JP5415326B2 - アッセイ緩衝剤、それを含有する組成物、及びその使用方法 - Google Patents
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Description
(1) pH緩衝剤とリン酸特異的抗体を含み、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物。
(2) pH緩衝剤とリン酸特異的抗体を含み、無機リン酸塩を実質的に含まない、アッセイに適した組成物。
(3) pH緩衝剤と、リンペプチド特異的抗体と、前記リンペプチド特異的抗体に結合するリンペプチドとを含み、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物。
(4) 前記pH緩衝剤がグリシルグリシン、トリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される、項目1、2又は3に記載の組成物。
(5) 1つ若しくは複数のキナーゼ、及び/又は1つ若しくは複数のキナーゼ基質をさらに含む、項目1、2、3又は4に記載の組成物。
(6) 1つ若しくは複数のホスファターゼ、及び/又は1つ若しくは複数のホスファターゼ基質をさらに含む、項目1、2、3又は4に記載の組成物。
(7) 前記pH緩衝剤がグリシルグリシンである、項目1、2、3、5又は6に記載の組成物。
(8) 前記pH緩衝剤がトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンである、項目1、2、3、5又は6に記載の組成物。
(9) 前記組成物が1つ又は複数のECL共反応物を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(10) 前記ECL共反応物が第三級アミンを含む、項目9に記載の組成物。
(11) 前記ECL共反応物がトリプロピルアミン(TPA)を含む、項目9に記載の組成物。
(12) さらにKOHを含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(13) さらに洗浄剤又は界面活性剤を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(14) さらに非イオン洗浄剤又は界面活性剤を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(15) 前記リンペプチド特異的抗体に結合するリンペプチドをさらに含む、項目1、2又は4から14までのいずれか一項に記載の組成物。
(16) 前記組成物が無機リン酸塩を含まない、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(17) さらに停止試薬を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(18) さらにエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(19) さらに塩基を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(20) さらにKOHを含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(21) さらにKOH及び界面活性剤又は洗浄剤を含む、項目1から18までのいずれか一項に記載の組成物。
(22) さらに電気化学発光標識を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(23) さらに金属含有電気化学発光標識を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(24) さらにRu又はOs含有電気化学発光標識を含む、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(25) 前記組成物のpHが6〜9である、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(26) 前記組成物のpHが7〜8である、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(27) 前記組成物のpHが7.5〜8である、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(28) 前記組成物のpHが約7.8である、前記項目のいずれかに記載の組成物。
(29) 項目1から28までのいずれか一項に記載の組成物を含む電気化学発光アッセイを実施するように構成された装置。
(30) 前記組成物から放出される光を検出する光検出器、及び/又は電気化学発光を誘導するのに十分な電圧を前記組成物に印加する電圧源をさらに含む、項目29に記載の装置。
(31) 1つ又は複数の容器中に、項目1から28までのいずれか一項に記載の組成物及び1つ又は複数の作用電極を含むアッセイモジュールを含むキット。
(32) 項目1から28までのいずれか一項に記載の組成物に電気化学エネルギーを与えるステップを含む電気化学発光方法を実施する方法。
(33) 放出された電気化学発光を検出するステップをさらに含む、項目32に記載の方法。
(34) 項目1から28までのいずれか一項に記載の組成物を用いてアッセイを実施する方法であって、
前記組成物とキナーゼ産物を含むアッセイ混合物を形成させるステップと、前記キナーゼ産物と前記リン酸特異的抗体を含む複合体を形成させるステップとを含む、方法。
(35) キナーゼをキナーゼ基質と接触させて前記キナーゼ産物を形成させるステップと、前記複合体を検出するステップをさらに含む、項目34に記載の方法。
(36) 電気化学発光を用いて前記複合体を検出する、項目34又は35に記載の方法。
(37) キナーゼ産物とリン酸特異的抗体を含む複合体を形成させ、前記複合体を無機リン酸塩に曝さないステップを含むアッセイを実施する方法。
(38) キナーゼをキナーゼ基質と接触させて前記キナーゼ産物を形成させるステップと、前記キナーゼ産物を前記リン酸特異的抗体と接触させて前記複合体を形成させるステップと、前記複合体を検出するステップとをさらに含む項目37に記載の方法。
(39) 電気化学発光を用いて前記複合体を検出する、項目37又は38に記載の方法。
(40) pH緩衝剤と、ECL共反応物とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物であって、
前記pH緩衝剤は、グリシルグリシン、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択され、前記ECL共反応物は第三級アミンを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物。
(41) 前記ECL共反応物がトリプロピルアミンである、項目40に記載の組成物。
(42) 無機リン酸塩ではないpH緩衝剤と、Ru又はOs含有ECL標識と、ECL共反応物とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物。
(43) 前記ECL共反応物が第三級アミンを含む、項目42に記載の組成物。
(44) 前記ECL共反応物がトリプロピルアミンである、項目43に記載の組成物。
(45) 無機リン酸塩ではないpH緩衝剤と、トリプロピルアミンであるECL共反応物とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適した組成物。
(46) 前記pH緩衝剤がECLアッセイpH緩衝剤バックグラウンド低減剤である、項目42、43、44又は45に記載の組成物。
(47) 前記共反応物の濃度が50〜1000mMである、項目40、41、42、43、44、45又は46に記載の組成物。
(48) 電気化学発光方法に使用するのに適した組成物であって、(a)濃度が50〜1000mMの範囲にあるトリプロピルアミンと、(b)濃度が50〜1000mMの範囲にあり、グリシルグリシン、トリス[ヒドロキシメチル]−アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択されるpH緩衝剤とを含み、pHが6.5〜8.5の範囲にある組成物。
(49) さらにECL成分を含む、項目40、41、45又は48に記載の組成物。
(50) 前記ECL成分が金属含有ECL成分である、項目49に記載の組成物。
(51) 前記ECL成分がRu又はOs含有ECL標識である、項目50に記載の組成物。
(52) 前記ECL成分が電気化学発光を繰り返し放出可能である、項目42、43、44、49、50又は51に記載の組成物。
(53) 無機リン酸塩の濃度が20mM未満である、項目40から52までのいずれかに記載の組成物。
(54) 前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、項目40から52までのいずれかに記載の組成物。
(55) 前記組成物が無機リン酸塩を含まない、項目40から52までのいずれかに記載の組成物。
(56) キナーゼ及びキナーゼ基質からなる群から選択される1つ又は複数の成分をさらに含む、項目54又は55に記載の組成物。
(57) ホスファターゼ及びホスファターゼ基質からなる群から選択される1つ又は複数の成分をさらに含む、項目54又は55に記載の組成物。
(58) 前記pH緩衝剤がグリシルグリシンである、項目40から57までのいずれか一項に記載の組成物。
(59) 前記pH緩衝剤がトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンである、項目40から57までのいずれか一項に記載の組成物。
(60) さらにエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む、項目40から59までのいずれか一項に記載の組成物。
(61) さらにKOHを含む、項目40から60までのいずれか一項に記載の組成物。
(62) 塩、洗浄剤、保存剤、キレート化剤及び消泡剤からなる群から選択される物質をさらに含む、項目40から61までのいずれか一項に記載の組成物。
(63) さらに界面活性剤を含む、項目40から62までのいずれか一項に記載の組成物。
(64) 前記組成物のpHが6.5〜8.5である、項目40から63までのいずれか一項に記載の組成物。
(65) 前記組成物のpHが7〜8である、項目40から64までのいずれか一項に記載の組成物。
(66) 前記組成物のpHが7.5〜8である、項目40から65までのいずれか一項に記載の組成物。
(67) 前記組成物のpHが約7.8である、項目40から66までのいずれか一項に記載の組成物。
(68) 前記組成物が水性である、項目40から67までのいずれか一項に記載の組成物。
(69) 前記組成物が、酸化条件下で金属含有ECL成分からECLを誘導するのに適切な環境を提供する、項目40から68までのいずれか一項に記載の組成物。
(70) 項目40から69までのいずれか一項に記載の組成物を含む、電気化学発光方法に使用するのに適した試薬。
(71) 無機リン酸塩を実質的に含まないpH緩衝剤と、Ru又はOs含有ECL成分とを含む試薬であって、
前記試薬はECLアッセイを実施するための組成物に使用するのに適していて、
(i)電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ECL成分と、
(ii)酸化されると強い還元剤を形成するECL共反応物と、
(iii)前記ECL成分及び前記アミン又はアミン成分がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質と、
からなる群から選択される成分を含むアッセイ組成物によって電磁放射が放出される、試薬。
(72) 前記試薬がさらに前記pH緩衝剤と、アミン又はアミン成分と、前記グループ(i)〜(iii)の他の2つの成分のうちの1つとを含む、項目71に記載の試薬。
(73) さらに界面活性剤又は洗浄剤を含む、項目71に記載の試薬。
(74) さらにECL共反応物を含む、項目71に記載の試薬。
(75) さらにEDTAを含む、項目71に記載の試薬。
(76) 1つ又は複数の容器中に、pH緩衝剤及びECL共反応物を含み、前記pH緩衝剤がグリシルグリシン、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択され、前記ECL共反応物が第三級アミンを含む、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
(77) 1つ又は複数の容器中に、pH緩衝剤と、Ru又はOs含有ECL標識と、ECL共反応物とを含み、前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
(78) 1つ又は複数の容器中に、pH緩衝剤とトリプロピルアミンを含み、前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
(79) 1つ又は複数の容器中に、(a)濃度50〜1000mMのトリプロピルアミンと、(b)グリシルグリシン、トリス[ヒドロキシメチル]−アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される濃度50〜1000mMのpH緩衝剤とを含む、電気化学発光方法に使用するのに適したキット。
(80) 濃度50〜1000mMのトリプロピルアミンを含む、項目78に記載のキット。
(81) 無機リン酸塩を含まない、項目76、77、78、79又は80に記載のキット。
(82) キナーゼ及びキナーゼ基質からなる群から選択される1つ又は複数の成分をさらに含む、項目76、77、78、79、80又は81に記載のキット。
(83) ホスファターゼ及びホスファターゼ基質からなる群から選択される1つ又は複数の成分をさらに含む、項目76、77、78、79、80又は81に記載のキット。
(84) 前記pH緩衝剤がグリシルグリシンである、項目76から83までのいずれか一項に記載のキット。
(85) 前記pH緩衝剤がトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタンである、項目76から83までのいずれか一項に記載のキット。
(86) 前記ECL共反応物が第三級アミンを含む、項目77又は81から83までのいずれか一項に記載のキット。
(87) 前記ECL共反応物がトリプロピルアミン(TPA)を含む、項目76又は77に記載のキット。
(88) さらにエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む、項目76から87までのいずれか一項に記載のキット。
(89) 前記pH緩衝剤がグリシルグリシンであり、前記組成物がさらにエチレンジアミン四酢酸(EDTA)を含む、項目76、77又は78に記載のキット。
(90) さらにKOHを含む、項目76から89までのいずれか一項に記載のキット。
(91) さらにECL成分を含む、項目76又は78から90までのいずれか一項に記載のキット。
(92) 電気化学発光を繰り返し放出可能であるECL成分をさらに含む、項目76又は78から90までのいずれか一項に記載のキット。
(93) さらに金属含有ECL成分を含む、項目76又は78から90までのいずれか一項に記載のキット。
(94) さらにRu又はOs含有ECL標識を含む、項目76又は78から90までのいずれか一項に記載のキット。
(95) 塩、洗浄剤、保存剤、キレート化剤及び消泡剤からなる群から選択される1つ又は複数の物質をさらに含む、項目76から94までのいずれか一項に記載のキット。
(96) さらに界面活性剤を含む、項目76から95までのいずれか一項に記載のキット。
(97) 前記キットが水性である、項目76から96までのいずれか一項に記載のキット。
(98) ECL成分(i)及び電解質(ii)からなる群の1つ又は複数の成分を含めて少なくとも1つの別個の成分をさらに含む、項目76、78から89まで又は95から97までのいずれか一項に記載のキット。
(99) (a)無機リン酸塩を実質的に含まないpH緩衝剤と(b)リン酸特異的抗体とを含む組成物において、定性的又は定量的に特異的結合アッセイを実施する方法。
(100) 前記組成物がさらにECL共反応物を含む、項目99に記載の方法。
(101) 前記組成物がさらにECL標識を含む、項目99に記載の方法。
(102) 前記組成物がさらにリン酸特異的抗体を含む、項目101に記載の方法。
(103) 結合試薬がその上に固定された1つ又は複数のアッセイドメインを含むウェルにおいて、無機リン酸塩を実質的に含まないpH緩衝剤を含む組成物を用いて、定性的又は定量的に特異的結合非洗浄アッセイを実施する方法。
(104) 電気化学発光標識と、
キナーゼ、キナーゼ基質、キナーゼ産物及びこれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つの試薬と、
を含む組成物であって、無機リン酸塩を実質的に含まない組成物を用いて、キナーゼアッセイを実施する方法。
(105) 電気化学発光標識を誘導して電磁放射を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、放出された電気化学発光を検出するステップとをさらに含む項目104に記載の方法。
(106) 前記組成物をリン酸特異的抗体と接触させるステップをさらに含む、項目104又は105に記載の方法。
(107) アッセイを実施する方法であって、
(a)キナーゼ産物とリン酸特異的抗体を含む複合体を形成させ、前記複合体を無機リン酸塩に曝さないステップと、
(b)金属含有ECL成分を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
(c)放出された電磁放射を検出するステップとを含む方法。
(108) 前記複合体がさらに前記金属含有ECL成分を含む、項目107に記載の方法。
(109) ECL標識と、ECL共反応物と、リン酸塩ではないpH緩衝剤とを含む組成物の存在下で誘導される電気化学発光を誘導する方法。
(110) 前記pH緩衝剤がECLアッセイpH緩衝剤バックグラウンド低減剤である、項目109に記載の方法。
(111) 前記pH緩衝剤がグリシルグリシン、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される、項目109に記載の方法。
(112) 前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まない、項目109、110又は111に記載の方法。
(113) 前記ECL共反応物が第三級アミンである、項目109、110、111又は112に記載の方法。
(114) 前記共反応物が濃度50〜1000mMで存在し、前記pH緩衝剤が濃度50〜1000mMで存在し、前記pHが6.5〜8.5であり、前記ECL共反応物がトリプロピルアミンであり、前記pH緩衝剤がグリシルグリシン、トリス[ヒドロキシメチル]−アミノメタン又はそれらの組合せからなる群から選択される、項目109に記載の方法。
(115) 前記ECL標識がルテニウム又はオスミウムの有機金属複合体である、項目109から114までのいずれか一項に記載の方法。
(116) 前記方法がさらに、
(a)前記組成物を電気化学エネルギーに曝し、前記電気化学発光組成物を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
(b)放出された電磁放射を検出するステップとを含む、項目109から115までのいずれか一項に記載の方法。
(117) 電極に酸化電位を印加することによって前記電気化学エネルギーを発生させる、項目116に記載の方法。
(118) 前記ECL標識が前記電極に付着している、項目117に記載の方法。
(119) 前記電極が元素状炭素を含む、項目117又は118に記載の方法。
(120) 第三級アミンであるECL共反応物と、少なくとも1つの非リン酸塩ベースのpH緩衝剤とを含む電気化学発光アッセイpH緩衝剤。
(121) 前記共反応物がTPAである、項目120に記載の電気化学発光アッセイpH緩衝剤。
(122) 前記非リン酸塩ベースのpH緩衝剤が、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン(Tris)、オリゴ(グリシン)又はそれらの組合せから選択される、項目120に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
(123) 前記非リン酸塩ベースのpH緩衝剤がグリシル−グリシン(Gly−Gly)である、項目120に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
(124) キレート化剤、洗浄剤、塩、消泡剤及び保存剤からなる群から選択される1つ又は複数の物質をさらに含む、項目120から123までのいずれか一項に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
(125) さらにリン酸特異的抗体を含む、項目120から124までのいずれか一項に記載の電気化学発光アッセイ緩衝剤。
(126) 項目120から125までのいずれか一項に記載のアッセイ緩衝剤とECL標識を接触させるステップと、電気化学発光を誘導するステップと、放出された電気化学発光を検出するステップとを含む、電気化学発光を発生させる方法。
(127) 電気化学発光標識と、非TPA電気化学発光共反応物と、少なくとも1つのフェニルエーテル含有洗浄剤とを含む組成物。
(128) 前記非TPA電気化学発光共反応物がPIPESである、項目127に記載の組成物。
(129) 前記非TPA電気化学発光共反応物が、3−(ジ−n−プロピルアミノ)−プロパンスルホン酸、4−(ジ−n−プロピルアミノ)−ブタンスルホン酸、4−[ビス−(2−ヒドロキシエタン)−アミノ]−ブタンスルホン酸、ピペリジン−N−(3−プロパンスルホン酸)、アゼパン−N−(3−プロパンスルホン酸)、ピペリジン−N−(3−プロピオン酸)(PPA)、3−モルフォリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、3−モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−3−プロパンスルホン酸(EPPS)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−3−エタンスルホン酸(BES)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、トリエタノールアミン、N−2−ヒドロキシピペラジン−N−2−エタンスルホン酸(HEPES)、ピペラジン−N,N’−ビス−4−ブタンスルホン酸、ホモピペリジン−N−3−プロパンスルホン酸、ピペラジン−N,N’−ビス−3−プロパンスルホン酸、ピペリジン−N−3−プロパンスルホン酸、ピペラジン−N−2−ヒドロキシエタン−N’−3−メチルプロパノエート、ピペラジン−N,N’−ビス−3−メチルプロパノエート、1,6−ジアミノへキサン−N,N,N’,N’−四酢酸、N,N−ビスプロピル−N−4−アミノブタンスルホン酸、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、1,3−ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン(ビス−Trisプロパン)、3−ジメチルアミノ−1−プロパノール、3−ジメチルアミノ−2−プロパノール、N,N,N’,N’−テトラプロピルプロパン−1,3,−ジアミン(TPA2量体)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパン)スルホン酸(POPSO)及び2−ヒドロキシ−3−[4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−イル]プロパン−1−スルホン酸(HEPPSO)からなる群から選択される、項目127に記載の組成物。
(130) 前記組成物が作用電極と接触している、項目127、128又は129に記載の組成物。
(131) 前記組成物が炭素ベースの作用電極と接触している、項目127、128又は129に記載の組成物。
(132) 前記電気化学発光標識がRu又はOs含有ECL標識である、項目127から131までのいずれかに記載の組成物。
(133) 3−(ジ−n−プロピルアミノ)−プロパンスルホン酸又は4−(ジ−n−プロピルアミノ)−ブタンスルホン酸を含む組成物。
(134) さらにECL標識を含む、項目133に記載の組成物。
(135) さらに金属含有ECL標識を含む、項目133に記載の組成物。
(136) さらにRu又はOs含有ECL標識を含む、項目133に記載の組成物。
(137) 前記項目133から136までのいずれか一項に記載の組成物を用いて電気化学発光を誘導する方法。
(138) 電気化学発光を発生させる方法であって、
(a)電気化学発光標識を項目136に記載の組成物と接触させるステップと、
(b)前記電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出させるステップと、
(c)前記電気化学発光を検出するステップとを含む方法。
(139) 電気化学発光を発生させる方法であって、
(a)項目133から137までのいずれか一項に記載の組成物を誘導して電気化学発光を放出させるステップと、
(b)前記電気化学発光を検出するステップとを含む方法。
(140) 前記電気化学発光標識が作用電極に付着している、項目138又は139に記載の方法。
(141) 前記ECL誘導が、実質的に洗浄剤を含まない組成物において実施される、項目138又は139に記載の方法。
(142) 1つ又は複数の容器中に、電気化学発光標識と、非TPA電気化学発光共反応物と、少なくとも1つのフェニルエーテル含有洗浄剤とを含むキット。
(143) 1つ又は複数の容器中に、少なくとも1つのトリアルキルアミン非TPA共反応物を含む1つ又は複数のECLアッセイ緩衝剤を含むキット。
(144) 1つ又は複数の容器中に、金属含有電気化学発光標識、及び3−(ジ−n−プロピルアミノ)−プロパンスルホン酸、4−(ジ−n−プロピルアミノ)−ブタンスルホン酸及びそれらの組合せからなる群から選択される少なくとも1つの共反応物を含むキット。
(145) 電気化学発光を発生させる方法であって、
(a)電気化学発光標識を電気化学発光共反応物と接触させるステップと、
(b)前記電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出させるステップと、
(c)前記電気化学発光を検出するステップと、を含み、
前記電気化学発光共反応物がTPA以外の第三級アミンである、方法。
(146) 電気化学発光標識を電気化学発光共反応物と接触させることを含む、電気化学発光を誘導する方法であって、
電気化学発光共反応物がトリ−n−プロピルアミン以外の第三級アミンであり、前記電気化学発光標識が作用電極に付着している、電気化学発光を誘導する方法。
(147) 電気化学発光アッセイを実施する方法であって、
(a)電気化学発光標識と、少なくとも1つの電気化学発光共反応物と、を含む組成物を形成させるステップであって、前記電気化学発光共反応物はトリ−n−プロピルアミン以外の第三級アミンであり、前記電気化学発光標識は作用電極に付着しているステップと、
(b)前記電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、
(c)放出された電気化学発光を検出するステップとを含む方法。
(148) 電気化学発光アッセイを実施する方法であって、
(a)電気化学発光標識と、少なくとも1つの電気化学発光共反応物とを含む組成物を形成させるステップであって、前記電気化学発光共反応物がトリ−n−プロピルアミン以外の第三級アミンであり、前記電気化学発光標識の第1の部分が作用電極に付着しており、前記電気化学発光標識の第2の部分が溶液中にあるステップと、
(b)前記電気化学発光標識の第1の部分を誘導して電気化学発光を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、
(c)前記電気化学発光標識の第1の部分から放出された電気化学発光を選択的に検出するステップとを含む方法。
(149) 目的分析物又は活性のアッセイを実施する方法であって、
(a)試料を含む組成物と、ECL標識を含むアッセイ試薬と、電極とを形成させるステップであって、前記試料中に前記分析物又は活性が存在することによって前記電極からの前記アッセイ試薬の付着又は解離がもたらされるステップと、
(b)ECL共反応物を含むECLアッセイ緩衝剤と前記電極を接触させるステップであって、前記共反応物はTPA以外の第三級アミンであるステップと、
(c)前記電極上のECL標識を誘導してECLを誘導するのに適切な条件下で前記電極に電気化学エネルギーを与えるステップと、
(d)放出されたECLを測定するステップとを含む方法。
(150) 結合現象を測定する方法であって、
(a)電極上に固定された結合試薬を、ECL標識を含むアッセイ試薬と接触させるステップであって、前記結合試薬が前記アッセイ試薬に特異的に結合するステップと、
(b)前記アッセイ試薬を前記結合試薬に結合させて前記標識を前記電極に付着させるステップと、
(c)前記電極を、ECL共反応物を含むECLアッセイ緩衝剤と接触させるステップであって、前記共反応物はTPA以外の第三級アミンであるステップと、
(d)前記電極上のECL標識を誘導してECLを誘導するのに適切な条件下で前記電極に電気化学エネルギーを与えるステップと、
(e)放出されたECLを測定するステップとを含む方法。
(151) 前記共反応物が1つ又は複数の以下の諸特性を有する、すなわち、i)1電極酸化において炭素ベース電極上で酸化されてアミンラジカルカチオンを与え、前記アミンラジカルカチオンは、プロトンをその後失ってラジカル還元剤を形成することができ、ii)炭素ベース電極上で、Ru(II)(bpy)3の酸化電位と同等以上の酸化電位を有し、iii)炭素ベース電極において、水を分解するのに必要な電位よりも低い電位で酸化され、iv)前記ラジカル還元剤とRu(III)(bpy)3が反応してRu(II)(bpy)3を生成する反応によって放出されるエネルギーが、発光励起状態のRu(II)(bpy)3を生成するのに十分であり、v)前記アミンラジカルカチオン及び/又はラジカル還元剤の寿命が、対応するTPA誘導種よりも短い、項目145から150までのいずれかに記載の方法。
(152) 前記共反応物がアミンラジカルカチオン及び/又はラジカル還元剤を形成し、前記アミンラジカルカチオン及び/又はラジカル還元剤の拡散距離が100nm未満である、項目145から151までのいずれか一項に記載の方法。
(153) 前記方法が洗浄ステップなしで実施される、項目145から152までのいずれか一項に記載の方法。
(154) 前記ECL共反応物をTPAで置換することによって、溶液中の標識に対する電極に付着している標識からのECL誘導の選択性が少なくとも2倍低下する、項目145から153までのいずれか一項に記載の方法。
(155) 前記電気化学発光共反応物がPIPESである、項目145から154までのいずれかに記載の方法。
(156) 前記共反応物が、NR1R2R3の構造を有するアミンであり、式中、R1、R2及びR3は少なくとも2つの炭素を含むアルキル基であり、R1、R2及びR3のうち1つ又は複数は親水性官能基で官能化されている、項目145から154までのいずれか一項に記載の方法。
(157) 前記親水性官能基が帯電した基を含む、項目156に記載の方法。
(158) 前記親水性官能基が負に帯電した基を含む、項目157に記載の方法。
(159) 前記親水性官能基がヒドロキシル、ジアルキルアミノ、サルフェート、スルホネート、カルボキシレート及び/又はカルボン酸エステルを含む、項目157に記載の方法。
(160) 前記共反応物が(n−Pr)2N(CH2)nRの構造を有し、式中、nは2以上であり、Rは親水性官能基である、項目145から154までのいずれか一項に記載の方法。
(161) 前記共反応物が以下の式を有し、i)Xが−(CH2)−又はヘテロ原子であり、ii)R及びR1が2つ以上の炭素を含むアルキル基であり、iii)n及びmが各々1以上であり、iv)R(及び、場合によってはR1)が親水性官能基を含む、項目145から154までのいずれか一項に記載の方法。
(162) 前記共反応物が、3−(ジ−n−プロピルアミノ)−プロパンスルホン酸、4−(ジ−n−プロピルアミノ)−ブタンスルホン酸、4−[ビス−(2−ヒドロキシエタン)−アミノ]−ブタンスルホン酸、ピペリジン−N−(3−プロパンスルホン酸)、アゼパン−N−(3−プロパンスルホン酸)、ピペリジン−N−(3−プロピオン酸)(PPA)、3−モルフォリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、3−モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−3−プロパンスルホン酸(EPPS)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−3−エタンスルホン酸(BES)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、トリエタノールアミン、N−2−ヒドロキシピペラジン−N−2−エタンスルホン酸(HEPES)、ピペラジン−N,N’−ビス−4−ブタンスルホン酸、ホモピペリジン−N−3−プロパンスルホン酸、ピペラジン−N,N’−ビス−3−プロパンスルホン酸、ピペリジン−N−3−プロパンスルホン酸、ピペラジン−N−2−ヒドロキシエタン−N’−3−メチルプロパノエート、ピペラジン−N,N’−ビス−3−メチルプロパノエート、1,6−ジアミノへキサン−N,N,N’,N’−四酢酸、N,N−ビスプロピル−N−4−アミノブタンスルホン酸、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、1,3−ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン(ビス−Trisプロパン)、3−ジメチルアミノ−1−プロパノール、3−ジメチルアミノ−2−プロパノール、N,N,N’,N’−テトラプロピルプロパン−1,3,−ジアミン(TPA2量体)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパン)スルホン酸(POPSO)及び2−ヒドロキシ−3−[4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−イル]プロパン−1−スルホン酸(HEPPSO)からなる群から選択される、項目145から154までのいずれか一項に記載の方法。
(163) 前記共反応物がピペリジン−N−(3−プロピオン酸)及びピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)からなる群から選択される、項目145から154までのいずれか一項に記載の方法。
(164) 前記電気化学発光が、1つ又は複数の炭素ベースの作用電極を用いて誘導される、項目145から163までのいずれか一項に記載の方法。
(165) 前記1つ又は複数の炭素ベースの作用電極が炭素粒子又はカーボンナノチューブを含む、項目164に記載の方法。
(166) 前記ECL標識を少なくとも1つのフェニルエーテル含有洗浄剤とも接触させる、項目145から165までのいずれか一項に記載の方法。
(167) 前記共反応物の濃度が10〜800mMである、項目145から166までのいずれか一項に記載の方法。
(168) 前記標識をpH緩衝剤と接触させるステップをさらに含む、項目146から167までのいずれか一項に記載の方法。
(169) 前記pH緩衝剤の濃度が好ましくは0〜800mMである、項目168に記載の方法。
すべてではないにしてもほとんどの現行の市販電気化学発光技術の適用例には、共反応物としてのトリ−n−プロピルアミン(TPA)及びpH緩衝剤としてのリン酸塩を含有する電気化学発光アッセイ緩衝剤の存在下における電気化学発光標識(及び、特に、ルテニウムの有機金属錯体)の測定が含まれている。これらの電気化学発光アッセイ緩衝剤は、結合アッセイの固相として金属(一般に、白金)電極表面に収集された磁気粒子を使用する市販の電気化学発光計測手段に対して最適化され、優れた性能を示す。
市販のECL機器で使用するために最適化された従来のECLアッセイ緩衝剤は、一般に、リン酸塩ベースのpH緩衝剤中にTPAを含んでいる。それらの配合物は、電極上に捕獲された磁気粒子を用いる固相アッセイを実施するために特に有用であった。出願人らは、いくつかの用途において、(有機pH緩衝剤を含めて)他のpH緩衝剤がリン酸塩以上の性能をもたらすことができることを発見した。これらの非リン酸塩pH緩衝剤(及び、pH緩衝剤溶液、及びこれらの緩衝剤を含むECLアッセイ緩衝剤は、炭素ベースの電極(例えば、プラスチック及びインクなどの炭素粒子又はカーボンナノチューブ含有複合材料を含む電極)及び/又は電極上に固定されたアッセイ試薬(結合試薬など)を用いるアッセイに特に有用である。それらは、リン酸塩が干渉物質(interferent)となるアッセイに使用する場合にも有利である。好ましくは、本発明の非リン酸塩緩衝剤を用いるECLアッセイ緩衝剤は、15mM未満の無機リン酸塩、より好ましくは5mM未満の無機リン酸塩、さらにより好ましくは1mM未満のリン酸塩を含み、さらにより好ましくは無機リン酸塩を実質的に含まない、最も好ましくは無機リン酸塩を含まない。
出願人らは、洗浄剤の有無が、ECLシグナルに対して驚くほど大きな効果を及ぼし得ることを発見した。この効果の性質は、予想外なことに、電極によって決まる。TPA含有ECLアッセイ緩衝剤に曝された酸化電極(例えば、炭素粒子又はカーボンナノチューブを含有するプラズマ酸化カーボンインク又はプラズマ酸化ポリマー複合材料)上では、この効果は、Triton、Nonidetシリーズの洗浄剤(例えば、Triton X−100)などのフェニルエーテル含有洗浄剤の場合を除き、比較的小さいように見える。ECLを発生させる一般的な方法は、傾斜電位(ramp potential)を使用することである。一般に、ECL強度と印加された電位のプロットは、ピーク形状をしている。ECLは、標識の酸化電位と共反応物の酸化電位が近づくにつれ増加する。この電位を過ぎてスキャンし続けると、結局、共反応物が消費されてECL強度が減少し始め、水の酸化が起き始める。出願人らは、フェニルエーテル含有洗浄剤を添加することによって、ECL主ピークよりも高電位で小さなECLピークが追加されることを観測した。このピークは、純粋なTriton X−100を用いて観測される酸化波とほぼ同じ電位にあり、したがって、出願人らは新しいピークが洗浄剤(又は同伴する不純物)の酸化及びECL反応へのその酸化生成物の関与と関連があると推測している。
ECLアッセイ緩衝剤を保存するときには、微生物増殖を防止する保存剤を入れることが有利な場合がある。保存剤は、ECLアッセイ緩衝剤を用いて発生したECLに対してほとんど又はまったく影響を及ぼさないことが好ましく、特に炭素ベースの電極でECLアッセイ緩衝剤を使用するときにはそうである。アジドは、適切な保存剤であることが判明した。イソチアゾロン(例えば、Kathon、2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン及び5−クロロ−2−メチル−4−イソチアゾリン−3−オン)、オキサゾリジン(例えば、Oxaban A又は4,4ジメチルオキサゾリジン)及び関係する保存剤は、ECLとの高い相溶性、高い活性、安全上の問題又は環境問題に関連する諸問題が少ないことのために、特に好ましい。
特にHTS用途では、バブル、即ち、泡の生成を回避することが有利なことがある。このため、消泡剤をECLアッセイ緩衝剤に添加することが望ましいことがある。出願人らは、(Antifoams o−30、Antifoam 204、Antifoam A、Antifoam SE−15、Antifoam SO−25及びAntifoam 289を含めて)多数の市販の消泡剤が、ECLアッセイ緩衝剤の性能に有意な影響を及ぼすことなくECLアッセイ緩衝剤に添加できることを見出した。
本発明の組成物はECL標識を含むことができる。ECL標識は、従来のECL標識でもよい。ECL標識の例としては、i)トリス−ビピリジル−ルテニウム(RuBpy)成分などのRu含有及びOs含有有機金属化合物を含めて、金属が、例えば、VIII族貴金属から選択される有機金属化合物、並びにii)ルミノール及び関係化合物がある。ECL標識は、電気化学発光を繰り返し放出できることが好ましい。好ましいECL標識は、ルテニウム又はオスミウム含有有機金属種である。より好ましくは、これらのルテニウム又はオスミウム含有有機金属は、ポリピリジルリガンド(最も好ましくは、ビピリジン、フェナントロリン及び/又はその置換誘導体)とキレートを形成しているルテニウム又はオスミウムを含む。最も好ましくは、ECL標識は、ルテニウム−トリス−ビピリジンを含み、ビピリジンリガンドは、場合によっては、例えば、標識をアッセイ試薬に結合させる連結基で置換されている。
本発明の一態様は、本発明のECLアッセイ緩衝剤を含む組成物に関する。
(a)好ましくは0.1〜0.7M、より好ましくは0.3〜0.5M、最も好ましくは約0.2Mのグリシルグリシン(Gly−Gly)と、
(b)好ましくは0.01M〜0.3M、より好ましくは0.05〜0.2、最も好ましくは約0.1Mのトリプロピルアミン(TPA)とを含むECLアッセイ緩衝剤に関する。
(a)好ましくは0.1〜0.7M、より好ましくは0.3〜0.5M、最も好ましくは約0.2Mのトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)と、
(b)好ましくは0.01M〜0.3M、より好ましくは0.05〜0.2M、最も好ましくは約0.1Mのトリプロピルアミン(TPA)とを含むECLアッセイ緩衝剤に関する。
(i)電磁放射から励起状態に転化可能である金属含有ECL成分と、
(ii)酸化されると強い還元剤を形成するECL共反応物(好ましくはアミン又はアミン成分、最も好ましくは第三級アミン、最も好ましくはTPA)と、
(iii)前記ECL成分及び前記ECL共反応物がその中で酸化され得る媒体として機能できる電解質と、
からなる群から選択される成分を含む。
(i)電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ECL成分と、
(ii)酸化されると強い還元剤を形成するECL共反応物と、
(iii)前記ECL成分及び前記アミン又はアミン成分がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質とからなる群から選択される成分を含むアッセイ組成物によって放出される。
(i)電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ECL成分と、
(ii)酸化されると強い還元剤を形成する、アミン又はアミン成分(好ましくはTPA)であるECL共反応物と、
(iii)前記ECL成分及び前記アミン又はアミン成分がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質とからなる群から選択される成分を含むアッセイ組成物によって放出される。
(a)リン酸特異的抗体と、
(b)リン酸化酵素、リン酸化酵素の基質又はそれらの組合せからなる群から選択される試薬と、
(b)pH緩衝剤とを含み、無機リン酸塩を実質的に含まない、好ましくは含まない組成物に関する。組成物は、ECL共反応物(例えば、TPA)も含むことが好ましい。
本発明の一態様は、1つ又は複数の容器中に、本発明のECLアッセイ緩衝剤の1つ又は複数の成分を含むキットに関する。それらの成分を、場合によっては、追加の試薬と組み合わせて、本発明のECLアッセイ緩衝剤を形成させることができる。このキットには、ECL標識、ECL標識アッセイ試薬、酵素、結合試薬、電極、アッセイプレートなど追加のアッセイ関連成分も含めることができる。
本発明の別の態様は、本発明の改良された緩衝剤、試薬及び/又は組成物を用いる方法に関する。
(a)(i)電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ECL成分と、
(ii)酸化されると強い還元剤を形成するECL共反応物(好ましくはアミン又はアミン成分)と、
(iii)前記ECL成分及び前記ECL共反応物(例えば、アミン又はアミン成分)がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質と、
(iv)pH緩衝剤とを含む組成物を形成するステップであって、前記組成物が無機リン酸塩を実質的に含まず、ECLバックグラウンド低減剤(好ましくは、非リン酸塩pH緩衝剤)を含み、かつ/又は前記ECL共反応物が官能性第三級アルキルアミンであるステップと、
(b)組成物を誘導して電磁放射を放出させるのに有効な量の電気化学エネルギーに適切な諸条件下で組成物を曝すステップと、
(c)放出された電磁放射を検出するステップとを含む、電磁放射放出を起こす方法に関する
(a)キナーゼ産物とリン酸特異的抗体を含む複合体を形成するステップであって、前記複合体を無機リン酸塩に曝さないステップと、
(b)金属含有ECL成分を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
(c)放出された電磁放射を検出するステップとを含むアッセイを実施する方法に関する。
(a)pH緩衝剤を含み、無機リン酸塩を実質的に含まず、(i)電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ECL成分、(ii)酸化されると強い還元剤を形成するアミン又はアミン成分、及び/又は(iii)前記ECL成分及び前記アミン又はアミン成分がその中で酸化され得る媒体として機能することができる電解質を含む組成物を形成するステップと、
(b)適切な諸条件下で、組成物を誘導して電磁放射を放出させるのに有効な量の電気化学エネルギーに組成物を曝すステップと、
(c)放出された電磁放射を検出するステップとを含む電磁放射放出を起こす方法に関する。
(1)(a)目的分析物について試験される試料と、
(b)(i)追加の目的分析物又は目的分析物のアナログと、
(ii)目的分析物又はその前記アナログの結合相手と、
(iii)(i)又は(ii)と結合可能である反応成分とからなる群から選択される少なくとも1つの物質と、
(c)電磁放射が放出される励起状態に転化可能であり、(b)目的分析物又は(b)(i)、(b)(ii)又は(b)(iii)に定義した物質と結合相互作用可能である金属含有ECL成分と、
(d)酸化されると強い還元剤を形成するECL共反応物(好ましくは、アミン又はアミン成分)と、
(e)前記ECL成分及び前記種をその中で酸化することができる媒体として機能することができる電解質とを含む組成物を形成するステップと、
(2)組成物を誘導して電磁放射を放出させるのに有効な量の電気化学エネルギーに前記組成物を曝すステップと、
(3)放出された電磁放射を検出するステップとを含み、試料はアッセイ性能に有害な無機リン酸塩に曝されず、前記組成物はさらにECLアッセイ緩衝剤バックグラウンド低減剤(好ましくは、非リン酸塩pH緩衝剤)を含む。好ましくは、組成物は、15mM未満の無機リン酸塩、より好ましくは5mM未満の無機リン酸塩、さらにより好ましくは1mM未満のリン酸塩を含み、さらにより好ましくは無機リン酸塩を実質的に含まず、最も好ましくは無機リン酸塩を含まない。
本発明のさらに別の態様は、アッセイを実施するための、本発明の試薬及び/又は組成物を含む又は使用するシステムに関する。
(a)pH緩衝剤と
(b)試料と、
(c)(i)添加された目的分析物又は目的分析物のアナログと、
(ii)目的分析物又はその前記アナログの結合相手と、
(iii)(i)又は(ii)と結合可能である反応成分とからなる群から選択される少なくとも1つの物質であって、前記物質の1つが、電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ECL成分に、直接又は1つ若しくは複数の他の分子を介して連結されている物質と、
(d)強い還元剤及び電解質に転化可能であるECL共反応物、好ましくはアミン又はアミン成分と、
(d)ECL成分を誘導して電磁放射を放出させる1つ又は複数の電極と、
(e)放出された放射エネルギーを測定して試料中の目的分析物の有無又は量を決定するための1つ又は複数の検出器とを含み、
前記pH緩衝剤は、実質的にリン酸塩を含まないECLアッセイ緩衝剤バックグラウンド低減剤であり、かつ/又は前記ECL共反応物は官能性第三級アミンである。
(a)pH緩衝剤と
(b)試料と、
(c)(i)添加された目的分析物又は目的分析物のアナログと、
(ii)目的分析物又はその前記アナログの結合相手と、
(iii)(i)又は(ii)と結合可能である反応成分とからなる群から選択される少なくとも1つの物質であって、前記物質の1つが、電磁放射が放出される励起状態に転化可能である金属含有ECL成分に、直接又は1つ若しくは複数の他の分子を介して連結されている物質と、
(d)強い還元剤及び電解質に転化可能であるECL共反応物、好ましくは官能性第三級アミンと、
(d)ECL成分を誘導して電磁放射を放出させる1つ又は複数の電極と、
(e)放出された放射エネルギーを測定して試料中の目的分析物の有無又は量を決定するための1つ又は複数の検出器とを含む。
本発明の別の態様は、2002年6月28日にそれぞれ出願され、参照により本明細書に援用する「発光試験測定用アッセイプレート、リーダーシステム及び方法(Assay Plates、Reader Systems and Methods for Luminescence Test Measurements)」と題する米国特許出願第10/185,274号及び同第10/185,363号のパラグラフ6.11に記載されたように、生物活性化合物を選択し又は同定し、場合によっては、このような生物活性化合物を適切な担体組成物に適切な用量で組み込むための改良された方法及びシステムに関する。
ECL測定
別段に示さない限り、一体型カーボンインク電極を有するマルチウェルプレートを用いてECL測定を実施した(2002年6月28日にそれぞれ出願され、参照により本明細書に援用する「発光試験測定用アッセイプレート、リーダーシステム及び方法(Assay Plates、Reader Systems and Methods for Luminescence Test Measurements)」と題する同時係属中の米国特許出願第10/185,274号及び同第10/185,363号の実施例6.1及び、特に、プレートタイプA及びBを参照されたい)。電極を、場合によっては、結合試薬で被覆する前に酸素プラズマで処理した(以後、プラズマ処理及び非プラズマ処理プレートを、それぞれPT又はNPTプレートと表す)。米国特許出願第10/185,274号及び同第10/185,363号に記載された方法又はその改造方法を用いて、結合試薬をプレートの作用電極に固定した。別段に示さない限り、これらのマルチウェルプレートを使用するように構成されたマルチウェルプレートリーダーを用いてECL測定を実施した。リーダー及びそれらの使用は、米国特許出願第10/185,274号及び同第10/185,363号の実施例6.3に記載されている。米国特許出願第10/185,274号及び同第10/185,363号及び、特に、プレートタイプ、固定化方法、プレートリーダー及びECL測定方法の記述を、参照により本明細書に援用する。報告するECL強度は相対値であり、個々の実験で使用する機器、ゲイン設定及びプレートによって左右され得る。このため、異なる実験において報告された絶対値を直接比較することはできない。
チロシンキナーゼアッセイ
構成には、ECL測定(実施例I参照)用に構成されたマルチウェルプレート中の電極に固定されたキナーゼ基質のリン酸化、標識抗ホスホチロシン抗体への生成物の複合体形成、及びECL共反応物を含むECLアッセイ緩衝剤の存在下におけるECL測定による表面結合標識の検出が含まれる。電極を酸素プラズマでエッチング前処理して露出炭素量を増加させた。GluとTyrの比が4:1であり、分子量が20,000〜50,000ダルトンであるポリ(Glu、Tyr)(PGT、Sigma−Aldrich Co.)のキナーゼ基質を、プレートのウェル中の作用電極表面に非特異的に吸着させて固定した。各ウェル中の作用電極を、PBS緩衝剤で希釈した1mg/ml PGTを含有する溶液1500nLで処理した。次いで、プレートを終夜乾燥し、ウシ血清アルブミンの5%溶液中4℃でブロックした。プレートを洗浄して、使用前に遮断剤を除去した。
Gly−Glyアッセイ緩衝剤:
0.4Mグリシルグリシン(Gly−Gly)
0.1Mトリプロピルアミン(TPA)
12mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)
pH=7.8(10%KOHを添加して調整)
Trisアッセイ緩衝剤:
0.4Mトリス(ヒドロキシメチル)アミノメタン(Tris)
0.15Mトリプロピルアミン(TPA)
12mMエチレンジアミン四酢酸(EDTA)
pH=7.8(10%KOHを添加して調整)
リン酸化EGF受容体の検出
サンドイッチ免疫測定法を用いて、EGF活性化A−431細胞(American Type Culture Collection)から調製された細胞溶解物中の自己リン酸化α−表皮成長因子受容体(α−EGFR)を検出した。このアッセイには、α−EGFR細胞外ドメインに対するビオチン標識捕獲抗体、及びホスホチロシンに特異的なSulfo−TAG標識検出抗体(実施例2参照)を使用した。ビオチン標識と電極表面に受動的に吸着されたアビジンとの相互作用によって、ECLアッセイ(実施例1参照)に使用するように構成されたマルチウェルプレートの作用電極上にビオチン標識抗体を固定した。次いで、(RIPA、デオキシコレート含有緩衝剤中の)可溶化EGFRを添加し、抗EGFR抗体に結合させた。次いで、Sulfo−TAG標識α−ホスホチロシン抗体を添加して自己リン酸化EGFRを検出した。
特異的シグナルとアッセイ緩衝剤バックグラウンドの識別能力に対するECLアッセイ緩衝剤組成物の効果
多数のECLアッセイ形式において、ECL標識の測定感度は、ECL標識の非存在下におけるECLアッセイ緩衝剤によって生成される光シグナル(及び光シグナル中のノイズ)(ECLアッセイ緩衝剤バックグラウンド)の制限を受ける。この制限は、非特異的結合レベルが低くかつ/又は高感度低ノイズ光検出器を有するECLリーダーを使用する洗浄アッセイにおいて特に明白である。出願人らは、ECLアッセイ緩衝剤組成物と、ECL標識によるシグナルとECLアッセイ緩衝剤バックグラウンドとの識別能力との関係を調べた。特に、出願人らは、ECL共反応物の種類及び/又はpH緩衝剤の種類を変えた4つのECLアッセイ緩衝剤配合、すなわち、TPA/リン酸塩、TPA/Tris、TPA/Gly−Gly及びPIPES/リン酸塩(ここで、PIPESは1,4−ピペラジン−1,4−ビス(2−エタンスルホン酸を表す)を試験した。
電極表面に結合しているECL標識と溶液中に遊離しているECL標識との識別能力に対するECLアッセイ緩衝剤組成物の効果
いくつかのECLアッセイ形式において、電極近傍に保持されたECL標識の測定感度は、溶液中のECL標識によって生成される光シグナル(及び光シグナルのノイズ)の制限を受ける。この制限は、ECLアッセイ緩衝剤の添加及びECL測定の前の洗浄によって溶液中の標識が除去されないアッセイ(非洗浄アッセイ)において特に明白である。出願人らは、ECLアッセイ緩衝剤組成物と、電極に結合している(又は近傍に保持されている)ECL標識と溶液中に遊離しているECL標識によるシグナル間の識別能力との関係を調べた。
ECLアッセイ緩衝剤性能に対する洗浄剤の効果
図6に、アビジン被覆プラズマ処理電極に結合したBT−IgG*からのECLシグナルに対する様々な非イオン洗浄剤の有無による効果を示す。2つのECLアッセイ緩衝剤のうちの1つに洗浄剤を0.5%(w/v)添加した。図6Aに、150mM TPA、250mMリン酸塩、pH7.5を用いて得られた結果を示す。図6Bに、50mM PIPES、150mMリン酸塩、pH7.5を用いて得られた結果を示す。BT−IgG*(0.01nM溶液50μL)をアビジン表面に結合させた。プレートを洗浄し、ECLアッセイ緩衝剤を添加し、ECLを検出してプレートを分析した。図に、ECLアッセイ緩衝剤の各々を用いて測定したアッセイ緩衝剤バックグラウンド、シグナル、及び(実施例4と同様に計算した)S/B比を示す。試験した洗浄剤のうち、Triton X−100のみが性能に対して有意な効果を示した。PIPESベースの緩衝剤の場合、その効果は大きく、Tritonの添加によってS/B比が>2.5倍増加した。TPAベースの緩衝剤に対するTriton X−100の効果は極めてわずかであった。Triton X−100は、フェノールエーテル成分を含有している点で、使用した他の洗浄剤とは異なる。出願人らは、Triton X−100の有利な効果は、電極でのフェノールエーテル成分の酸化、及びECL反応へのTriton酸化生成物の関与に起因しているとの仮説を立てている。
選択した第三級アミンのECL活性
いくつかの第三級アミンを、共反応物としての作用能力についてスクリーニングした。実施例4及び5に記載した方法と同様にして測定を実施した。選択した第三級アミン(200mM)、リン酸塩緩衝剤(200mM)、Triton X−100(0.1%)を含有し、pH7.5に調節されたECLアッセイ緩衝剤を調製した。電極に付着した標識からのシグナルを以下の手順により測定した。i)ECLアッセイ緩衝剤中に0.3nM Bt−IgG*(Sulfo−TAG及びビオチンで標識されたIgG)を含有する溶液を、ストレプトアビジン被覆96ウェルNPT又はPTプレートのウェルに導入した。ii)プレートを2時間振とうさせながらインキュベートしてBt−IgG*を表面に結合させた。iii)プレートを4回洗浄し、ECLアッセイ緩衝剤150μLを添加した。iv)標識からのECLを測定した。ECLアッセイ緩衝剤150uLをストレプトアビジン被覆プレートに導入し、ECLを測定することによって、アッセイ緩衝剤バックグラウンドを測定した。10nM IgG*(Sulfo−TAGで標識されビオチンでは標識されていないIgG)を含有する溶液をストレプトアビジン被覆96ウェルNPT又はPTプレートのウェルに導入し、ECLを測定することによって、溶液中の遊離ECL標識からのECLシグナルを測定した。
Claims (28)
- 電気化学発光標識を含む組成物を、電気化学発光共反応物と非リン酸塩ベースのpH緩衝剤とを含み、かつ、リン酸塩を含まない試薬と混合するステップと、
電気化学発光を誘導するステップと、
放出された電気化学発光を検出するステップと、
を含む、電気化学発光を発生させる方法であって、
前記電気化学発光共反応物が第三級アミンであり、
前記非リン酸塩ベースのpH緩衝剤が、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン(Tris)、オリゴ(グリシン)又はそれらの組合せからなる群から選択される、
電気化学発光を発生させる方法。 - 前記非リン酸塩ベースのpH緩衝剤がグリシル−グリシン(Gly−Gly)である、請求項1に記載の方法。
- さらに界面活性剤を含む、請求項1に記載の方法。
- 前記電気化学発光標識がルテニウム又はオスミウムの有機金属錯体である、請求項1に記載の方法。
- 前記方法がさらに、
(a)前記組成物を電気化学エネルギーに曝し、前記電気化学発光組成物を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
(b)放出された電磁放射を検出するステップと、
を含む、請求項1に記載の方法。 - 電極に酸化電位を印加することによって前記電気化学エネルギーを発生させる、請求項5に記載の方法。
- 前記電極が元素状炭素を含む、請求項6に記載の方法。
- 前記電気化学発光標識が前記電極に付着している、請求項7に記載の方法。
- 電気化学発光アッセイを実施する方法であって、
(a)電気化学発光標識と、少なくとも1つの電気化学発光共反応物を含み、かつ、リン酸塩を含まない試薬と、を含む組成物を形成させるステップであって、前記電気化学発光共反応物は親水性官能基を含む第三級アミンであり、前記電気化学発光標識は作用電極に付着しており、前記リン酸塩を含まない試薬は、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン(Tris)、オリゴ(グリシン)又はそれらの組合せからなる群から選択されるステップと、
(b)前記電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、
(c)放出された電気化学発光を検出するステップと、を含む方法。 - 電気化学発光アッセイを実施する方法であって、
(a)電気化学発光標識と、少なくとも1つの電気化学発光共反応物を含み、かつ、リン酸塩を含まない試薬とを含む組成物を形成させるステップであって、前記電気化学発光共反応物が親水性官能基を含む第三級アミンであり、前記電気化学発光標識の第1の部分が作用電極に付着しており、前記電気化学発光標識の第2の部分が溶液中にあり、前記リン酸塩を含まない試薬は、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン(Tris)、オリゴ(グリシン)又はそれらの組合せからなる群から選択されるステップと、
(b)前記電気化学発光標識の第1の部分を誘導して電気化学発光を放出させるのに有効な電気化学エネルギーを与えるステップと、
(c)前記電気化学発光標識の第1の部分から放出された電気化学発光を選択的に検出するステップと、を含む方法。 - 試料中の目的分析物又は活性のアッセイを実施する方法であって、
(a)試料を含む組成物と、電気化学発光標識を含むアッセイ試薬と、電極とを形成させるステップであって、前記試料中に前記分析物又は活性が存在することによって前記電極からの前記アッセイ試薬の付着又は解離がもたらされるステップと、
(b)電気化学発光共反応物を含む電気化学発光アッセイ緩衝剤と前記電極を接触させるステップであって、前記電気化学発光共反応物が親水性官能基を含む第三級アミンであり、前記電気化学発光アッセイ緩衝剤が、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン(Tris)、オリゴ(グリシン)又はそれらの組合せからなる群から選択される、リン酸塩を含まない試薬であるステップと、
(c)前記電極上の電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を誘導するのに適切な条件下で前記電極に電気化学エネルギーを与えるステップと、
(d)放出された電気化学発光を測定するステップと、を含む方法。 - 結合現象を測定する方法であって、
(a)電極上に固定された結合試薬を、電気化学発光標識を含むアッセイ試薬と接触させるステップであって、前記結合試薬が前記アッセイ試薬に特異的に結合するステップと、
(b)前記アッセイ試薬を前記結合試薬に結合させて前記電気化学発光標識を前記電極に付着させるステップと、
(c)前記電極を、電気化学発光共反応物を含む電気化学発光アッセイ緩衝剤と接触させるステップであって、前記電気化学発光共反応物が親水性官能基を含む第三級アミンであり、前記電気化学発光アッセイ緩衝剤が、トリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン(Tris)、オリゴ(グリシン)又はそれらの組合せからなる群から選択される、リン酸塩を含まない試薬であるステップと、
(d)前記電極上の電気化学発光標識を誘導して電気化学発光を放出するのに適切な条件下で前記電極に電気化学エネルギーを与えるステップと、
(e)放出された電気化学発光を測定するステップと、を含む方法。 - 前記電気化学発光共反応物がアミンラジカルカチオン及び/又はラジカル還元剤を形成し、前記アミンラジカルカチオン及び/又はラジカル還元剤の拡散距離が100nm未満である、請求項9から12までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記方法が洗浄ステップなしで実施される、請求項9から13までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記電気化学発光共反応物をTPAで置換することによって、溶液中の電気化学発光標識に対する電極に付着している電気化学発光標識からの電気化学発光誘導の選択性が少なくとも2倍低下する、請求項9から14までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記電気化学発光共反応物がPIPESである、請求項9から14までのいずれかに記載の方法。
- 前記電気化学発光共反応物が、3−(ジ−n−プロピルアミノ)−プロパンスルホン酸、4−(ジ−n−プロピルアミノ)−ブタンスルホン酸、4−[ビス−(2−ヒドロキシエタン)−アミノ]−ブタンスルホン酸、ピペリジン−N−(3−プロパンスルホン酸)、アゼパン−N−(3−プロパンスルホン酸)、ピペリジン−N−(3−プロピオン酸)(PPA)、3−モルフォリノ−2−ヒドロキシプロパンスルホン酸(MOPSO)、3−モルホリンプロパンスルホン酸(MOPS)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−3−プロパンスルホン酸(EPPS)、N−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−N’−3−エタンスルホン酸(BES)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−エタンスルホン酸)(PIPES)、トリエタノールアミン、N−2−ヒドロキシピペラジン−N−2−エタンスルホン酸(HEPES)、ピペラジン−N,N’−ビス−4−ブタンスルホン酸、ホモピペリジン−N−3−プロパンスルホン酸、ピペラジン−N,N’−ビス−3−プロパンスルホン酸、ピペリジン−N−3−プロパンスルホン酸、ピペラジン−N−2−ヒドロキシエタン−N’−3−メチルプロパノエート、ピペラジン−N,N’−ビス−3−メチルプロパノエート、1,6−ジアミノへキサン−N,N,N’,N’−四酢酸、N,N−ビスプロピル−N−4−アミノブタンスルホン酸、N−トリス(ヒドロキシメチル)メチル−2−アミノエタンスルホン酸(TES)、1,3−ビス[トリス(ヒドロキシメチル)メチルアミノ]プロパン(ビス−Trisプロパン)、3−ジメチルアミノ−1−プロパノール、3−ジメチルアミノ−2−プロパノール、N,N,N’,N’−テトラプロピルプロパン−1,3−ジアミン(TPA2量体)、ピペラジン−N,N’−ビス(2−ヒドロキシプロパン)スルホン酸(POPSO)及び2−ヒドロキシ−3−[4−(2−ヒドロキシエチル)ピペラジン−1−イル]プロパン−1−スルホン酸(HEPPSO)からなる群から選択される、請求項9から12までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記電極が元素状炭素を含む、請求項9から18までのいずれか一項に記載の方法。
- 前記電気化学発光標識を少なくとも1つのフェニルエーテル含有洗浄剤とも接触させる、請求項9から19までのいずれか一項に記載の方法。
- 電気化学発光標識と、電気化学発光共反応物と、pH緩衝剤と、を含む組成物の存在下で、電気化学発光を誘導する、前記pH緩衝剤はトリス[ヒドロキシメチル]アミノメタン(Tris)、オリゴ(グリシン)又はそれらの組合せからなる群から選択され、リン酸塩ではなく、前記電気化学発光共反応物が第三級アミンである、電気化学発光を誘導する方法。
- 前記pH緩衝剤が電気化学発光アッセイ緩衝剤バックグラウンド低減剤である、請求項21に記載の方法。
- 前記電気化学発光標識がルテニウム又はオスミウムの有機金属錯体である、請求項21又は22に記載の方法。
- 前記方法がさらに、
(a)前記組成物を電気化学エネルギーに曝し、前記電気化学発光組成物を誘導して電磁放射を放出させるステップと、
(b)放出された電磁放射を検出するステップと、
を含む、請求項21から23までのいずれか一項に記載の方法。 - 電極に酸化電位を印加することによって前記電気化学エネルギーを発生させる、請求項24に記載の方法。
- 前記電気化学発光標識が前記電極に付着している、請求項25に記載の方法。
- 前記電極が元素状炭素を含む、請求項25又は26に記載の方法。
- 前記電気化学発光標識がルテニウム又はオスミウムの有機金属錯体であり、前記組成物は無機リン酸塩を実質的に含まない、請求項21に記載の方法。
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