JP5374685B2

JP5374685B2 - 新規ｈｃｖエントリー阻害剤

Info

Publication number: JP5374685B2
Application number: JP2008300937A
Authority: JP
Inventors: 豊武部; 航袴田; 理恵上西
Original assignee: Japan Health Sciences Foundation
Current assignee: Japan Health Sciences Foundation
Priority date: 2008-02-14
Filing date: 2008-11-26
Publication date: 2013-12-25
Anticipated expiration: 2028-11-26
Also published as: JP2009215280A

Description

本発明は、新規ＨＣＶエントリー阻害剤に関する。より詳しくは、ＨＣＶ受容体の候補物質である、ＣＤ８１との結合を阻害し得るＨＣＶエントリー阻害剤に関するものである。

Ｃ型肝炎ウイルス（ＨＣＶ：ｈｅｐａｔｉｔｉｓＣｖｉｒｕｓ）の感染によって引き起こされる肝炎は、感染後２０数年の経過の中で肝硬変、そして最終的には肝癌を発症する。ＨＣＶ感染者は、日本国内では約２００万人、世界では約２億人に達すると推定されている。現在、我が国での肝細胞癌による犠牲者は年間約３．５万人となっており、その８割はＨＣＶ感染によるものである。

ＨＡＡＲＴ(Ｈｉｇｈｌｙａｃｔｉｖｅａｎｔｉｒｅｔｒｏｖｉｒａｌｔｈｅｒａｐｙ)の導入によってエイズ患者の予後が大幅に改善された結果、我が国を含む先進国では、ヒト免疫不全ウイルス（ＨＩＶ：ＨｕｍａｎＩｍｍｕｎｏｄｅｆｉｃｉｅｎｃｙＶｉｒｕｓ）感染者がエイズ以外の病因、特に、ＨＣＶ重複感染による肝障害（及び肝不全の合併）が原因で死亡するケースが急増している。また、非加熱凝固因子製剤によるＨＩＶ感染者におけるＨＩＶとＨＣＶの共感染率は９７％にも及び、ＨＣＶ感染症の治療は、ポストＨＡＡＲＴ時代の重要な医療課題となっている。現在、ＨＣＶ感染症に対して、インターフェロン−α（ＩＦＮα）とリバビリン（１−β−Ｄ−ｒｉｂｏｆｕｒａｎｏｓｙｌ−１Ｈ−１，２，４−ｔｒｉ−ａｚｏｌｅ−３−ｃａｒｂｏｘａｍｉｄｅ）の併用療法が一般的であるが、患者全体の５０％程度にしか有効ではなく、また、血球減少症・溶血性貧血など重篤な副作用をおこすことが知られており、ＨＣＶキャリアの発症予防や生体からのＨＣＶ排除を目指した、抗ウイルス剤や治療用ワクチンの開発が求められている。しかし、治癒率が低い１ｂ型のＨＣＶを効率よく増殖可能な培養細胞系が存在していないことや、感受性を示す実験動物がチンパンジー以外は存在しないことから、ワクチンや治療薬の開発には多くの課題が残されている。

ＨＣＶの感染の分子機構に関しては、ＨＣＶを増殖可能な細胞培養系が存在しないために不明な点が多いが、これまでの研究から、ＨＣＶは細胞表面に存在する、ヘパリンやヘパラン硫酸等の硫酸多糖類に捕捉され、細胞膜上の受容体に結合し、エンドサイトーシス機構によって、細胞の中に取り込まれると考えられている。ＨＣＶのエントリー機構に関与する受容体タンパク質として、ＣＤ８１、ＳＲ−ＢＩ及びＣｌａｕｄｉｎ−１の３種が知られているが、その他に、肝細胞に特異的な未同定の因子の関与が推定されている。本発明者らは、上記のエンドサイトーシス機構に関する知見に基づいて、エンベロープタンパク質（Ｅ２タンパク質）とＣＤ８１との結合を阻止する複数の化合物について研究を重ね、ＨＣＶエントリー阻害剤に関する報告をしている（特許文献１参照）。
特願２００７−１８１４５

しかしながら、ＣＤ８１とＨＣＶのＥ２タンパク質との結合阻害機構が解明されれば、優れたＨＣＶエントリー阻害活性を有する物質の探索も容易となるところ、この機構の詳細は未だ明らかにされていない。

したがって、本発明の目的は、ＣＤ８１とＨＣＶのＥ２タンパク質との結合阻害機構に基づいて探索され、ＨＣＶ増殖に対する優れたＨＣＶエントリー阻害活性能を有するＨＣＶエントリー阻害剤を提供することにある。

本発明者らは、斯かる従来技術の問題点に鑑み、ＣＤ８１とＨＣＶのＥ２タンパク質との結合阻害機構について鋭意研究を重ねた結果、ＣＤ８１の長鎖細胞外ループ（ＬＥＬ：ｌｏｎｇｅｘｔｅｒｎａｌｌｏｏｐ）に見出される疎水性ポケットに、高い親和性で適合する構造を有する物質が、優れたＨＣＶエントリー阻害活性を有することを見出し、本発明を完成した。

（１）すなわち、本発明は、一般式（Ｉ）

［式中、Ｒ^１は、水素原子、

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又は

を表す。］で示されるヘキサヒドロシクロペンタキノリルアミン誘導体、又はその生理学的に許容される塩を有効成分とする、Ｃ型肝炎ウイルスエントリー阻害剤である。

（２）また、本発明は、（１）に記載のＣ型肝炎ウイルスエントリー阻害剤を有効成分とする、Ｃ型肝炎、肝硬変又は肝細胞癌の予防剤又は治療剤である。

本発明のＨＣＶエントリー阻害剤は、上述したとおり、ＨＣＶ受容体の１種であるＣＤ８１分子間のＬＥＬに見出される疎水性ポケットに、高い親和性で適合する構造を有する物質を含有しているので、ＨＣＶのエントリー（感染）を阻止し、その結果としてＨＣＶの増殖を阻害することができる。

以下、本発明の実施の形態を、添付の図面を参照して説明する。

本発明のＨＣＶエントリー阻害剤は、表１〜８に示すヘキサヒドロシクロペンタキノリルアミン誘導体、又はその生理学的に許容される塩を有効成分とするものである。これらの化合物は複数の異性体を含み、これらの異性体のいずれか１つ又は２つ以上の混合物を包含するものである。また、これらの化合物は、既知の化合物であり、表１〜８の左欄に示す化合物は、右欄に示す製造会社からそれぞれ入手することができる。

本発明のＨＣＶエントリー阻害剤の有効成分となり得るヘキサヒドロシクロペンタキノリルアミン誘導体の生理学的に許容される塩としては、ナトリウム塩、カリウム塩等のアルカリ金属塩、カルシウム塩、マグネシウム塩等のアルカリ土類金属塩、塩酸塩、硝酸塩、臭化水素酸塩、硫酸塩、燐酸塩、炭酸塩、炭酸水素塩、過酸化水素塩等の無機酸塩、トリメチルアミン塩、トリエチルアミン塩、ジシクロヘキシルアミン塩、エタノールアミン塩、ジエタノールアミン塩、トリエタノールアミン塩、ブロカイン塩等の脂肪族アミン塩、Ｎ，Ｎ−ジベンジルエチレンジアミン等のアラルキルアミン塩、ピリジン塩、ピコリン塩、キノリン塩、イソキノリン塩等の複素環芳香族アミン塩、テトラメチルアンモニウム塩、テトラエチルアモニウム塩、ベンジルトリメチルアンモニウム塩、ベンジルトリエチルアンモニウム塩、ベンジルトリブチルアンモニウム塩、メチルトリオクチルアンモニウム塩、テトラブチルアンモニウム塩等の第４級アンモニウム塩、アンモニウム塩、酢酸塩、プロピオン酸塩、乳酸塩、マレイン酸塩、フマル酸塩、酒石酸塩、リンゴ酸塩、クエン酸塩、アスコルビン酸塩、メタンスルホン酸塩、ベンゼンスルホン酸塩、ｐ−トルエンスルホン酸塩、メタンスルホン酸塩、イセチオン酸塩等の有機酸塩、又は、アスパラギン酸、グルタミン、アルギニン塩、リジン塩酸等のアミノ酸との塩等が挙げられる。なお、本発明における生理学的に許容される塩は、水和物等の溶媒和物の形であってもよく、状況に応じて適宜選択することができる。

本発明のＨＣＶエントリー阻害剤の有効成分となり得るヘキサヒドロシクロペンタキノリルアミン誘導体は、上述したとおりの、ＬＥＬに見出される疎水性ポケットに、高い親和性で適合する構造を有する複数の候補化合物の中から、薬剤スクリーニング（ＨＣＶエントリー阻害活性確認試験）及び細胞毒性アッセイ（細胞毒性確認試験）によって選定されたものである。

本発明におけるスクリーニング方法は、図１に示すように、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７細胞（ＰＮＡＳ，Ｖｏｌ．１０２，ｎｏ．２６（２００５），９２９４−９２９９．参照）に、スクリーニング候補化合物及び感染性ＨＣＶを接触させたのち、ＨＣＶを測定することにより行うものである。

まず、文献（特願２００６−３５１８０９参照）に記載の方法に従い、ＲＮＡＰｏｌＩプロモーター／ターミネーター系を利用したＪＦＨ１株（ｇｅｎｏｔｙｐｅ２ａ)のｃＤＮＡ発現プラスミド導入細胞株（Ｈｕｈ７．５．１／ＪＦＨ１ｚｅｏ^Ｒ細胞）を用い、感染性ＨＣＶのレプリコンゲノムから感染性ＨＣＶを作製する。なお、ＨＣＶストック液は、分注した後に−８０℃で保存しておく。次に、ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７．５．１細胞を、例えば９６穴のマイクロプレート等のスクリーニング用容器に播種し、候補化合物を、播種した細胞を含む培養液に加え、さらに感染性ＨＣＶを播種し、培養の上清を採取してＨＣＶを測定する。なお、感染性ＨＣＶを細胞中で培養するために、３〜６日間、３７±１℃で加温してもよい。ＨＣＶの測定は、ＨＣＶの複製の促進又は抑制を確認しうる方法であれば良く、特に限定されるものではないが、例えば、市販のキットを用いてＨＣＶコアタンパクの産生量をＥＬＩＳＡ法などにより確認することができる。

本発明におけるアッセイ方法は、図１に示すとおり、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８から産生されるホルマザンの吸光度を測定（ＷＳＴ法）することによって、細胞毒性試験を行うものである。生細胞においては、細胞内脱水素酵素によりＷＳＴ−８が還元され、４６０ｎｍ付近に極大吸収を持つ水溶性ホルマザンが産生される。産生されるホルマザン量は生細胞数に比例することから、ホルマザン産生量を吸光度により測定することで、生細胞数（生存率）を測定することができる。

上記スクリーニング及びアッセイによって選定された化合物は、ＨＣＶの増殖を抑制するものであり、例えば、直接的もしくは間接的にＨＣＶの増殖に影響を及ぼしたり、あるいは、ＨＣＶゲノム又はその相補鎖の標的配列にハイブリダイズすることにより、ＨＣＶの増殖又はＨＣＶタンパク質の翻訳に、直接的又は間接的に影響を及ぼしたりする特性を有するものである。

本発明のＨＣＶエントリー阻害剤は、経口又は非経口により患者に投与することができる。経口投与の場合には、本発明のＨＣＶエントリー阻害剤に、賦形剤、結合剤、崩壊剤、滑沢剤、着色剤、矯味矯臭剤、抗酸化剤等を加えた後、常法により、錠剤、被服錠剤、丸剤、顆粒剤、散剤、粉剤、トローチ剤、カプセル剤等の固形製剤として投与することができる。賦形剤としては、乳糖、コーンスターチ、白糖、ブドウ糖、ソルビット、結晶セルロース、二酸化ケイ素等が挙げられ、結合剤としては、ポリビニルアルコール、ポリビニルエーテル、エチルセルロース、メチルセルロース、アラビアゴム、トラガント、ゼラチン、セラック、ヒドロキシプロピルセルロース、ヒドロキシプロピルメチルセルロース、クエン酸カルシウム、デキストリン、ペクチン等が挙げられ、崩壊剤としては、乾燥デンプン、アルギン酸ナトリウム、カンテン末、炭酸水素ナトリウム、炭酸カルシウム、ラウリル硫酸ナトリウム、ステアリン酸モノグリセリド、乳糖等が挙げられ、滑沢剤としては、ステアリン酸マグネシウム、タルク、ポリエチレングリコール、シリカ、硬化植物油等が挙げられ、着色剤としては、医薬品に添加することが許可されているものであればよく、矯味矯臭剤としては、ココア末、ハッカ脳、芳香酸、ハッカ油、龍脳、桂皮末等が挙げられ、抗酸化剤としては、アスコルビン酸、α−トコフェロール等の医薬品に添加することが許可されているものであればよい。なお、上記固形製剤に、糖衣、ゼラチン衣、その他必要に応じ適宜コーティングすることは差し支えない。

一方、非経口投与の場合には、坐剤、注射剤（点滴用注射剤も含む。）、軟膏剤、眼軟膏剤、点眼剤、点鼻剤、点耳剤、パップ剤、ローション剤等の非固形製剤として投与することができ、注射剤、点眼剤等の液状製剤を製造する場合は、本発明のＨＣＶエントリー阻害剤に、必要に応じてｐＨ調整剤、懸濁化剤、溶解補助剤、安定化剤、等張化剤、抗酸化剤、保存剤等を添加し、常法により製造することができる。なお、上記非固形製剤は、必要に応じて凍結乾燥物にすることも可能であり、注射剤は静脈、皮下、筋肉内に投与することができる。ｐＨ調整剤としては、塩酸、水酸化ナトリウム、乳糖、乳酸、ナトリウム、リン酸一水素ナトリウム、リン酸二水素ナトリウム等が挙げられ、懸濁化剤としては、メチルセルロース、ポリソルベート８０、ヒドロキシエチルセルロース、アラビアゴム、トラガント末、カルボキシメチルセルロースナトリウム、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等が挙げられ、溶解補助剤としては、ポリオキシエチレン硬化ヒマシ油、ポリソルベート８０、ニコチン酸アミド、ポリオキシエチレンソルビタンモノラウレート等が挙げられ、安定化剤としては、亜硫酸ナトリウム、メタ亜硫酸ナトリウム、エーテル等が挙げられ、等張剤としては、塩化ナトリウム、ぶどう糖等が挙げられ、保存剤としては、パラオキシ安息香酸メチル、パラオキシ安息香酸エチル、ソルビン酸、フェノール、クレゾール、クロロクレゾール等が挙げられる。

本発明のＨＣＶエントリー阻害剤の投与量は、患者、疾患の種類、症状の程度、患者の年齢、性差、薬剤に対する感受性差等により著しく異なり、正確な投与量は医師の診断により決定されるものであるが、通常、成人に対し１日あたり、上記有効化合物の投与量換算で、経口投与に場合は０．１〜１０００ｍｇを、非経口投与、例えば静脈内投与の場合は０．１〜１０００ｍｇを、１日１回又は数回に分けて投与する。

本発明のＨＣＶエントリー阻害剤は、極めて優れたＨＣＶエントリー阻害活性を有するので、急性Ｃ型肝炎又は慢性Ｃ型肝炎による諸症状、あるいは、肝硬変又は肝細胞癌への進展等の予防及び治療に用いることができる。

以下に実施例を示して本発明を具体的に説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではなく、本発明の要旨を逸脱しない範囲内において種々変更を加え得ることは勿論である。

［実施例１］
本発明のＨＣＶエントリー阻害剤の抗ＨＣＶ作用確認試験

ヒト肝癌由来Ｈｕｈ７．５．１細胞（継代数が第４３回目までのものを使用）を、１０％ＦＣＳを含むＤＭＥＭ培地に１×１０^４ｃｅｌｌｓ／１００μｌ／ウェルとなるように懸濁したものを９６ウェルのマイクロプレートに播種し、１日培養後に、表１及び２並びに表４〜６の式（ＩＩＩ）〜（ＸＸＶＩＩ）、で示される化合物１〜１０，２０〜２２，２４，２５，２８，３０，３２〜２４，３７及び３９（表１及び２並びに表４〜６に示す会社からそれぞれ購入）を、５μＭとなるように添加した。１５分間静置した後に、上記方法に従って作製した感染性ＨＣＶをＨｕｈ７．５．１細胞に播種して感染させ、３７℃、５％ＣＯ_２にて３〜６日間培養した。培養後、上清中のＨＣＶコアタンパク質量をオーソＨＣＶ抗原ＥＬＩＳＡテストにより定量し、化合物１〜１０，２０〜２２，２４，２５，２８，３０，３２〜２４，３７及び３９のＨＣＶ増殖阻害効果を評価し、該ＨＣＶ増殖阻害効果から、化合物１〜１０，２０〜２２，２４，２５，２８，３０，３２〜２４，３７及び３９のＥＣ_５０値（ＥＣ：ｅｆｆｅｃｔｉｖｅｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を求めた結果を表９に示した。

［実施例２］
本発明のＨＣＶエントリー阻害剤の細胞毒性試験

実施例１の化合物１〜１０，２０〜２２，２４，２５，２８，３０，３２〜２４，３７及び３９について、テトラゾリウム塩ＷＳＴ−８の生成したホルマザンの吸光度を直接測定するＷＳＴ法により、Ｈｕｈ７．５．１細胞に対する細胞毒性試験を行い、該細胞毒性試験結果から、化合物１のＣＣ_５０値（ＣＣ：ｃｙｔｏｌｏｘｉｃｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ）を求めた結果を表９に示した。

［実施例３］
本発明のＨＣＶエントリー阻害剤のＳＩ値

実施例１及び２で算出した化合物１〜１０，２０〜２２，２４，２５，２８，３０，３２〜２４，３７及び３９のＣＣ_５０値を、ＥＣ_５０値で割ってＳＩ値(ＳＩ：ｓｅｌｅｃｔｉｖｅｉｎｄｅｘ)を算出し、その結果を表９に示した。

［比較例１］
従来のＨＣＶエントリー阻害剤の抗ＨＣＶ作用確認試験

検体として表２の式（ＸＩＩＩ）〜（ＸＶ）で示される化合物Ａ〜Ｃ（表２に示す会社からそれぞれ購入）を用いた以外は実施例１と同様にして、化合物Ａ〜ＣのＨＣＶ増殖阻害効果を評価し、該ＨＣＶ増殖阻害効果から化合物Ａ〜ＣのＥＣ_５０値を求めた結果を表９に示した。

［比較例２］
従来のＨＣＶエントリー阻害剤の細胞毒性試験

比較例１の化合物Ａ〜Ｃを用いた以外は実施例２と同様にして、化合物Ａ〜Ｃについて、Ｈｕｈ７．５．１細胞に対する細胞毒性試験を行い、該細胞毒性試験結果から化合物Ａ〜ＣのＣＣ_５０値を求めた結果を表９に示した。

［比較例３］
従来のＨＣＶエントリー阻害剤のＳＩ値

比較例１及び２で算出した化合物Ａ〜ＣのＥＣ_５０値及びＣＣ_５０値を用いた以外は実施例３と同様にして、化合物Ａ〜ＣのＳＩ値を算出し、その結果を表９に示した。

実施例１〜３及び比較例１〜３の結果より、本発明のＨＣＶエントリー阻害剤の１つは、ＨＣＶ増殖に対する高い阻害活性（ＥＣ_５０＝〜０．１μＭ、ＣＣ_５０＝〜１２８μＭ；ＳＩ＝〜１２８０）を示し、ＨＣＶエントリー阻害剤として特に優れていることが示唆された。

本発明のＨＣＶエントリー阻害剤は、ＨＣＶ増殖に対する高い阻害活性を有するので、ウイルスの増殖を抑制することができ、急性Ｃ型肝炎による発熱や全身倦怠感、その後の食欲不振や悪心及び嘔吐、あるいは黄疸等の諸症状や、慢性Ｃ型肝炎による全身倦怠感、食欲不振、易疲労感等の諸症状を改善し、又は、慢性Ｃ型肝炎を発症した後の肝硬変への進展や、肝硬変になった後の肝細胞癌への進展を予防することができるので、Ｃ型肝炎、肝硬変、肝細胞癌等の予防薬及び治療薬として有用である。

本発明のＨＣＶエントリー阻害剤のスクリーニング方法及びアッセイ方法を模式的に示す図である。

Claims

一般式（Ｉ）

［式中、Ｒ^１は、水素原子、

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又は

を表す。］で示されるヘキサヒドロシクロペンタキノリルアミン誘導体、又はその生理学的に許容される塩を有効成分とする、Ｃ型肝炎ウイルスエントリー阻害剤。
請求項１に記載のＣ型肝炎ウイルスエントリー阻害剤を有効成分とする、Ｃ型肝炎、肝硬変又は肝細胞癌の予防剤又は治療剤。