JP5342705B2 - バイオセンサ - Google Patents

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Description

本発明は、試料中の特定成分を分析するバイオセンサに関し、特に、バイオセンサの試薬層を構成する試薬構成に関するものである。
バイオセンサは、微生物、酵素、抗体等の生物材料の分子認識能力を利用し、生物材料を分子識別素子として応用したセンサである。すなわち、固定化された生物材料が、目的の特定成分を認識したときに起こる反応、微生物の呼吸による酸素の消費、酵素反応、発光などを利用したものである。
バイオセンサの中でも酵素センサの実用化は進んでおり、特に、グルコース用の酵素センサは、糖尿病の病状監視に利用されている。グルコース用の酵素センサの一例として、例えば、特許文献１で提案されたようなバイオセンサが開示されている。
このバイオセンサは、絶縁性基板上に、測定電極、対電極および検知電極からなる電極層を形成し、これら電極層上に、試料液中の特定成分と特異的に反応する酵素などを含む試薬層を形成してなるものである。上記試薬層に含まれる酵素として、ピロロキノリンキノンを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＰＱＱ−ＧＤＨと呼ぶ）を用いている。さらに試薬層には、酵素ＰＱＱ−ＧＤＨ以外に、フェリシアン化カリウムなどの電子受容体が含まれている。
このような構成のバイオセンサに血液を添加すると、試薬層では、酵素ＰＱＱ−ＧＤＨが、血液中のグルコースと反応して、グルコノラクトンと電子を生成し、該生成した電子によって電子受容体であるフェリシアン化イオンがフェロシアン化イオンに還元される。そこに一定の電圧をかけ、フェロシアン化イオンを再度フェリシアン化イオンに酸化させる。この時に生じる電流値から血液中のグルコース濃度（血糖値）を求めることができる。
特開２０００−１７１４２８号公報 特開２００１−３４３３５０号公報 特開２００２−２０７０２２号公報
しかしながら、上記従来のバイオセンサで使用している酵素ＰＱＱ−ＧＤＨは、グルコースだけでなく、マルトースなど基質以外の糖類にも反応してしまう。そのため、イコデキストリン、マルトース等を含む輸液を投与中の患者が、このバイオセンサを使用して血糖値を測定すると、実際の血糖値より高い値を示すことになる。このような測定値をもとに、過剰のインスリン投与を行うと、医療事故にもつながる恐れがある。
本発明は、上記問題点を解決するためになされたものであり、グルコースに対する基質特異性に優れ、グルコース以外の糖類への作用を回避することができる高精度の測定が可能なバイオセンサを提供することを目的とする。
上記課題を解決するために、本発明の請求項１にかかるバイオセンサは、試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、その分子内に少なくとも１つのカルボキシル基を有する有機酸もしくはその塩とを含む、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項２にかかるバイオセンサは、請求項１に記載のバイオセンサにおいて、前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項３にかかるバイオセンサは、請求項２に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、前記電極上に形成される、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項４にかかるバイオセンサは、請求項２に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項５にかかるバイオセンサは、請求項１に記載のバイオセンサにおいて、前記有機酸は、脂肪族カルボン酸、炭酸環カルボン酸、複素環カルボン酸、もしくはそれらの置換体、あるいは誘導体である、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項６にかかるバイオセンサは、請求項５に記載のバイオセンサにおいて、前記有機酸は、クエン酸、クエン酸塩もしくはフタル酸、フタル酸塩のいずれか、またはそれらの組み合わせである、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項７にかかるバイオセンサは、試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、その分子内に少なくとも１つのアミノ基、もしくはカルボニル基を有する有機酸、あるいはその塩とを含む、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項８にかかるバイオセンサは、請求項７に記載のバイオセンサにおいて、前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項９にかかるバイオセンサは、請求項８に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、前記電極上に形成される、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項１０にかかるバイオセンサは、請求項８に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項１１にかかるバイオセンサは、請求項７に記載のバイオセンサにおいて、前記有機酸は、アミノ酸、もしくはそれらの置換体、あるいは誘導体である、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項１２にかかるバイオセンサは、請求項１１に記載のバイオセンサにおいて、前記有機酸は、タウリンである、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項１３にかかるバイオセンサは、試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、糖アルコールとを含む、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項１４にかかるバイオセンサは、請求項１３に記載のバイオセンサにおいて、前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項１５にかかるバイオセンサは、請求項１４に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、前記電極上に形成される、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項１６にかかるバイオセンサは、請求項１４に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項１７にかかるバイオセンサは、請求項１３に記載のバイオセンサにおいて、前記糖アルコールは、鎖状の多価アルコール、もしくは環式糖アルコール、あるいはそれらの置換体もしくは誘導体である、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項１８にかかるバイオセンサは、請求項１７に記載のバイオセンサにおいて、前記糖アルコールは、マルチトール、ラクチトールのいずれか、または両方である、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項１９にかかるバイオセンサは、試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、可溶化蛋白質とを含む、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項２０にかかるバイオセンサは、請求項１９に記載のバイオセンサにおいて、前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項２１にかかるバイオセンサは、請求項２０に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、前記電極上に形成される、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項２２にかかるバイオセンサは、請求項２０に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達対を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項２３にかかるバイオセンサは、請求項１９に記載のバイオセンサにおいて、前記可溶化蛋白質は、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、ゼラチン、あるいはコラーゲンである、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項２４にかかるバイオセンサは、試料液中の特定成分と特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中の特定成分の濃度を計測するバイオセンサであって、前記試薬層は、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、その分子内に少なくとも１つのカルボキシル基を有機酸もしくはその塩、その分子内に少なくとも１つのアミノ基もしくはカルボニル基を有する有機酸あるいはその塩、糖アルコール、および可溶化蛋白質のうちの少なくとも２つ以上の添加剤とを含む、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項２５にかかるバイオセンサは、請求項２４に記載のバイオセンサにおいて、前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項２６にかかるバイオセンサは、請求項２５に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、前記電極上に形成される、ことを特徴とする。
また、本発明の請求項２７にかかるバイオセンサは、請求項２５に記載のバイオセンサにおいて、前記試薬層は、電子伝達体を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、ことを特徴とする。
本発明のバイオセンサによれば、ＦＡＤ−ＧＤＨを含む試薬層中に、少なくともカルボキシル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩を添加するようにしたので、酵素反応等を阻害することなく、ブランク電流値を抑えることができ、また、血液中に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、直線性が良好で、かつ、センサ個々のバラツキの少ない、グルコースに対する基質特異性に優れた、高精度の測定が可能なバイオセンサを実現することができる。
また、本発明のバイオセンサによれば、ＦＡＤ−ＧＤＨを含む試薬層中に、少なくともアミノ基、もしくはカルボニル基を有する有機酸あるいは有機酸塩を添加するようにしたので、試薬層を緻密かつ均質に形成することができ、センサのグルコース濃度に対する応答性を飛躍的に高めることができる、グルコースに対する基質特異性に優れた、高精度の測定が可能なバイオセンサを実現することができる。
また、本発明のバイオセンサによれば、ＦＡＤ−ＧＤＨを含む試薬層中に、糖アルコールを添加するようにしたので、酵素反応等を阻害することなく、ブランク電流値を抑えることができるため、直線性が良好で、かつ、センサ個々のバラツキの少ない、グルコースに対する基質特異性及び保存安定に優れた、高精度の測定が可能なバイオセンサを実現することができる。
また、本発明のバイオセンサによれば、ＦＡＤ−ＧＤＨを含む試薬層中に、可溶化蛋白質を添加するようにしたので、酵素反応等を阻害することなく、ヘマトクリットの影響および環境温度の影響を緩和することができる、血液中に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができる、保存安定性及びグルコースに対する基質特異性に優れた高精度の測定が可能なバイオセンサを実現することができる。
図１は、本発明のバイオセンサの構成例を示す図である。 図２は、本発明のバイオセンサの他の構成例を示す図である。 図３は、試料液としてマルトースを添加した場合のセンサ応答特性を示す図である。 図４は、試料液としてグルコースを添加した場合のセンサ応答特性を示す図である。 図５（ａ）は、試料液として精製水を用いた場合のブランク値を示す図、図５（ｂ）は、試薬として有機酸を用い、試料液として精製水を添加した場合のブランク値を示す図、図５（ｃ）は、試料液としてグルコース濃度を添加した場合のセンサ応答特性を示す図である。 図６は、試料液として全血を用いた場合のセンサにおいて、アミノ酸の一例であるタウリンの添加による電流値の応答特性を示す図である。 図７（ａ）は、試料液として全血を用い、試薬層に糖アルコールを添加した場合の高温高湿環境下での保存特性を示す図、図７（ｂ）は、バックグラウンド電流の応答特性を示す図、図７（ｃ）は、電流の応答特性を示す図である。 図８（ａ）は、試料液として全血を用いた場合のセンサ応答特性に対するヘマトクリットの影響を示す図、図８（ｂ）は、試薬層中にＢＳＡを添加した場合のセンサ応答特性に対するヘマトクリットの影響を示す図である。
以下に、本発明の実施の形態について図面を参照しながら説明する。
（実施の形態１）
以下に、本発明の実施の形態１によるバイオセンサについて説明する。
図１は、本実施の形態１による３電極方式のバイオセンサの構成例を示す図である。
図１に示す３電極方式のバイオセンサは、その表面に電気伝導層が形成された絶縁性基板１と、試薬層５と、切り欠き部６ａを有するスペーサ６と、空気孔９を有するカバー８とを備えたものである。
上記絶縁性基板１の材料としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミドなどがある。
上記電気伝導層の材料としては、金、白金、パラジウムなどの貴金属やカーボンなどの単体材料、あるいは、カーボンペーストや貴金属ペーストなどの複合材料があげられる。
上記スペーサ６およびカバー８の材料としては、ポリエチレンテレフタレート、ポリカーボネート、ポリイミド、ポリブチレンテレフタレート、ポリアミド、ポリ塩化ビニル、ポリ塩化ビニリデン、ナイロンなどがあげられる。
このような構成のバイオセンサの作製方法について説明する。
絶縁性の基板１上に、電気伝導層をスパッタリング蒸着法やスクリーン印刷法などによって形成後、レーザなどを用いてスリットを設けることにより、作用極２、対極３、および検知電極４を形成する。検知電極４とは、検体量の不足を検知するための電極として機能するだけでなく、参照電極あるいは対極の一部として用いることも可能である。
そして、電極２、３、４上に、フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素とするグルコースデヒドロゲナーゼ（以下、ＦＡＤ−ＧＤＨと呼ぶ）、電子伝達体、および添加剤を含む試薬層５を形成する。その後、試薬層５及び電極２、３、４上に、スペーサ６と、カバー８とを貼り合わせることにより、試料液が供給されるキャビティ７を形成する。なお、バイオセンサへの試料液供給は、毛細管現象により実現されるが、キャビティ７内の空気をバイオセンサ外部へ逃がすための空気孔９をカバー８に設けることで、毛細管現象を促進し、試料液の供給をスムーズに行うことができる。
試料液は、キャビティ７の入り口から毛細管現象によりキャビティ７内に供給され、試薬層５の位置に到達すると、試料液中の特定成分が、試薬層５に含まれる試薬と反応する。この反応により生じる電流の変化量を、作用極２、対極３、検知電極４のそれぞれのリード部１０、１１、１２を通じて接続された外部の測定装置により読み取り、試料液中の特定成分を定量する。
以下に、試薬層５中に含まれる試薬構成について説明する。
まず、酵素について説明する。
本実施の形態１では、試薬層５中に含む酵素としてＦＡＤ−ＧＤＨを採用している。以下に、ＦＡＤ−ＧＤＨを採用した理由について、図３及び図４を用いて説明する。
図３に、グルコース濃度８０ｍｇ／ｄＬの存在下で、マルトースを０〜２００ｍｇ／ｄＬの濃度範囲で添加した場合のセンサ応答特性を示す。図３において、縦軸は、ＰＱＱ−ＧＤＨ及びＦＡＤ−ＧＤＨのマルトースに対する作用性（マルトース０ｍｇ/ｄＬ感度からの乖離度（％））を、横軸は、添加マルトース濃度（ｍｇ/ｄＬ）を表している。
ＰＱＱ−ＧＤＨは、従来のバイオセンサで使用している酵素であり、マルトースの添加量に比例してセンサ応答値が上昇している。一方、ＦＡＤ−ＧＤＨは、本実施の形態１のバイオセンサで採用している酵素であり、マルトースの添加量を増加させても、センサ応答値は、マルトース無添加の時と変わらず低い値を示しており、マルトースへの作用性が低いことが分かる。
図４に、試料液としてグルコースを添加した場合のセンサ応答特性を示す。図４において、縦軸は、センサ応答値（電流値（μＡ））を、横軸は、グルコース濃度（ｍｇ/ｄＬ）を表している。
ＰＱＱ−ＧＤＨを酵素として用いた場合、グルコース濃度に比例してセンサ応答値が上昇している。また、ＦＡＤ−ＧＤＨを酵素として用いた場合、ＰＱＱ−ＧＤＨを用いた場合と同様、グルコース濃度に比例してセンサ応答値が上昇している。したがって、両酵素のグルコースに対する作用性はほぼ同じである。
以上のことから、本実施の形態１で採用している酵素ＦＡＤ−ＧＤＨは、従来のバイオセンサで採用されている酵素ＰＱＱ−ＧＤＨとほぼ同じグルコースに対する基質特異性を有しながら、マルトースに対する作用性は低いことがわかる。
従って、本実施の形態１では、酵素としてＦＡＤ−ＧＤＨを採用することで、グルコースに対する基質特異性に優れ、マルトースに対する作用性の低い、つまり、グルコースとの相関がよく、マルトースの影響を受けない、優れたバイオセンサを実現することができる。
次に、添加剤について説明する。
本実施の形態１では、試薬層５中に添加する添加剤として、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩を用いた。
この分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩は、酸化型の電子伝達体と、試薬中に含まれる酵素蛋白に存在する反応性に富んだ一部の官能基とが接触して、電子伝達体が酸化型から還元型に変性する（還元される）ことを抑制する働きがある。
そのため、試薬層５中に、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩を添加することで、熱や水分の介在下において、試薬層５に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨと電子伝達体との還元反応により発生するノイズ電流を抑制し、バイオセンサの性能が悪化するのを防ぎ、保存安定性を高めることができる。さらに、血液中、特には血球に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、センサ個々のバラツキを抑え、良好な直線性を実現、つまり、回帰式の傾きが大きく切片が小さくすることができ、高精度の測定を行うことができる。
なお、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩としては、脂肪族カルボン酸、炭素環カルボン酸、複素環カルボン酸等や、それらの塩が挙げられる。
例えば、脂肪族カルボン酸としては、マロン酸、コハク酸、グルタル酸、アジピン酸、マレイン酸、フマル酸などや、それらの塩があげられる。効果の度合いは、直鎖が長く分子量の大きいものほど大きく、炭化水素鎖が３つ以上あるものが、特に好ましい。また、バイオセンサに用いる試薬としては、水に対する溶解性が高いことが求められるため、分子構造中に、より多くの親水性官能基を持つものがより好ましい。
炭素環カルボン酸としては、安息香酸、フタル酸、イソフタル酸、テレフタル酸などや、それらの塩があげられ、これらを用いることでも前記と同様の効果を得ることができる。
複素環カルボン酸としては、２−フル酸、ニコチン酸、イソニコチン酸などや、それらの塩があげられ、これらを用いることでも、前記と同様の効果を得ることができる。
上述の脂肪族ならびに炭素環カルボン酸、複素環を有するカルボン酸もしくはカルボン酸塩以外にも、カルボン酸ならびにカルボン酸塩の一部の官能基が別の官能基に置き換えられた、例えばリンゴ酸、オキサロ酢酸、クエン酸、ケトグルタル酸などやそれらの塩においても前記と同様の効果を得ることができる。
これらの有機酸もしくは有機酸塩のなかで最も好適なものは、グルタル酸、アジピン酸、フタル酸、安息香酸である。
なお、これらの有機酸もしくは有機酸塩の添加量は、酵素溶液濃度５００〜２５００Ｕ／ｍｌに対し、試薬溶液濃度として０．０００５〜１００ｍＭ範囲が適当である。
このような実施の形態１のバイオセンサによれば、試薬層５中に、グルコースに対する基質特異性の優れたＦＡＤ−ＧＤＨと、少なくともカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩とを含ませるようにしたので、酵素反応等を阻害することなく、ブランク電流値を抑えることができ、また、血液中に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、グルコースに対する基質特異性及び保存安定性を高めることができ、高精度の測定を行うことができる。
（実施の形態２）
以下に、本発明の実施の形態２によるバイオセンサについて説明する。
本実施の形態２によるバイオセンサは、図１で示した試薬層５が、ＦＡＤ−ＧＤＨ、電子伝達体、および、分子内に少なくとも一つのアミノ基もしくはカルボニル基を有する有機酸または有機酸塩を含むことを特徴とする。なお、他の構成要素は、上記実施の形態１によるバイオセンサと同様であるため説明を省略する。
以下、添加剤について説明する。
本実施の形態２では、試薬層５に添加する添加剤として、分子内に少なくとも一つのアミノ基もしくはカルボニル基を有する有機酸、または有機酸塩を用いた。
分子内に少なくとも一つのアミノ基、もしくはカルボニル基を有する有機酸、または有機酸塩は、試薬層５の表面状態を極めて平滑、且つ均質に形成することができる。
特に、試薬層５中に電子伝達体として用いられるフェリシアン化カリウムなどの無機塩を含む場合には、試薬溶液の乾燥過程において試薬層が結晶化しやすいが、試薬層５中に、分子内に少なくとも一つのアミノ基、あるいはカルボニル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩が含まれることにより、当該無機塩の結晶の成長を阻害することができる。
そして、結晶の成長を阻害された無機塩は、微少な粒子状態で試薬層５中に存在するため、酵素分子と密に、均一に接触することが可能となり、酵素分子との電子伝達効率が良好な試薬層状態が実現できる。また、試薬層の溶解性を高めることができるため、センサの感度、ならびに直線性を飛躍的に高めることが可能となる。
なお、分子内に少なくとも一つのアミノ基、あるいはカルボニル基を有する有機酸、もしくは有機酸塩としては、グリシン、アラニン、バリン、ロイシン、イソロイシン、セリン、トレオニン、メチオニン、アスパラギン、グルタミン、アルギニン、リシン、ヒスチジン、フェニルアラニン、トリプトファン、プロリンなどや、それらの塩、あるいはサルコシン、ベタイン、タウリンなどのアミノ酸、もしくはそれらの置換体あるいは誘導体及びその塩が挙げられる。また、これらのアミノ酸もしくは置換体、あるいは誘導体、及びその塩の中でも、グリシン、セリン、プロリン、トレオニン、リシン、タウリンは、特に結晶化阻害の効果が高く好適である。
なお、これらのアミノ酸、もしくはそれらの置換体あるいは誘導体及びその塩の添加量は、酵素溶液濃度５００〜２５００Ｕ／ｍｌに対し、試薬溶液濃度として１０〜１００ｍＭが適当である。
このような実施の形態２のバイオセンサによれば、試薬層５中に、グルコースに対する基質特異性の優れたＦＡＤ−ＧＤＨと、少なくともアミノ基もしくはカルボニル基を有する有機酸、あるいは有機酸塩とを含ませるようにしたので、試薬層を緻密かつ均質に形成することができるとともに、センサのグルコース濃度に対する応答性を飛躍的に高めることができ、高精度の測定を行うことができる。
（実施の形態３）
以下、本発明の実施の形態３によるバイオセンサについて説明する。
本実施の形態３によるバイオセンサは、図１で示した試薬層５が、ＦＡＤ−ＧＤＨ、電子伝達体、及び糖アルコールを含むことを特徴とする。なお、他の構成要素は、上記実施の形態１によるバイオセンサと同様であるため説明を省略する。
以下、添加剤について説明する。
本実施の形態３では、試薬層５に添加する添加剤として、糖アルコールを用いた。
糖アルコールは、酸化型の電子伝達体と、試薬中に含まれる酵素蛋白に存在する反応性に富んだ一部の官能基が接触して、電子伝達体が酸化型から還元型に変性する（還元される）ことを抑制する働きがある。
そのため、試薬層５中に、糖アルコールを添加することで、熱や水分の介在下において、試薬層５に含まれるＦＡＤ−ＧＤＨと電子伝達体との還元反応が生じることにより発生するノイズ電流を抑制することができるため、バイオセンサの性能が悪化することを防ぐことができる。また、血液中、特には血球に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、直線性が良好で、かつ、センサ個々のバラツキを抑制することができる。
なお、糖アルコールとしては、ソルビトール、マルチトール、キシリトール、マンニトール、ラクチトール、還元パラチノース、アラビニトール、グリセロール、リビトール、ガラクチトール、セドヘプチトール、ペルセイトール、ボレミトール、スチラシトール、ポリガリトール、イジトール、タリトール、アリトール、イシリトール、還元澱粉糖化物、イシリトールなどの鎖状の多価アルコールや、環式糖アルコールがあげられる。また、これらの糖アルコールの立体異性体、置換体、または誘導体であっても、同様の効果を得ることができる。なお、これらの糖アルコールの中でも、マルチトール、ラクチトールは、比較的材料単価が安く、容易に入手もでき、また、ノイズ電流を抑制する効果が飛躍的に高いため、最も好適な材料であると言える。
なお、これら糖アルコールの添加量は、酵素溶液濃度５００〜２５００Ｕ／ｍｌに対し、試薬溶液濃度として０．１〜５０ｍＭが適当である。
このような実施の形態３のバイオセンサによれば、試薬層５中に、グルコースに対する基質特異性の優れたＦＡＤ−ＧＤＨと、糖アルコールとを含ませるようにしたので、酵素反応等を阻害することなく、ブランク電流値を抑えることができ、また、血液中に存在する様々な夾雑物質との不必要な反応をも併せて抑制することができるため、グルコースに対する基質特異性及び保存安定性を高めることができ、高精度の測定を行うことができる。
（実施の形態４）
以下、本発明の実施の形態４によるバイオセンサについて説明する。
本実施の形態４によるバイオセンサは、図１で示した試薬層５が、ＦＡＤ−ＧＤＨ、電子伝達体、及び可溶化蛋白質を含むことを特徴とする。なお、他の構成要素は、上記実施の形態１によるバイオセンサと同様であるため説明を省略する。
以下、添加剤について説明する。
本実施の形態４では、試薬層５に添加する添加剤として、可溶化蛋白質を用いた。
可溶化蛋白質は、酵素反応等を阻害することなく、薬剤等の運搬作用、浸透圧の維持、電解質バランスの維持など多彩な働きを有する。
そのため、試薬層５中に、可溶化蛋白質を添加することで、酵素反応等を阻害することなく、グルコース電極近傍への供給を制限することができ、ヘマトクリットの影響、および環境温度の影響を低減することができる。
なお、可溶化蛋白質としては、ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）、卵アルブミン、ゼラチン、コラーゲン等があげられる。
なお、これら可溶化蛋白質の添加量は、酵素溶液濃度５００〜２５００Ｕ／ｍｌに対し、０．０１〜１．００ｗｔ％が適当である。
このような実施の形態４のバイオセンサによれば、試薬層５中に、グルコースに対する基質特異性の優れたＦＡＤ−ＧＤＨと、可溶化蛋白質とを含ませるようにしたので、酵素反応等を阻害することなく、ヘマトクリットの影響、および環境温度の影響を緩和することができ、保存安定性、かつグルコースに対する基質特異性を高め、高精度の測定を行うことができる。
なお、上記実施の形態１から４では、上記試薬層５中に添加する添加剤として、分子内に少なくとも一つのカルボキシル基を有する有機酸もしくは有機酸塩、分子内に少なくとも一つのアミノ基もしくはカルボニル基を有する有機酸あるいは有機酸塩、糖アルコール、可溶化蛋白質をそれぞれ添加した例を説明したが、さらにはそれらを組み合わせることも可能である。
また、上記実施の形態１から４において、試薬中に含まれる電子伝達体としては、フェリシアン化カリウム、ｐ−ベンゾキノンおよびその誘導体、フェナジンメトサルフェート、メチレンブルー、フェロセンおよびその誘導体などを用いることができる。
また、上記実施の形態１から４では、試薬層５が、電極上に設けられるものとして説明をしたが、具体的には、電極上の全面、もしくは一部に、試薬層５を配置することができ、また、それ以外にも、バイオセンサの性能を悪化させることのない範囲内、すなわち、試薬層中の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が設けられるよう、試薬層５を配置してもよい。
また、上記実施の形態１から４では、３電極方式のバイオセンサについて示したが、２電極方式のバイオセンサを作製しても良い。この２電極方式のバイオセンサの構成例を図２に示す。
図２に示す２電極方式のバイオセンサは、絶縁性基板１０１と、試薬層１０５と、スペーサ１０６と、カバー１０８とを有する。各構成要素の材料は、図１と同様のものが考えられる。
このようなバイオセンサの作製方法について説明する。
絶縁性の基板１０１上に、電気伝導層をスパッタリング蒸着法やスクリーン印刷法などにより形成後、レーザなどを用いてスリットを設けることにより作用極１０２、および対極１０３を形成する。この電極上に、ＦＡＤ−ＧＤＨ、電子伝達体、および添加剤を含む試薬層１０５を形成する。そして、試薬層１０５及び電極１０２、１０３上に、切り欠き部１０６ａを有するスペーサ１０６とカバー１０８とを貼り合わせることにより、試料液が供給されるキャビティ１０７が形成される。
試料液は、キャビティ１０７の入り口から毛細管現象によりキャビティ７内に供給され、試薬層５の位置に到達すると、試料液中の特定成分が、試薬層１０５に含まれる試薬と反応する。この反応により生じる電流の変化量を、作用極１０２、対極１０３のそれぞれのリード部１１０、１１１を通じて接続された外部の測定装置により読み取り、試料液中の特定成分を定量する。
（実施例１）
ポリエチレンテレフタレートからなる絶縁基板１０１上に、スクリーン印刷により作用極１０２と、対極１０３と、からなる電極層を設ける。その電極層上に、酵素（ＦＡＤ−ＧＤＨ：６００〜１５００Ｕ/ｍｌ）、電子伝達体（フェリシアン化カリウム）、アミノ酸（タウリン：５０〜８５ｍＭ）、および糖アルコール（マルチトール：１〜３ｍＭ）を含んだ試薬層１０５を形成する。その上に、ポリエチレンテレフタレートからなるスペーサ１０６と、同じくポリエチレンテレフタレートからなるカバー１０８とを設ける。このようにして２電極方式の血糖値測定センサを作製した。
上記作製した血糖値測定センサに、試料液として精製水を用いた場合のセンサ応答値（ブランク電流値）を計測する。その結果を、図５（ａ）に示す。ここでは比較のため、酵素としてＰＱＱ−ＧＤＨを用い、試薬層中に、酵素溶液濃度１０００〜１５００Ｕ/ｍｌに対して、０．０５〜０.１５ｍＭのクエン酸塩、タウリン５０〜８５ｍＭ、マルチトール１〜３ｍＭが添加された従来のバイオセンサのセンサ応答特性を示した。
この図５（ａ）から分かるように、従来のＰＱＱ−ＧＤＨを用いたバイオセンサのブランク電流値は、約０．０３μＡであるのに対し、本発明のＦＡＤ−ＧＤＨを用いたバイオセンサのブランク電流値は、０．４０μＡと高い値を示している。ブランク電流値が高いと、グルコースの正確な定量ができなくなるため，ブランク電流値を抑える必要がある。
そこで、ノイズ電流を抑制する働きのある有機酸を試薬層に添加した。具体的には、ＦＡＤ−ＧＤＨ酵素溶液濃度１５００Ｕ／ｍｌに対し、フタル酸塩の濃度を０．０５ｍＭ、クエン酸塩の濃度を０．０８ｍＭとなるよう調製して添加したところ、図５（ｂ）に示すように、無添加時に比べ、ブランク電流値が小さくなった。また、フタル酸塩の濃度を０．０１５ｍＭ、クエン酸塩の濃度を０．２４ｍＭに調製し添加した場合には、ブランク電流値がより小さくなった。
このときのグルコース濃度に対するセンサ応答電流値を、図５（ｃ）に示す。図５（ｃ）に示すように、ＦＡＤ−ＧＤＨに、上述したように調製した有機酸を添加しても、ＰＱＱ−ＧＤＨとほぼ同程度の、グルコースに対する基質特異性を有していることが分かる。
以上のように、試薬層中に有機酸を添加することで、ブランク電流値が小さく、グルコースに対する基質特異性が高い、高精度の測定が可能なバイオセンサを作製することができる。
（実施例２）
次に、試薬層１０５にアミノ酸を添加した場合のセンサ応答特性について説明する。
本実施例２のバイオセンサは、上記実施例１と同様の手順により作製した。そして、該バイオセンサの試薬層１０５に、アミノ酸の一例であるタウリンをさらに添加した。
図６に、試薬層１０５中にタウリンを０ｍＭ、１５ｍＭ、８５ｍＭ添加した場合の電流の応答特性を示す。
図６を見て判るように、タウリンの添加量を多くするほど、センサ応答特性は飛躍的に向上していることがわかる。
したがって、試薬層１０５にタウリンを添加することで、グルコースに対する基質特異性に優れ、高精度の測定が可能なバイオセンサを実現することができる。
（実施例３）
次に、試薬層１０５に糖アルコールを添加した場合のセンサ応答特性について説明する。
本実施例３のバイオセンサは、上記実施例１と同様の手順により作製した。そして、該バイオセンサの試薬層１０５に、糖アルコールの一例であるマルチトールあるいはラクチトールをさらに添加した。また、試料液として、グルコース濃度８０ｍｇ/ｄｌを含む全血を用いた。
図７（ａ）は、試薬層５中にマルチトールあるいはラクチトールをそれぞれ０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ添加した場合の高温高湿環境下（温度４０℃、湿度８０％）での保存特性を示す。
図７（ａ）を見て判るように、マルチトールまたはラクチトールを添加した場合の方が、高温高湿度環境による電流値上昇を抑制することができ、センサの保存特性は明らかに向上する。
また、図７（ｂ）は、試薬層１０５中にマルチトールあるいはラクチトールをそれぞれ０ｍＭ、５ｍＭ、１０ｍＭ添加した場合の高温高湿環境下（温度４０℃、湿度８０％）でのバックグラウンド電流の応答特性を示す。
図７（ｂ）を見て判るように、マルチトールまたはラクチトールを添加することで、高温高湿環境下でのバックグラウンド電流値の上昇を抑制することができ、センサの保存特性が向上する。
図７（ｃ）は、試薬層１０５中にマルチトールあるいはラクチトールをそれぞれ０ｍＭ，５ｍＭ，１０ｍＭ添加した場合の電流の応答特性を示している。
図７（ｃ）を見て判るように、マルチトールまたはラクチトールを添加しても、センサのグルコース濃度に対する応答特性を低下させることなく良好な直線性を維持することができる。
以上のことから、糖アルコールであるマルチトールまたはラクチトールを添加することで、直線性が良好で、保存安定性に優れた、高精度の測定が可能なバイオセンサを実現することができる。
（実施例４）
次に、ヘマトクリットの影響について説明する。
図８（ａ）は、試料液として、グルコース濃度３５０ｍｇ/ｄＬを含有する全血を用いた場合のセンサ応答特性に対するヘマトクリットの影響を示すグラフである。図８において、縦軸は、ヘマトクリット値４５％感度からの乖離を示し、横軸は、ヘマトクリット値を示す。
ＰＱＱ−ＧＤＨを用いた場合のセンサ応答特性と、ＦＡＤ−ＧＤＨを用いた場合のセンサ応答特性を比較すると、ヘマトクリット値が約２５〜７５％の範囲では、ヘマトクリットの影響によるセンサ応答特性の差異は見られなかった。ヘマトクリット値が２５％以下の低濃度範囲では、ヘマトクリットの影響に顕著な差異が見られ、ＦＡＤ−ＧＤＨを用いた場合の方に特にヘマトクリットの影響が大きいことが認められた。
このように、酵素としてＦＡＤ−ＧＤＨを用いた場合のセンサ応答特性は、ＰＱＱ−ＧＤＨを用いた場合に比べ、特に、低ヘマトクリット濃度範囲において、ヘマトクリットの影響を受けやすい。そのため、ヘマトクリットの影響を受けにくい、保存安定性に優れたバイオセンサが望まれる。
そこで、試料層１０５に、可溶化蛋白質であるＢＳＡを添加した。図８（ｂ）は、試薬層中にＢＳＡを添加した場合のセンサ応答特性に対するヘマトクリットの影響を示す図である。
０.１ｗｔ％のＢＳＡを試薬層１０５に添加したところ、低ヘマトクリット濃度範囲において、ＰＱＱ−ＧＤＨと同程度にまでヘマトクリットの影響を抑えることができた。
このように、従来のＰＱＱ−ＧＤＨを用いたバイオセンサと同程度にまでヘマトクリットの影響を抑え、保存安定性、かつグルコースに対する基質特異性に優れたバイオセンサを作製することができた。
本発明によるバイオセンサは、グルコースに対する基質特異性に優れた高精度の測定が可能なグルコース用酵素センサとして、利用可能である。
１ 基板
２ 作用極
３ 対極
４ 検知電極
５ 試薬層
６ スペーサ
６ａ 切り欠き部
７ キャビティ
８ カバー
９ 空気孔
１０、１１、１２ リード部
１０１ 基板
１０２ 作用極
１０３ 対極
１０５ 試薬層
１０６ スペーサ
１０６ａ 切り欠き部
１０７ キャビティ
１０８ カバー
１０９ 空気孔
１１０、１１１ リード部

Claims (8)

  1. 試料液中のグルコースと特異的に反応する試薬を含む試薬層を有し、試料液中のグルコース濃度を計測するバイオセンサであって、
    前記試薬層は、
    電子伝達体と、
    フラビンアデニンジヌクレオチドを補酵素としたグルコースデヒドロゲナーゼと、
    その分子内に少なくとも１つのカルボキシル基を有する有機酸（アミノ基を有する場合を除く）もしくはその塩、グリシン、セリン、プロリン、トレオニン、リシンおよびタウリンから選ばれるアミノ酸あるいはその塩、糖アルコール、および可溶化蛋白質のうちの少なくとも２つ以上の添加剤と、
    を含む、バイオセンサ。
  2. 請求項１に記載のバイオセンサにおいて、
    前記試料液中の特定成分の濃度を、絶縁性基板上に形成された、少なくとも作用極と対極とからなる電極を用いて計測する、バイオセンサ。
  3. 請求項２に記載のバイオセンサにおいて、
    前記試薬層は、前記電極上に形成される、バイオセンサ。
  4. 請求項２に記載のバイオセンサにおいて、
    前記試薬層は、電子伝達体を含み、当該試薬層の試薬が試料液に溶解して拡散する拡散エリア内に電極が配置されるよう形成される、バイオセンサ。
  5. 請求項１に記載のバイオセンサにおいて、
    前記アミノ酸は、タウリンである、バイオセンサ。
  6. 請求項１に記載のバイオセンサにおいて、
    前記糖アルコールは、鎖状の多価アルコール、もしくは環式糖アルコール、あるいはそれらの置換体もしくは誘導体である、バイオセンサ。
  7. 請求項６に記載のバイオセンサにおいて、
    前記糖アルコールは、マルチトール、ラクチトールのいずれか、または両方である、バイオセンサ。
  8. 請求項１に記載のバイオセンサにおいて、
    前記可溶化蛋白質は、ウシ血清アルブミン、卵アルブミン、ゼラチン、あるいはコラーゲンである、バイオセンサ。
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