JP5435722B2 - スーパーオキシドの分析方法およびスーパーオキシドの分析キット - Google Patents
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Description
本実施形態に係るスーパーオキシドの分析方法は、化学発光法によりスーパーオキシドを分析する方法であって、ニトロキシルラジカルの存在下で、発光試薬としてウミホタルルシフェリン系化合物を用いる。
(構造式(1)において、R1〜R4は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数1〜20のアルキル基、炭素数2〜20のアルケニル基、炭素数2〜20のアルキニル基、炭素数6〜20のアリール基、炭素数7〜20のアラルキル基、インドリル基であり、それらは置換基を有していてもよい炭素数1〜20のアルキル基;置換基を有していてもよい炭素数1〜20のアルコキシ基;ヒドロキシ基;炭素数1〜20のアルキル基、炭素数1〜20のアルコキシ基を有していてもよいフェニル基で置換されていてもよい。)
オン(FCLA Free Acid)、[2−[4−[4−[3,7−ジヒドロ−2−メチル−3−オキソイミダゾ[1,2−a]ピラジン−6−イル]フェノキシ]ブチルアミド]エチルアミノ]スルホローダミン(Red−CLA)等が挙げられる。
(構造式(4)〜(7)において、R5〜R8は、それぞれ独立して、水素原子、炭素数1〜20のアルキル基、炭素数2〜20のアルケニル基、炭素数2〜20のアルキニル基、炭素数7〜20のアラルキル基、もしくはインドリル基であり、それらは炭素数1〜20のアルキル基、炭素数1〜20のアルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基等で置換されていてもよい。また、R5とR6、R7とR8はそれぞれで炭素数3〜8のスピロ環を形成していてもよく、それらは炭素数1〜20のアルキル基、炭素数1〜20のアルコキシ基、ヒドロキシ基、カルボキシル基、アミノ基等で置換されていてもよい。ただし、スピロ環に酸素、イオウ、窒素などのヘテロ原子を含んでいてもよい。一方、R9は、水素原子、ヒドロキシ基、カルボキシル基、カルバモイル基、アミノ基、シアノ基、アセトアミド基、2−クロロアセトアミド基、2−ヨードアセトアミド基、イソチオシアナト基、炭素数1〜20のアルキル基、炭素数1〜20のアルコキシ基、オキソ基、炭素数1〜20のアルキル基によるモノ置換あるいはジ置換アミノ基、独立して炭素数1〜20のアルキル基を3つ有するアンモニウム基であり、これらアルキル基はヒドロキシル基、カルボキシル基、アミノ基等を有していてもよい。)
本発明の実施形態に係るスーパーオキシドの分析キットは、化学発光法によりスーパーオキシドを分析するための分析キットであって、ウミホタルルシフェリン系化合物と、ニトロキシルラジカルと、必要に応じてpH調整剤と、必要に応じて溶媒とを含む。また、本実施形態に係るスーパーオキシドの分析キットは、ウミホタルルシフェリン系化合物と溶媒と必要に応じてpH調整剤とを含むウミホタルルシフェリン系化合物含有溶液と、ニトロキシルラジカルと溶媒と必要に応じてpH調整剤とを含むニトロキシルラジカル含有溶液とを含むものであってもよい。
[ニトロキシルラジカルの存在による発光強度の増加の確認]
ウミホタルルシフェリン系化合物として2−メチル−6−(4−メトキシフェニル)−イミダゾピラジノン(MCLA)の13μmol/L水溶液を10μLと、ニトロキシルラジカルである4−ヒドロキシ−2,2,6,6−テトラメチルピペリジン−1−オキシル(TEMPOL)の2.5mmol/L水溶液を25μLと、pH調整剤として4−(2−ヒドロキシエチル)−1−ピペラジンエタンスルホン酸(HEPES)緩衝液(20mM、pH7.4)を500μLと、スーパーオキシド生成系(4.0×10−6mol・L−1・min−1)としてヒポキサンチンの2mmol/L水溶液を25μLおよびキサンチンオキシダーゼ(XOD)の0.4u/mL水溶液を10μLとを混合して、測定サンプル(1)を調製した(実施例)。また、ウミホタルルシフェリン系化合物として2−メチル−6−フェニル−イミダゾピラジノン(CLA)を使用した以外は同様にして、測定サンプル(2)を調製した(実施例)。
測定サンプル(1)〜(4)について、発光測定装置としてアロカ(株)製AccuFLEX Lumi400型を用いて、37℃で低速反転による撹拌を行いながら発光測定を行った。時間に対する発光強度を図1(MCLA:測定サンプル(1),(3))および図2(CLA:測定サンプル(2),(4))に示す。
ニトロキシルラジカルとして、2,2,6,6−テトラメチルピペリジン−1−オキシル(TEMPO)、3−カルボキシ−2,2,5,5−テトラメチルピロリジン−1−オキシル(PROXYL−COOH)、3−カルバモイル−2,2,5,5−テトラメチルピロリジン−1−オキシル(PROXYL−CONH2)を用いた以外は、測定サンプル(1)と同様にして、測定サンプル(5)、測定サンプル(6)、測定サンプル(7)をそれぞれ調製した。
スーパーオキシドの特異的消去剤としてスーパーオキシドジスムターゼ(SOD)の2.6u/mL水溶液を50μL添加した以外は、測定サンプル(1)と同様にして、測定サンプル(8)を調製した。
ニトロキシルラジカルによる効果と、単に発光試薬(MCLA)の濃度を増やしたときとの違いを、スーパーオキシド生成酵素キサンチンオキシダーゼ(XOD)の量を変えて比較した。MCLAの13μmol/Lの水溶液を10μL、TEMPOLの2.5mmol/Lの水溶液を25μL、ヒポキサンチンの2mmol/Lの水溶液を25μL、HEPES緩衝液(20mmol/L、pH7.4)を500μLを混合して、測定サンプル(9)および測定サンプル(11)を調製した。MCLAの13μmol/Lの水溶液を120μL用い、HEPES緩衝液(20mmol/L、pH7.4)を415μLにして、TEMPOLを添加しない以外は、測定サンプル(9)と同様にして測定サンプル(10)を調製した。MCLAの13μmol/Lの水溶液を40μL用い、HEPES緩衝液(20mmol/L、pH7.4)を495μLにして、TEMPOLを添加しない以外は、測定サンプル(9)と同様にして測定サンプル(12)を調製した。
発光強度のスーパーオキシド発生量依存性を検証した。スーパーオキシド生成酵素キサンチンオキシダーゼ(XOD)の量を変えて、測定サンプル(13)〜(21)を調製した。加えたキサンチンオキシダーゼ(XOD)の量は、0.004u、0.002u、0.001u、0.0005u、0.00025u、0.000125u、0.0000625u、0.0000343u、0.0000171uとした。
発光試薬と過酸化水素、一重項酸素との反応に対するニトロキシルラジカル存在の影響を検証した。MCLAの40μmol/Lの水溶液を10μL、TEMPOLの2.5mmol/Lの水溶液を25μL、過酸化水素水0.95mol/Lを20μL、HEPES緩衝液(20mmol/L、pH7.4)を500μLを混合して、測定サンプル(22)を調製した。TEMPOLを添加しない以外は測定サンプル(22)と同様にして、測定サンプル(23)を調製した。
Claims (2)
- 化学発光法によりスーパーオキシドを分析する方法であって、
ニトロキシルラジカルの存在下で、発光試薬としてウミホタルルシフェリン系化合物を用いることを特徴とするスーパーオキシドの分析方法。 - 化学発光法によりスーパーオキシドを分析するための分析キットであって、
ウミホタルルシフェリン系化合物と、
ニトロキシルラジカルと、
を含むことを特徴とするスーパーオキシドの分析キット。
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JP2010012288A JP5435722B2 (ja) | 2010-01-22 | 2010-01-22 | スーパーオキシドの分析方法およびスーパーオキシドの分析キット |
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