JP6449632B2 - フルオレセイン誘導体またはその塩、グルタチオン−s−トランスフェラーゼ測定用蛍光プローブ、およびこれを用いたグルタチオン−s−トランスフェラーゼ活性の測定方法 - Google Patents
フルオレセイン誘導体またはその塩、グルタチオン−s−トランスフェラーゼ測定用蛍光プローブ、およびこれを用いたグルタチオン−s−トランスフェラーゼ活性の測定方法 Download PDFInfo
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で表されるフルオレセイン誘導体またはその塩が提供される。
(1)上記フルオレセイン誘導体またはその塩を、還元型グルタチオンの存在下でグルタチオン−S−トランスフェラーゼと反応させる工程;および、
(2)反応の前後における蛍光の変化を検出する工程、
を含む、測定方法が提供される。
(1)本発明により提供されるフルオレセイン誘導体(一般式(1)で表される化合物)またはその塩を、還元型グルタチオン(GSH)の存在下でグルタチオン−S−トランスフェラーゼ(GST)と反応させる工程;および、
(2)反応の前後における蛍光の変化を検出する工程、
を含むものである。一般式(1)で表される化合物を各種試料中のGSTと反応させることで強蛍光性の化合物(グルタチオン化体)を生成させ、この化合物(グルタチオン化体)の蛍光を測定することにより、試料中のGST活性を測定することができる。
従来公知の文献(Synthesis 2009, 7; 1224-1226(非特許文献6)およびJ Am Chem Soc. 2008, 130(44):14533-14543(非特許文献5))に記載の手法を参照し、下記の合成スキームに従って本発明に係るフルオレセイン誘導体(下記の合成スキームに記載の化合物(5)(「3,4−DNADCF」とも称する))を合成した。
上記で合成した化合物(5)(3,4−DNADCF)および従来公知(非特許文献5に記載)の蛍光プローブであるDNAF1(化合物(5)(3,4−DNADCF)における2つの塩素原子がともに水素原子で置換された構造を有する化合物)について、GSTによる反応前後での吸収スペクトルおよび(反応生成物の)蛍光スペクトルのpH依存性を比較した。
上記で合成した3,4−DNADCFについて、GSHとの酵素非依存的な反応性の指標である二分子反応速度定数k2のpH依存性を比較した。
上記で合成した3,4−DNADCFについて、GSTによる反応前後における吸収強度および(反応生成物の)蛍光強度のpH依存性を比較した。
上記で合成した3,4−DNADCFについて、異なるpH条件下でのGSTとの反応による蛍光強度の経時的な変化を測定した。
上記で合成した3,4−DNADCFについて、GSTおよび還元型グルタチオンの存在下における反応液組成の経時的な変化をHPLC(高速液体クロマトグラフィー)法により測定した。
上記で合成した3,4−DNADCFについて、種々の種類および濃度のGSTを用いてGST活性を測定した場合の蛍光強度の経時的な変化を測定した。
(A)GSTA1−1、(B)GSTM1−1、(C)GSTP1−1、および(D)GSTnoboの4種の異なるGSTを用いて、3,4−DNADCFの酵素反応速度論を比較した。具体的には、種々の濃度の3,4−DNADCFを100mMリン酸バッファー(pH6.5;DMSO0.1%を共溶媒として用いた)に溶解し、1mM還元型グルタチオン(GSH)の存在下、所定の濃度(GSTA1−1:13ng/ml、GSTM1−1:33ng/ml、GSTP1−1:7.9ng/ml、GSTnobo:50ng/ml)になるように各酵素を加え、室温(25℃)で5分間蛍光強度を測定した。それぞれの濃度における初速度(蛍光強度上昇が線形)を算出し、ミカエリスメンテン式V=Vmax/([S]+KM)(Vmaxは最大反応速度、[S]は基質濃度、KMはVmax/2の速度を与える基質濃度)を用いて回帰曲線を作成した。得られたミカエリスメンテンプロットを図8(A)〜(D)に示す。また、図8に示す結果から算出された各GSTにおける酵素反応速度論的パラメータを下記の表2に示す。
10種のヒトGST(hGST)およびキイロショウジョウバエ由来GSTnobo(DmGSTnobo)について、比活性(タンパク質1mg当たりの活性)を比較した。具体的には、1μMの3,4−DNADCFを100mMリン酸バッファー(pH6.5、0.005% Tween20、DMSO0.1%を共溶媒として用いた)に溶解し、100μMの還元型グルタチオン(GSH)の存在下、室温(25℃)にて撹拌しながら反応させた。この際、酵素濃度の変化に対して反応速度が線形性を示す領域の酵素濃度を用いた。そして、マルチウェルプレートリーダー(SH−9000、コロナ電気株式会社)を用い、蛍光強度を10秒ごとに1000秒間測定した(励起/蛍光波長 505/525nm)。それぞれの酵素濃度から得られた反応速度から、比活性(1分間当たり1mgのGSTが触媒する3,4−DNADCFのナノモル数)を算出した。結果を下記の表3に示す。
Claims (5)
- 下記一般式(1):
で表されるフルオレセイン誘導体またはその塩。 - logP値が5.2以下である、請求項1に記載のフルオレセイン誘導体またはその塩。
- R1、R2、R3、R4、R5およびR6が水素原子であり、X1およびX2が塩素原子である、請求項1または2に記載のフルオレセイン誘導体またはその塩。
- 請求項1〜3のいずれか1項に記載のフルオレセイン誘導体またはその塩を含む、グルタチオン−S−トランスフェラーゼ測定用蛍光プローブ。
- グルタチオン−S−トランスフェラーゼ活性の測定方法であって、下記の工程:
(1)請求項1〜3のいずれか1項に記載のフルオレセイン誘導体またはその塩を、還元型グルタチオンの存在下でグルタチオン−S−トランスフェラーゼと反応させる工程;および、
(2)反応の前後における蛍光の変化を検出する工程、
を含む、測定方法。
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