで配置される、測定デバイス。
2. 前記電極ペアの両方の電極が、指型電極である、請求項１に記載の測定デバイス。
3. 前記パターンが、正規化された自己相関特性を定めるシーケンスコードを定める信号を生成するよう構成される、請求項１に記載の測定デバイス。
4. 前記シーケンスコードが、疑似乱数シークエンスに対応する、請求項３に記載の測定デバイス。
5. 測定電極の第２のペアを更に有する、請求項１に記載の測定デバイス。
6. 前記測定電極の第２のペアが、少なくとも１つの指型電極を持ち、前記電極の第１のペアにおける１つの電極の前記フィンガーは、前記電極の第２のペアにおける１つの電極の前記フィンガーと互いに嵌合される、請求項５に記載の測定デバイス。
7. 少なくとも１つの指型電極構造体が、可変電極フィンガー幅及び／又は可変間隔幅を持つ、請求項１乃至６のいずれかに記載の測定デバイス。
8. 請求項１に記載の測定デバイスを有するマイクロ流体システム。
9. 請求項８に記載のマイクロ流体システムを有する細胞ソーター。
10. 搬送液体において懸濁される粒子を調査する方法において、
    少なくとも１つの測定電極ペアを用いて少なくとも１つの粒子に関する電気的測定処理を行い、測定信号を生成するステップであって、前記電極ペアにおける少なくとも１つの電極が、空間的に不規則なパターンで配置される複数のフィンガーを持つ指型電極である、ステップと、
    前記搬送液体における粒子の存在を前記測定信号から決定するステップとを有する、方法。
11. 電気的測定処理を実行するステップが、インピーダンス測定を行うステップを有する、請求項１０に記載の方法。
12. 電気的測定処理を実行するステップが、インピーダンス分光法を行うステップを有する、請求項１１に記載の方法。
13. 基準測定を行うステップと、前記測定信号と前記基準測定の結果とを比較するステップとを更に有する、請求項１０に記載の方法。
14. 前記搬送液体における粒子の存在を前記測定信号から決定するステップが、前記少なくとも１つの測定電極ペアの前記フィンガー間の粒子の通過を表すモデル曲線を前記測定信号のセクションと相関させるステップと有し、前記電極ペアにおける少なくとも１つの電極が、複数のフィンガーを持つ指型電極である、請求項１０に記載の方法。

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