JP5397722B2

JP5397722B2 - 大きさが１５ｎｍ以下の微粒子の膜隔離膜除去および膜濃縮方法。

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Publication number: JP5397722B2
Application number: JP2007106596A
Authority: JP
Inventors: 真鍋征一; 関千恵子
Original assignee: 真鍋征一
Priority date: 2007-04-14
Filing date: 2007-04-14
Publication date: 2014-01-22
Anticipated expiration: 2027-04-14
Also published as: JP2008260001A

Description

本発明は液体や気体中に分散している微粒子を膜を用いて隔離したり、除去したり、あるいは濃縮する方法に関する。分散とは微粒子（分散相に相当）とそれを分散している媒質（すなわち分散媒）との間に明確な界面が存在することを意味する。ここで微粒子とは分散媒との間に明確な界面を持つ分散相を形成し、相当直径が１５ｎｍ以下である。相等直径は粒子体積を用いて次式で定義される。
相当直径＝２（３×粒子体積／４π）^１／３（１）

バイオ医薬品の製造工程、特に精製工程においてウイルス除去不活化のプロセスバリデーションが求められる。この場合最小のウイルスの大きさは焼く２０ｎｍであるのでこのプロセスで採用される微粒子除去用膜の機能は２０ｎｍ以上の径の粒子を除去することを目的としている。該微粒子除去膜では膜間差圧（ΔＰ）を物質移動の駆動力とするろ過法を採用しているため、膜の平均孔径が小さくなると急速にろ過速度が低下し、また目詰まりが急速に起こる。すなわち平均孔径が１５ｎｍ未満の濾過用膜は微粒子除去を目的として産業的に利用されていない（非特許文献１）。

ナノテクノロジーで注目される物質としてナノ粒子がある。ナノ粒子は数ｎｍ〜数百ｎｍの粒子であり、その粒子の濃縮、精製、分離等の制御技術がナノテクノロジーの発展に必要となる。しかしこの分野で膜分離技術が適用された例はない。ディーゼル車等のエンジンからの排気ガス中にはナノ粒子が分散していることが明らかとなっている。しかし一端この粒子が空気中の分散した場合には粒子のブラウン運動のため地上に落下することはほとんどなく、一部は吸着により固体表面にとらえられる。

医薬品あるいは食品等の水溶液中に混入されていると推察されるプリオンあるいはタンパクの会合体あるいはパイロジェン等は大きさは１５ｎｍ未満の微粒子となって水溶液中に分散していると推測される（非特許文献２）。これらの微粒子を除去する方法は提案されていない。

生ワクチンの製造などのようにウイルス粒子の濃縮の際には研究室規模では遠心分離法が利用されている。この方法で１５ｎｍ以下の微粒子を濃縮しようとすると分離濃縮に必要とする遠心力は粒子径の減少に伴なって大幅に増大し、工業的な方法として遠心分離法の適用はむつかしい。また膜を利用した微粒子の濃縮は可能であるが、その際濾過方法によって主として水分を除去するため膜中の孔の目詰りと膜表面での濃度分極が起る。膜の最適な孔特性及び濾過条件を選定することによって上記の問題点は緩和することは可能であるが問題点を完全に解消することは不可能である。これらの問題点はいずれも微粒子径が小さくなると顕著である。

微粒子の一部はそれ自体で人体に悪影響を与える場合もある。ウイルス細菌等の微生物、炭素系のナノ粒子、アレルゲン等がその例である。これらの物質の侵入を防止つつ、空気や炭素ガスは抵抗なく移動することが出来る環境が必要である。特にこれらの微粒子で空気環境が汚染されている場合には微粒子の侵入を防止する隔離された空間を作る必要がある。特許文献１に示されるように親水性多孔膜がこの目的には最適である。しかしこの場合においても物質移動の騒動力が圧力差であるため微粒子による目詰りは防止できず、特に微粒子の大きさが１５ｎｍ以下の場合には目詰り現象が顕著である。

空気中あるいは水中に分散する微粒子は結晶化を含めた相分離現象に重大な影響を及ぼすことが知られている。微粒子は相分離の際の核となり相分離速度に影響する。界面現象の中で従来別御が困難であった核発生の過程では１０〜１５ｎｍの微粒子（これを相分離過程での一次粒子といわれている）が生成し、製膜、結晶化、液一液分離で重要な役割を示す。そのため１５ｎｍ以下の微粒子の混入の濃度制御が重要であるが現在、その制御法はない。

ＰＤＡＪｏｕｒｎａｌｏｆｐｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅａｎｄＴｅｃｈｎｏｌｏｇｙ，ｖｏｌ５９（ＮＯ５−２）ＴｅｃｈｎｉｃａｌＲｅｐｏｒｔＮＯ．４１ＶｉｒｕｓＦｉｌｔｒａｔｉｏｎ（２００５）真鍋征一，Ｊ．，ＭａｓｓＳｐｅｃｔｒｏｎ．Ｓｏｃ．Ｊｐｎ．５１（１），ｐｐ１４６−１５２（２００３）特許第３８９１８０８号

１５ｎｍ以下の大きさの微粒子を分散した環境より（１）微粒子のみを隔離し、分子状に溶解または分散した大きさ約３ｎｍ以下の分子に対しては開空間を提供することが可能な技術は膜を利用した透析法がある。この際使用される透析膜は半透膜として従来呼称されているように膜中には孔が観察されていない。そのため分子の膜透過の機構として溶解／拡散流れである。溶解／拡散流れでは分子の拡散係数は１０^−１０ｃｍ^２／ｓ〜１０^−１２ｃｍ^２／ｓであり、この流れを使った空間形成では実用性がない。実用性をもたせるには分子の拡散係数を１万倍高めなくてはならない。すなわち本発明の第１の課題は分子の膜透過の拡散係数を１０^−８ｃｍ／ｓにすることである。

ウイルスは大きさとして２０ｎｍ〜２００ｎｍの範囲内の微粒子であり、マイコプラズマ、細菌はそれ以上の大きさを持つ微粒子である。感染性を持つプリオンの大きさは確定されていないが、その最小のプリオンの大きさは３５ｎｍ以下であり、かつ分子量とコンホメーション（β―シート）を考慮すると約１０ｎｍである。ディーゼルエンジンから排出される微粒子は１５ｎｍ以下の成分も多数存在していることが明らかにされている。従来のウイルス除去膜は１５ｎｍを越える微粒子の除去性を持つが１５ｎｍ以下の微粒子除去には無力である。１５ｎｍ以下の微粒子は除去された状態で有効成分を効率良く回収する膜分離技術を提供するのが本発明の第２の課題である。

ナノテクノロジーによって作製されるナノ粒子、あるいは現在水や大気環境に存在する１５ｎｍ以下の粒子を高濃度に濃縮することによって微粒子が新材料の資源として利用することが可能となる。本発明の第３の課題は工業的規模での微粒子の精製と濃縮方法を与えるとことにある。

前途した課題の解決の困難さは１５ｎｍ以下という微小粒子の下記特性から容易に推察される。（１）微粒子のブラウン運動の激しさ（その結果として微粒子の拡散が起り、この運動の激しさは拡散係数の大きさで表現される）は粒子半径に反比例する。そのため１５ｎｍ以下の微粒子はその位置の特定さえ困難となる。このため遠心分離法による分離濃縮は困難である。（２）自然界の大気や水中には１５ｎｍ以下の微粒子の存在密度が高く、また沈殿等によってそれらの微粒子を分離することはできない。存在密度の高さのため膜濾過では目詰りが急速に起り、膜濾過技術は工業的には利用できない。（３）微小粒子の除去法としては静電気的な力、親和力などによる吸着が一般的であるが、選択性が不足し目的とする有効な成分の吸着も起る。

本発明の最大の特徴は孔拡散型の膜分離法を利用し、ふるい効果のみで粒子分離する点にある。ここで孔拡散型の膜分離法とは以下の技術である。（１）物質の膜内部の透過機精が物質自体のブラウン運動が中心である。そのため濾過の場合とは異なり力学的な力（膜間差圧など）を主たる駆動力とせずに物質の濃度差が物質移動の駆動力である。（２）物質間の分離はそれぞれの物質間でのブラウン運動の激しさと膜中の孔が持つふるい効果によって起こる。（３）膜中での物質の移動が主として膜中の孔を通して行われる。

物質の膜内部の透過機精がブラウン運動が中心（拡散による物質移動が中心）であるため膜中の孔への目詰りが防止される。拡散による膜中での物質移動ではその速度が小さく拡散係数で表現した場合１０^−１０〜１０^−１２ｃｍ^２／ｓ程度である。本発明の拡散係数では拡散係数は１０^−５〜１０^−９ｃｍ^２／ｓとなり、拡散機構を利用した膜分離技術の実用化が可能となった。

拡散数では孔の目詰りが生じないという特徴は膜の平均孔径が小さくなるほど有効である。すなわち平均孔径として５ｎｍ以上でかつ１０ｎｍ以下であれば１５ｎｍの微粒子を効率的に除去可能となり、目詰りも起らない。この場合の膜間差圧が０．１気圧以下であれば濾過による物質移動速度よりも拡散による物質移動速度が上まわる。すなわち膜濾過と孔拡散とが同時に行われてても平均孔径が１０ｎｍ以下で膜間差圧が０．１気圧以下であれば目詰りはほとんど起らない。

平均孔径が５ｎｍ未満では分子量が１万以上の物質では孔拡散は起らない。孔拡散が物質輸送で支配的であるかどうかは、拡散係数の温度依存性から判断できる。すなわち孔拡散での拡散の見掛けの活性化エネルギーは０〜５ｋｃａｌ／ｍｏｌｅであり、溶解拡散での活性化エネルギーは１０ｋｃａｌ／ｍｏｌｅ以上となる。

孔拡散型膜分離法で利用される膜はその空孔率は６０％以上９０％以下で膜厚が２０μｍ以上であり、かつ膜構造として多層構造を有する。拡散係数は原理上、空孔率に比例するが空孔率が６０％未満ではこの比例関係で算出される拡散係数以下となる。空孔率が９０％以上では多層構造の維持がむつかしい。多層構造を持つ膜はミクロ相分離法で作製される。多層構造は膜の横断面の透過型電子顕微鏡観察で確認される。多層構造により微粒子の高い除去性能が達成される。

本発明で利用される膜の形状として平面状の膜（平膜）がより望ましいが中空糸膜でもかまわない。ただし中空糸膜の場合には液体の流入口での液流速をほぼ等しくするための特別な条件（例えば連動モーターの使用など）が求められる。

多層構造を持つ膜では膜厚を大きくすればするほど微粒子除去性能は上昇する。ただし有用物質の膜透過速度は膜厚に反比例する。そのため膜厚は１ｍｍ以下であることが実用上望ましい。膜厚が２０μｍ未満では膜透過速度は上昇するが（ａ）微粒子除去性能の低下（ｂ）ピンホールの発生確率が増加する。

本発明で利用される膜の素材としては、水溶液中からの微粒子除去濃縮分離を目的とする場合には親水性高分子が望ましい。親水性高分子であれば溶解した成分の吸着が防止され目詰りが起りにくく、かつ有効成分の回収率の低下が起りにくくなる。気体中からの微粒子除去や濃縮回収の場合にも膜素材としては親水性高分子が望ましい。親水性高分子では膜の帯電が起りにくく帯電現象による微粒子の吸着が起こらないため微粒子除去性能の完全性と予測性とが確保できる。

親水性高分子の例として天然セルロース、再生セルロース、セルロース誘導体、ポリスルホン、ポリビニルアルコール、ポリビニルピリドン、ポリアクリロニトルおよびこれらの共重合体である。これらの高分子素材での良溶媒が知られていればその溶液を用いて乾式法あるいは湿式法でミクロ相分離を起こさせる方法で製膜する。天然セルロースのように良溶媒が容易に見い出せない場合には天然セルロース原料であるパルプや綿花あるいは草類から直径１００ｎｍ以下のミクロフィブリルを取り出し、これを水で分散させて紗紙法で製膜する。

除去すべき微粒子としてプリオンの場合には、その粒子の大きさは確定されていない。感染性を持つプリオンは界面活性剤が共存していない水中では大きさ３５ｎｍ以上である。しかし界面活性剤（例サルコシル）を共存させると感染性プリオンの大きさは小さくなる。プリオンを分散した水溶液にはタンパク質が溶解している系が多い。特にバイオ医薬品や食品中に混入したプリオンを除去するには孔拡散型膜分離法で産業的に唯一の方法と考えられる。この際利用する膜は再生セルロースで構成され平均孔径は５〜１０ｎｍで特に１０ｎｍが望ましい。空孔率は６０％以上で９０％以下であるが８０〜８７％が特に望ましい。膜厚は２０μｍ以上であるが膜透過速度と微粒子除去性能を考慮すると３５μｍ〜５０μｍが望ましい。膜は多層構造で構成される。

本発明により液体中や気体中に分散している多量の１５ｎｍ以下の微粒子を除去、濃縮、分離することが工業的規模で可能となった。またこれらの微粒子のみを閉空間として隔離でき、分子に関しては開空間をなすことができる。孔拡散によって高い拡散速度を得、さらに膜中の孔の目詰りを防止することができる。

図１に孔拡散型膜分離機を３台直列的に結合させ被処理用原液Ｓ₁を設定された速度で孔拡散濾過処理するシステムを示す、濾過の際の駆動力である膜間差圧△Ｐは０．１気圧以下に保たれるように静水圧として与えられる。この静水圧は原液Ｓ_１と拡散液Ｓ_２との高さの差で設定される。孔拡散による特定物質の物質輸送の駆動力は溶液Ｓ_１とＳ_２との特定物質の濃度差で制御される。△Ｐの値は膜ｍ_１、ｍ_２、ｍ_３の平均孔径によって設定され、濾過による物質移動量が孔拡散による物質移動量以下になるように設定される。この設定により膜中の孔への目詰りが防止される。

図１中の孔拡散型膜分離機に利用する膜ｍ_１、ｍ_２、ｍ_３の間すくなとも１種は平均孔径５〜１０ｎｍでなくてはならない。典型的な例としてｍ_１、ｍ_２、およびｍ_３が完全に同種の膜で、平均孔径１０ｎｍ、空孔率８５％、膜厚が２００μｍで膜素材は再生セルロース膜を用いる。この膜は酢酸セルロースのアセトン溶液を流延し、ミクロ相分離を生起させ製膜し、その後ケン化処理により再生セルロースに変化させる。このような製法により、空孔率の高いまた親水性の大きな多層構造膜が作製される。この膜を流体の回路をもうけた支持体にはさみ流路厚さ１ｍｍを確保する。

平均孔径が１０ｎｍで、溶液Ｓ_１の粘度が５ｃｐである場合には△Ｐ＝０．１気圧粘度が１ｃｐの場合には△Ｐ＝０・０３気圧の静水圧差を設定する。溶液Ｓ_１をあらかじめ濃縮工程を経て、粘度をさらに高めておれば△Pをさらに高めて良く、またＳ_３、Ｓ_４およびＳ_５中の目的物質の濃度を高めることができる。溶液Ｓ_１の流出速度に対してＳ_６の流出速度の比が１００対１になるようにコツクＣ_１で調整する。拡散液Ｓ_２の流出速度をＳ_１のそれと同じになるようにコックＣ_２で調整する。

平均孔径１０ｎｍ、空孔率８６％、膜厚２００μｍ、膜面積０．０１０ｍ^２再生セルロース平膜を用いて孔拡散型膜分離モジュールを３個作製した。このモジュールを図１のように直列に３台連結した。図中の膜間差圧△Ｐを５０ｃｍＨ_２Ｏとし溶液Ｓ_１に１重量％のアルブミン水溶液５００ｍｌ、Ｓ_２として純水を５００ｍｌ用いた。温度を２０℃に設定した。Ｓ_１およびＳ_２の流出速度を２０ｍｌ／時間、溶液Ｓ_６の流出速度を０．２ｍｌ／時間に設定した。２４時間後に得られた拡散液量は９９０ｍｌでアルブミンの回収率は９８％、アルブミン濃度は０．５重量％であった。拡散液の透明度はＳ_１に比較して上昇していた。

純水１５０ｍｌを容器１，２のそれぞれに充填し、Ｓ_１およびＳ_２の流れ速度を１０ｍｌ／分とし、ΔＰ＝１００ｃｍＨ_２Ｏに設定して、膜Ｍ_１，Ｍ_２およびＭ_３の表面を洗浄した。洗浄後平均粒径１０ｎｍの無定形水酸化第二鉄コロイド溶液（鉄イオン濃度１０００ｐｐｍ）５０ｍｌを容器１に注ぎ、容器２に純水を入れΔＰ＝１００ｃｍＨ２ＯとしてＳ_１およびＳ_２の流出速度を５０ｍｌ／時間で流出させた。容器３，４，５中の溶液中の水酸化第二鉄コロイド粒子濃度は０．０１ｐｐｍ以下であった。すなわち１０ｎｍ径の微粒子除去性能は対数除去係数は５以上であった。

本発明は動物由来の物質を原料とした製品の安全性を与える基本技術となる。そのためバイオ医薬品の製造工程中の精製工程に利用される。また食品、特に機能食品、健康保険食品調味材の製造工程に利用される。さらにナノテクノロジー分野での微粒子除去、濃縮、分離隔離の基本技術として利用される。

本発明の実施の孔拡散型膜分離器を３台直列に連結した典型的な例。

符号の説明

１：被処理原液（Ｓ_１）を貯蓄する容器。大気への無菌的導通管（Ｐ_１）を持つ。
２：拡散液（Ｓ_２）を貯留する容器。大気への無菌的導通管（Ｐ_２）を持つ。
３：孔拡散型膜分離機（Ｄ_１）より流出する拡散液（Ｓ_３）を貯留する容器、大気への無菌的導通管（Ｐ_３）を持つ。
４：孔拡散型膜分離機（Ｄ_２）より流出する拡散液（Ｓ_４）を貯留する容器、大気への無菌的導通管（Ｐ_４）を持つ。
５：孔拡散型膜分離機（Ｄ_３）より流出する拡散液（Ｓ_５）を貯留する容器、大気への無菌的導通管（Ｐ_５）を持つ。
６：孔拡散型膜分離機（Ｄ_３）の拡散濾過処理後の液（Ｓ_６）を貯留する容器、大気あるいは真空系への無菌的導通管（Ｐ_６）を持つ。
Ｄ_１：第１段階目の孔拡散型膜分離機
Ｄ_２：第２段階目の孔拡散型膜分離機
Ｄ_３：第３段階目の孔拡散型膜分離機
Ｐ_１、Ｐ_２、Ｐ_３、Ｐ_４、：大気への無菌的導通管
Ｐ_５、Ｐ_６、：大気または真空系への無菌的導通管
Ｃ_１Ｃ_２Ｃ_３Ｃ_４：流速調節用コック
Ｓ_１：非処理用原液
Ｓ_２：拡散用溶液
Ｓ_３：Ｄ_１より留出する溶液
Ｓ_４：Ｄ_２より留出する溶液
Ｓ_５：Ｄ_３より留出する溶液
Ｍ_１、Ｍ_２、Ｍ_３、：孔拡散型膜分離機に装着されている膜
Ｔ_１：容器１とＤ_１とを結合するチューブ
Ｔ_２：Ｄ_１とＤ_３とを結合するチューブ
Ｔ_３：Ｄ_２とＤ_３とを結合するチューブ
Ｔ_４：Ｄ_３と容器１とを結合するチューブ
Ｔ_５：容器２とＤ_１の拡散液側とを結合するチューブ
Ｔ_６：Ｄ_１とＤ_２との拡散液側を結合するチューブ
Ｔ_７：Ｄ_２とＤ_３との拡散液側を結合するチューブ
Ｔ_８：Ｄ_３の拡散側と容器５とを結合するチューブ
△
Ｐ：被処理用原液側と拡散液側との間で生じる膜間差圧

Claims

気圧以下負荷した条件下での孔拡散型の膜分離法を利用する際に該分離法で使われる膜は親水性高分子を膜素材とし平均孔径が５ｎｍ以上で１０ｎｍ以下、空孔率が６０％以上で９０％以下で膜厚が２０μｍ以上でありかつ膜構造として多層構造を有する特徴を持ち、該微粒子を吸着することなく、ふるい効果で（１）該微粒子のみを隔離するか、（２）該微粒子のみを除去するか、あるいは（３）該微粒子のみを濃縮することを特徴とする微粒子分離方法。
請求項１において除去すべき微粒子がプリオンであり、膜素材が再生セルロースで構成される平膜であり平均孔径が１０ｎｍであることを特徴とする微粒子除去方法。