JP5349490B2 - 細胞アッセイキット及び方法 - Google Patents
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Description
本発明は、細胞試料中における所与の型の細胞の存在及び/又は濃度、特に、試料中における少なくとも特定の閾値レベルの細胞の存在を判定するための細胞アッセイキット及び方法に関する。
病態の治療に対する応答を含む様々な疾患状態は、血液学的マーカーにより、血液試料中における特定の白血球細胞の近似濃度を、疾患に対する身体の応答の指標として用いてモニタすることができる。例えば、血液試料中におけるCD4+Tリンパ球細胞の濃度は、HIV感染後のAIDSの突発についてのマーカーを提供し得る。約200細胞/μl血液未満の細胞計数値は、免疫系が著しく弱まっており、従って、例えば抗レトロウイルス治療(ART)を直ちに開始する必要があることを示す。ウイルス感染症又は細菌感染症などの一部の疾患状態は、例えば約10,000細胞/μl血液を上回るような血液白血球濃度の上昇を特徴とし、従ってこれは、感染性病態の指標として機能し得る。逆に、白血病を有する人か、又は化学療法若しくは放射線療法を受けている人では、血液試料中における白血球濃度は、例えば約4,000細胞/μl血液を下回るまでに低下し得る。白血球細胞型のレベルの低下又は上昇を特徴とする以上の、及び他の疾患状態においては、マーカー細胞のレベルを用いることで、疾患状態を検出若しくは確認したり、又は病態の治療に対する身体の応答をモニタしたりすることができる。
(a)所与の細胞型の細胞を含む細胞試料を、細胞と特異的に結合可能な粒子であって、細胞と結合すると、細胞の密度又は磁化率を増加させる効果を有する粒子と反応させる工程であって、それにより、重力又は加えられる遠心力若しくは磁界の力の影響下に、特定の密度及び/又は特定の粘度の媒体を通じたその移動速度がより大きいことに基づき、試料中の粒子の結合した細胞及び単体粒子を、粒子が結合していない細胞と分離させる工程と、
(b)特定の密度の媒体を含み、且つその長さに沿って複数の細胞捕集領域を有する細長状の捕集チャンバを通じて、粒子の結合した細胞及び粒子が捕集チャンバの連続する細胞捕集領域を完全に充填するのに十分な期間にわたり、試料を重力又は特定の遠心力若しくは磁界の力に供することにより、細胞試料中の粒子の結合した細胞及び粒子を移動させる工程と、
(c)細胞試料が少なくとも閾値濃度の所与の細胞型の細胞を含むことの証拠として、少なくとも1つの特定の捕集領域が部分的又は完全に充填されているかどうかを判定するため、チャンバを検査する工程と、
を含む。
(a)細胞試料を受け入れるための試料チャンバと、それと流体連通した細長状の捕集チャンバであって、特定の媒体を含み、且つその長さに沿って複数の細胞捕集領域を有する捕集チャンバとを有するアッセイ装置と、
(b)細胞試料に添加されると、特定の細胞型の細胞と特異的に結合することが可能で、且つ細胞と結合すると、細胞の密度又は磁化率を増加させる効果を有する粒子であって、それにより、細胞試料中における粒子の結合した細胞及び粒子を、重力又は特定の遠心力若しくは磁界の力の影響下に、粒子の結合した細胞及び粒子が捕集チャンバの連続した細胞捕集領域を完全に充填するまで、細長状の捕集チャンバを通じて選択的に移動させることが可能な粒子と、
(c)装置の捕集チャンバにある少なくとも1つの捕集領域に関連した1つ又は複数の標線であって、粒子の結合した細胞及び単体粒子が捕集チャンバを通じて引き込まれるとき、当該の捕集領域を少なくとも部分的に充填する効果を有する特定の型の細胞の濃度を指示する標線と、
を含む。
I.定義
特に断らない限り、下記の用語は本明細書において以下の意味を有する。
図1は、本発明の一実施形態に従い作製された細胞アッセイキット20を示す。この装置は基材又は支持材22を含み、その上に装置の他の構成要素が装着されるか、又は組み込まれる。例えば、以下に記載される特定のリザーバ及びチャネル要素が、2枚の基材プレートの間において周知の方法に従い形成されたマイクロ流体要素として基材に組み込まれてもよく、この場合、例えば、リザーバ及びチャネル要素は下部プレート24の凹部として形成され、下部プレート24は上部カバープレート26によって被覆される。好ましい実施形態において、装置のチャンバ及び連結するマイクロチャネルは、ガラス又は硬質ポリマー材料のような平滑面材料で作製され、及びチャンバ及びチャネルの表面は、細胞がチャネル壁に非特異的に付着することを最小限に抑えるためコーティングで被覆される。例えば、チャネル壁は、米国特許第5567440号、同第6884628号及び同第5462990号に記載されるとおりの、ペグ化されたポリイオン共重合体によって被覆することができる。特定のシラン、アルカンチオール自己組織化単分子膜、PEG共重合体、界面活性剤及び無機層、又は例えばBSA若しくは血清のような受動的に吸収されるタンパク質に基づくコーティングなどの、チャネル壁に対する非特異的な、又は望ましくない細胞の付着を低減又は防止する当該技術分野において公知の他のコーティングが用いられてもよい。
本発明の方法は、所与の型の細胞の少なくとも閾値濃度の存在について細胞試料をアッセイするための上記の細胞アッセイ装置を使用する。説明のため、本方法は、感染症の状態をモニタされているHIV感染症を有する個人に存在するCD4+T細胞の閾値濃度(細胞計数値)を確定する方法に関して説明される。一般に、重力下で所定密度の媒体を通じた沈降によって細胞移動を生じさせる場合に、CD4+細胞計数値が500〜1500個のCD4+T細胞/μl血液であれば、個人におけるT細胞免疫は正常に機能していることが示される。HIVによってCD4+T細胞が200個のCD4+T細胞/μl血液より少なくなるまで死滅すると、細胞性免疫が失われ、AIDSとの診断可能性に至る。ここで説明されるアッセイは、250/μl血液未満のCD4+T細胞の閾値レベルを検出するように設計され、この閾値で治療が勧告されることを意味する。この閾値は、例えば個人の年齢に応じて、例えば、350、450、550、又は750/μl血液に調節され得る。
Claims (6)
- 所与の細胞表面抗原を有する被分析細胞の濃度を決定するためにヒト血液細胞試料をアッセイする方法であって、
(a)被分析細胞を含むヒト血液細胞試料に、前記被分析細胞上の前記所与の細胞表面抗原に特異的かつ高親和性に結合可能な表面結合性の結合剤を有し、且つ、被分析細胞を含む前記所与の細胞表面抗原を有する細胞と特異的に反応し結合するのに有効な重粒子であって、該重粒子が結合した細胞の密度を増加させるための重粒子と、
試料中の第2の種類の細胞であって前記所与の細胞表面抗原も含む細胞上に存在する第2の細胞表面抗原と特異的反応可能な表面結合性の結合剤が固定された磁性粒子であって、該磁性粒子が結合した細胞の磁化率を増加させるための粒子と、を加える工程と、
(b)前記試料に磁界を作用させて、前記第2の細胞表面抗原を有する細胞と磁性粒子を該試料から除く工程と、
(c)特定の媒体を含むマイクロチャネルカラムを通じて、前記細胞試料中の前記重粒子の結合した細胞及び前記重粒子を移動させる工程であって、
前記重粒子の結合した細胞及び前記重粒子の実質的に全て(但し、粒子に結合していない細胞を除く)を、前記特定の媒体を通じて、試料中の被分析細胞の血液試料における濃度に対応するカラムの容積が表示されているカラムの底に向かって移動させるのに十分な期間にわたり、前記試料を重力又は遠心力に供する工程と、
(d)前記カラム内の細胞レベルを検出するために前記カラムを検査し、前記特定の媒体を通って前記カラムの底に移動した細胞の容積に基づいて、前記試料中の被分析細胞の濃度を決定する工程と、
を含む、方法。 - 前記重粒子が、工程(a)において前記被分析細胞と結合すると、前記被分析細胞を検出可能なレポーターで標識する効果を有し、及び前記検査する工程が、前記検出可能なレポーターで標識された細胞の存在について、前記カラムを目視検査することを含む、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)が、前記カラムを実質的に直立した垂直配置状態に置くことによって前記粒子の結合した細胞を重力に供することを含み、前記特定の密度の媒体が前記粒子の結合した細胞より低い密度を有し、及び前記重粒子が実質的に球形の金属粒子である、請求項1に記載の方法。
- 工程(c)が、前記粒子の結合した細胞を遠心力に供することを含み、前記特定の密度
の媒体が前記粒子の結合した細胞より低い密度を有し、及び前記重粒子が実質的に球形の金属粒子である、請求項1に記載の方法。 - 工程(a)で加えられる磁性粒子が、実質的に球形の磁性粒子又は常磁性粒子である、請求項1に記載の方法。
- HIVに感染している可能性のある個人の血液試料中におけるCD4+Tリンパ球細胞の濃度を、前記個人のT細胞カテゴリーの指標として検出するための、請求項5に記載の方法であって、前記個人の血液試料を、表面結合性の抗CD4+結合剤を有する重粒子と、表面結合性の抗CD14結合剤を有する磁性粒子と、に曝露することによって添加工程(a)を実施する、方法。
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