JP6274585B2

JP6274585B2 - 酸素検出剤

Info

Publication number: JP6274585B2
Application number: JP2016096349A
Authority: JP
Inventors: 洋介内山; 弘子丸山; 文貴川上; 維宏澤村
Original assignee: Kitasato Institute
Current assignee: Kitasato Institute
Priority date: 2016-05-12
Filing date: 2016-05-12
Publication date: 2018-02-07
Anticipated expiration: 2036-05-12
Also published as: JP2017203719A

Description

本発明は、酸素検出剤及びその使用に関する。より具体的には、酸素検出剤、９−アミノアントラセン（以下、「９ＡＡ」という場合がある。）又はその誘導体の安定化剤、蛍光組成物、９ＡＡ又はその誘導体の安定化方法に関する。

蛍光物質には、天然の動植物から抽出された天然物と人工的に合成された非天然物が存在する。天然物は、大量の動植物から選択的に抽出しなければならないため、大量に得ることが困難な場合があるが、非天然物は、人工的な合成により大量に得ることが比較的容易である。

非天然物の緑色蛍光物質の１つとして、下記式（１）で表される９−アミノアントラセン（以下、「９ＡＡ」という場合がある。）が知られている（例えば、非特許文献１を参照）。９ＡＡは、波長約４２０ｎｍの励起光を照射すると、波長約５１０ｎｍの蛍光を発する化合物である。９ＡＡは、カラムクロマトグラフィーや再結晶等による分離を必要としない方法により、研究室レベルでも数１０ｇのオーダーで合成することができる。このため、工場レベルで大量生産することにより安価に提供することができる。

H. Prichystalova, et al., N-Triazinyl Derivatives of 1- and 9-aminoanthracene: Synthesis and Photo-Physical Properties, J. Fluoresc., 23, 425-437, 2013.

しかしながら、９ＡＡ又はその誘導体は、不安定で徐々に分解し、例えば大気中では数十秒で退色するため、その利用が限られている。そこで、本発明は、９ＡＡ又はその誘導体の新たな用途を提供することを目的とする。

本発明は以下の態様を含む。
［１］９−アミノアントラセン（９ＡＡ）又はその誘導体を有効成分として含有する、酸素検出剤。
［２］低酸素領域の可視化用である、［１］に記載の酸素検出剤。
［３］９ＡＡ又はその誘導体が存在する環境から酸素を除去する工程を備える、９ＡＡ又はその誘導体の安定化方法。

本発明によれば、９ＡＡ又はその誘導体の酸素検出剤としての用途を提供することができる。

（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ、実験例１において、酸素の非存在下で１６、２４、７２時間放置後のサンプルの^１ＨＮＭＲスペクトルの測定結果を示すグラフである。（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）は、それぞれ、実験例１において、酸素の存在下で１．５、１６、２４、７２時間放置後のサンプルの^１ＨＮＭＲスペクトルの測定結果を示すグラフである。（ａ）は、実験例２における、エタノールアミンを添加したサンプルの^１ＨＮＭＲスペクトルの測定結果を示すグラフである。（ｂ）は実験例２における、対照サンプルの^１ＨＮＭＲスペクトルの測定結果を示すグラフである。

［９ＡＡの分解過程］
発明者らは、９ＡＡの分解過程を^１ＨＮＭＲ測定により追跡した。下記スキーム（１）に、発明者らが追跡した９ＡＡの分解過程を示す。スキーム（１）に示すように、９ＡＡは酸化によりアントラキノンモノイミン（以下、「ＡＱＮＨ」という場合がある。）に変換され、更にＡＱＮＨは加水分解によりアントラキノン（以下、「ＡＱ」という場合がある。）に変換される。

また、酸性条件下では、９ＡＡは９ＡＡＨ^＋との平衡状態にあるため、酸化が遅くなる傾向にある。すなわち、酸性条件下では、９ＡＡの蛍光が維持される傾向にある。また、実施例において後述するように、エタノールアミンの存在下では、９ＡＡの酸化が抑制される。

したがって、酸素の非存在下では９ＡＡは安定であり、酸素の存在下では上記の反応により９ＡＡがＡＱＮＨに変換される。また、酸素の存在下であってもエタノールアミンを共存させることにより、９ＡＡのＡＱＮＨへの変換を抑制することができる。

［酸素検出剤］
１実施形態において、本発明は、９ＡＡ又はその誘導体を有効成分として含有する、酸素検出剤を提供する。

（９ＡＡ又はその誘導体）
本実施形態の酸素検出剤において、９ＡＡの誘導体としては、例えば、下記式（２）で表される化合物が挙げられる。式（２）中、Ｒ^１は水素原子又は炭素数１〜６のアルキル基を表し、Ｒ^２はそれぞれ独立に水素原子、ハロゲン原子、炭素数１〜６のアルキル基又は炭素数１〜６のアルコキシ基を表す。上記のハロゲン原子としては、フッ素原子、塩素原子、臭素原子又はヨウ素原子が挙げられる。

９ＡＡ又はその誘導体は、波長約４２０ｎｍの励起光を照射すると波長約５１０ｎｍの蛍光を発する。しかしながら、上述したように、９ＡＡ又はその誘導体は、酸素の存在下では、それぞれＡＱＮＨ又はＡＱＮＨに対応する化合物に変換され、上記の蛍光を発しなくなる。

そこで、この性質を利用して、９ＡＡ又はその誘導体を酸素の検出に用いることができる。具体的には、例えば、酸素の存在を検出する対象となる試料に９ＡＡ又はその誘導体を添加する。続いて、試料に波長約４２０ｎｍの励起光を照射し、前記９ＡＡ又はその誘導体が発する波長約５１０ｎｍの蛍光を検出する。その結果、波長約５１０ｎｍの蛍光が検出された場合には、試料中に酸素が存在しないと判断することができる。逆に、波長約５１０ｎｍの前記蛍光が検出されなかった場合には、試料中に酸素が存在し、９ＡＡ又はその誘導体は、それぞれＡＱＮＨ又はＡＱＮＨに対応する化合物に変換されたと判断することができる。

いいかえると、本発明の一態様は、試料中の酸素の存在を検出する方法であって、前記試料に９ＡＡ又はその誘導体を添加する工程と、前記９ＡＡ又はその誘導体に波長約４２０ｎｍの励起光を照射する工程と、前記９ＡＡ又はその誘導体が発する波長約５１０ｎｍの蛍光を検出する工程と、を備え、波長約５１０ｎｍの前記蛍光が検出されることが、前記試料中に酸素が存在しないことを示し、波長約５１０ｎｍの前記蛍光が検出されないことが、前記試料中に酸素が存在することを示す方法を提供するものであるということができる。

本実施形態の酸素検出剤は、試料中の低酸素領域の可視化用に用いることもできる。より具体的には、例えば、本実施形態の酸素検出剤を、生体組織切片等の試料中の低酸素領域をイメージングする等の用途に用いることができる。

実施例において後述するように、発明者らは、９ＡＡ又はその誘導体の生体に対する毒性が低いことを明らかにした。したがって、本実施形態の酸素検出剤は、培養容器中の生細胞や組織等の試料に適用することもできる。

［安定化剤］
１実施形態において、本発明は、エタノールアミンを有効成分として含有する、９ＡＡ又はその誘導体の安定化剤を提供する。

実施例において後述するように、発明者らは、エタノールアミンが共存すると、酸素の存在下であっても９ＡＡのＡＱＮＨへの変換が抑制されることを見出した。したがって、エタノールアミンは９ＡＡ又はその誘導体の安定化剤として利用することができる。

［蛍光組成物］
１実施形態において、本発明は、９ＡＡ又はその誘導体、及びエタノールアミンを含有する、蛍光組成物を提供する。本実施形態の蛍光組成物中の９ＡＡは、ＡＱＮＨへの変換が抑制されているため、長期間安定に９ＡＡ又はその誘導体に由来する蛍光を発することができる。

［９ＡＡ又はその誘導体の安定化方法］
１実施形態において、本発明は、９ＡＡ又はその誘導体が存在する環境から酸素を除去する工程を備える、９ＡＡ又はその誘導体の安定化方法を提供する。実施例において後述するように、酸素の非存在下では、９ＡＡはＡＱＮＨに変換されず、安定に存在することができる。したがって、本実施形態の安定化方法によって、９ＡＡ又はその誘導体を安定化し、その蛍光を維持することができる。

別の１実施形態において、本発明は、９ＡＡ又はその誘導体にエタノールアミンを添加する工程を備える、９ＡＡ又はその誘導体の安定化方法を提供する。実施例において後述するように、酸素の存在下であっても、エタノールアミンを共存させることにより、９ＡＡのＡＱＮＨへの変換を抑制することができる。したがって、本実施形態の安定化方法によって、９ＡＡ又はその誘導体を安定化し、その蛍光を維持することができる。

次に実施例を示して本発明を更に詳細に説明するが、本発明は以下の実施例に限定されるものではない。

［実験例１］
酸素と９ＡＡとの反応を検討した。具体的には、酸素の非存在下及び存在下において、９ＡＡの分解反応を^１ＨＮＭＲスペクトル測定により追跡した。まず、Ｊ−Ｙｏｕｎｇバルブ付き５φＮＭＲ管中で、９ＡＡ（３．４６ｍｇ、０．１５ｍｍｏｌ）のＣＤＣｌ_３（０．５ｍＬ）溶液を調製し、キャピラリーを通じて窒素を５分間バブリングさせた。続いて、窒素を吹き込みながらバルブを閉じた。続いて、バルブを閉じてから１６、２４、７２時間後の^１ＨＮＭＲスペクトルを測定した。

図１（ａ）、（ｂ）、（ｃ）は、それぞれ、バルブを閉じてから１６、２４、７２時間後の^１ＨＮＭＲスペクトルの測定結果を示すグラフである。その結果、低酸素条件下（窒素存在下）では、７２時間経過しても９ＡＡの分解（ＡＱＮＨへの変換）は観察されなかった。

続いて、上記のＮＭＲ管に、キャピラリーを通じて酸素を５分間バブリングさせた後、バルブを閉じた。続いて、バルブを閉じてから１．５、１６、２４、７２時間後の^１ＨＮＭＲスペクトルを測定した。

図１（ｄ）、（ｅ）、（ｆ）、（ｇ）は、それぞれ、バルブを閉じてから１．５、１６、２４、７２時間後の^１ＨＮＭＲスペクトルの測定結果を示すグラフである。その結果、酸素の存在下では、１．５時間後に９ＡＡの分解（ＡＱＮＨへの変換）が観察された。以上の結果から、酸素により９ＡＡがＡＱＮＨに酸化されることが明らかとなった。

［実験例２］
酸素存在下での９ＡＡの分解に対するエタノールアミンの影響を検討した。具体的には、５φＮＭＲ管中で、９ＡＡ（２．３４ｍｇ、０．１２ｍｍｏｌ）のＤＭＳＯ−ｄ_６（０．２５ｍＬ）溶液にＤ_２Ｏ（０．２５ｍＬ）及びエタノールアミン（１０μＬ）を添加したサンプルを作製した。対照として、エタノールアミン（１０μＬ）を添加しない点以外は上記と同様のサンプルを作製した。続いて、各サンプルにキャピラリーを通じて窒素を５分間バブリングさせた。続いて、窒素を吹き込みながらバルブを閉じた。バルブを閉じてから経時的に３日間^１ＨＮＭＲスペクトルを測定した。その結果、いずれのサンプルにおいてもスペクトルに変化は観察されなかった。

続いて、上記の各サンプルに、キャピラリーを通じて酸素を５分間バブリングさせた後、バルブを閉じた。続いて、バルブを閉じてから経時的に２日間^１ＨＮＭＲスペクトルを測定した。その結果、いずれのサンプルにおいてもスペクトルに変化は観察されなかったが、白色の不溶物の生成が観察された。

そこで、各サンプル（０．０５ｍＬ）をＣＤＣｌ_３（０．５ｍＬ）に溶解させ、^１ＨＮＭＲスペクトルを測定した。図２（ａ）はエタノールアミンを添加したサンプルの^１ＨＮＭＲスペクトルの測定結果を示すグラフである。図２（ｂ）は対照サンプルの^１ＨＮＭＲスペクトルの測定結果を示すグラフである。

その結果、エタノールアミンの存在下では、９ＡＡのＡＱＮＨへの分解が抑制されることが明らかとなった。これに対し、エタノールアミンの非存在下（対照）では、９ＡＡのＡＱＮＨへの分解が認められた。

［実験例３］
９ＡＡの毒性を検討した。具体的には、まず、ヒト胎児由来の腎細胞株であるＨＥＫ２９３ＦＴ細胞を、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）を含有するＤＭＥＭ培地（高グルコース）中、３×１０^４個／ウェルで９６ウェルプレートに播種し、５％ＣＯ_２、３７℃の環境下で２時間インキュベートし、細胞をウェルの底に沈着させた。

続いて、細胞の培地を、９ＡＡを終濃度が０、１、３、１０、１００、１０００μＭとなるように添加した１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地（高グルコース）に交換し、５％ＣＯ_２、３７℃の環境下で２４時間インキュベートした。

続いて、ＭＴＴ試験により細胞の生存を検討した。ＭＴＴ試験には、ＷＳＴ−８（２−（２−メトキシ−４−ニトロフェニル）−３−（４−ニトロフェニル）−５−（２，４−ジスルホフェニル）−２Ｈ−テトラゾリウム，１ナトリウム塩、同仁化学）を使用した。細胞の培地を、ＷＳＴ−８を含有する１０％ＦＢＳ−ＤＭＥＭ培地（高グルコース）に交換し、５％ＣＯ_２、３７℃の環境下で２時間インキュベートした後、プレートリーダーを用いてＷＳＴ−８ホルマザンの４５０ｎｍの吸光を測定した。

その結果、０、１、３、１０、１００、１０００μＭのいずれの濃度の９ＡＡの存在下においても、吸光度の値は１．２〜１．４であった。この結果は、上記の濃度の範囲において、９ＡＡが毒性を有しないことを示す。

本発明によれば、９ＡＡ又はその誘導体の、細胞毒性の無い酸素検出剤としての用途を提供することができる。

Claims

９−アミノアントラセン（９ＡＡ）又はその誘導体を有効成分として含有する、酸素検出剤。
酸素が存在しない領域の可視化用である、請求項１に記載の酸素検出剤。