JP5340931B2

JP5340931B2 - 骨髄増殖性疾患治療用ｊａｋ阻害剤

Info

Publication number: JP5340931B2
Application number: JP2009521782A
Authority: JP
Inventors: ドブザンスキ、パウエル; ルジェリ、ブルース、エー．
Original assignee: セファロン、インク．
Priority date: 2006-07-21
Filing date: 2007-07-20
Publication date: 2013-11-13
Anticipated expiration: 2027-07-20
Also published as: AU2007275562A1; KR101399180B1; EP2046340A2; HK1127301A1; BRPI0715196A2; ES2437317T3; JP2009544700A; NO20090415L; KR20090035596A; AU2007275562B2; WO2008011174A3; IL196517A; MX2009000713A; WO2008011174A2; US20080021013A1; CA2658192C; EP2046340B1; IL196517A0; CA2658192A1; NZ574212A

Description

本発明は、骨髄増殖性疾患（ｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ＭＰＤｓ）および骨髄異形成症候群の治療法に関連する。具体的には、本発明は、ＪＡＫ２阻害剤である化合物、特に、縮合ピロロカルバゾール化合物を用いたＭＰＤｓおよび骨髄異形成症候群の治療法に関連する。

骨髄増殖性疾患（ＭＰＤｓ）は、比較的正常に分化する１若しくはそれ以上の造血性分化系列の過剰産生を特徴とするクロ−ン性悪性腫瘍であって、過形成性骨髄（ｂｏｎｅｍａｒｒｏｗ：ＢＭ）をもたらすものである。ＭＰＤｓはＢＭ及び血液を支配する単一の多能性前駆細胞若しくは幹細胞において発生すると考えられている。ＭＰＤ患者由来の培養造血前駆細胞は、変化した成長特性および成長因子非依存性を示す。一連の最近の報告によりＪＡＫ２の偽キナーゼ領域の単一アミノ酸置換のＶ６１７Ｆが、真性赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａｖｅｒａ：ＰＶ）、本態性血小板血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ：ＥＴ）および慢性の特発性骨髄線維症（ｃｈｒｏｎｉｃｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｍｙｅｌｏｇｉｂｒｏｓｉｓ：ＣＩＭＦ）において頻繁に見られる分子傷害として特定されるまで、特定のＭＰＤｓに対する分子的機序は不明瞭であった。この変異は、ＰＶ患者の７５％〜９７％、更に、ＥＴおよびＣＩＭＦ患者の約４０％〜５０％において見られた（Ｊａｍｅｓｅｔａｌ．，２００５，ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ１１，５４６〜５５４）。重要なことに、他の変異は、他の８５種のキナ−ゼの自己抑制領域あるいはキナーゼ領域では見出されてはいないことである（Ｌｅｖｉｎｅｅｔａｌ．，２００５，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ７，３８７〜３９７）。さらに、前記Ｖ６１７Ｆ変異は、骨髄異形成症候群（ＭＤＳ）患者において同定されている。予想したＪＡＫ２構造に基づくと、前記Ｖ６１７Ｆ置換により、蛋白質のＪＨ２領域とキナ−ゼ（ＪＨ１）領域との間の自己抑制相互作用が中断される。その結果、ＢａＦ３／ＥＰＯＲ細胞において発現した場合、Ｖ６１７Ｆ突然変異体は恒常的に活性され、さらに成長因子非依存性および恒常的なＳＴＡＴ５活性化がもたらされた（Ｌｅｖｉｎｅｅｔａｌ．，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ２００５，７，３８７−３９７；Ｋｒａｌｖｉｃｓｅｔａｌ．，２００５，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２，１７７９〜１７９０））。Ｖ６１７Ｆ変異を有する赤血球前駆細胞は、外因性エリスロポエチン（ｅｘｏｇｅｎｏｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｔｉｎ：ＥＰＯ）不在下において増殖し、ＭＰＤの特徴である内因性赤芽球コロニ−（ｅｎｄｏｇｅｎｏｕｓｅｒｙｔｈｒｏｉｄｃｏｌｏｎｉｅｓ：ＥＥＣ）を形成し、さらにｓｉＲＮＡを媒介したＪＡＫ２の不活性化によって、ＥＥＣの形成が減少した。最終的に、野生型ＪＡＫ２では起こらないが、Ｖ６１７Ｆ変異体を発現するネズミ科の骨髄細胞を移植したマウスは、ヘモグロビン／ヘマトクリットの著しい増加、白血球増加症、巨核球の過形成、髄外造血を含むヒトのＰＶに非常に類似した病理学的特徴を発症し、脾腫および骨髄線維症が引き起こされた（Ｊａｍｅｓｅｔａｌ．，２００５，Ｎａｔｕｒｅ４３４，１１４４−１１４８、Ｗｅｒｎｉｇｅｔａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ．２００６Ｆｅｂ１４，［印刷前に電子出版］）。臨床的に、ＣＩＭＦ患者における前記変異体の存在は、より侵襲性の高い疾患および著しくより低い生存率に関連付けられている（Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｔａｌ．，２００６，Ｂｌｏｏｄ，２０９８〜２１００）。
当該技術分野において、前記変異体あるいは活性化されたＪＡＫ２に関連した発現型を妨げること、並びにＪＡＫ２の活性化に関連する骨髄増殖性疾患および骨髄異形成症候群を治療することが必要とされている。
【先行技術文献】
【特許文献】

【特許文献１】国際出願特許公報第ＷＯ２００７／０６１７６４号
【特許文献２】国際出願特許公報第ＷＯ２００７／０７０４４４号
【特許文献３】米国特許出願公開第２００６／０２８１７００号明細書
【特許文献４】米国特許出願公開第２００７／０１３５６２８号明細書
【特許文献５】米国特許第４９２３９８６号明細書
【特許文献６】米国特許第５７０５５１１号明細書
【特許文献７】米国特許第５８０８０６０号明細書
【特許文献８】米国特許第６１２７４０１号明細書
【特許文献９】米国特許第６８４１５６７号明細書
【特許文献１０】米国特許第６６３０５００号明細書
【特許文献１１】米国特許第５７５６４９４号明細書
【特許文献１２】米国特許第５４６８８７２号明細書
【特許文献１３】米国特許第５５１６７７１号明細書
【特許文献１４】米国特許第６３０６８４９号明細書
【特許文献１５】米国特許第６０９３７１３号明細書
【特許文献１６】国際公開第２００４／１０８１３２号
【特許文献１７】国際公開第２００７／０６１７６４号
【特許文献１８】国際公開第２００７／０７０４４４号
【特許文献１９】米国特許出願公開第２００５／０１５３９９０号明細書
【特許文献２０】米国特許第６２００９６８号明細書
【特許文献２１】米国特許第６６３０５００号明細書
【特許文献２２】米国特許第６３９９７８０号明細書
【特許文献２３】米国特許第５９８５８７７号明細書
【非特許文献】

【非特許文献１】ＬＥＶＩＳＭＡＲＫＥＴＡＬ："Ｐｈａｒｍａｃｏｋｉｎｅｔｉｃａｎｄｐｈａｒｍａｃｏｄｙｎａｍｉｃｓｔｕｄｉｅｓｏｆｌｅｓｔａｕｒｔｉｎｉｂ（ＣＥＰ−７０１）ａｎｄＰＫＣ−４１２:Ｃｙｔｏｔｏｘｉｃｉｔｙｉｓｏｆｔｅｎｄｅｐｅｎｄｅｎｔｏｎｎｏｎ−ＦＬＴ３−ｍｅｄｉａｔｅｄｅｆｆｅｃｔｓ．"ＢＬＯＯＤ，ｖｏｌ．１０６，ｎｏ．１１，Ｐａｒｔ１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２００５（２００５−１１），ｐａｇｅｓ６９２Ａ−６９３Ａ
【非特許文献２】ＬＡＩＲＤＥＴＡＬ："Ｓｍａｌｌｍｏｌｅｃｕｌｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓ：ｃｌｉｎｉｃａｌｄｅｖｅｌｏｐｍｅｎｔｏｆａｎｔｉｃａｎｃｅｒａｇｅｎｔｓ"ＥＸＰＥＲＴＯＰＩＮＩＯＮＯＦＩＮＶＥＳＴＩＧＡＴＩＯＮＡＬＤＲＵＧＳ，ＡＳＨＬＥＴＹＰＵＢＬＩＣＡＴＩＯＮＳＬＴＤ．，ＬＯＮＤＯＮ，ＧＢ，ｐａｇｅｓ５１−６４
【非特許文献３】ＱＵＥＮＴＭＥＩＥＲＨＥＴＡＬ："ＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｃｅｌｌｌｉｎｅｓｄｅｒｉｖｅｄｆｒｏｍｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ"ＬＥＵＫＥＭＩＡ（ＢＡＳＩＮＧＳＴＯＫＥ），ｖｏｌ．２０，ｎｏ．３，Ｍａｒｃｈ２００６（２００６−０３），ｐａｇｅｓ４７１−４７６
【非特許文献４】ＤＯＢＲＺＡＮＳＫＩＰＡＷＥＬＥＴＡＬ："ＣＥＰ−７０１ｉｓａＪＡＫ２ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｗｈｉｃｈａｔｔｅｎｕａｔｅｓＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５ｓｉｇｎａｌｉｎｇｐａｔｈｗａｙａｎｄｔｈｅｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｏｎｏｆｐｒｉｍａｒｙｃｅｌｌｓｆｒｏｍｐａｔｉｅｎｔｓｗｉｔｈｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ．"ＢＬＯＯＤ，ｖｏｌ．１０８，ｎｏ．１１，Ｐａｒｔ１，Ｎｏｖｅｍｂｅｒ２００６（２００６−１１），ｐａｇｅｓ１０２６Ａ
【非特許文献５】Ａｍｉｎ，Ｈ．Ｍ．ｅｔａｌ．，"ＣｈａｒａｃｔｅｒｉｚａｔｉｏｎｏｆａｐｏｐｔｏｓｉｓｉｎｄｕｃｅｄｂｙｐｒｏｔｅｉｎｋｉｎａｓｅＣｉｎｈｉｂｉｔｏｒｓａｎｉｔｓｍｏｄｕｌａｔｉｏｎｂｙｔｈｅｃａｓｐａｓｅｐａｔｈｗａｙｉｎａｃｕｔｅｐｒｏｍｙｅｌｏｃｙｔｉｃｌｅｕｋａｅｍｉａ，"ＢｒｉｔｉｓｈＪｏｕｒｎａｌｏｆＨａｅｍａｔｏｌｏｇｙ，２０００，１１０（３），５５２−５６２
【非特許文献６】Ｊａｍｅｓｅｔａｌ．，"ＡＪＡＫ２ｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ；ｐａｔｈｏｇｅｎｅｓｉｓａｎｄｔｈｅｒａｐｅｕｔｉｃａｎｄｓｃｉｅｎｔｉｆｉｃｐｒｏｓｐｅｃｔｓ，"２００５，ＴｒｅｎｄｓｉｎＭｏｌｅｃｕｌａｒＭｅｄｉｃｉｎｅ１１，ｐｐ．５４６−５５４
【非特許文献７】Ｌｅｖｉｎｅｅｔａｌ．，"ＡｃｔｉｖａｔｉｎｇｍｕｔａｔｉｏｎｉｎｔｈｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅＪＡＫ２ｉｎｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａｖｅｒａ，ｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ，ａｎｄｍｙｅｌｏｉｄｍｅｔａｐｌａｓｉａｗｉｔｈｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ，"２００５，ＣａｎｃｅｒＣｅｌｌ７，ｐｐ．３８７−３９７
【非特許文献８】Ｋｒａｌｏｖｉｃｓｅｔａｌ．，"ＡＧａｉｎ−ｏｆ−ＦｕｎｃｔｉｏｎＭｕｔａｔｉｏｎｏｆＪＡＫ２ｉｎＭｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅＤｉｓｏｒｄｅｒｓ"，２００５，Ｎ．Ｅｎｇｌ．Ｊ．Ｍｅｄ．３５２，ｐｐ．１７７９−１７９０
【非特許文献９】Ｊａｍｅｓｅｔａｌ．，"ＡｕｎｉｑｕｅｃｌｏｎａｌＪＡＫ２ｍｕｔａｔｉｏｎｌｅａｄｉｎｇｔｏｃｏｎｓｔｉｔｕｔｉｖｅｓｉｇｎａｌｉｎｇｃａｕｓｅｓｐｏｌｙｃｙｔｈａｅｍｉａｖｅｒａ，"２００５，Ｎａｔｕｒｅ４３４，１１４４−１１４８
【非特許文献１０】Ｗｅｒｎｉｇｅｔａｌ．，"ＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＪＡＫ２Ｖ６１７Ｆｃａｕｓｅｓａｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａｖｅｒａ−ｌｉｋｅｄｉｓｅａｓｅｗｉｔｈａｓｓｏｃｉａｔｅｄｍｙｅｏｆｉｂｒｏｓｉｓｉｎａｍｕｒｉｎｅｂｏｎｅｍａｒｒｏｗｔｒａｎｓｐｌａｎｔｍｏｄｅ，"２００６，Ｂｌｏｏｄ１０７（１１），ｐｐ．４２７４−４２８１
【非特許文献１１】Ｃａｍｐｂｅｌｌｅｔａｌ．，"Ｖ６１７ＦｍｕｔａｔｉｏｎｉｎＪＡＫ２ｉｓａｓｓｏｃｉａｔｅｄｗｉｔｈｐｏｏｒｅｒｓｕｒｖｉｖａｌｉｎｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ，"２００６，Ｂｌｏｏｄ，１０７（５），ｐｐ．２０９８−２１００
【非特許文献１２】Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，ＳｅｃｏｎｄＥｄｉｔｉｏｎ，ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ，１９７５，ｐｐ．７３−７５
【非特許文献１３】Ｂａｘｔｅｒ，Ｅ．Ｊ．ｅｔａｌ．，"ＡｃｑｕｉｒｅｄｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅＪＡＫ２ｉｎｈｕｍａｎｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ"，２００５，Ｌａｎｃｅｔ３６５，ｐｐ．１０５４−１０６１
【非特許文献１４】Ｌａｒｇｈｅｒｏｅｔａｌ．Ｆａｒｎｅｓｙｌｔｒａｎｓｆｅｒａｓｅｉｎｈｉｂｉｔｏｒｔｉｐｉｆａｒｎｉｂ（Ｒ１１５７７７）ｐｒｅｆｅｒｅｎｔｉａｌｌｙｉｎｈｉｂｉｔｓｉｎｖｉｔｒｏａｕｔｏｎｏｍｏｕｓｅｒｙｔｈｒｏｐｏｉｅｓｉｓｏｆｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａｖｅｒａｐａｔｉｅｎｔｃｅｌｌｓ．Ｂｌｏｏｄ．１Ｍａｙ２００５．Ｖｏｌｕｍｅ１０５，Ｎｕｍｂｅｒ９．
【非特許文献１５】ＬＩＮＧＹＡＮ，"ＭｕｔａｔｉｏｎＤｅｔｅｃｔｉｎｇａｎｄＡｎａｌｙｓｉｓｏｆＣｌａｓｓＩＩＩＲｅｃｅｐｔｏｒＴｙｒｏｓｉｎｅＫｉｎａｓｅａｎｄＰＴＰＮ１１ＧｅｎｅｉｎＭｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅＤｉｓｏｒｄｅｒｓ，"ＣｈｉｎａＤｏｃｔｏｒＤｉｓｓｅｒｔａｔｉｏｎＦｕｌｌ−ＴｅｘｔＤａｔａｂａｓｅ（２００５），ｐｐ．４４−４８
【非特許文献１６】Ｌｅｖｉｓｅｔａｌ．ＩｎｖｉｔｒｏｓｔｕｄｉｅｓｏｆａＦＬＴ３ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｃｏｍｂｉｎｅｄｗｉｔｈｃｈｅｍｏｔｈｅｒａｐｙ：ｓｅｑｕｅｎｃｅｏｆａｄｍｉｎｉｓｔｒａｔｉｏｎｉｓｉｍｐｏｒｔａｎｔｔｏａｃｈｉｅｖｅｓｙｎｅｒｇｉｓｔｉｃｃｙｔｏｔｏｘｉｃｅｆｆｅｃｔｓ．Ｂｌｏｏｄ．ｖｏｌ．１０４，ｎｏ．４，２００４

受容体結合チロシンキナ−ゼ（ｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅｓ：ｔｒｋ）は、細胞外リガンド結合領域、膜貫通配列、および細胞質チロシンキナ−ゼ領域を含む膜貫通タンパクである。チロシンキナーゼは、細胞のシグナル伝達において機能する。細胞増殖、分化、遊走、代謝およびプログラム死は、チロシンキナーゼを介した細胞応答の例である。ＪＡＫ２は非受容体型チロシンキナーゼである。
ＪＡＫ２の恒常的発現が病理状態に起因する骨髄増殖性疾患および他の疾病を治療するために、ＪＡＫ２阻害剤が使用可能であることが見出されている。

したがって、本発明は、縮合ピロロカルバゾール誘導体を含む組成物を用いて、骨髄増殖性疾患および関連疾病を治療する方法を提供する。

本発明の方法において治療可能な活性化ＪＡＫ２に関連した骨髄増殖性疾患および関連疾病は、例えば真性赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａｖｅｒａ：ＰＶ）、本態性血小板血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ：ＥＴ）および慢性の特発性骨髄線維症（ｃｈｒｏｎｉｃｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ：ＣＩＭＦ）とも呼ばれる骨髄様化生を有する骨髄線維症（ｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓｗｉｔｈｍｙｅｌｏｉｄｍｅｔａｐｌａｓｉａ：ＭＭＭ）、未分類の骨髄増殖性疾患（ｕｎｃｌａｓｓｉｆｉｅｄｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ：ｕＭＰＤｓ）、高好酸球症候群（ｈｙｐｅｒｅｏｓｉｎｏｐｈｉｌｌｉｃｓｙｎｄｒｏｍｅ：ＨＥＳ）および全身性肥満細胞症（ｓｙｓｔｅｍｉｃｍａｓｔｏｃｙｔｏｓｉｓ：ＳＭ）などの骨髄増殖性疾患を含むが、これらに限定されるものではない。

本発明の方法では、ＪＡＫ２阻害剤の治療的有効量を被験者に投与する。平均７０ｋｇの成人に対する用法は、例えば、一日二回、約２０〜約１２０ｍｇであっても良い。特定の実施形態において、平均成人の用量は、一日二回、約４０〜約１００ｍｇである。他の実施形態では、平均成人の用量は一日二回、約６０〜約８０ｍｇである。

本発明の方法において、縮合ピロロカルバゾール不在下と比較して、縮合ピロロカルバゾール誘導体存在下では、特定の蛋白質の活性が減少する。そのような蛋白質は、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ３、ＳＨＰ２、ＧＡＢ２、ＡＫＴおよびＥＲＫを含むが、これらに限定されるものではない。

図１は、ＣＥＰ−７０１によるＪＡＫ２キナ−ゼ活性阻害を示す。図２は、ＨＥＬ９２細胞におけるＶ６１７Ｆ変異体の存在を確認するために行なわれた対立遺伝子に特異的なＰＣＲ（パネルＡ）、および制限酵素分析（パネルＢ）の結果を示したものである。このような変異を有していないＫ５６２細胞は、野生型コントロ−ルとしての役割を果たした。パネルＡ：対立遺伝子に特異的なＰＣＲについては、変異体に特異的なプライマ−が変異に特徴的な２０３ｂｐの産物（矢印）を産生し、３６４ｂｐ産物はＰＣＲの内部コントロ−ルとしての役割を果たした。Ｍは分子量マーカーである、レ−ン１および２は３６４ｂｐの変異体、野生型の対立遺伝子、および２０３ｂｐの変異体特異的対立遺伝子を示すＨＥＬ９２細胞である。レ−ン３は３６４ｂｐの野生型の対立遺伝子のみを示す対照Ｋ５６２細胞である。パネルＢ：制限分析については、Ｖ６１７Ｆ変異を包含するＰＣＲ産物が、ＨＥＬ９２およびＫ５６２のＤＮＡから産生され、ＢｓａＸＩ制限酵素により消化された。未消化（「−」にて表示）およびＢｓａＸＩにより消化された（「＋」で表示）ＰＣＲ産物は、分子量マーカーＭが示されている。予想制限パターンはＫ５６２ＤＮＡに対する形成した。２つの独立したＤＮＡ調製物を各細胞株に対してテストした。図３は、ＨＥＬ９２細胞のＪＡＫ２／ＳＴＡＴシグナル伝達に対するＣＥＰ−７０１の影響を示したものである。図のように、ＨＥＬ９２細胞は、０．１μＭ、０．３μＭ、１．０μＭおよび３．０μＭのＣＥＰ−７０１と共に２４時間培養した。図示したように、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴシグナル伝達に対する影響は、リン酸化型特異ＳＴＡＴ３およびＳＴＡＴ５抗体を用いたウェスタンブロット法により、あるいはＪＡＫ２に対する、免疫沈殿／ウェスタンブロット・プロトコル（ｉｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎ／ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔｐｒｏｔｏｃｏｌ：ＩＰ／ＷＢ）により評価した。全ＪＡＫ２抗体をＩＰに使用し、リン酸化は、リン酸化チロシン抗体を用いてＷＢで評価した。Ｂｃｌｘｌ発現はウェスタンブロットにより決定した。図４は、ＨＥＬ９２細胞の増殖に対するＣＥＰ−７０１の効果を示したものである。図示したように、ＨＥＬ９２細胞は、ＣＥＰ−７０１濃度を増加させて、２４時間および４８時間培養した。細胞増殖に対する効果は、ＭＴＳアッセイで評価した。実験は、１０％ＦＣＳ（パネルＡおよびＢ）中、あるいは無血清（パネルＣおよびＤ）にて行なった。パネルＡは、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下で２４時間培養した結果を示す。パネルＢは、１０％のＦＢＳ存在下で４８時間培養した結果を示す。パネルＣは、ＦＢＳ無しで２４時間培養した結果を示す。パネルＤは、ＦＢＳ無しで４８時間培養した結果を示す。パネルＡ〜Ｄについては、ＣＥＰ−７０１の量を増加させて別々の培養物に添加した（斜線棒グラフで示す）、未処理の細胞は最初の棒グラフで示す。図５は、ＨＥＬ９２細胞の増殖に対するＣＥＰ−７０１の効果を、該化合物が２４時間毎に補充された場合について示たものである。図示したように、ＨＥＬ９２細胞は、ＣＥＰ−７０１濃度を増加させて、２％ＦＣＳ中で７２時間培養した。ＣＥＰ−７０１は、２４時間毎に補充した。細胞増殖に対する効果はＭＴＳアッセイで評価した。未処理の細胞は最初の棒グラフで示す。図６は、ＨＥＬ９２細胞のアポトーシス誘導に対するＣＥＰ−７０１の影響を示したものである。図示したように、ＨＥＬ９２細胞は、ＣＥＰ−７０１濃度を増加させて、２４時間、４８時間、７２時間培養した。アポトーシス誘導は、ヒストン／ＤＮＡ放出アッセイで分析した。パネルＡは２４時間のアッセイを示し、パネルＢは４８時間のアッセイを示し、パネルＣは７２時間のアッセイを示す。図７は、ＣＥＰ−７０１によるＨＥＬ９２細胞のＳＴＡＴ５活性化の抑制を示したものである。図示したのように、ＨＥＬ９２細胞は、ＣＥＰ−７０１の濃度を増加させて、１時間、１．５時間、２．５時間培養した。細胞全体の抽出物を調製し、ＳＴＡＴ５リン酸化に対する効果を、特異抗体を使用して、ウェスタンブロットで評価した。バンドの量を定量化し、リン酸化の程度を検体中のＳＴＡＴ５の合計量に対して正規化した。結果は、賦形剤処理検体と比較した、残留ＳＴＡＴ５リン酸化の％として示した。５組の実験の平均値は最後の行に示した。５組の独立した実験を基に、ＨＥＬ９２細胞のＳＴＡＴ５の抑制に対するＩＣ５０（５０％阻害率濃度）（５０％ｉｎｈｉｂｉｔｏｒｙｃｏｎｃｅｎｔｒａｔｉｏｎ：ＩＣ５０）は約１０ｎＭであると決定された。図８は、ＣＥＰ−７０１によるＨＥＬ９２細胞のＳＴＡＴ３活性化の抑制を示したものである。図示したように、ＨＥＬ９２細胞は、ＣＥＰ−７０１の濃度を増加させて、１時間、１．５時間、２．５時間培養した。細胞全体の抽出物を調製し、特異抗体を使用して、ＳＴＡＴ３リン酸化に対する効果をウェスタンブロットで評価した。バンドの量を定量化し、リン酸化の程度を検体中のＳＴＡＴ３の合計量に対して正規化した。結果は、賦形剤処理検体と比較した、残留ＳＴＡＴ３リン酸化の％として示した。５組の実験の平均値は最後の行に示した。ＨＥＬ９２細胞のＳＴＡＴ３の抑制に対するＩＣ５０は、約１０ｎＭとして示される。図９は、ＨＥＬ９２細胞中の、ＣＥＰ−７０１を介したＳＴＡＴ５活性抑制に対するヒトのα１−ＡＧＰの効果を示したものである。図示したように、ＨＥＬ９２細胞は、１．０ｍｇ／ｍｌのα１−ＡＧＰを用いて、さらにＰＣＥＰ−７０１の濃度を増加させて１時間培養した。細胞全体の抽出物を調製し、ＳＴＡＴ５リン酸化に対する影響を、特異抗体を用いてウェスタンブロットにより評価した。バンドの量を定量化し、リン酸化の程度を検体中のＳＴＡＴ５の合計量に対して正規化した。結果は、賦形剤処理検体と比較し、残留ＳＴＡＴ５リン酸化の％として示した。１．０ｍｇ／ｍｌのＡＧＰと共に共培養したために、ＳＴＡＴ５の抑制に対する該ＩＣ５０は、３μＭにシフトした。図１０は、ＨＥＬ９２腫瘍異種移植片の成長に対する、一日二回、皮下投与したＣＥＰ−７０１（３０ｍｇ／ｋｇ）の効果を示したものである。パネルＡ：治療済み腫瘍を三角形で示す一方、未治療腫瘍の成長を正方形で示す。パネルＢ：切除した未治療および治療済み腫瘍を示す。図１１は、ＨＥＬ９２腫瘍異種移植片のＪＡＫ２／ＳＴＡＴシグナル伝達に対するＣＥＰ−７０１の影響を示したものである。ＣＥＰ−７０１（３０ｍｇ／ｋｇ）の１回用量を、ＨＥＬ９２腫瘍異種移植片を有する動物に皮下投与し、ＣＥＰ−７０１投与から０、１、２、４、８および１２時間後、ＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ３活性化に対する効果をウェスタンブロットにて評価した。ＣＥＰ−７０１の腫瘍内濃度も測定した。図１２は、対立遺伝子特異的ＰＣＲによる、Ｖ６１７Ｆ変異の存在に対する臨床検体の遺伝子型決定を示したものである。慢性の特発性骨髄線維症（ＣＩＭＦ）と診察された患者＃６４８および＃６５０のＶ６１７Ｆ変異を、対立遺伝子特異的ＰＣＲによってテストした。野生型と変異体対立遺伝子は３６４ｂｐ断片として増幅させ、２０３ｂｐの変異体特異的ＰＣＲ産物は、Ｖ６１７Ｆ変異の存在を示す。さらに、ＨＥＬ９２（変異体対立遺伝子を含む）および野生型Ｋ５６２細胞の結果も示す。図１３は、制限酵素ＢｓａＸＩを用いた臨床検体の遺伝子型決定を示したものである。図示したように、Ｖ６１７Ｆ変異を包含するＰＣＲ産物をＢｓａＸＩで消化した。ＳＬＣは、ＪＡＫ２と関連性のないＢｓａＸＩ部位を含むＰＣＲ産物であって、消化の完了を示すコントロ−ルとして働く。図１４は、患者＃６４８（ＸＴＴアッセイ）に由来のＣＤ３４＋初代培養の増殖に対するＣＥＰ−７０１の効果を示したものである。パネルＡ：２４時間。パネルＢ：４８時間。図１５は、患者＃６４８に由来したＣＤ３４＋初代培養の増殖および生存に対するＣＥＰ−７０１の影響を示したものである。図示したように、患者＃６４８由来のＣＤ３４＋造血前駆細胞を精製し、ＣＥＰ−７０１濃度を増加させて培養した。パネルＡ：細胞は２４時間ＣＥＰ−７０１で処置し、細胞増殖（生細胞）およびアポト−シス（アネキシン）（ＡｎｎｅｘｉｎＶ）に対する影響をＦＡＣＳ分析で評価した。パネルＢ：ＣＥＰ−７０１で２４時間処理した細胞を新鮮な培地で希釈し、７２時間培養した。細胞数はトリパンブルー（ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ）で測定した。Ｔ＝０は、実験開始時の細胞数を表わす。図１６は、患者＃６４８に由来したＣＤ３４＋初代培養のＪＡＫ２／ＳＴＡＴシグナル伝達に対するＣＥＰ−７０１の影響を示す。図示したように、患者＃６４８由来のＣＤ３４＋造血前駆細胞を精製し、ＣＥＰ−７０１濃度を増加させて１時間培養した。全細胞抽出物を調製し、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ３の発現およびリン酸化を特異抗体を用いてウェスタンブロットにて分析した。ＪＡＫ２活性を評価するために、ＪＡＫ２を免疫沈殿させ、続いて抗リン酸化チロシン（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）特異抗体（４Ｇ１０）を用いてウェスタンブロットを行なった。ブロットを剥ぎＪＡＫ２抗体で再標識した。シクロフィリンおよびβアクチンは内部コントロ−ルとしての役割を果たした。図１７は、患者＃６４８に由来したＣＤ３４＋初代培養液のＳＨＰ２およびＧａｂ２活性化およびＡＫＴおよびＭＡＰＫのシグナル伝達に対するＣＥＰ−７０１の影響を示したものである。図示したように、患者＃６４８由来のＣＤ３４＋造血前駆細胞を精製し、ＣＥＰ−７０１濃度を高めて１時間培養した。全細胞抽出物を調製し、種々のシグナル伝達分子の発現およびリン酸化を特異抗体を用いてウェスタンブロットで分析した。パネルＡ：ＳＨＰ２とＧＡＢ２の活性化に対するＣＥＰ−７０１の影響をリン酸化型特異抗体（ｐＳＨＰ２とｐＧＡＢ２）によって評価した。合計発現レベルを分析した（ＳＨＰ２とＧＡＢ２）。パネルＢ：ＣＥＰ−７０１のＭＡＰＫおよびＡＫＴシグナル伝達への影響をＡＫＴ（ｐＡＫＴ）およびＥＲＫ（ｐＥＲＫ）に対抗するリン酸化型特異抗体を使用して評価した。合計発現レベルを特異抗体（ＡＫＴとＥＲＫ）を使用して分析した。βアクチンは、内部コントロ−ルとしての役割を果たした。図１８は、患者＃６４８由来のＣＤ３４＋初代培養液のＳＴＡＴ５シグナル伝達に対する、ＣＥＰ−７０１との２４時間培養の影響を示したものである。図示したように、患者＃６４８由来のＣＤ３４＋造血前駆細胞を精製し、ＣＥＰ−７０１濃度を増加させて、２４時間培養した。全細胞抽出物を調製し、ＳＴＡＴ５の発現およびリン酸化、およびＢｃｌｘｌの発現を特異抗体を用いてウェスタンブロットで分析した。βアクチンおよびシクロフィリンは、内部コントロ−ルとしての役割を果たした。

本発明は、生物学的に活性な縮合ピロロカルバゾール誘導体を用いて、ＪＡＫ２の活性化が関連する様々な疾病あるいは症候群を治療するための方法に関連する。特定の実施形態において、前記疾病あるいは症候群は、例えば骨髄増殖性疾患（ＭＰＤｓ）および骨髄異形成症候群を含む。疾病および／又は症候群の治療に役立つ縮合ピロロカルバゾール誘導体の中には、インドロカルバゾール（ｉｎｄｏｌｏｃａｒｂａｚｏｌｅ）およびインデノカルバゾール（ｉｎｄｅｎｏｃａｒｂａｚｏｌ）誘導体がある。より具体的に、本発明は、ＭＰＤ並びに骨髄異形成症候群およびＪＡＫ２活性化が関連する他の関連疾病をインドロカルバゾールを用いて治療することに関連する。

そのような疾病に有用な前記縮合ピロロカルバゾール誘導体は、当該技術分野で周知であり、当業者であれば、例えば以下のものを含むいかなる方法においても調製することが可能であり、米国特許第４，９２３，９８６号（Ｍｕｒａｋａｔａら）、第５７０５５１１号（Ｈｕｄｋｉｎｓら）、第５，８０８，０６０号（Ｈｕｄｋｉｎｓら）、米国特許第６，１２７，４０１号（Ｓｉｎｇｈら）、米国特許第６，８４１，５６７号（Ｈｕｄｋｉｎｓら）、第６，６３０，５００号（Ｇｉｎｇｒｉｃｈら）、第５，７５６，４９４号（Ｌｅｗｉｓら）、第５，４６８，８７２号（Ｇｌｉｃｋｓｍａｎら）、第５，５１６，７７１号（Ｄｉｏｎｎｅら）、第６，３０６，８４９号（Ｈｕｄｋｉｎｓら）、および第６，０９３，７１３号（Ｈｕｄｋｉｎｓら）、これらの開示はこの参照によってその全体が本願明細書に組み込まれるものである。特定の実施形態において、インドロカルバゾール類の調製における出発原料、例えばＫ−２５２ａおよびＫＴ−５５５６は、光学活性である。本願明細書に記載の治療方法に有用な化合物の調製において、Ｋ−２５２ａあるいはＫＴ−５５５６を出発原料として使用することにより、所望の縮合ピロロカルバゾール誘導体に、一部又はすべての前記光学活性がもたらされる可能性ががある。

上述および本開示全体にわたって使用される以下の用語は、別記しない限り、以下の意味を有するように理解されるものである。

本願明細書において使用される「約」は、特定された値の一連の±１０％の値を意味する。例えば、「約２０」は、２０の±１０％、すなわち１８〜２２をすべて包括的に含む。

本願明細書において使用される「アルキル」は、１〜８個の炭素原子（およびその炭素原子の範囲および特定数のすべての組み合わせおよびサブコンビネーション）を有する、選択的に置換されていてもよい飽和直鎖又は分岐炭化水素を指し、好ましくは約１〜約４個の炭素原子を有するものである（本願明細書において「低級アルキル」と称する）。アルキル基は、メチル、エチル、ｎ−プロピル、イソプロピル、ｎ−ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、ｎ−ペンチル、イソペンチル、ネオペンチル、ｎ−ヘキシル、イソヘキシル、３−メチルペンチル、２，２−ジメチルブチル、および２，３−ジメチルブチルを含むがこれ等に限定されない。

本願明細書において使用される「アルケニル」は、２〜１０個の炭素原子、好ましくは約２〜約８個の炭素原子、および１個又はそれ以上の二重結合（およびその炭素原子の範囲および特定数の総ての組み合わせおよびサブコンビネーション）を有する、選択的に置換してもよい、アルキル基を指し、ここでアルキルはすでに定義した通りである。

本願明細書において使用される「アルキニル」は、選択的に置換してもよい、２〜１０個の炭素原子好ましくは約２〜約８個の炭素原子、および１個又はそれ以上の三重結合を有する、（およびその炭素原子の範囲および特定数の総ての組み合わせおよびサブコンビネーション）アルキル基を指し、ここでアルキルはすでに定義した通りである。

本願明細書において使用される「アリール」は、６〜１４個の炭素原子（およびその炭素原子の範囲および特定数の総ての組み合わせおよびサブコンビネーション）を有する、選択的に置換されていてもよい、単環、双環、又は三環芳香環システムを指し、好ましくは約６〜約１０個の炭素原子を有するものである。非限定な例として、例えば、フェニル、ナフチル、アンスラセニル、およびフェナンスレニルを含む。

本願明細書において使用される「アリールアルキル」は、アリール置換基を有するアルキル基よりなる、選択的に置換されていてもよい部分を指し、ここで前記アラルキル部分は、約７〜約２２個の炭素原子（およびその炭素原子の範囲および特定数の総ての組み合わせおよびサブコンビネーション）を有し、好ましくは約７〜約１０個の炭素原子を有するものである。非限定な例は、例えば、ベンジル、ジフェニルメチル、トリフェニルメチル、フェニルエチル、およびジフェニルエチルを含む。

本願明細書において使用される「ヘテロアリール」は、５〜１４個の炭素原子環メンバ−を有し、ここで１個又はそれ以上の炭素原子環が独立して、１個又はそれ以上のヘテロ原子で置き換えられている、選択的に置換されていてもよい、芳香環システムを指す。特定の実施形態において、ヘテロ原子はＳ、Ｏ、あるいはＮから選択される。合計約５〜１４個、さらに好ましくは約５〜約６個の炭素原子環メンバーおよびヘテロ原子環メンバー（および炭素およびヘテロ原子環メンバ−の全ての組み合わせとサブコンビネーションの範囲および特定数）を有するヘテロアリール基が好ましい。典型的なヘテロアリール基は、ピリル、フリル、ピリジル、ピリジン−Ｎ−オキサイド、１、２、４−チアジアゾリル、ピリミジル、チエニル、イソチアゾリル、イミオダゾリル、テトラゾリル、ピラジニル、ピリミジル、キノリル、イソキノリル、チオフェニル、ベンゾチエニル、イソベンゾフィリル、ピラゾリル、インドリル、プリニル、カルバゾリル、ベンズイミダゾリル、およびイソキサゾリルを含むがこれらに限定されない。ヘテロアリール基は、炭素又はヘテロ原子を通して分子の残部に結合されてもよい。

本願明細書において使用される「ヘテロアリールアルキル」は、ヘテロアリール置換アルキルからなり、選択的に置換してもよい環システムを指し、ヘテロアリールおよびアルキルは、すでに定義されているものである。非限定な例は、例えば、２−（１Ｈ−ピロ−ル−３−イル）エチル、３−ピリジルメチル、５−（２Ｈ−テトラゾイル）メチルおよび３−（ピリミジン−２−イル）−２−メチルシクロペンタニルを含む。

本願明細書において使用される用語「Ｐｒｏ」「Ｓｅｒ」「ＧｌＹ」「Ｌｙｓ」はそれぞれ、アミノ酸である、プロリン、セリン、グリシン、およびリジンを指す。

本願明細書において使用される用語「アミノ酸」はアミノ基およびカルボキシル基の両方を含む分子を示す。アミノ酸の実施形態は、α−アミノ酸、つまり、一般式ＨＯＯＣ−ＣＨ（ＮＨ_２）−（側鎖）のカルボン酸を含む。アミノ酸の側鎖は天然および非天然由来の部分を含む。天然由来でない（つまり、非天然）アミノ酸の側鎖は、例えばアミノ酸類似体の天然由来アミノ酸側鎖の代わりに使用される部分である。例えば、Ｌｅｈｎｉｎｇｅｒ，Ｂｉｏｃｈｅｍｉｓｔｒｙ，第２版，ＷｏｒｔｈＰｕｂｌｉｓｈｅｒｓ，Ｉｎｃ，１９７５，７３〜７５頁を参照し、本願明細書に組み込まれるものである。好ましいα−アミノ酸は、Ｄ配置、Ｌ−配置を有するか、あるいはラセミ体としてのグリシン、アラニン、プロリン、グルタミン酸およびリジンを含む。

本願明細書において使用される用語「Ｇｌｃ」はグルコ−スを指す。

本願明細書において使用される立体異性体あるいは立体異性体中心を指す場合、用語「実質上豊富な」は、混合物中、１つの立体異性体あるいは１つの立体異性体の中心の少なくとも約６０％、好ましくは約７０％、さらに好ましくは、約８０％、なお好ましくは、約９０％が主成分であることを示し、１つの立体異性体あるいは１つの立体異性の中心が少なくとも約９５％であることがさらに好ましい。特定の好ましい実施形態において、化合物は「実質上、鏡像異性的に純粋である」とは、つまり、少なくとも約９７．５％、より好ましくは約９９％、さらに好ましくは、９９．５％が１つの立体異性体を主成分とするものである。

本願明細書において使用される用語「有効量」は、特定の病気、疾病あるいは疾患の症状を阻害あるいは治療するのに、治療上有効であり得る、本願明細書に記載の化合物の量を指す。そのような病気、疾病、および疾患は、ＪＡＫ２の活性が関係する病理学的条件を含むが、これらに限定されるものではなく、ここで前記治療は、例えば、細胞、組織あるいは受容体を本発明の化合物と接触させることによりその活性を阻害することから成る。従って、例えば、骨髄増殖性疾患の治療用の本発明の化合物に関連して使用される場合、用語「有効な量」は、典型的に髄増殖性疾病に関係する症状、病気、および疾患の治療を指すものである。

本願明細書において使用される「薬学的に許容できる」は、適切な医学的判断内で、ヒトおよび動物の組織との接触に適合し、合理的な利益／危険比率に相応した、過度の毒性、炎症、アレルギ−反応、又は他の問題の併発のない、化合物、材料、組成物および／又は投薬形態を意味する。

本願明細書において使用される「薬学的に許容できる塩類」は、親化合物の酸又は塩基の塩類を生成して変性された前記開示化合物の誘導体を意味する。薬学的に許容できる塩類の例は、アミンのような塩基残基の鉱酸又は有機酸の塩類、カルボン酸のような酸性残基のアルカリ又は有機塩類などを含むが、これらに限定されない。薬学的に許容できる塩類は、例えば無毒の無機又は有機酸から生成された、親化合物の従来の無毒な塩類又は第四アンモニウム塩類を含む。例えば、そのような従来の無毒な塩類は、塩酸、臭化水素酸、硫酸、スルファミン酸、燐酸、硝酸等のような無機酸から誘導されたもの、および酢酸、プロピオン酸、琥珀酸、グリコ−ル酸、ステアリン酸、乳酸、リンゴ酸、酒石酸、クエン酸、アスコルビン酸、パモン酸、マレイン酸、ヒドロキシマレイン酸、フェニル酢酸、グルタミン酸、安息香酸、サリチル酸、スルファニル酸、２−アセトキシ安息香酸、フマル酸、トルエンスルフォン酸、メタンスルフォン酸、エタンジスルフォン酸、蓚酸、イセチオン酸等の有機酸から調製された塩類を含む。これ等の生理学的に許容できる本発明の塩類は、例えば、該遊離アミン塩基を過剰の酸と共に水性アルコ−ルに溶解されるか、あるいは遊離カルボン酸を水酸化物のようなアルカリ金属塩基、あるいはアミンで中和することにより、当該技術分野で周知の方法によって調製する。本明細書中に記載した化合物は、別の形態で使用あるいは調製可能である。例えば、多くのアミノ基含有化合物は、酸付加塩として使用あるいは調製可能であるる。そのような塩類は、しばしば該化合物の分離および取り扱い特性を改善する。例えば、該試薬、反応条件などによって、本願明細書に記載した化合物は、例えば、それらの塩酸塩又はトシラート（ｔｏｓｙｌａｔｅ）塩類として、使用あるいは調製可能である。同形の結晶形、すべてのキラルおよびラセミ体、Ｎ−オキサイド、水和物、溶媒和物、および酸性塩水和物も、本発明の範囲内に入ると考えられる。

本願明細書において使用される「水和物」は分子の形式で水と会合している本発明の化合物を指す、つまり、Ｈ−ＯＨ結合が切断されず、Ｒが本発明の化合物である場合、例えば式Ｒ・Ｈ_２Ｏで表わすことが出来る。与えられた化合物は、例えば、１つ以上の水和物を形成することができる、例えば、１水和物（Ｒ・Ｈ_２Ｏ）、あるいは多水和物（Ｒ・ｎＨ_２Ｏ）（ここでｎは>１の整数）で、例えば、２水和物（Ｒ・２Ｈ_２Ｏ）、３水和物（Ｒ・３Ｈ_２Ｏ）など、あるいは、例えば、ｎが整数である場合、Ｒ・ｎ_／２Ｈ_２Ｏ，Ｒ・ｎ_／３Ｈ_２Ｏ，Ｒ・ｎ_／４Ｈ_２Ｏなどのような半水和物である。

本願明細書において使用される「溶媒和化合物」は、溶剤と分子の形式、つまり、溶媒が配位結合し、Ｒが本発明の化合物である場合、式Ｒ・（溶媒）で表すことができる形態で会合した本発明の化合物を指す。任意の化合物は、１つ以上の溶媒化合物を形成でき、ｎが>１の整数である場合、例えば、１溶媒和化合物（Ｒ・（溶媒））あるいは、ｎが整数である場合多溶媒和化合物（Ｒ・ｎ（溶媒））であって、例えば、２溶媒和化合物（Ｒ・２（溶媒））、３溶媒和化合物（Ｒ・３（溶媒））等、あるいは、例えばｎが整数である場合Ｒ・ｎ／２（溶媒），Ｒ・_ｎ／３（溶媒），Ｒ・_ｎ／４（溶媒）などである。溶剤は、ここでは例えばメタノ−ル／水のような混合溶剤を含み、また、そのようなものとして、溶媒和化合物は、溶媒化合物内に１種又はそれ以上の溶剤を組み入れることができる。

本願明細書において使用される「酸塩水和物」は、１又はそれ以上の塩基部分を有する化合物と１又はそれ以上の酸性部分を有する化合物との結合、あるいは１種又はそれ以上の酸性部分を有する化合物と１又はそれ以上の塩基部分を有する化合物との結合によって形成し得る複合体であって、当該複合体がさらに水分子と会合して水和化合物を生成し、ここで該水和化合物は前に定義した通りであり、Ｒは本願明細書において上述した複合体を表わす。

この明細書中に記載された化合物は、別の形態で使用あるいは調製可能である。例えば、多くのアミノ基含有化合物は、酸付加塩として使用あるいは調製可能である。そのような塩類は、しばしば該化合物の分離および取り扱い特性を改善する。例えば、該試薬、反応条件などによって、本願明細書に記載の化合物は、例えば、それらの塩酸塩又はトシラ−ト（ｔｏｓｙｌａｔｅ）塩類として、使用するか調製できる。同形の結晶形、すべてのキラルおよびラセミ体、Ｎ−オキサイド、水和物、溶媒和物、および酸性塩水和物も、本発明の範囲内に入ると考えられる。

本願明細書において使用される「患者」は哺乳動物を含む動物、好ましくはヒトを指す。

本願明細書において使用される「プロドラッグ」は、目的とする反応部位に到達する活性種の量を最大限にするように特異的に設計された化合物を指し、そのもの自体は通常所望の活性に対して不活性であるか、あるいは僅かに活性であるが、生体内変換を経て生物学的に活性な代謝物質に変換される。

本願明細書において使用される用語「立体異性体」は同一の化学組成を有するが、原子か原子団の空間配置が異なる化合物を指す。

本願明細書において使用される「Ｎ−オキサイド」は、ヘテロアリール環あるいは三級アミンのいずれかの塩基性窒素原子が酸化され、形式正電荷を有する第４級窒素および形式負電荷を有する結合酸素原子を生成した化合物を指す。

本願明細書において使用される用語「治療」および本願明細書において使用される「治療する」は、予防（例えば予防薬）、治療および／又は待機的治療を含む。

任意の組成物あるいは任意の化学式において１若しくはそれ以上の任意の変更が生じる場合、その各発生時における定義は、他のすべての発生時における定義とは無関係である。

置換および／又は変更の組み合わせは、かかる組み合わせの結果、安定した化合物に導かれる場合にのみ許容され得る。

本願明細書において正しく且つ正確に使用される化学式及び名称が、実際の化合物を表わしていると考えられる。しかしながら、本発明の本質および価値は、全てあるいは部分的にも、これらの化学式の理論的な正確さに依存しているわけではない。したがって、本願明細書に使用した化学式は、該当して示されている化合物に起因する化学名と同様、本発明を一切限定するものでなく、これは本発明を如何なる特定の互変異性型あるいは任意の特定の光学あるいは幾何異性体に限定することも含まれるが、ただし、その立体化学が明白に定義される場合は除く。

従って、特定の実施形態において、本発明は、骨髄増殖性疾患を治療する方法に関連していて、治療を必要とする患者に、治療上有効な量のＪＡＫ２阻害剤を投与することを含むものである。特定の実施形態において、ＪＡＫ２阻害剤は縮合ピロロカルバゾールである。特定の実施形態において、縮合ピロロカルバゾールはインドロカルバゾールであり、他の実施形態において、それはインデノカルバゾールである。特定の実施形態では、縮合ピロロカルバゾールは、式Ｉの構造を有するもの、またはその立体異性体あるいは薬学的に許容できる塩形態であり、

式中、
環ＢおよびＦは独立して、フェニル又はヘテロアリールであり、
Ｒ^１は独立してＨ、アルキル、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、
ヘテロアリールアルキル、−ＣＯＲ^９、−ＯＲ^１０、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＲ^７Ｒ^８、
−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、あるいは−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８であり、
Ｒ^２は独立してＨ、−ＳＯ_２Ｒ^９、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＲ^９、１〜８個の炭素を有するアルキル、２〜８個の炭素を有するアルケニル、２〜８個の炭素を有するアルキニル、あるいは５〜７個の炭素を有する単糖であって、
前記単糖の各水酸基は、独立して、１〜４個の炭素を有するアルキル、２〜５個の炭素を有するアルキルカルボニルオキシ、あるいは１〜４個の炭素を有するアルコキシと選択的に置換され、また、
前記アルキル、アルケニルあるいはアルキニル基は、１〜３個のＲ^２７基と選択的に置換され、
ＸがＣＨＲ^１６かＮＲ^１６である場合、Ｒ^２およびＲ^１６は、選択的に共に結合して、２および５の位置を介して連結するフランを形成することが可能であり、前記連結フランの２および５位は、それぞれＲ^２８とＲ^２９と選択的に置換されており、さらに前記連結フランの３位はＲ^１７およびＲ^１８により二置換されており、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、Ｈ、アリール、ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＯＲ^１０、（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−ＯＣＯＲ^９、−ＯＣＯＮＨＲ^９、−ＣＨ_２ＯＲ^１４、−ＮＲ^７Ｒ_８、−ＮＲ^１０ＣＯＲ_９、−ＮＲ^１０ＣＯ_２Ｒ^９、−ＮＲ^１０ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１１、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＲ^９、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＮＯＲ^１１、−ＣＨ＝ＮＲ^９、−ＣＨ＝ＮＮＲ^１２Ｒ^１３、−（ＣＨ２）_ｐＳ（Ｏ）_ｙＲ^９、−ＣＨ_２ＳＲ^１５、−ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１４、−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−（ＣＨ_２）_ｐＮＨＲ^１４、１〜８個の炭素を有するアルキル、２〜８個の炭素を有するアルケニル、あるいは２〜８個の炭素を有するアルキニルであり、
前記アルキル、アルケニルあるいはアルキニル基は各々、選択的に独立して１〜３個のＲ^２７基と置換されており、
Ｘは、
選択的に、ＯＨ、＝Ｏ、＝ＮＯＲ^１１、ＯＲ^１１、−ＯＣＯＲ^９、−ＯＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、−ＳＯ_２Ｒ^９、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＲ^９、１〜８個の炭素を有するアルキル、２〜８個の炭素を有するアルケニル、２〜８個の炭素を有するアルキニル、あるいは５〜７個の炭素を有する単糖の少なくとも１つと置換された１〜３個の炭素を有するアルキレンであり、
前記単糖の各水酸基は、独立して、１〜４個の炭素を有するアルキル、２〜５個の炭素を有するアルキルカルボニルオキシ、あるいは１〜４個の炭素を有するアルコキシと選択的に置換されており、さらに、
前記アルキル、アルケニルあるいはアルキニル基は、１〜３個のＲ^２７基、−Ｏ−、−Ｓ（Ｏ）_ｙ−、Ｎ（Ｒ^１６）、ＣＨＲ^１６、−ＣＨ_２Ｚ−、−Ｚ−ＣＨ_２−、あるいはＣＨ_２ＺＣＨ_２−と選択的に置換されており、
Ｚは、Ｃ（ＯＲ^１１）（Ｒ^１１）、Ｏ、Ｓ、Ｃ（＝Ｏ）、Ｃ（＝ＮＯＲ^１１）あるいはＮＲ^１１であり、
ＸがＣＨＲ^１６かＮＲ^１６である場合、Ｒ^２およびＲ^１６は、選択的に共に結合して、２および５の位置を介して連結するフランを形成することが可能であり、前記連結フランの２および５位は、それぞれＲ^２８およびＲ^２９によって選択的に置換されており、さらに、前記連結フランの３位はＲ^１７およびＲ^１８により二置換されており、
Ａ^１およびＡ^２は、独立して、Ｈ、−ＯＲ^１１、−ＳＲ^１１あるいは−Ｎ（Ｒ^１１）_２であるか、あるいは、共に結合して、＝Ｏ、＝Ｓあるいは＝ＮＲ^１１である部分を形成しており、
Ｂ^１およびＢ^２は、独立して、Ｈ、−ＯＲ^１１、−ＳＲ^１１あるいは−Ｎ（Ｒ^１１）_２であるか、あるいは、共に結合して、＝Ｏ、＝Ｓあるいは＝ＮＲ^１１である部分を形成しており、
但し、Ａ^１およびＡ^２又はＢ^１およびＢ^２の少なくとも１組が共に結合して＝Ｏを生じ、
Ｒ^７およびＲ^８は独立して、Ｈあるいは１〜４個の炭素を有するアルキルであるか、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成しており、
Ｒ^９は独立して、１〜４個の炭素を有するアルキル、アリールあるいはヘテロアリールであり、
Ｒ^１０は独立して、Ｈ又は１〜４個の炭素を有するアルキルであり、
Ｒ^１１は、独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、６〜１０個の炭素を有するアリールあるいはヘテロアリールであり、
Ｒ^１２とＲ^１３は、独立して、Ｈ、アルキル、６〜１０個の炭素を有するアリール、あるいはヘテロアリールである、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成しており、
Ｒ^１４は独立してカルボキシル基の水酸基が除去された後のアミノ酸の残基であり、
Ｒ^１５は独立して１〜４個の炭素を有するアルキルであり、
Ｒ^１６は独立して、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、２〜８個の炭素を有するアルケニル、２〜８個の炭素を有するアルキニル、アリールあるいはヘテロアリールであって、ここで、該アルキル、アルケニル、アルキニル、アリールあるいは、ヘテロアリール基は各々、選択的に１〜３個のＲ^２７基により独立して置換されているか、あるいは、ＸがＣＨＲ^１６あるいはＮＲ^１６である場合、Ｒ^２およびＲ^１６は、選択的に共に結合して、２および５の位置を介して連結するフランを形成することが可能であり、前記連結フランの２および５位は、それぞれＲ^２８およびＲ^２９により選択的に置換されており、さらに、前記連結フランの３位はＲ^１７およびＲ^１８により二置換されており、
Ｒ^１７は、独立してＯＨ、１〜６個の炭素を有するＯ−ｎ−アルキルあるいは２〜６個の炭素を有するＯ−アシルであり、
Ｒ^１８は独立して、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、ＣＯＮＨＣ_６Ｈ_５、ＣＨ_２Ｙであり、
ＹはＯＲ^１９、ＳＯＲ^２０、ＮＲ^２１Ｒ^２２あるいはＳＲ^２３、Ｎ_３、ＣＯ_２Ｒ^１５、Ｓ−Ｇｌｃ、ＣＯＮＲ^２４Ｒ^２５、ＣＨ＝ＮＮＨＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＯＲ^１０、ＣＨ＝ＮＯＲ^１０、ＣＯＮＲ^２４Ｒ^２５、ＣＨ＝ＮＮＨＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＯＲ^１０、ＣＨ＝ＮＯＲ^１０、ＣＨ＝ＮＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、

、ＣＨ＝ＮＮ（Ｒ^２６）_２、あるいはＣＨ_２ＮＨＣＯＮＨＲ^１６であり、
あるいは、Ｒ^１７およびＲ^１８は、選択的に共に結合して、−ＣＨ_２ＮＨＣＯ_２−、−ＣＨ_２ＯＣ（ＣＨ_３）_２Ｏ−、＝Ｏ、あるいはＣＨ_２Ｎ（ＣＨ_３）ＣＯ_２−を形成しており、
Ｒ^１９は、独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル又は２〜５個の炭素を有するアシルであり、
Ｒ^２０は、独立して１〜４個の炭素を有するアルキル、アリール、又は窒素原子を含むヘテロシクロアルキル基であり、
Ｒ^２１およびＲ^２２は、独立して、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、プロリン、セリン、グリシン、およびリジンあるいは２〜５個の炭素を有するアシルであるが、但しＲ^２１とＲ^２２のうち１個だけがプロリン、セリン、グリシン、リジン、又はアシルであり、
Ｒ^２３は、独立して、アリール、１〜４個の炭素を有するアルキル、あるいは窒素原子を含むヘテロシクロアルキル基であり、
Ｒ^２４およびＲ^２５は独立して、Ｈ、１〜６個の炭素を有するアルキル、フェニル、あるいは１〜６個の炭素を有するヒドロキシアルキルであるか、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成しており、
Ｒ^２６は独立してアリールであり、
Ｒ^２７は独立してアリール、ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−ＯＣＯＲ^９、−ＯＣＯＮＨＲ^９、Ｏ−テトラヒドロピラニル、−ＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＲ^１０ＣＯＲ^９、−ＮＲ^１０ＣＯ_２Ｒ^９、−ＮＲ^１０ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、−ＮＲ^１０ＳＯ_２Ｒ^９、−Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１１、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ^９、−ＣＨ_２ＯＲ^７、−ＣＨ＝ＮＮＲ^１２Ｒ^１３、−ＣＨ＝ＮＯＲ^１１、−ＣＨ＝ＮＲ^９、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＨ（Ｎ＝ＮＨ）ＮＨ_２、−ＳＯ_２ＮＲ^１２Ｒ^１３、−Ｐ（＝Ｏ）（ＯＲ^１１）_２、あるいは−ＯＲ^１４であり、
Ｒ^２８は，独立して１〜４個の炭素を有するアルキル、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、７〜１０個の炭素を有するアリールアルキル、−（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−（ＣＨ_２）_ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^７Ｒ^８あるいは−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８であり、
Ｒ^２９は独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、７〜１０個の炭素を有するアリールアルキル、−（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−（ＣＨ_２）_ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^７Ｒ^８あるいは−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８であり、
ｐは１〜４の整数であり、さらに
ｙは０、１又は２である。

とくていの実施形態において、縮合ピロロカルバゾールは、式ＩＩの構造を有するもの、あるいはその立体異性体あるいは薬学的に許容できる塩形態であり、

式中、
Ｒ^１は独立してＨ、アルキル、フェニル、７〜１０個の炭素を有するアリールアルキル、５〜６員ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、−ＣＯＲ^９、−ＯＲ^１０、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＲ^７Ｒ^８、−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、あるいは−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８であり、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、独立して、Ｈ、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＯＲ^１０、（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−ＯＣＯＲ^９、−ＯＣＯＮＨＲ^９、−ＣＨ_２ＯＲ^１４、−ＮＲ^７Ｒ_８、−ＮＲ^１０ＣＯＲ_９、−ＮＲ^１０ＣＯ_２Ｒ^９、−ＮＲ^１０ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１１、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＲ^９、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＮＯＲ^１１、−ＣＨ＝ＮＲ^９、−ＣＨ＝ＮＮＲ^１２Ｒ^１３、−（ＣＨ_２）_ｐＳ（Ｏ）_ｙＲ^９、−ＣＨ_２ＳＲ^１５、−ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１４、−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−（ＣＨ_２）_ｐＮＨＲ^１４、１〜８個の炭素を有するアルキル、２〜８個の炭素を有するアルケニル、あるいは２〜８個の炭素を有するアルキニルであり、
前記アルキル、アルケニルあるいはアルキニル基は選択的に１〜３個のＲ^２７基と置換されており、
Ｘは−ＣＨ−またはＮであり、
Ａ^１およびＡ^２は、独立して、Ｈ、−ＯＲ^１１、−ＳＲ^１１又はＮ（Ｒ^１１）_２であるか、
あるいは、共に結合して、＝Ｏ、＝Ｓ又は＝ＮＲ^１１である部分を形成しており、
Ｂ^１とＢ^２は、独立して、Ｈ、−ＯＲ^１１、−ＳＲ^１１又はＮ（Ｒ^１１）_２であるか、あるいは、共に結合して、＝Ｏ、＝Ｓあるいは＝ＮＲ^１１である部分を形成しており、
但しＡ^１およびＡ^２又はＢ^１およびＢ^２の少なくとも１組が共に結合して＝Ｏを形成しており、
Ｒ^７およびＲ^８は独立して、Ｈ又は１〜４個の炭素を有するアルキルであるか、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成しており、
Ｒ^９は独立して１〜４個の炭素を有するアルキル、アリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ^１０は独立して１〜４個の炭素を有するＨ又はアルキルであり、
Ｒ^１１は、独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、６〜１０個の炭素を有するアリール又はヘテロアリールであり、
Ｒ^１２とＲ^１３は、独立して、Ｈ、アルキル、６〜１０個の炭素を有するアリール、あるいはヘテロアリールであり、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ^１４は独立してカルボキシル基の水酸基が除去された後の、アミノ酸の残基であり、
Ｒ^１５は独立して１〜４個の炭素を有するアルキルであり、
Ｒ^１６は独立して、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、アリールあるいはヘテロアリールであって、、
Ｒ^１７は、独立してＯＨ、１〜６個の炭素を有するＯ−ｎ−アルキルあるいは２〜６個の炭素を有するＯ−アシルであり、
Ｒ^１８は、独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、ＣＯＮＨＣ_６Ｈ_５、ＣＨ_２Ｙであって、ここで、ＹはＯＲ^１９、ＳＯＲ^２０、ＮＲ^２１Ｒ^２２又はＳＲ^２３、Ｎ_３、ＣＯ_２Ｒ^１５、Ｓ−Ｇｌｃ、
ＣＯＮＲ^２４Ｒ^２５、ＣＨ＝ＮＮＨＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＯＲ^１０、ＣＨ＝ＮＯＲ^１０、ＣＨ＝ＮＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、

、ＣＨ＝ＮＮ（Ｒ^２６）_２、あるいはＣＨ_２ＮＨＣＯＮＨＲ^１６、
あるいは、Ｒ^１７とＲ^１８は、選択的に共に結合して、−ＣＨ_２ＮＨＣＯ_２−、−ＣＨ_２ＯＣ（ＣＨ_３）_２Ｏ−、＝Ｏ、あるいはＣＨ_２Ｎ（ＣＨ_３）ＣＯ_２−を生成し、
Ｒ^１９は、独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキルあるいは２〜５個の炭素を有するアシルであり、
Ｒ^２０は、独立して１〜４個の炭素を有するアルキル、アリールあるいは窒素原子を含むヘテロシクロアルキル基であり、
Ｒ^２１とＲ^２２は、独立して、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、プロリン、セリン、グリシン、およびリジンあるいは２〜５個の炭素を有するアシルであるが、但しＲ^２１およびＲ^２２のいずれか１つのみがプロリン、セリン、グリシン、リジン、あるいはアシルであり、
Ｒ^２３は、独立してアリール、１〜４個の炭素を有するアルキル、あるいは窒素原子を含むヘテロシクロアルキル基であり、
Ｒ^２４とＲ^２５は独立して、Ｈ、１〜６個の炭素を有するアルキル、フェニル、あるいは１〜６個の炭素を有するヒドロキシアルキル、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ^２６は独立してアリールであり、
Ｒ^２７は独立してアリール、ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−ＯＣＯＲ^９、−ＯＣＯＮＨＲ^９、Ｏ−テトラヒドロピラニル、−ＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＲ^１０ＣＯＲ^９、−ＮＲ^１０ＣＯ_２Ｒ^９、−ＮＲ^１０ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、−ＮＲ^１０ＳＯ_２Ｒ^９、−Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１１、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ^９、−ＣＨ_２ＯＲ^７、−ＣＨ＝ＮＮＲ^１２Ｒ^１３、−ＣＨ＝ＮＯＲ^１１、−ＣＨ＝ＮＲ^９、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＨ（Ｎ＝ＮＨ）ＮＨ_２、−ＳＯ_２ＮＲ^１２Ｒ^１３、−ＰＯ（ＯＲ^１１）_２、あるいは−ＯＲ^１４であり、
Ｒ^２８は，独立して１〜４個の炭素を有するアルキル、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、７〜１０個の炭素を有するアリールアルキル、−（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−（ＣＨ_２）_ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^７Ｒ^８あるいは−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８であり、
Ｒ^２９は独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、７〜１０個の炭素を有するアリールアルキル、−（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−（ＣＨ_２）_ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^７Ｒ^８あるいは−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８であり、
ｐは１〜４までの整数であり、また
ｙは０、１又は２である。

ある他の実施形態では、縮合ピロロカルバゾールは、式ＩＩＩの構造を有するもの、またはその立体異性体あるいは薬学的に許容できる塩形態であり、

式中、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^２８、Ｒ^２９およびＸは、ここに上記されている式ＩＩ化合物の通りである。ある好ましい実施形態では、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、およびＲ^６は、各々Ｈである。

本発明の方法の他の実施形態では、前記縮合ピロロカルバゾールは、式ＩＩＩの構造を有し、ここで：
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、Ｈ、フェニル、Ｆ、Ｃｌ、−ＯＲ^１０、（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−ＮＲ^７Ｒ_８、−ＣＨＯ、−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、あるいは１〜８個の炭素を有するアルキルであって、ここで前記アルキル基は選択的に１〜３個のＲ^２７基で置換され、
Ｘは−ＣＨ−あるいはＮであり、
Ｒ^７とＲ^８は独立して、Ｈあるいは１〜４個の炭素を有するアルキルであるか、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ^９は独立して１〜４個の炭素を有するアルキル、アリールあるいはヘテロアリールであり、
Ｒ^１０は独立してＨ又は１〜４個の炭素を有するアルキルであり、
Ｒ^１１は、独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、６〜１０個の炭素を有するアリール、あるいはヘテロアリールであり、
Ｒ^１２とＲ^１３は、独立して、Ｈ、アルキル、６〜１０個の炭素を有するアリール、あるいはヘテロアリールであり、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ^１４は独立してカルボキシル基の水酸基が除去された後の、アミノ酸の残基であり、
Ｒ^１５は独立して１〜４個の炭素を持っアルキルである、
Ｒ^１７は、独立してＯＨ、１〜６個の炭素を有するＯ−ｎ−アルキルあるいは２〜６個の炭素を有するＯ−アシルであり、
Ｒ^１８は独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、ＣＯＮＨＣ_６Ｈ_５、ＣＨ_２ＯＨ、ＣＨ_２ＯＣＨ_３、ＣＨ_２ＯＣ（ＣＨ_３）_３、ＣＨ_２ＮＨ_２、ＣＯ_２ＣＨ_３、あるいはＣＯＮＲ^２４Ｒ^２５であり、
Ｒ^２４とＲ^２５は独立して、Ｈ、１〜６個の炭素を有するアルキル、フェニル、あるいは１〜６個の炭素を有するヒドロキシアルキル、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ^２７は独立してアリール、ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−ＯＣＯＲ^９、−ＯＣＯＮＨＲ^９、Ｏ−テトラヒドロピラニル、−ＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＲ^１０ＣＯＲ^９、−ＮＲ^１０ＣＯ_２Ｒ^９、−ＮＲ^１０ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、−ＮＲ^１０ＳＯ_２Ｒ^９、−Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１１、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ^９、−ＣＨ_２ＯＲ^７、−ＣＨ＝ＮＮＲ^１２Ｒ^１３、−ＣＨ＝ＮＯＲ^１１、−ＣＨ＝ＮＲ^９、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＨ（Ｎ＝ＮＨ）ＮＨ_２、−ＳＯ_２ＮＲ^１２Ｒ^１３、−ＰＯ（ＯＲ^１１）_２、あるいは−ＯＲ^１４であり、
Ｒ^２８は，独立して１〜４個の炭素を有するアルキル、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、７〜１０個の炭素を有するアリールアルキル、−（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−（ＣＨ_２）_ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^７Ｒ^８あるいは−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８であり、
Ｒ^２９は独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、７〜１０個の炭素を有するアリールアルキル、−（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−（ＣＨ_２）_ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^７Ｒ^８あるいは−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８であり、
ｐは１〜４までの整数であり、また
ｙは０、１又は２である。

ある他の実施形態では、前記縮合ピロロカルバゾールは、式ＩＩＩの構造を有するものであり、式中、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、各々独立して、Ｈ、フェニル、Ｆ、Ｃｌ、−ＯＲ^１０、−ＮＲ^７Ｒ_８、−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、あるいは１〜８個の炭素を有するアルキルであって、ここで前記アルキル基は選択的に１〜３個のＲ^２７基で置換されているか、あるいはその立体異性体あるいは薬学的に許容できる塩形態である。

式ＩＩＩ化合物の特定の好ましい実施形態において、式ＩＩＩのインドロカルバゾールは実質上、鏡像異性的に純粋である。式ＩＩＩのインドロカルバゾールが実質的に鏡像異性的に純粋である好ましい実施形態において、当該化合物は、以下の構造を有するもの、またはその立体異性体あるいは薬学的に許容できる塩形態であり、

式中、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、Ｒ^６、Ｒ^１７、Ｒ^１８、Ｒ^２８、Ｒ^２９およびＸは、本願明細書に記載の式ＩＩ化合物および式ＩＩＩの実施形態について上述されている通りである。特定の好ましい実施形態において、式ＩＩＩのインドロカルバゾールのＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５、およびＲ^６は、各々Ｈである。

他の実施形態において、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、独立して、Ｈ、Ｃｌ、１〜４個の炭素を有するアルキル、−ＯＲ^１０、ＣＨ_２ＯＲ^１０、ＮＲ^７Ｒ^８、ＣＨ_２ＮＲ７Ｒ^８あるいはＣＯＮＲ^７Ｒ^８であり、
Ｒ^７とＲ^８は独立して、Ｈ又は１〜４個の炭素を有するアルキルであり、
Ｒ^１０は独立して、Ｈ又は１〜４個の炭素を有するアルキルであり、
Ｒ^１７は、独立してＯＨ、あるいは１〜４個の炭素を有するＯ−ｎ−アルキル、
Ｒ^１８は、独立してＨ、ＣＨ_２ＯＨ、ＣＯ_２ＣＨ_３、ＣＯ_２ＣＨ_２ＣＨ_３、ＣＯ_２ＣＨ_２ＣＨ_２ＣＨ_３あるいはＣＯ_２ＣＨ（ＣＨ_３）_２であり、あるいは、
Ｒ^２８は独立してＣＨ_３であり、また、
Ｒ^２９は独立してＨ又はＣＨ_３である、構造である。

式Ｉの化合物のさらなる実施形態で、前記縮合ピロロカルバゾールは、式Ｉ−Ａを有するもの、あるいはその立体異性体あるいは薬学的に許容できる塩形態であり、

式中、
Ｒ^１は独立してＨ、アルキル、フェニル、７〜１０個の炭素を有するアリールアルキル、５〜６員ヘテロアリール、ヘテロアリールアルキル、−ＣＯＲ^９、−ＯＲ^１０、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＲ^７Ｒ^８、−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、あるいは−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８であり、
Ｒ^２は独立してＨ、−ＳＯ_２Ｒ^９、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＲ^９、１〜８個の炭素を有するアルキル、２〜８個の炭素を有するアルケニル、２〜８個の炭素を有するアルキニル、あるいは５〜７個の炭素を有する単糖であって、
前記単糖の各水酸基は、独立して、１〜４個の炭素を有するアルキル、２〜５個の炭素を有するアルキルカルボニルオキシ、あるいは１〜４個の炭素を有するアルコキシと選択的に置換され、また、
前記アルキル、アルケニルあるいはアルキニル基は、１〜３個のＲ^２７基と選択的に置換され、
ここでＸがＣＨＲ^１６かＮＲ^１６である場合、Ｒ^２およびＲ^１６は、選択的に共に結合して、その２および５の位置を経て、連結するフランを形成することができ、ここでこの連結フランの位置２および５は、それぞれＲ^２８とＲ^２９と選択的に置換され、また、連結フランの位置３はＲ^１７とＲ^１８で二置換され、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、Ｈ、フェニル、５〜６員ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＣＦ_３、−ＮＯ_２、−ＯＲ^１０、（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−ＯＣＯＲ^９、−ＯＣＯＮＨＲ^９、−ＣＨ_２ＯＲ^１４、−ＮＲ^７Ｒ_８、−ＮＲ^１０ＣＯＲ_９、−ＮＲ^１０ＣＯ_２Ｒ^９、−ＮＲ^１０ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１１、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＲ^９、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＣＨＯ、−ＣＨ＝ＮＯＲ^１１、−ＣＨ＝ＮＲ^９、−ＣＨ＝ＮＮＲ^１２Ｒ^１３、−（ＣＨ_２）_ｐＳ（Ｏ）_ｙＲ^９、−ＣＨ_２ＳＲ^１５、−ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１４、−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−（ＣＨ_２）_ｐＮＨＲ^１４、１〜８個の炭素を有するアルキル、２〜８個の炭素を有するアルケニル、あるいは２〜８個の炭素を有するアルキニルであり、
前記アルキル、アルケニルあるいはアルキニル基は各々、選択的に１〜３個のＲ^２７基で置換されており、
Ｘは、ＣＨＲ^１６あるいは１〜２個の炭素を有するアルキレンで、選択的に，ＯＨ、＝Ｏ、＝ＮＯＲ^１１、ＯＲ^１１、−ＯＣＯＲ^９、−ＯＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、アリール、アリールアルキル、ヘテロアリール、−ＳＯ_２Ｒ^９、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＲ^９、１〜８個の炭素を有するアルキル、２〜８個の炭素を有するアルケニル、２〜８個の炭素を有するアルキニル、あるいは５〜７個の炭素を有する単糖の少なくとも１つと置換されており、
前記単糖の各水酸基は、独立して、１〜４個の炭素を有するアルキル、２〜５個の炭素を有するアルキルカルボニルオキシ、あるいは１〜４個の炭素を有するアルコキシと選択的に置換されており、さらに、
前記アルキル、アルケニルあるいはアルキニル基は、１〜３個のＲ^２７基と選択的に置換されており、
Ａ^１とＡ^２は、独立して、Ｈ、−ＯＲ^１１、−ＳＲ^１１あるいは−Ｎ（Ｒ^１１）_２であるか、
あるいは、共に結合して、＝Ｏ、＝Ｓあるいは＝ＮＲ^１１である部分を形成し、
Ｂ^１およびＢ^２は、独立して、Ｈ、−ＯＲ^１１、−ＳＲ^１１あるいは−Ｎ（Ｒ^１１）_２であるか、あるいは、共に結合して、＝Ｏ、＝Ｓあるいは＝ＮＲ^１１である部分を形成しており、
但しＡ^１およびＡ^２又はＢ^１およびＢ^２の少なくとも１組が共に結合して＝Ｏを形成し、
Ｒ^７とＲ^８は独立して、Ｈあるいは１〜４個の炭素を有するアルキルであるか、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成しており、
Ｒ^９は独立して、１〜４個の炭素を有するアルキル、アリールあるいはヘテロアリールであり、
Ｒ^１０は独立して、Ｈ又は１〜４個の炭素を有するアルキルであり、
Ｒ^１１は、独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、６〜１０個の炭素を有するアリールあるいはヘテロアリールであり、
Ｒ^１２とＲ^１３は、独立して、Ｈ、アルキル、６〜１０個の炭素を有するアリール、あるいはヘテロアリールであり、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成しており、
Ｒ^１４は独立してカルボキシル基の水酸基が除去された後の、アミノ酸の残基である、
Ｒ^１５は独立して１〜４個の炭素を有するルキルであり、
Ｒ^１６は独立して、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、アリールあるいはヘテロアリールであって、あるいは、ＸがＣＨＲ^１６である場合、Ｒ^２およびＲ^１６は、選択的に共に結合して、２および５の位置を介して連結するフランを形成することが可能であり、前記連結フランの２および５位は、それぞれＲ^２８およびＲ^２９により選択的に置換されており、さらに、前記連結フランの３位はＲ^１７およびＲ^１８で二置換されており、
Ｒ^１７は、独立してＯＨ、１〜６個の炭素を有するＯ−ｎ−アルキルあるいは２〜６個の炭素を有するＯ−アシルであり、
Ｒ^１８は独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、ＣＯＮＨＣ_６Ｈ_５、ＣＨ_２Ｙであって、
ここで、ＹはＯＲ^１９、ＳＯＲ^２０、ＮＲ^２１Ｒ^２２、あるいはＳＲ^２３、Ｎ_３、ＣＯ_２Ｒ^１５、Ｓ−Ｇｌｃ、
ＣＯＮＲ^２４Ｒ^２５、ＣＨ＝ＮＮＨＣＯＮＨ_２、ＣＯＮＨＯＲ^１０、ＣＨ＝ＮＯＲ^１０、ＣＨ＝ＮＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、

、ＣＨ＝ＮＮ（Ｒ^２６）_２、あるいはＣＨ_２ＮＨＣＯＮＨＲ^１６、
あるいは、Ｒ^１７とＲ^１８は、選択的に共に結合して、−ＣＨ_２ＮＨＣＯ_２−、−ＣＨ_２ＯＣ（ＣＨ_３）_２Ｏ−、＝Ｏ、あるいはＣＨ_２Ｎ（ＣＨ_３）ＣＯ_２−を生成し、
Ｒ^１９は、独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、あるいは２〜５個の炭素を有するアシルであり、
Ｒ^２０は、独立して１〜４個の炭素を有するアルキル、アリールあるいは窒素原子を含むヘテロシクロアルキル基であり、
Ｒ^２１とＲ^２２は、独立して、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキル、プロリン、セリン、グリシン、およびリジンあるいは２〜５個の炭素を有するアシルであるが、但しＲ^２１およびＲ^２２のいずれか１つのみがプロリン、セリン、グリシン、リジン、あるいはアシルであり、
Ｒ^２３は、独立してアリール、１〜４個の炭素を有するアルキル、あるいは窒素原子を含むヘテロシクロアルキル基であり、
Ｒ^２４とＲ^２５は独立して、Ｈ、１〜６個の炭素を有するアルキル、フェニル、あるいは１〜６個の炭素を有するヒドロキシアルキル、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ^２６は独立してアリールであり、
Ｒ^２７は独立してアリール、ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−ＯＣＯＲ^９、−ＯＣＯＮＨＲ^９、Ｏ−テトラヒドロピラニル、−ＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＲ^１０ＣＯＲ^９、−ＮＲ^１０ＣＯ_２Ｒ^９、−ＮＲ^１０ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、−ＮＲ^１０ＳＯ_２Ｒ^９、−Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１１、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ^９、−ＣＨ_２ＯＲ^７、−ＣＨ＝ＮＮＲ^１２Ｒ^１３、−ＣＨ＝ＮＯＲ^１１、−ＣＨ＝ＮＲ^９、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＨ（Ｎ＝ＮＨ）ＮＨ_２、−ＳＯ_２ＮＲ^１２Ｒ^１３、−ＰＯ（ＯＲ^１１）_２、あるいは−ＯＲ^１４であり、
Ｒ^２８は，独立して１〜４個の炭素を有するアルキル、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、７〜１０個の炭素を有するアリールアルキル、−（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−（ＣＨ_２）_ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^７Ｒ^８あるいは−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８であり、
Ｒ^２９は独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、１〜４個の炭素を有するアルコキシ、７〜１０個の炭素を有するアリールアルキル、−（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−（ＣＨ_２）_ｐＯＣ（＝Ｏ）ＮＲ^７Ｒ^８あるいは−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８であり、
ｐは１〜４の整数であり、また
ｙは０、１又は２である。

式Ｉ−Ａ化合物の特定の実施形態において、当該化合物は次の構造を有するものであり、

式中、
Ｒ^２は、独立してＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＲ^９、１〜４個の炭素を有するアルキルであって、ここでアルキル基は、選択的に１〜３個のＲ^２７と置換されており、
Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は独立して、Ｈ、フェニル、Ｃｌ、−ＯＲ^１０、（ＣＨ_２）_ｐＯＲ^１０、−ＮＲ^７Ｒ_８、−（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、あるいは１〜６個の炭素を有するアルキルであり、
前記アルキル基は選択的に１〜３個のＲ^２７基と置換されており、
Ｒ^７とＲ^８は独立して、Ｈあるいは１〜４個の炭素を有するアルキルであるか、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成し、
Ｒ^９は独立して１〜４個の炭素を有するアルキル、アリールあるいはヘテロアリールであり、
Ｒ^１０は独立してＨ又は１〜４個の炭素を有するアルキルであり、
Ｒ^１１は、独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキル、６〜１０個の炭素を有するアリール、あるいはヘテロアリールであり、
Ｒ^１２とＲ^１３は、独立して、Ｈ、アルキル、６〜１０個の炭素を有するアリール、あるいはヘテロアリールであり、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜７員のヘテロシクロアルキルを形成しており、
Ｒ^１４は独立してカルボキシル基の水酸基が除去された後の、アミノ酸の残基であり、
Ｒ^１６は独立して、Ｈ、１〜４個の炭素を有するアルキルであり、
Ｒ^２７は独立してアリール、ヘテロアリール、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＣＮ、−ＮＯ_２、−ＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−ＯＣＯＲ^９、−ＯＣＯＮＨＲ^９、Ｏ−テトラヒドロピラニル、−ＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＲ^１０ＣＯＲ^９、−ＮＲ^１０ＣＯ_２Ｒ^９、−ＮＲ^１０ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＨＣ（＝ＮＨ）ＮＨ_２、−ＮＲ^１０ＳＯ_２Ｒ^９、−Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１１、−ＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＣＨＯ、−ＣＯＲ^９、−ＣＨ_２ＯＲ^７、−ＣＨ＝ＮＮＲ^１２Ｒ^１３、−ＣＨ＝ＮＯＲ^１１、−ＣＨ＝ＮＲ^９、−ＣＨ＝ＮＮＨＣＨ（Ｎ＝ＮＨ）ＮＨ_２、−ＳＯ_２ＮＲ^１２Ｒ^１３、−ＰＯ（ＯＲ^１１）_２、あるいは−ＯＲ^１４であり、
ｐは１〜４までの整数であり、また
ｙは０、１又は２である。

式Ｉ−Ａ化合物の他の実施形態において、当該化合物は次の構造を有するものであり、

式中、
Ｒ^２は、独立してＣＯ_２Ｒ^９、−ＣＯＲ^９、１〜４個の炭素を有するアルキルであり、ここで、アルキル基は、選択的に１〜３個のＲ^２７と置換され、
Ｒ^７およびＲ^８は独立して、Ｈあるいは１〜４個の炭素を有するアルキルであるか、あるいは、それらが結合している窒素と共に、５〜６員のヘテロシクロアルキルを形成しており、選択的に更なる環窒素原子を含み、
Ｒ^９は独立して１〜４個の炭素を有するアルキル、あるいはフェニルであり、
Ｒ^１０は独立して、Ｈ又は１〜４個の炭素を有するアルキルであり、
Ｒ^１１は、独立してＨ、１〜４個の炭素を有するアルキルであり、
Ｒ^１４は独立してカルボキシル基の水酸基が除去された後の、アミノ酸の残基であリ、
Ｒ^２７は独立してフェニル、５〜６員ヘテロアリール、−ＯＲ^１０、−Ｏ（ＣＨ_２）_ｐＮＲ^７Ｒ^８、−ＯＣＯＲ^９、−ＯＣＯＮＨＲ^９、Ｏ−テトラヒドロピラニル、−ＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＲ^１０ＣＯＲ^９、−ＮＲ^１０ＣＯ_２Ｒ^９、−ＮＲ^１０ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＮＲ^１０ＳＯ_２Ｒ^９、−Ｓ（Ｏ）_ｙＲ^１１、−ＣＯＮＲ^７Ｒ^８、−ＣＯＲ^９、−ＣＨ_２ＯＲ^７、あるいは−ＯＲ^１４であり、
ｐは１〜４の整数であり、また
ｙは０、１又は２である。

本発明の範囲内の縮合ピロロカルバゾール類は、式ＩＶでも示される。好ましい式ＩＶ誘導体は今後、化合物包括的に、ＩＶ−１〜ＩＶ−４と称する。式ＩＶによって示されるこの機能的な誘導体は以下のもの、あるいはその立体異性体あるいは薬学的に許容できる塩形態であり、

式中、
（ａ）Ｒ^２およびＲ^１６は各々独立して、Ｈ、１〜６個の炭素を有するアルキル、１〜３個の炭素を有するヒドロキシアルキル、および３〜６個の炭素を有するアルケニルから成る群から選択されるものであり、但しＲ^２およびＲ^１６の両方がＨではなく、
（ｂ）Ａ^１およびＡ^２はいずれも水素であり、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は各々独立してＨであり、あるいは、そのうち最大２個が、Ｆ、Ｃｌ、Ｂｒ、Ｉ、−ＮＯ_２、ＣＮ，あるいはＯＨ、ＮＨＣＯＮＨＲ^７であり、Ｒ^７が１〜４個の炭素を有するアルキルであり、但しＲ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６のうち１個だけがＮＨＣＯＮＨＲ^７、ＣＨ_２ＯＲ^１０、１〜４個の炭素を有するアルキル、ＣＨ_２ＯＣＯＮＨＣ_２Ｈ_５、あるいはＮＨＣＯ_２ＣＨ_３であり、
（ｃ）Ａ^１およびＡ^２の両者共に結合して、Ｏを表わす場合、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、各々水素である。

本発明の様々な方法のいずれにおいても使用される好ましい式ＩＶ化合物は、表１の化合物のＩＶ−１〜ＩＶ−４であって、以下のように置換されている。

本発明は、以下の式Ｖで表わされる化合物も特徴としており、

Ｒ^５がハロゲン、ＣＨ_２ＯＣＯＮＨＲ^１４あるいはＮＨＣＯ_２Ｒ^１４（Ｒ^１４は、より低級アルキルを表わす）を示し、Ｒ^３は水素又はハロゲンを示し、また、ＸはＣＯ_２ＣＨ_３、ＣＨ_２ＯＨあるいはＣＯＮＨＲ^１５（Ｒ^１５は、水素、水酸基置の低級アルキル、あるいはアリール）を示すが、但しＲ^５＝ハロゲン、Ｒ^３＝水素、およびＸ＝ＣＯ_２ＣＨ_３あるいはＣＨ_２ＯＨとの組み合わせ、Ｒ^５＝Ｒ^３＝ハロゲンおよびＸ＝ＣＯ_２ＣＨ_３との組み合わせ、およびＲ^５＝Ｒ^３＝ＢｒおよびＸ＝ＣＯＮＨＣ_６Ｈ_５との組み合わせは除外する。式Ｖの化合物の立体異性体および薬学的に許容できる塩類は、本発明の方法における使用に好適である。

特定の実施形態において、縮合ピロロカルバゾールは、式ＶＩの構造を有し、

Ｘは、ＣＨ_２Ｓ（Ｏ）Ｒ^１６（Ｒ^１６は、アリールあるいは窒素原子を含む複素環の基）、ＣＨ_２ＳＲ^１６、ＣＨ＝ＮＮ（Ｒ^１７）_２（Ｒ^１７は、アリールを表わす）、ＣＨ_２ＮＨＣＯＮＨＲ^１８（Ｒ^１８は、低級アルキルあるいはアリールを示す）、あるいはＣＨ_２ＣＯ_２ＣＨ_３を表わす。式ＶＩの化合物の立体異性体および薬学的に許容できる塩類は、本発明の方法における使用に好適である。

本発明は、以下の式ＶＩＩによって示される化合物も特徴としており、

Ｒ^２およびＲ^１６のいずれか１つが水素であり、一方はアリール、あるいは、それらは両方ともアリール、あるいはその薬学的に許容できる塩である。

前記縮合ピロロカルバゾールは、式ＶＩＩＩの構造をを有する化合物であってもよく、

Ｒ^５は、ＣＨ（ＳＣ_６Ｈ_５）２、ＣＨ（−ＳＣＨ_２ＣＨ_２Ｓ−）、ＣＨ_２ＳＲ^２４（Ｒ^２４はベンズイミダゾ−ル−２−イル、フルフリル、２−ジメチルアミノエチル、あるいは１Ｈ−１、２、４−トリアゾ−ル−３−イルを表わし）、あるいはＣＨ＝ＮＲ^２５（Ｒ^２５はピロリジン−１−イル、ピリジン−２−イルアミノ、グアニジノ、モ−フォリノ、ジメチルアミノ、あるいは４−メチルピペラジン−１−イルを表わし）、あるいはその薬学的に許容できる塩を表わす。

他の好ましい実施形態において、前記縮合ピロロカルバゾールは以下のとおりであり、

さらに好ましくは、上記の縮合ピロロカルバゾールは、実質的に鏡像異性的に純粋である。さらなる実施形態において、縮合ピロロカルバゾールは以下のとおりである。

本願明細書において使用されるように、前記構造を有する化合物は「ＣＥＰ−７０１」と称する。

本発明の方法において使用される縮合ピロロカルバゾール類は、個々にあるいは組み合わせて薬学的に許容可能である、無毒な賦形剤および担体と混和することにより薬剤組成物に調剤できる。そのような組成物は、特に液体溶液あるいは懸濁液の形態において非経口投与用に、特に液体、錠剤、あるいはカプセルの形態において経口投与用に、あるいは、特に粉末、点鼻剤、あるいはエアロゾルの形態において鼻腔内投与用に調製可能である。

前記組成物は、単位投薬形態で簡便に投与でき、当該周知技術のいかなる方法によって調製可能である。そのような方法は、例えば、Ｒｅｍｉｎｇｔｏｎ’ｓＰｈａｒｍａｃｅｕｔｉｃａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ（ＭａｃｋＰｕｂ．Ｃｏ．，ペンシルバニア州Ｅａｓｔｏｎ，１９８０）に記載されている。

経口投与用の液体投薬形態は、薬学的に許容可能な乳剤、マイクロエマルジョン、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル剤を含む。活性化合物に加えて、前記液体投薬形態は、例えば、水、あるいは、エチルアルコ−ル、イソプロピルアルコ−ル、炭酸エチル、酢酸エチル、ベンジルアルコ−ル、安息香酸ベンジル、プロピレングリコ−ル、１，３−ブチレングリコ−ル、ジメチルフォルムアミド、油類（特に、綿実油、落花生油、トウモロコシ油、胚芽油、オリ−ブ油、蓖麻子油、および胡麻油）、グリセリン、テトラヒドロフルフリルアルコ−ル、ポリエチレングリコ−ル類およびソルビタンの脂肪酸エステル、およびこれ等の混合物のような他の溶剤、可溶化剤および乳化剤のような、当該技術で一般に使用される不活性希釈剤を含むものであっても良い。不活性希釈剤の他に、経口剤組成は、湿潤剤、乳化剤および懸濁剤のような補助剤、甘味料、香味剤および芳香剤も含むものであっても良い。

経口投与用の固形投薬形態は、カプセル、錠剤、丸薬、粉末、パウダ−および顆粒を含む。そのような固形投薬形態では、前記活性化合物は、クエン酸ナトリウムあるいは第二リン酸カルシウムのような、少なくとも１種の不活性な、薬学的に許容できる賦形剤あるいは担体および／あるいは（ａ）澱粉、乳糖、蔗糖、葡萄糖、マンニト−ル、およびケイ酸のような充填剤あるいは増量剤、（ｂ）例えばカルボキシメチルセルロース、アルギン、ゼラチン、ポリビニ−ルピロリジノン、蔗糖、およびアカシアのようなバインダ−、（ｃ）グリセリンのような保湿剤、（ｄ）寒天、炭酸カルシウム、ジャガイモあるいはタピオカ澱粉、アルギン酸、ある種のケイ酸塩、および炭酸ナトリウムのような崩壊剤、（ｅ）パラフィンのような溶解遅延剤、（ｆ）第四アンモニウム化合物のような吸収促進剤、（ｇ）例えばセチルアルコ−ルおよびグリセロ−ルモノステアレ−トのような湿潤剤、（ｈ）カオリンおよびベントナイト粘土のような吸収剤、そして（ｉ）タルク、ステアリン酸カルシウム、ステアリン酸マグネシウム、固形ポリエチレングリコ−ル、ラウリル硫酸ナトリウムおよびこれらの混合物のような潤滑剤と混和される。カプセル、錠剤、および丸薬の場合には、投薬形態は、さらに緩衝剤を含んでもよい。同様のタイプの固形組成物も、高分子量ポリエチレングリコ−ル等と同様にラクト−ゼ、つまり乳糖のような賦形剤を使用して、軟質および硬質−充填ゼラチン・カプセル内に充填剤として使用してもよい。

前記活性化合物は、上述したように１又はそれ以上の賦形剤を用いてマイクロカプセル化した形態に入れることもできる。固形投薬形態では、前記活性化合物は、蔗糖、乳糖あるいは澱粉ような少なくとも１種の不活性希釈剤と混和してもよい。通常の慣行通り、そのような投薬形態は、さらに不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、ステアリン酸マグネシウムおよび微結晶性セルロースのような製錠潤滑剤およびその他の製錠助剤を含んでもよい。カプセル、錠剤および丸薬の場合には、投薬形態がさらに緩衝剤を含んでもよい。これらの形態は、選択的に乳白剤を含み、また活性成分を腸管のある部分中だけに、あるいは優先して、選択的に遅延放出する組成であり得る。使用可能な包埋剤組成の例は重合体物質およびワックスを含む。

本発明の化合物の最適投薬量は、骨髄増殖性疾患のタイプおよび進行程度、患者の全般健康状態、患者の年齢および体重、当該化合物の効能、および投与経路のような要因に依存して変わることがある。この化合物の投薬量の最適化は当業者の技術分野の内にあり、本明細書で提供する範囲内の値は、その範囲以内にあるすべての値を含む。本発明の方法で使用される調剤中の活性成分は、血漿中の濃度が約１〜約２０μＭである場合、この範囲内のどんな値でも有効であり、２、３、４、５、６、７、８、９、１０、１１、１２、１３、１４、１５、１６、１７、１８および１９μＭを含むがこれらに限定されない。好ましい実施形態では、血漿中のこの化合物濃度が約５〜１５μＭに到達するように投与される。他の好ましい実施形態では、血漿中のこの化合物濃度が約７．５〜１５μＭに到達するように投与される。

本発明のある実施形態において、前記化合物の投薬量は、１日当たり約２００μｇ〜約１ｇ／ｋｇ体重である。さらに好ましくは、該化合物の投薬量は、１日当たり約２５０μｇ〜約３ｍｇ／体重ｋｇである。さらに好ましくは、該化合物の投薬量は、１日当たり約０．５ｍｇ〜約２．３ｍｇ／体重ｋｇである。さらに好ましくは、該化合物の投薬量は、１日当たり約０．８ｍｇ〜約１３ｍｇ／体重ｋｇである。

特定の実施形態において、平均成人（約７０ｋｇ）の一日用量は、約２０ｍｇ〜約３００ｍｇ、あるいは約４０ｍｇ〜約２５０ｍｇ、あるいは約４０ｍｇ〜約１００ｍｇである。さらに好ましくは、一日用量は、約８０ｍｇ〜約１６０ｍｇである。一日用量は、通常一日に一回、一日に二回、一日に三回、あるいは一日に四回投与できる。特定の実施形態において、投与法は、一日に二回約２０〜約１２０ｍｇである。他の実施形態においては、一日に二回約２０〜約１００ｍｇである。さらなる実施形態において、用量は、一日に二度約６０〜約８０ｍｇである。

本発明の方法において、治療量のＪＡＫ２阻害剤を投与すると、多くの他の蛋白質の活性は、ＪＡＫ２阻害剤の存在下、ＪＡＫ２阻害剤がない場合のこの他の蛋白質の活性より小さくなる。これらの他の蛋白質は、例えば次の多くの蛋白質、ＪＡＫ２、ＳＴＡＴ５、ＳＴＡＴ３、ＳＨＰ２、ＧＡＢ２、ＡＫＴ、およびＥＲＫである。

本発明は、以下の実施例によってさらに説明される。こらの実施例は、説明のために提供するものであり、決して本発明の範囲あるいは内容の限定として解釈されるべきではない。

患者の細胞および細胞株
ＨＥＬ９２．１．７ヒトの赤白血病細胞株ＨＥＬ９２．１．７は、ＡＴＣＣ（ＴＩＢ−１８０）から購入し、推奨されているように、細胞は、１．５ｇ／Ｌの重炭酸ナトリウム、４．５ｇ／Ｌのグルコ−ス、１０ｍＭのＨＥＰＥＳおよび１．０ｍＭのピルビン酸ナトリウム塩およびウシ胎児血清１０％を含有するよう調整した、２ｍＭＬ−グルタミン含有ＲＰＭＩ１６４０培地で培養した。ＣＥＰ−７０１あるいは賦形剤を完全培地に加え、示されたように培養した。

ＣＤ３４＋末梢血は、インフォ−ムド・コンセント後にｔｈｅＵｎｉｖｅｒｓｉｔｙｏｆＰｅｎｎｓｙｌｖａｎｉａＣａｎｃｅｒＣｅｎｔｅｒでＭＰＤｓ（骨髄増殖性疾患）と診断された患者から収集した。血球はＦｉｃｏｌｌ勾配遠心分離（Ｐｈａｒｍａｃｉａ）で分離した。単核細胞層を採取し、洗浄した。単核細胞は反ＣＤ３４免疫磁性ビ−ズと共に培養し、ＣＤ３４＋細胞を磁気細胞分離システム（ｍａｇｎｅｔｉｃｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ）ＡｕｔｏＭａｃｓ（ＭｉｌｔｅｎｙｉＢｉｏｔｅｃｈ，ビ−ズおよび装置のプロトコルは、すべてメ−カ−の推奨による）を使用して精製した。ＣＤ３４＋細胞を洗浄し、計数した。細胞は、新鮮なまま、あるいは１０％ＤＭＳＯ中凍結生存細胞として使用した。ＣＤ３４＋細胞は、２０％血清代替物（ＢＩＴ９５００，ＳｔｅｍＣｅｌｌＴｅｃｈｎｏｌｏｇｉｅｓ，Ｖａｎｃｏｕｖｅｒ）含有ＩＭＤＭ培地で培養した。細胞は，最初の増幅（ｅｘｐａｎｓｉｏｎ）のために，３〜５日間幹細胞因子，インタ−ロイキン６およびインタ−ロイキン３と培養した。最初の培養後、エリスロポエチン（赤血球生成促進因子）を培養メディアに加えた。細胞はさらに、適切な細胞が実験に利用可能になるまで、２〜５日間増幅（ｅｘｐｎｄｅｄ）した。サイトカイニンはすべてＲ&ＤＳｙｓｔｅｍｓから取得した。

慢性の特発性骨髄線維症（ＣＩＭＦ）患者は，上記のＰＣＲおよびＲｅｓｔｒｉｃｔｉｏｎＤｉｇｅｓｔ（制限消化法）を使用して遺伝子型決定をした。患者＃６４８と＃６５０は、対立遺伝子に特有のＰＣＲ（図１２）およびＢｓａＸＩ消化（図１３）で図示のように，Ｖ６１７Ｆ変異を保有することが見出された。図１４では、ＳＣＬＰＣＲ産物をコントロ−ルとして使用した。ＢｓａＸＩで消化すると、４９６ｂｐのＳＣＬ産物は、３５６ｂｐ、１１０ｂｐおよび３０ｂｐ断片に切断される。

ＣＥＰ−７０１によるＪＡＫ２キナ−ゼ活性の阻害
ＣＥＰ−７０１がバキュロウイルス（ｂａｃｕｌｏｖｉｒｕｓ）で発現したＪＡＫ２のキナ−ゼ活性を阻害する能力を、時間分解蛍光（ｔｉｍｅ−ｒｅｓｏｌｖｅｄｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅ：ＴＲＦ）検知を用いるマイクロタイタ−プレ−ト・アッセイでテストした。

９６−ウエルのＣｏｓｔａｒ高結合プレ−ト（ＣｏｒｎｉｎｇＣｏｓｔａｒ＃３９２２、ニュ−ヨ−ク州コ−ニング）を先ず、３７℃で，１０μｇ／ｍＬニュ−トラビジン（Ｎｅｕｔｒａｖｉｄｉｎ）（Ｐｉｅｒｃｅ＃３１０００、イリノイ州ロックフォ−ド）入りＴｒｉｓバッファ−食塩水（ＴＢＳ）を１００μＬ／ウエル当たり２時間塗布して、次いで３７℃で１μｇ／ｍＬ１５−ｍｅｒペプチド基質（ｂｉｏｔｉｎｙｌ−ａｍｉｎｏ−ｈｅｘａｎｏｙｌ−ＥＱＥＤＥＰＥＧＤＹＦＥＷＬＥ−ａｍｉｄｅ，ＩｎｆｉｎｉｔｙＢｉｏｔｅｃｈＲｅｓｅａｒｃｈａｎｄＲｅｓｏｕｒｃｅ，ペンシルバニア州、Ａｓｔｏｎ）を１００μＬ／ウエル当たり更に１時間塗布した。その後２０ｍＭＨＥＰＥＳ（ｐＨ７．２）、０．２μＭＡＴＰ，１ｍＭＭｎＣｌ_２、０．１％血清アルブミン（ＢＳＡ）、および異なった濃度のＣＥＰ−７０１（ＤＭＳＯで希釈、最終アッセイ、２．５％ＤＭＳＯ）からなるＪＡＫ２アッセイ混合物（合計容積＝１００μＬ／ウエル当たり）を分析プレ−トに添加した。酵素（１５ｎｇ／ｍｌＪＡＫ２、ロット＃ＪＡＫ２［３１８］、ＪＡ２−２．１）を添加し、２０分間室温で反応させた。リン酸化産物は、０．０５％のＴｗｅｅｎ２０および０．２５％のＢＳＡを含有するＴＢＳで１：５０００に希釈した、Ｅｕ−Ｎ１標識ＰＹ１００抗体（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ＃ＡＤ００４１、マサチュ−セッツ州、ボストン）を１００μＬ／ウエル当たり添加して検知した。その後、室温で培養を１時間行い、次いで１００μＬの増強液（ｅｎｈａｎｃｅｍｅｎｔｓｏｌｕｔｉｏｎ）（ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＬｉｆｅＳｃｉｅｎｃｅｓ＃１２４４−１０５，マサチュ−セッツ州、ボストン）を添加した。プレ−トを緩やかにゆり動かし、３０分後に、生じた溶液の蛍光を、ＰｅｒｋｉｎＥｌｍｅｒＥｎＶｉｓｉｏｎ２１００（あるいは２１０２）多重ラベル・プレ−ト・リ−ダを使用して測定した。阻害カ−ブは複数作成し，阻害率％対化合物濃度のｌｏｇ１０としてプロットした。デ−タを、次のようにグラフパッド・プリズム（ＧｒａｐｈＰａｄＰｒｉｓｍ）ソフトで、Ｓ字形の用量応答（勾配変化のある法面）方程式にフィットさせて非線形回帰分析した：

ｙ＝ｂｏｔｔｏｍ＋（ｔｏｐ−ｂｏｔｔｏｍ）／（１＋１０（ｌｏｇＩＣ５０−ｘ）＊Ｈｉｌｌｓｌｏｐｅ）

ここで、ｙは、与えられた化合物濃度における％阻害率、ｘは化合物濃度の対数、ｂｏｔｔｏｍは，テストした化合物の最低濃度における％阻害率、およびｔｏｐはテストした化合物の最高濃度における％阻害率である。ｂｏｔｔｏｍ値とｔｏｐ値は、それぞれ０と１００に固定した。個々のカ−ブからのＩＣ５０値を平均し，平均ＩＣ５０値として報告した。ＣＥＰ−７０１濃度対ＪＡＫ２活性をプロットし（図１）。ＣＥＰ−７０１は０．９±０．２ｎＭのＩＣ５０値を持つことが示された。

Ａ．Ｖａｌ６１７Ｐｈｅ変異体に対する対立遺伝子特異的なＰＣＲ
細胞株および患者検体の遺伝子型決定は、Ｂａｘｔｅｒ，Ｅ．Ｊ．ら（２００５） "ＡｃｑｕｉｒｅｄｍｕｔａｔｉｏｎｏｆｔｈｅｔｙｒｏｓｉｎｅｋｉｎａｓｅＪＡＫ２ｉｎｈｕｍａｎｍｙｅｌｏｐｒｏｌｉｆｅｒａｔｉｖｅｄｉｓｏｒｄｅｒｓ" Ｌａｎｃｅｔ３６５：１０５４−１０６１に記載のように、実施した。

対立遺伝子特異的なＰＣＲおよび制限酵素分析を含む二組の手段を使用してＶ６１７Ｆ変異状態を定めた。患者のＤＮＡは、別記の無い限りメ−カ−の指示に従って、顆粒細胞又は単核細胞からＷｉｚａｒｄＧｅｎｏｍｉｃＤＮＡＰｕｒｉｆｉｃａｔｉｏｎＫｉｔ（Ｐｒｏｍｅｇａ）を使用して調製した。ＰＣＲ反応は、別記の無い限りメ−カ−の指示に従って、Ｐｒｏｍｅｇａ社のＰＣＲＣｏｒｅＫｉｔを使用して行なった。

簡潔に言えば、ＤＮＡ８０〜２００ｎｇを、通常の逆方向プライマ−（５’−ｃｔｇａａｔａｇｔｃｃｔａｃａｇｔｇｔｔｔｔｃａｇｔｔｔｃａ−３’）（配列ＩＤ番号：１）および２種の正方向プライマ−を使用して、ＰＣＲ反応（アニ−ル温度５８℃、３８〜４４サイクル）で増幅した。第１の［正方向プライマ−］は、変異体特異的なプライマ−（５’−ａｇｃａｔｔｔｇｇｔｔｔｔａａａｔｔａｔｇｇａｇｔａｔａｔｔ−３’）（配列ＩＤ番号：２）であって、特異性を改善するためにその３’末端から３番目のヌクレオチドに故意のミスマッチを含み、Ｖ６１７Ｆ変異の存在を示す２０３ｂｐ産物を産生するものである。第２の正方向プライマ−（５‘−ａｔｃｔａｔａｇｔｃａｔｇｃｔｇａａａｇｔａｇｇａｇａａａｇ−３’）（配列ＩＤ番号：３）は、変異および野生の対立遺伝子由来の３６４ｂｐ断片を増幅し、内部コントロ−ルとして役立つ。この結果は、図２（パネルＡ）に示す。両方のＨＥＬ９２検体は、変異体対立遺伝子由来の２０３ｂｐ産物と同様に前記内部コントロ−ルの増幅も示す。Ｋ５６２は、野生型のコントロ−ルとして役立った。

Ｂ．ＪＡＫ２遺伝子型の制限酵素に基づくアッセイ
Ｖ６１７Ｆの置換を起こすＧ→Ｔ変異は、野生型体ＪＡＫ２中の制限酵素ＢｓａＸＩ制限部位を除去する。したがって、ＢｓａＸＩに対する耐性はＣを識別するのである。

細胞株および患者検体中の変異の存在を評価するために、ＪＡＫ２の６１７（番目の）位置を包含するゲノムのＤＮＡ２００ｎｇを、正方向プライマ−（５’−ｇｇｇｔｔｔｃｃｔｃａｇａａｃｇｔｔｇａ−３’）（配列ＩＤ番号：４）および逆方向プライマ−（５’−ｔｃａｔｔｇｃｔｔｔｃｃｔｔｔｔｔｃａｃａａ−３’）（配列ＩＤ番号：５）を使用して、ＰＣＲ（５７℃、４０〜４４サイクル）で増幅した。生じた４６０ｂｐ断片は、３〜４時間ＢＳＡＸＩで消化し、２％アガロ−スゲルで分析した。野生型対立遺伝子は、２４１ｂｐ、１８９ｂｐ、３１ｂｐの断片を産生するが、変異対立遺伝子は変化しない。ＨＥＬ９２細胞由来の増幅ＤＮＡ断片は、ＢｓａＸＩによる消化に耐性があったが、その一方でＫ５６２由来の増幅ＤＮＡ断片はＢｓａＸＩで完全に消化した。該消化の完了程度をコントロ−ルするため、ＢｓａＸＩサイトを含有するヒトのＳＬＣ遺伝子由来のＤＮＡ断片を増幅し、ＢｓａＸＩで消化した。正方向（５’ −ｔｃｃｔｇｇｇｇｔｃｔｔｃｔｇｔｃｔｔｇ−３’）（配列ＩＤ番号：６）プライマ−および逆方向（５’−ｃｃｔｇａｇａｇｇｃａａｔｇｇｇａｇｔａ−３’）（配列ＩＤ番号：７）プライマ−で４９６ｂｐＳＬＣ産物を増幅し、消化して３５６ｂｐ、１１０ｂｐおよび３０ｂｐ断片を生じた。結果は図２（パネルＢ）に示す。

ＣＥＰ−７０１の細胞増殖に対する影響
精製し、増幅したＣＤ３４＋細胞を計数し、ＸＴＴアッセイ用９６ウエル・プレ−トに入れた。細胞は、ＪＡＫ２阻害剤あるいは賦形剤のいずれかで２４〜７２時間処理し、相対細胞生存率をＸＴＴ試薬（ＭｏｌｅｃｕｌａｒＰｒｏｂｅｓ）を使用して、メ−カ−の推奨通りにアッセイした。

９６ウエル・プレ−トに入れたＨＥＬ９２．１．７細胞（２ｘ１０^４／ウェル）をＣＥＰ−７０１あるいは賦形剤で処理し、細胞生存率をＭＴＳ試薬（Ｐｒｏｍｅｇａ）で推奨通りにアッセイした。

細胞生存率は、ＣＥＰ−７０１（図４、パネルＡ〜Ｄ））で処理したＨＥＬ９２．１．７細胞に就いて評価した。パネルＡで、細胞は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下、培養２４時間後、ＣＥＰ−７０１で処理して、この薬剤で処理しない場合の生存率に比して評価した。ＣＥＰ−７０１は、細胞生存率を約５０％（ＣＥＰ−７０１、３．０μＭで処理）までに低下させた。パネルＢでは、細胞は、ウシ胎児血清（ＦＢＳ）の存在下、培養４８時間後、ＣＥＰ−７０１で処理して、薬剤処理なしの場合の生存率に比して評価した。ＣＥＰ−７０１は、細胞生存率を約２５％（ＣＥＰ−７０１、３．０μＭで処理）までに低下させた。パネルＣで、細胞は、ＦＢＳ不在で、ＣＥＰ−７０１で培養２４時間後に評価された。ＣＥＰ−７０１は、パネルＡのそれに似たパタ−ンで、細胞生存率を約５０％（ＣＥＰ−７０１、３．０μＭで処理）までに低下させた。パネルＤでは、細胞は、ＦＢＳ不在でＣＥＰ−７０１で培養４８時間後評価した。ＣＥＰ−７０１は、パネルＢのそれに似たパタ−ンで、細胞生存率を約２５％（ＣＥＰ−７０１、３．０μＭで処理）までに低下させた。

図５は、ＣＥＰ−７０１を２４時間おきに補充しながら、ウシ胎仔血清（ＦＣＳ）存在下に増殖させたＨＥＬ細胞の生存率に対する、この薬剤の影響を示す。この実験では、ＨＥＬ９２．１．７細胞を７２時間薬剤に接触し、ＭＴＳアッセイで生存率を評価した。ＣＥＰ−７０１（１．０ μＭＣＥＰ−７０１）は、細胞生存率を５％未満にまで低下させた。
このＭＴＳアッセイは、ＣＥＰ−７０１がＶ６１７Ｆ変異を有するＨＥＬ９２細胞の増殖を阻害することを示す。

図６は、ヒストン／ＤＮＡリリ−ス・アッセイによって測定したＨＥＬ９２細胞のアポト−シスの誘導に対するＣＥＰ−７０１の影響を示す。このアッセイは、ＣＥＰ−７０１がアポト−シスを引き起こしたことを示している。

信号伝達経路に対するＣＥＰ−７０１の影響の分析
信号伝達経路に対するＣＥＰ−７０１の影響は、特異抗体および細胞株並びに培養した患者の検体から調製した全細胞抽出液を用い、免疫沈殿および／又はウェスタンブロットによって評価した。全細胞抽出物は、プロテアーゼ阻害剤（ＣｏｍｐｌｅｔｅＭｉｎｉ，ＲｏｃｈｅＤｉａｇｎｏｓｔｉｃ）を添加した溶菌バッファ−：（２０ｍＭＴｒｉｓ−ＨＣｌ（ｐＨ７．５）、１５０ｍＭＮａＣｌ、１ｍＭＮａ_２ＥＤＴＡ、１ｍＭＥＧＴＡ、１％Ｔｒｉｔｏｎ、２．５ｍＭピロリン酸塩ナトリウム、１ｍＭβ−グリセロリン酸塩、１ｍＮａ_３ＶＯ_４、１μｇ／ｍｌロイペプチン）中で調製された。蛋白質濃度が測定され、等しい量（１０〜３０μｇ／レ−ン）をＳＤＳ−ＰＡＧＥゲル上で分離した。蛋白質はニトロセルロ−ス・フィルタに転送され、また、発現および／又はリン酸化の程度は、メ−カ−の推奨通り、特異抗体を使用して評価した。ブロットは、メ−カ−の指示通り、ＳｕｐｅｒｓｉｇｎａｌＷｅｓｔＰｉｃｏＳｙｓｔｅｍ（Ｐｉｅｒｃｅ）を使用して展開した。ＪＡＫ２の活性化は免疫沈殿／ウェスタンブロット・プロトコルによって決定した。

簡潔に述べれば、ＪＡＫ２は、２５０μｇの抽出物から、ＩｍｍｕｎｏｐｒｅｃｉｐｉｔａｔｉｏｎＳｔａｒｔｅｒＰａｃｋ（ＡｍｅｒｓｈａｍＢｉｏｓｃｉｅｎｃｅｓ）を使用して推奨通りにＪＡＫ２抗体で免疫沈殿させた。ウェスタンブロッティングに続いて、ＪＡＫ２のチロシンリン酸化を、抗リン酸化チロシン（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）特異抗体（４Ｇ１０）（Ｕｐｓｔａｔｅ）による試験で評価した。

図３のパネルＡは、ＣＥＰ−７０１（０．１〜３．０μＭＣＥＰ−７０１）の濃度を高めた場合の、ＳＴＡＴ５のリン酸化に対する、用量依存の阻害を示す。パネルＢは、ＣＥＰ−７０１濃度（０．０３〜１．０μＭ）を高めた場合の、ＪＡＫ２およびＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害を示す。パネルＢは、さらにＢｃｌＸＬ（ＪＡＫ２／ＳＴＡＴ５シグナル伝達の下流のエフェクタ−）の発現に対する、用量依存の阻害を示す。

図７は、ＣＥＰ−７０１濃度を高めて、１．０，１．５、および２．５時間接触させた後のＳＴＡＴ５のリン酸化の阻害を示す。５組の実験の阻害平均は下段に示してある。ＨＥＬ９２．１．７細胞のＳＴＡＴ５阻害のＩＣ_５０は約１０ｎＭで、これは、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴシグナル伝達に対して臨床的に意味ある抑制を意味する筈である。

図８は、ＣＥＰ−７０１濃度を高めて、０，１．５、および２．５時間接触させた後のＳＴＡＴ３のリン酸化の阻害を示す。５組の実験の阻害平均は下段に示す。ＨＥＬ９２．１．７細胞のＳＴＡＴ３阻害のＩＣ_５０は約１０ｎＭで、これは、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴシグナル伝達に対する臨床的に意味ある抑制を意味する筈である。

図９は、ＨＥＬ９２細胞におけるＳＴＡＴ５活性のＣＥＰ−７０１−媒介阻害に対するα１−ＡＧＰの影響を示す。図９に図示のように、１．０ｍｇ／ｍｌのα１−ＡＧＰで、ＳＴＡＴ５阻害のＩＣ_５０を３μＭにシフトした。これらの濃度は、例えば、８０ｍｇ用量計画で容易に、インビボで達成可能である。

ＨＥＬ９２腫瘍異種移植片の増殖に対するＣＥＰ−７０１の影響
腫瘍増殖に対するＣＥＰ−７０１の影響を、ＨＥＬ９２異種移植片を有するマイスで（賦形剤コントロ−ルと比較して）評価した。簡単に述べれば、３０ｍｇ／ｋｇのＣＥＰ−７０１を、一日に二度皮下投与し、腫瘍容積を図１０に図示のように、選択日に評価した。腫瘍の増殖はＣＥＰ−７０１によって阻害され、また、ＣＥＰ−７０１で治療したマイスの腫瘍容積著しく縮小した。

ＨＥＬ９２異種移植片のＪＡＫ２／ＳＴＡＴシグナル伝達に対するＣＥＰ−７０１の影響も評価された。この研究では、ＨＥＬ９２腫瘍を有する動物は、ＣＥＰ−７０１の一回用量（３０ｍｇ／ｋｇ、ｓ．ｃ．［皮下］）投与され、ＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ３の阻害の動力学を、ウェスタンブロットで、異なる時点で評価した。図１１に実証するように、ＣＥＰ−７０１は、ＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ３のリン酸化を強く阻害し、最高の阻害は、この薬剤投与から２４時間後に見られた。阻害の動力学は、腫瘍中のＣＥＰ−７０１濃度でと非常によく関連し、ＣＥＰ−７０１がインビボでＪＡＫ２／ＳＴＡＴのシグナル伝達を阻害する能力をさらに確認した。

患者の検体
ＣＥＰ−７０１は、ＸＴＴアッセイ（図１４）により、患者＃６４８から遊離したＣＤ３４＋細胞の増殖を阻害することが示された。ＣＥＰ−７０１濃度（０．０３μＭ，０．１μＭ、および０．３μＭ）を高めると、細胞増殖が２４時間（パネルＡ）および４８時間（パネルＢ）で低下した。

図１５は、ＣＥＰ−７０１で治療した患者＃６４８由来のＣＤ３４＋初代培養の蛍光活性化細胞選別装置（ｆｌｕｏｒｅｓｃｅｎｃｅａｃｔｉｖａｔｅｄｃｅｌｌｓｏｒｔｅｒ：ＦＡＣＳ）による分析を示す。パネルＡで、白色バーは、生細胞数を示す。パネルＡの黒色バーは、アネキシン（Ａｎｎｅｘｉｎ）Ｖで測定したアポト−シスの誘発を示す。図１５のパネルＢで、黒色バーは、ＣＥＰ−７０１濃度を高めて、２４時間処理し、新鮮な培地に入れて希釈し、さらに７２時間培養した生ＣＤ３４＋細胞数を示す。細胞数はトリパンブル−（ｔｒｙｐａｎｂｌｕｅ）で求めた。

図１６は、患者＃６４８由来のＣＤ３４＋初代培養中のＪＡＫ２／ＳＴＡＴシグナル伝達に対するＣＥＰ−７０１の影響を示す。患者＃６４８由来のＣＤ３４＋造血前駆細胞を精製し、ＣＥＰ−７０１の濃度（３０ｎＭ，１００ｎＭ，３００ｎＭ，および１０００ｎＭ）を高めて、１時間培養した。ＳＴＡＴ５およびＳＴＡＴ３の発現およびリン酸化は特異抗体を使用して、ウェスタンブロットによって分析した。ＪＡＫ２活性を評価するために、ＪＡＫ２を免疫沈殿させ、次いで抗リン酸化チロシン（ａｎｔｉｐｈｏｓｐｈｏｔｙｒｏｓｉｎｅ）特異抗体（４Ｇ１０）を使用して、ウェスタンブロットを行なった。ＣＥＰ−７０１は、Ｖ６１７Ｆ変異を有し、ＭＰＤ患者から由来し、培養されたＣＤ３４＋前駆細胞のＪＡＫ２／ＳＴＡＴシグナル伝達を阻害することが示された。

ＳＨＰ２、ＧＡＢ２、ＡＫＴおよびＥＲＫの活性化に対するＣＥＰ−７０１の影響は、患者＃６４８から由来し、培養されたＣＤ３４＋細胞中で評価した。ウェスタンブロットを用いてＳＨＰ２、ＧＡＢ２（図１７、パネルＡ）、およびＡＫＴおよびＥＲＫ（図１７、パネルＢ）のリン酸化および発現を調べた。ＣＥＰ−７０１の濃度を高めて、患者＃６４８から由来したＣＤ３４＋細胞の初代培養に添加した。使用した濃度は、ＣＥＰ−７０１が０（つまり賦形剤だけ）、３０，１００，３００および１００ｎＭであった。ＣＥＰ−７０１は、ＣＤ３４＋前駆細胞の増殖および生存に関係する、多数のシグナル伝達経路を阻害することが示され、Ｖ６１７Ｆ変異を有する細胞の受容体レベルで全般的な活動停止（シャット・ダウン）が起こることを示唆している。パネルＢでは、ハウスキ−ピング遺伝子であるβ−アクチンの発現をコントロ−ルとして使用した。

患者＃６４８由来の細胞も、ＳＴＡＴ５の発現並びにリン酸化およびＪＡＫ２／ＳＴＡＴシグナル伝達（図１８）の下流の標的である、ＢＣＬ−Ｘ_Ｌの発現を検討する実験で評価された。ＣＥＰ−７０１濃度を高めて、患者＃６４８から由来したＣＤ３４＋細胞の初代培養に添加した。使用した濃度は、ＣＥＰ−７０１が０（つまり賦形剤だけ）、３０、１００、３００、および１０００ｎＭであった。ハウスキ−ピング遺伝子である、β−アクチンとシクロフィリンをコントロ−ルとして使用した。ＣＥＰ−７０１はこれらの細胞で、ＪＡＫ２／ＳＴＡＴシグナルの伝達およびＢＣｌｘｌ発現を阻害することが示された。ＣＥＰ−７０１に対する接触を延長すると（例えば、数回投与）、ＳＴＡＴ５発現の下方制御（ｄｏｗｎｒｅｇｕｌａｔｉｏｎ）を起こす結果になるかもしれない。

当業者によって理解されるように、上記の教示を考慮すると、本発明に多数の修正および変形例を加えることが可能である。従って、添付の請求項の範囲内で、本発明が本願明細書に具体的に記載されたこととは異なるように実行されてもよく、本発明の範囲はそのような変形例をすべて包含するように意図されることが理解される。

Claims

治療上有効な量のＪＡＫ２阻害剤であり以下の構造を有する化合物を含む、ＪＡＫ２の活性化に関連する骨髄増殖性疾患を緩和する治療用組成物であって、：

前記ＪＡＫ２の活性化に関連する骨髄増殖性疾患は、真性赤血球増加症（ｐｏｌｙｃｙｔｈｅｍｉａｖｅｒａ：ＰＶ）、本態性血小板血症（ｅｓｓｅｎｔｉａｌｔｈｒｏｍｂｏｃｙｔｈｅｍｉａ：ＥＴ）、および、特発性骨髄線維症（ｉｄｉｏｐａｔｈｉｃｍｙｅｌｏｆｉｂｒｏｓｉｓ：ＣＩＭＦ）からなる群から選択されるものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記ＪＡＫ２阻害化合物は、１日当たり０．８ｍｇ／ｋｇ体重〜１．３ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されるものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記ＪＡＫ２阻害化合物は、１日当たり２回、６０ｍｇ〜８０ｍｇの用量で投与されるものである、組成物。
請求項１記載の組成物において、前記骨髄増殖性疾患は、真性赤血球増加症（ＰＶ）である、組成物。
請求項４記載の組成物において、前記ＪＡＫ２阻害化合物は、１日当たり０．８ｍｇ／ｋｇ体重〜１．３ｍｇ／ｋｇ体重の用量で投与されるものである、組成物。
請求項４記載の組成物において、前記ＪＡＫ２阻害化合物は、１日当たり２回、６０ｍｇ〜８０ｍｇの用量で投与されるものである、組成物。