JP5314317B2 - 検査方法及び試液 - Google Patents

Description

本発明は、培養された細胞等を含む液体の試料の観察又は検査を効率良く行うことのできる検査方法及びそれに用いられる試液に関する。

我々生物は多細胞動物であり、細胞間の情報伝達が正常に行えなくなる事や、ウイルスや化学物質が細胞に取り付く事によって病気が発症する。このようなことから、分子生物学や、製薬分野では、生体から剥離した細胞をシャーレ上で培養し、その細胞に刺激（電気、化学物質、薬等）を与え、その反応を細胞レベルで観察することで研究を行っている。

従来、このような観察には光学顕微鏡が、細胞の刺激にはマニピュレータやピペットが用いられていたが、観察すべき重要な箇所は光学顕微鏡では観察不可能な０．１μｍ以下の微小領域であることも多い。例えば、細胞間の物質のやり取りが正常に行えなくなることに起因する病気に高血圧症、尿崩症、不整脈、筋肉疾患、糖尿病、うつ病等がある。この細胞間の物質のやり取りは細胞膜にある１０ｎｍ程度の大きさのイオンチャンネルにより行われる。このようなイオンチャンネルは、光学顕微鏡では観察困難である為、分解能の高い走査型電子顕微鏡（以下、「ＳＥＭ」（Scanning Electron Microscope）という）を用いた観察が望まれていた。

しかし、ＳＥＭの構成を備える検査装置において、検査対象となる試料は、通常、真空引きにより減圧された試料室内に配置される。そして、このように減圧雰囲気とされた試料室内に配置された試料に電子線（荷電粒子線）が照射され、当該照射により試料から発生する二次電子や反射電子（後方散乱電子）等の二次的信号が検出される。このようなＳＥＭによる試料検査では、試料が減圧雰囲気に晒されることとなる。よって、試料から水分が蒸発して細胞が死んでしまい、生きた状態の細胞における刺激に対する反応を観察することは不可能であった。

従って、試料に水分が含まれた状態で検査を行う際には、試料から水分が蒸発しないように、試料を減圧雰囲気に晒されることがないようにする必要がある。このように試料が減圧雰囲気に晒されることなくＳＥＭを用いて検査を行う例の一つとして、膜により開口（アパーチャ）が密封された試料容器（サンプルカプセル、もしくは密封型サンプルカプセル）の内部に試料を配置し、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内に、このサンプルカプセルを設置する手法が考えられている。

ここで、試料が配置されるサンプルカプセルの内部は減圧されない。そして、サンプルカプセルに形成された当該開口を覆う膜は、ＳＥＭの試料室内の減圧雰囲気とサンプルカプセル内の減圧されていない雰囲気（例えば、大気圧雰囲気）との間の圧力差に耐えられるとともに、電子線が透過するものとなっている（特許文献１参照）。

試料検査を行う際には、まずサンプルカプセル内に細胞と共に培地を入れ、該膜上で細胞を培養させる。その後、減圧雰囲気とされたＳＥＭの試料室内にサンプルカプセルを配置し、サンプルカプセルの当該膜を介して、サンプルカプセルの外部からサンプルカプセル内の試料に電子線を照射する。電子線が照射された試料からは反射電子が発生し、この反射電子はサンプルカプセルの当該膜を通過して、ＳＥＭの試料室内に設けられた反射電子検出器によって検出される。これにより、ＳＥＭによる像（ＳＥＭ画像）が取得されることとなる。

しかしながら、この発明では試料は閉じた空間内に封入させるので、マニピュレータやピペットを用いて細胞に刺激を与えることは不可能であった。さらに、サンプルカプセル内に入れられる培地の量は１５μｌ程度なので培地の蒸発にともなう塩濃度上昇により、細胞培養は困難であり、その細胞を生きた状態で観察・検査をする場合には問題があった。

この問題は、サンプルカプセルを大きくし、中に入れられる容量を増加させることで解決可能である。しかし、膜が電子線や機械的な刺激に対し破壊された場合、装置内が大量の培地で汚染されるという新たな問題が発生する。

なお、このように真空と大気圧との圧力差に耐えられる膜を介して試料に電子線を照射し、試料から発生する反射電子を検出してＳＥＭ画像を取得する例は、非特許文献１（当該文献のChapter1 Introduction）にも記載されている。

また、このような膜を対向して設置して一対の膜を構成し、該一対の膜の間に試料を配置して透過型電子顕微鏡による像を取得する例は、特許文献２及び特許文献３に記載されている。特に、特許文献２には、このような一対の膜を利用して、その間に配置された試料のＳＥＭ画像を取得する場合についても述べられている。

さらに、特許文献４には、膜に保持された試料の試料交換を迅速に行うこと及び真空室内の汚染を防止すること等を目的として、真空室内において、膜と一次線照射手段との間の空間を仕切るための開閉バルブを備える試料検査装置が示されている。

特表２００４−５１５０４９号公報 特開昭４７−２４９６１号公報 特開平６−３１８４４５号公報 特開２００７−２９２７０２号公報 「Atmospheric scanning electron microscopy」 Green, Evan Drake Harriman, Ph.D., Stanford University, 1993

細胞の微小領域を観察するためには光学顕微鏡では分解能不足で、ＳＥＭを用いた観察が必要である。液体を保持したまま細胞をＳＥＭで観察する為には、シャーレ上で培養していた試料（細胞）をサンプルカプセルに封入し、サンプルカプセルに備えられた膜を介して電子線を試料に照射することで像を得ていた。

しかし、サンプルカプセルは狭く閉じた空間である為、外部からマニピュレータやピペット等を用いて刺激を与えた直後の様子を観察することが不可能であるという課題があった。さらに、サンプルカプセル内では、カプセル内の容量が少ないことから、水分の蒸発に伴う塩濃度上昇により細胞の長時間培養が困難で、細胞の長時間観察には問題があった。

なお、特許文献４においては、試料交換を行う際に、上記開閉バルブにより、膜と一次線照射手段との間の空間を仕切り、この状態で該膜側の空間部のみを常圧復帰させる点の記載がある。そして、試料の検査中に該膜が破損したときには、該開閉バルブを閉じることにより、真空室内の空間を仕切り、真空室内の汚染を防止する点の記載がある。

しかしながら、特許文献４における開閉バルブでは、当該真空室内部の空間を仕切ることとなるので、一次線照射手段が位置する側の空間部の汚染を防止することは可能であるが、該膜側の空間部の汚染を防止することは困難であった。

本発明は、このような点に鑑みてなされたものであり、液体の試料を保持している膜の損傷が発生した場合において、該膜と一次線照射手段との間に位置する真空室内全体の液体試料による汚染を極力小さくすることにより、検査装置のメンテナンスを容易にし、これにより液体の試料の観察又は検査を効率良く行うことのできる検査方法を提供することを目的とする。

本発明に基づく検査方法は、枠状部材の開口を覆う膜の第一の面に、検査対象物と該検査対象物を包含する試液とを含む試料を保持し、該膜の第二の面から該膜を介して該試料に一次線を照射し、該一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出する検査方法であって、該試液には、該開口の少なくとも一部を塞ぐことのできる大きさを備える閉塞物質が混入されていることを特徴とする。

また、本発明に基づく他の検査方法は、枠状部材の開口を覆う膜の第一の面に、検査対象物と該検査対象物を包含する試液とを含む試料を保持する工程と、該開口の少なくとも一部を塞ぐことのできる大きさを備える閉塞物質を該試液に混入させる工程と、該膜の第二の面から該膜を介して該試料に一次線を照射する工程と、該一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出する工程とを有することを特徴とする。

ここで、枠状部材は、その開口内部に格子構造を有してもよく、その場合、試液に該格子構造の格子内部の少なくとも一部を塞ぐ大きさの閉塞物質を混入させると良い。また、該閉塞部材は、該格子構造の格子内部を通過しない大きさとすることもできる。

一次線は、電子線若しくはイオン線であり、二次的信号は、反射電子、二次電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光、又は吸収電流とすることができる。

閉塞物質は、ポリテトラフルオルエチレン、ラテックス、アルミナ、ポリスチレン、ポリメチルメタルクリレート、シリカ、又はガラスを用いると良い。閉塞物質の密度は、試液の液体成分密度の０．９倍〜１．１倍の間であるとさらに良い。閉塞物質の試液中における濃度が、０．００１個／μｌ〜１個／μｌであると適切に効果を発揮する。

ここで、試液は、水、リン酸緩衝液、液体培地のうちの少なくとも何れか一つを含むようにすることができる。

本発明に基づく検査方法においては、試料を保持するための膜により覆われた枠状部材の開口の少なくとも一部を塞ぐことのできる大きさを有する閉塞物質が、試料を構成する試液に混入されている。

本発明においては、このような構成により、検査対象物と試液とを含む液体試料の検査において、試料を保持している膜の損傷が発生しても、当該損傷による膜の穴の部分に閉塞物質が吸い込まれて移動し、この閉塞物質により当該穴を塞ぐことが可能となる。

これにより、当該膜の損傷が生じても、検査装置への当該試料の侵入量を大幅に低減させることができる。よって、従来では、膜が損傷する度に装置内部（真空室内部）の洗浄が必要であったが、本発明を採用することにより、膜の損傷が十数回生じても、装置の洗浄は不要となる。

従って、検査装置のメンテナンスを軽減して容易にし、液体試料の観察又は検査を効率的に行うことが可能となる。

以下、図面を参照して、本発明における検査方法及びそれに用いられる試液について説明する。

図１は、本発明において使用される試料検査装置の一実施例を示す概略構成図である。構成の主部分は、光学顕微鏡２７、マニピュレータ２６、及び電子線装置部２９（試料保持体４０より下の部分）である。この図において、一次線照射手段である鏡筒１には、電子銃（電子源）２が配置されている。電子銃２から加速された状態で放出された一次線としての電子線（荷電粒子線）７は、集束レンズ（対物レンズ）３により集束される。

これにより集束された電子線７は、試料保持体４０に形成された試料保持膜３２（後述）を介して、試料保持体４０に保持された液状試料（液体試料）２０に照射される。本実施例では、この液状試料２０には、検査対象物となる細胞と、該細胞を包含する試液としての培地とが含まれている。

鏡筒１の先端側は真空室１１に接続されている。また、電子銃２が設けられた鏡筒１の基端側は真空室１１の下方に位置している。この構成により、電子銃２から放出された電子線７は、鏡筒１内を上方向に進み、真空室１１内の空間及び試料保持膜３２を通過し、液状試料２０に到達する。

当該照射時において、電子線７は図示しない偏向手段により偏向され、これにより電子線７は液状試料２０を走査する。このときには、液状試料２０に含まれる検査対象物である細胞も電子線７により走査される。

このように、この鏡筒１は、一次線照射手段を構成し、本実施例では倒立型鏡筒となっている。真空室１１内であって鏡筒１の先端側には、反射電子検出器４が設けられている。反射電子検出器４は、電子線７が液状試料２０内の検査対象物に照射された際に発生する反射電子を検出するものである。反射電子検出器４は、例えばPN接合を利用した半導体型検出器やYAG結晶を用いたシンチレータ型検出器が用いられる。反射電子検出器４により検出された検出信号は、真空室１１の外部に配置された画像形成装置２２に送られる。

画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データは、ＳＥＭ画像に対応する画像データとなる。当該画像データは、表示装置２３に送られる。表示装置２３は、送られた画像データに基づく画像を表示する。表示された画像は、ＳＥＭ画像となる。また、画像形成装置２２により形成された画像データは、必要に応じてコンピュータ２５に送られる。コンピュータ２５は、画像処理を当該画像データに対して施すとともに、当該画像処理の結果に基づく判定を実行する。

鏡筒１内は排気手段８により真空引きされて、所定の圧力まで減圧される。また、真空室１１内は、図示しない排気手段により真空引きされ、これにより所定の圧力まで減圧される。ここで、真空室１１は、除振装置１３を介して、架台１０に載置されている。

真空室１１の上部には、試料保持体載置部１２が設けられている。試料保持体載置部１２には、電子線７を試料保持膜３２に照射させるための孔が形成されている。この試料保持体載置部１２には、Ｏリング（図示せず）を介して、試料保持体４０が載置されている。これにより、試料保持体４０は真空室１１に着脱自在に支持される。

また、真空室１１の上側部分には、開閉バルブ１４が設置されている。この開閉バルブ１４は、真空室１１内において、試料保持体４０と鏡筒（一次線照射手段）１の先端部との間の空間１９を仕切るためのものである。

図１は、開閉バルブ１４が開かれた状態である。開閉バルブ１４を閉じると、図２のように真空室１１内の当該空間１９が仕切られることとなる。このように開閉バルブ１４により仕切られた当該空間１９が仕切られることにより、開閉バルブ１４と試料保持膜３２との間において密閉された空間部１９ａが形成される。この空間部１９ａは、開閉バルブ１４を境として試料保持体４０側に位置する空間となる。

当該空間部１９ａに連通して排気手段（減圧手段）９が設けられている。この排気手段９は、当該空間部１９ａを個別に排気できる。また、当該空間部１９ａには、図示しないガス供給手段が接続されている。このガス供給手段は、窒素やエアー等のガスを当該空間部１９ａに供給し、この空間部１９ａ内を減圧状態から常圧（大気圧）状態に復帰させる。これにより、当該空間部１９ａは、独立して減圧状態からの常圧復帰が可能となる。

さらに、当該空間部１９ａには、図示しない洗浄手段が接続されている。この洗浄手段は、当該空間部１９ａ内に洗浄剤を供給し、当該空間部１９ａを洗浄する。これにより、当該空間部１９ａを構成する壁面は洗浄される。

このとき使用される洗浄剤としては、洗剤、エタノール、アルコール、アセトン、過酸化水素水の少なくとも一つからなる洗浄液、又はこれらの物質の蒸気を使用できる。当該空間部１９ａに供給された洗浄剤は、この空間部１９ａの洗浄を実施後、排出管１５により該空間部１９ａから排出される。排出管１５には、開閉弁１６が設けられている。この開閉弁１６が開放されることにより、洗浄剤は排出管１５を介して外部に排出される。なお、後述する試料の検査を実行する際には、開閉弁１６は閉じられる。

また、当該空間部１９ａに紫外光や放射線を照射することにより、当該空間部１９ａの殺菌を行うこともできる。

ここで、鏡筒１及び真空室１１を備える電子線装置部２９は電子線制御部２４により制御される。また、試料保持体載置部１２には、検査対象物に刺激（電圧、化学物質、薬等）を与え、必要に応じて検査対象物を移動させるマニピュレータ２６と、検査対象物の観察やマニピュレータ２６の位置を確認する光学顕微鏡２７が載置されている。これらは制御部２８で制御されている。

なお、光学顕微鏡２７と電子線７の光軸は一致しており、もしくは、光学顕微鏡２７とＳＥＭ画像の視野中心は一致しており、光学顕微鏡の観察領域がＳＥＭ画像にほぼ一致させることができる。さらに、ＳＥＭ画像の視野と光学顕微鏡２７の視野調整は、マニピュレータ２６や、試料保持体４０が搭載されている試料保持体載置部１２を移動させる（移動機構は図示していない）ことによって行う。

本発明における試料検査装置は、電子線装置部２９、マニピュレータ２６、光学顕微鏡２７、電子線制御部２４、制御部２８、画像形成装置２２、及び表示装置２３を備えており、各部とコンピュータ２５が接続され、各部の情報がやり取りされることも可能である。

試料保持体４０は、図３のような構成となっている。この試料保持体４０は、プラスチック又はガラスからなる皿状の本体部３７と、電子線７が透過する試料保持膜３２が設けられた膜保持体（枠状部材）１８とから構成される。本体部３７の内側に位置する凹部の底面は、試料保持面３７ａを構成する。この試料保持面３７ａは、開放されている。

本体部３７の試料保持面３７ａの一部（図３の例では中央部）には、貫通孔３７ｂが形成されている。この孔３７ｂの試料保持面３７ａ側には、段差部３７ｃが設けられている。この段差部３７ｃに、膜保持体１８が配置されている。膜保持体１８は試料保持膜３２を備えており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａは試料保持面３７ａを構成し、本体部３７の試料保持面３７ａとほぼ面一となっている。これにより、試料保持体４０の試料保持面３７ａの少なくとも一部は試料保持膜３２により構成されている。

また、孔３７ｂの試料保持面３７ａ側の反対側には、テーパ部３７ｄが設けられている。このテーパ部３７ｄは、試料保持面３７ａの反対側の面に向けて広がるように開いているテーパ構造となっており、その開き角度は９０度〜１２０度に設定されている。

さらに、試料保持体４０の下面で真空雰囲気に晒され、電子線７が照射される可能性のある領域には、電子線７の照射に伴う帯電を防止するため導電膜３０１が形成されている。導電膜３０１は膜保持体１８に接しており、電子線７の照射により蓄積された電荷を膜保持体１８（シリコン製）を介して液状試料２０へ逃がすことができる。この導電膜３０１があることにより試料保持体４０の下面での帯電を低減させ、電子線７の軌道変位や、（電子線７が液状試料２０に照射された際に発生する）反射電子の軌道変位により生ずるＳＥＭ画像の歪や輝度斑を防止することができる。

また、電荷の蓄積を確実に防止するためには、液状試料２０へのアース線の接続や、導電膜３０１を試料保持体載置部１２と電気的に繋げておくことが有効である。導電膜３０１は、例えばアルミニウムや金を蒸着することによって形成させても、銀ペーストで塗りつけてもよい。

膜保持体１８の構成を図４に示す。シリコン基板３４に試料保持膜３２が形成されており、この試料保持膜３２の第１の面３２ａ（図４では下面、図３では上面）は露出されている。この試料保持膜３２の第１の面（試料保持面）３２ａには、培地等の液体（試液）及び検査対象物（細胞等）を含む液状試料２０が配置される。第一の面３２ａは大気圧下にあるので、液状試料２０からの水分の蒸発を極力抑えることができる。

また、シリコン基板３４の中央には開口３４ａ（図４では上面、図１および図３では下面）が形成されており、この開口３４ａは、試料保持膜３２により覆われている。ここで、試料保持膜３２における第２の面３２ｂの中央部は、該開口３４ａを介して真空室１１の内部雰囲気に露出されている。また、試料保持膜３２は、その第一の面３２ａが大気圧雰囲気に晒され、第二の面３２ｂが真空雰囲気に晒されるので、この圧力差に絶える為格子３５により支持されて補強されている。

次に、膜保持体１８の作成方法を、図５を用いて説明する。まず、シリコン基板５０１にＣＶＤ（Ｃｈｅｍｉｃａｌ Ｖａｐｏｒ Ｄｅｐｏｓｉｔｉｏｎ）を用いて窒化シリコン膜５０２，５０３を形成する（図５（a））。代表的な厚みは３０ｎｍである。この窒化シリコン膜５０２，５０３上にレジスト５０４，５０５を塗布する（図５（ｂ））。レジスト５０５をフォトリソグラフィー装置を用いてパターンニングし、レジスト５０５aを残す（図５（ｃ））。レジストパターンをマスクとしてドライエッチングで窒化シリコン膜５０３を加工し、窒化シリコン膜５０３aを残す（図５（ｄ））。

このパターンをマスクとしてシリコン基板５０１をＫＯＨでウエットエッチングし、開口５１０を作る（図５（ｅ））。アッシングによりレジスト５０４，５０５aを除去する（図５（ｆ））。格子３５の無い場合の膜保持体１８はこれで完成である。窒化シリコン膜５０２上にレジスト５０６を塗布する（図５（ｇ））。窒化シリコン膜５０２とは反対側に金属５０７（例えばＡｌ，Ｎｉ）を１μｍ成膜する（図５（ｈ））。金属５０７上にレジスト５０８を塗布し、マスクとフォトリソグラフィー装置を用いてパターンを形成する（図５（ｉ））。レジスト５０８をマスクとして金属層５０７をエッチングする（図５（ｊ））。最後にレジスト５０８をアッシング、もしくは有機洗浄を行い除去する（図５（ｋ））。これにより、開口３４a、および格子３５が形成される。

このようにして作成された膜保持体１８は、図４の状態から上下反転され、試料保持膜３２である窒化シリコン膜５０２の第１の面３２ａを上面とする。なお、第２の面３２ｂを上面にすることも可能である。

この膜保持体１８を、試料保持体４０を構成する本体部３７に形成された孔３７ｂの上記段差部３７ｃに固着し、これにより試料保持体４０を作成する（図３）。この固着には、エポキシ系、シリコーン系の接着剤等による接着、又は熱、超音波若しくはレーザによる融着によって行うことができる。これにより、膜保持体１８は、本体部３７の試料保持面３７ａにおける孔３７ｂに対応する位置に固着される。

また、本実施例では、本体部３７と膜保持体１８を組み合わせて試料保持体４０を製作したが、本体部３７に試料保持膜３２を直接固着したり、本体部３７と試料保持膜３２を一体的に形成したりするようにしてもよい。さらに、試料保持膜３２の第１の面３２ａを含む試料保持面３７ａに、付着用分子としての細胞接着分子（後述）を塗布することができる。

ここで、窒化シリコン膜５０２の厚みは、１０〜１０００ｎｍの範囲に設定される。なお、膜保持体１８の試料保持膜３２として用いられる膜としては、窒化シリコン膜の他に、酸化シリコン、窒化ボロン、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、若しくはカーボンからなる膜を用いても良い。これらの膜を用いた場合でも、その膜厚は１０〜１０００ｎｍに設定される。上述した素材からなる試料保持膜３２は、電子線７が透過するが気体や液体は透過しないものとなる。さらに、膜の両面で少なくとも一気圧の圧力差に耐えられる必要がある。

なお、このような試料保持膜３２は、その厚さが薄ければ電子線７の散乱が少なくなるので分解能が向上するが破損しやすくなり、また、その厚さが厚くなれば電子線７の散乱が増加して分解能が低下するが破損しにくくなる。好適な膜厚としては２０〜２００ｎｍとなる。

次に、本発明における検査方法について図１、図２、図３、及び図４を用いて説明する。まず、図３のように試料保持体４０を用いて、検査対象物となる細胞３８を培地（試液）３９中で培養させる。培地中には格子（格子構造）３５の格子内部を通過不可能な大きさの閉塞物質（例えば、ポリスチレン球）４１を入れておく。細胞３８をこの図３のように培養させるには、予め細胞を培養してあるシャーレから試料保持体４０へ植え接ぎを行う必要がある。それには、以下に示す通常の方法を用いる。

まず、予め細胞の培養してあるシャーレ内から培地（例えばSigma社 D5796）を捨て、Tripsin＋EDTA（ethylenediaminetetraacetic acid）混合液を当該シャーレの中に入れることで、このシャーレに吸着した細胞を剥がす。次に、剥がれた細胞を遠沈管に回収して培地を加え、Tripsinの活性を止めた後に遠沈させる。その後、遠沈管内から上澄み液を捨て、培地で攪拌する。その攪拌された液（細胞３８を含む）の例えば１／１０を試料保持体４０に入れ、培地３９を継ぎ足す。この状態で、培養室に静置後、数時間で試料保持体４０の試料保持面３７ａ（試料保持膜３２の表面３２ａを含む）に細胞３８が吸着し、増殖し始める。上記方法は細胞により異なり、一例として示した。これにより、試料保持体４０内において、観察・検査対象である試料となる細胞３８が培養され、培養された細胞３８と培地３９を含有する液状試料２０が構成されることとなる。

なお、細胞によっては試料保持体４０の試料保持面３７ａ、特に電子線による観察領域である試料保持膜３２の第一の面（試料保持面）３２ａに細胞接着分子（付着用分子）を塗布しておくと培養が容易になる。細胞接着分子とは、培養のために配置された細胞及び培養により増殖した細胞を試料保持面に吸着させる作用を有し、例えば、コラーゲン、フィブロネクチン、ビトロネクチン、カドヘリン、インテグリン、クローディン、デスモグレイン、ニューロリギン、ニューレキシン、セレクチン、ラミニン、及びポリLリジンである。

上述のように試料保持体４０内で細胞が培養された後、試料保持体載置部１２に当該試料保持体４０を載置する。このとき、開閉バルブ１４は閉じられており、図２の状態になっている。この開閉バルブ１４と試料保持膜３２との間において密閉された空間部１９ａは、常圧である大気圧雰囲気となっている。また、真空室１１内において、開閉バルブ１４の下側に位置する空間は所定の真空状態（減圧状態）となっている。

さらに、当該空間に連通する鏡筒１内は、真空排気手段８により排気されて減圧され、所定の真空状態となっている。真空室１１内の圧力（真空度）は、例えば、１０−3Ｐａ〜１０−4Ｐａ程度に設定される。鏡筒１１内（特に電子銃２周囲）の圧力（真空度）は、例えば、１０−４Ｐａ〜１０−５Ｐａ程度に設定される。

この状態で、排気手段９を用いて上記空間部１９ａを減圧して真空にする。真空にする際、大気圧状態からの急激な圧力変化による試料保持膜３２の破損を防ぐ為、図示しないニードルバルブ等を用いて１秒〜１００秒の間の時間かけて、大気圧である１気圧（１０１３２５Ｐａ）から１／２気圧〜１／１０気圧程度の圧力（５０ｋＰａ〜１０ｋＰａ）にまで減圧する。この工程で、試料保持体４０の試料保持膜３２が破壊されないことの確認を行う。

上記工程により試料保持膜３２の破壊がないことの確認をした後、光学顕微鏡２７で細胞３８とマニピュレータ２６の位置を確認する。マニピュレータ先端はガラス微小管（中に微小電極を設置）が設置してあり、微小電極による細胞への電圧の印加や、ガラス微小管による液体の流出及流入が可能になっている。

この状態で、光学顕微鏡２７で観察しながら細胞３８とガラス微小管が近接するようにマニピュレータ２６を移動させる。その後、ガラス微小管に負の圧力を掛けて細胞膜と密着させる。これにより、電位応答が測定可能となる。

以上のようなマニピュレータ２６の移動の際、誤って試料保持膜３２を破損させることがあっても、開閉バルブ１４が閉まっているので、液状試料２０の拡散による汚染は当該空間部１９ａ内のみで済む。さらにその際、液状試料２０には格子３５の枠を通過できない大きさの閉塞物質４１を入れてあるので、図６のように閉塞物質４１aが破損箇所に吸い込まれ破損個所を塞ぐことができる。

ここで、閉塞物質４１（４１a）は、格子３５からなる格子構造の枠内部を通過できないので、圧力差による外力が加わっても、閉塞物質４１（４１a）が真空室１１内部に侵入することはない。

また、閉塞物質４１が、破損箇所の穴を部分的に塞いだ場合でも、流入した液体が真空中で断熱膨張をすることにより、温度が低下し、液体が固化（氷）して穴を完全に塞ぐことができる。これにより培地の装置内への流入を低減することができる。

このとき、液体試料２０中の閉塞物質の濃度は０．００１〜１個／μｌとすると細胞観察の際、閉塞物質が邪魔になることが無いし、また、空間部１９ａ内への液体試料２０流入量も少なくすることができる。前記閉塞物質は、ポリテトラフルオルエチレン、ラテックス、アルミナ、ポリスチレン、ポリメチルメタルクリレート、シリカ、又はガラスからなる粒子（パーティクル）とすることができる。該粒子の形状は、球形等とすることができる。また、該閉塞物質の密度は、液状試料の密度の０．９〜１．１倍であるとさらに良い。

閉塞物質を用いない場合は、液体試料２０全てが装置内に流入するため、試料保持膜３２の破壊の度に装置の洗浄が必要で、時には装置が使用不可能な状態になっていた。しかし、閉塞物質を用いる本発明では、液体流入量は少なくなり、開閉バルブ１４が開いている場合や開閉バルブ１４が無い場合でも、このような汚染事故が十回発生しても問題なく装置を使用し続けることができる。

このような閉塞物質を用いていても、試料保持膜２０が数十回破壊された場合には、当該空間部１９ａ内が液状試料２０の拡散により汚染され、電子線装置部２９の性能が劣化する場合もある。その場合、上述したように空間部１９ａの洗浄は可能である。洗浄する場合にも液体試料２０の流入量が少ないので容易に洗浄できる。そして、洗浄で用いた洗浄剤である液体又は蒸気は、開閉弁１６を開けることにより、排出管１５を介して排出及び廃棄可能である。なお、当該空間部１９ａを構成する壁面を、窒化ボロンもしくは、フッ素樹脂でコーティング（被膜）することにより、汚染されにくくすることができる。

再び、観察の手順に戻る。当該空間部１９ａが減圧（真空）状態において、液状試料２０が載置された試料保持膜３２が破壊されないことを確認した後、開閉バルブ１４を開ける。これにより、真空室１１内の空間の仕切りが解除され、真空室１１内の下側の空間と当該空間部１９ａとが連通される。その後、光が試料保持膜３２を介して反射電子検出器４に入射させない為に、光学顕微鏡２７の光の照射を止め、他の外光の遮蔽（図への記載は略）を行う。この遮蔽は、膜保持体１８や液状試料２０に電子線７が照射した際に発生する放射線の防護の役目も果たしている。

次に、図１のように鏡筒１から電子線７を液状試料２０（細胞３８を含む）に向けて照射して撮像を行う。電子線７は試料保持体４０の試料保持膜３２を透過して細胞３８に照射され、当該照射に基づいて細胞３８から発生する反射電子（後方散乱電子）は反射電子検出器４で検出される。

このとき、試料保持体４０を構成する本体部３７の孔３７ｂには、上述したテーパ部３７ｄが設けられているので、反射電子が孔３７ｂの内側面に衝突して遮られることを極力防止することができ、反射電子検出器４による反射電子の検出を効率的に行うことができる。

反射電子検出器４からの検出信号は、画像形成装置２２に送られる。画像形成装置２２は、当該検出信号に基づいて、画像データを形成する。この画像データに基づいて、表示装置２３が画像（ＳＥＭ画像）を表示する。

これに引き続き、細胞３８に、マニピュレータ２６の先端に設置してある微小電極を用いて電気刺激を加え、先ほどと同様にＳＥＭ画像を取得し、刺激に対する細胞３８の応答を確認する。

撮像後は開閉バルブ１４を閉じることにより、万が一にでも試料保持膜３２が破壊される場合での鏡筒１への汚染を防止する。なお、上記のように細胞３８に刺激を与えた後の変化をＳＥＭで観察する前に、光学顕微鏡２７で観察する場合もある。その際も、開閉バルブ１４を閉じておくと、試料保持膜３２が破れた際の汚染のリスクを低減できる。いずれにせよ、電子線７を液状試料２０に照射させない時は開閉バルブ１４を閉じる等、検査中における開閉バルブ１４の開放時間を短縮することで、装置内部の汚染確立を低減させることができる。

刺激に対する細胞３８の反応速度が遅い場合、一旦開閉バルブ１４を閉じ、反応した頃合を見計らって再度開放バルブ１４を開放し、電子線７による撮像を行っても良い。反応の確認は光学顕微鏡２７で行うことができる。

また、マニピュレータ２６には、化学物質や薬物を液状試料２０中に散布可能な機構を有すことができ、ＳＥＭで細胞を観察しながら化学物質や薬物に対する細胞３８の挙動も観察・検査することができる。また、マニピュレータ２６には、液体の流出機能を有することもでき、これにより散布した物質の回収を行うことや、培地のｐＨや浸透圧を一定にすることが可能になる。

上記において、像を形成する電子には反射電子を用いた。反射電子は原子番号に比例した信号強度を持つ。その為、生物試料のようにほぼ全体が低原子番号の物質で構成されている場合、像のコントラストが非常に弱く、分解能を向上させることが困難である。

そこで、細胞３８の挙動で注目すべき部位に、金などの重金属を吸着させておくと良い。具体的には、該部位（抗原）に吸着する性質を持つ金粒子を標識した抗体を細胞に散布することで、抗原抗体反応を利用して、その部位（抗原）に該抗体を介して金を吸着させる。また、予め、電子線が照射されると発光する蛍光色素や量子ドット（例えばＳｉのナノ粒子、ＣｄＳｅをＺｎＳでコーティングした１０〜２０ｎｍの粒子）を細胞３８の特定部位に吸着させ発光を光学顕微鏡で観察しても良い。

上記実施例において、通常用いられる金粒子は１０〜３０ｎｍの粒径である。しかし、抗体と金粒子との吸着力が弱く、１０〜３０ｎｍの金粒子を付けられないこともある。その場合には、まず粒径数ｎｍと非常に小さな金（ナノゴールド）を抗体に付ける。このままでは金が小さすぎ、ＳＥＭでの観察は困難であるが、銀増感を利用して該金の周りに銀を吸着させることで、ＳＥＭで検出し易くする方法を用いても良い。

なお、上記においては、予めシャーレにおいて培養されていた細胞を取り出して、試料保持体４０に植え接ぎをして培養を行っていたが、生体から細胞を取り出して、この取り出された細胞を直接試料保持体４０の試料保持面３７ａに配置し、試料保持体４０内で当該細胞の培養をするようにしてもよい。

以上のように、本発明を用いて試料保持膜３２を介して液中の検査対象物の観察・検査が可能になった。特に開放された試料室を用いているため、外部から試料へのアクセスが可能で細胞に容易に刺激を与えることができる。また培地の量を多くでき、細胞を長時間生存させることも可能である。

試料保持膜３２が破れた場合には、破れた隙間から液体が装置内に流入するが、液中にその隙間を塞ぐことのできる大きさの閉塞物質４１を混入してあり、閉塞物質４１が隙間を少なくとも部分的に塞ぐことができる。これにより装置内への液体の流入量を低減することができた。液体流入量が少ないので、試料保持膜３２の十回の破壊では装置内の洗浄が必要でなくなった。また、洗浄をする場合でも、汚染物質の付着は少なく洗浄が容易になった。このように、本発明により装置の使い勝手を向上することができた。

なお、閉塞物質としてポリスチレンを用いたが、それ以外にもポリテトラフルオルエチレン、ラテックス、アルミナ、ポリメチルメタルクリレート、シリカ、ガラスを用いても良い。それ以外でも、閉塞物質の密度が液状試料の密度の０．９〜１．１倍（特に１．０〜１．１であるとさらに良い）であると、液中で閉塞物質が浮遊、もしくは沈んでいることになり、試料保持膜が破壊された場合において、速やかに破れた隙間を塞ぐことが可能になる。閉塞物質が重過ぎる場合は閉塞物質の移動に時間を要するし、軽すぎる場合は液体がなくなるまで隙間を塞ぐことができない。その為、適切な密度が重要となる。

閉塞物質の液状試料に対する濃度は、０．００１個／μｌ〜１個／μｌであると観察の邪魔にならない。この閉塞物質を、例えば、水、培地、リン酸緩衝液に混入させた検査試薬を用意しておき、観察前にこれら検査試薬を液状試料に加えることで、上記実施例に記載した所望の効果が期待できる。

さらに、本発明では倒立型ＳＥＭを用いたが、試料によっては密封型サンプルカプセル（背景技術参照）を用いた通常の正立型ＳＥＭでも問題は無い。ただし、この場合、閉塞物質の密度は液状試料の密度の０．９〜１．０倍であるのが望ましい。

また、試料保持体１８上に培養された細胞３８は、格子３５の隙間から観察されることとなる。細胞の大きさは、１０〜数百μｍであり、細胞の大きさから考えられる観察しやすい格子間隔は１０〜５００μｍである。その為、閉塞物質もその間隔にあわせた最大長、１０〜５００μｍを有すると効率的に試料保持膜３２が破れた穴を塞ぐことができる。

なお、上記実施例においては、一次線として電子線を用いたが、試料保持膜３２が他の荷電粒子（ヘリウムイオンビーム等）の照射に対する耐衝撃性及び強度が十分に高ければ、当該他の荷電粒子線を用いた場合でも適用可能である。

また、上記実施例では二次的信号として反射電子を用いたが、それ以外でも二次電子、Ｘ線、若しくはカソードルミネッセンス光、及び細胞（検査対象物）３８への吸収電流を検出することにより、細胞３８の情報を得ることが可能である。なお、吸収電流の測定はマニピュレータ２６を用いると便利である。

本実施例での試料保持膜３２は、少なくとも一気圧の圧力差に耐えることができ、気体や液体の流入出がないことが必要である。具体的な物質としては、ポリマー、ポリエチレン、ポリイミド、ポリプロピレン、カーボン、酸化シリコン、窒化シリコン、又は窒化ボロンのうちの少なくとも一つを含むものを用いることができる。

上述のごとく、本願発明における検査方法では、枠状部材１８の開口３４ａを覆う膜３２の第一の面に、細胞等の検査対象物３８と該検査対象物３８を包含する試液３９とを含む試料２０を保持し、該膜３２の第二の面から該膜３２を介して試料２０に一次線を照射し、該一次線の照射により試料２０から発生する二次的信号を検出する検査方法において、試液３９には、該開口３４ａの少なくとも一部を塞ぐことのできる大きさを備える閉塞物質４１が混入されている。

また、本発明における検査方法では、枠状部材１８の開口３４ａを覆う膜３２の第一の面に、検査対象物３８と該検査対象物３８を包含する試液３９とを含む試料２０を保持する工程と、該開口３４ａの少なくとも一部を塞ぐことのできる大きさを備える閉塞物質４１を試液３９に混入させる工程と、該膜３２の第二の面から該膜３２を介して試料２０に一次線を照射する工程と、該一次線の照射により試料２０から発生する二次的信号を検出する工程とを有している。

ここで、枠状部材１８は、その開口３４ａ内部に格子構造を備え、閉塞物質４１は、該格子構造の格子内部の少なくとも一部を塞ぐようにすることもできる。このとき、閉塞物質４１は、該格子構造の格子内部を通過しない大きさを備えるようにすることもできる。

そして、一次線は、電子線又はイオン線であり、二次的信号は、反射電子、二次電子、Ｘ線、カソードルミネッセンス光、吸収電流のうちの何れかとすることができる。また、膜３２の第一の面を上面とし、膜３２の第二の面を下面とすることができる。

さらに、本発明における試液は、枠状部材１８の開口３４ａを覆う膜３２を介して、検査対象物３８に一次線を照射して行われる検査において、該検査対象物３８を包含するための試液であって、該開口３４ａの少なくとも一部を塞ぐことのできる大きさを備える閉塞物質４１が混入されている。

このとき、枠状部材１８の開口３４ａ内に格子構造が備えられている場合において、閉塞物質４１が、該格子構造の格子内部を通過しない大きさを備えるようにすることもできる。

上記において、閉塞物質４１の最大長を、１０μｍ〜５００μｍの間とすることができる。

閉塞物質４１は、ポリテトラフルオルエチレン、ラテックス、アルミナ、ポリスチレン、ポリメチルメタルクリレート、シリカ、ガラスのうちの何れかから構成することができる。

また、閉塞物質４１の密度を、試液３９の液体成分密度の０．９倍〜１．１倍の間とすることができる。さらに、閉塞物質４１の試液３９中における濃度を、０．００１個／μｌ〜１個／μｌの間とすることができる。ここで、試液３９は、水、リン酸緩衝液、液体培地のうちの少なくとも何れか一つを含むようにすることができる。

本発明における試料検査装置の一実施例を示す概略構成図である。 本発明における試料検査装置の一実施例を示す概略構成図である。 本発明における試料保持体の構成を示す断面図である。 本発明における試料保持体を構成する枠状部材の概略図である。 本発明における試料保持体を構成する枠状部材の作成方法を示す図である。 本発明における試料保持体で、閉塞物質が枠状部材の破壊された穴を閉塞したことを示す概略構成図である。

符号の説明

１…鏡筒（一次線照射手段）、２…電子銃、３…集束レンズ、４…反射電子検出器（信号検出手段）、７…電子線（一次線）、８…排気手段、９…排気手段、１０…架台、１１…真空室、１２…試料保持体載置部（載置手段）、１３…除震装置、１４…開閉バルブ、１５…排出管、１６…開閉弁、１８…膜保持体（枠状部材）、１９…空間、１９ａ…空間部、２０…液状試料、２２…画像形成装置、２３…表示装置、２４…電子線制御部、２５…コンピュータ、２６…マニピュレータ、２７…光学顕微鏡（光学像取得手段）、２８…制御部、２９…電子線装置部、３２…試料保持膜（膜）、３２ａ…第１の面（試料保持面）、３２ｂ…第２の面、３４…シリコン基板、３４ａ…開口、３５…格子、３７…本体部、３７ａ…試料保持面、３７ｂ…孔、３７ｃ…段差部、３７ｄ…テーパ部、３８…細胞（検査対象物）、３９…培地（試液）、４０…試料保持体、４１…閉塞物質、４１ａ…閉塞物質、３０１…導電膜、５０１…シリコン基板、５０２…窒化シリコン膜、５０３…窒化シリコン膜、５０３ａ…窒化シリコン膜、５０４…レジスト、５０５…レジスト、５０５ａ…レジスト、５０６…レジスト、５０７…金属、５０８…レジスト、５１０…開口、

Claims (10)

1. 枠状部材の開口を覆う膜の第一の面に、検査対象物と該検査対象物を包含する試液とを含む試料を保持し、該膜の第二の面から該膜を介して該試料に一次線を照射し、該一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出する検査方法であって、該試液には、該開口の少なくとも一部を塞ぐことのできる大きさを備える閉塞物質が混入されていることを特徴とする検査方法。
2. 枠状部材の開口を覆う膜の第一の面に、検査対象物と該検査対象物を包含する試液とを含む試料を保持する工程と、該開口の少なくとも一部を塞ぐことのできる大きさを備える閉塞物質を該試液に混入させる工程と、該膜の第二の面から該膜を介して該試料に一次線を照射する工程と、該一次線の照射により該試料から発生する二次的信号を検出する工程とを有する検査方法。
3. 前記枠状部材は、その開口内部に格子構造を備えており、前記閉塞物質は、該格子構造の格子内部の少なくとも一部を塞ぐことを特徴とする請求項１又は２記載の検査方法。
4. 前記閉塞物質は、前記格子構造の格子内部を通過しない大きさを備えることを特徴とする請求項３記載の検査方法。
5. 前記一次線は、電子線又はイオン線であり、前記二次的信号は、反射電子、二次電子、Ｘ線、カソードルミネッセンス光、吸収電流のうちの何れかであることを特徴とする請求項１乃至４何れか記載の検査方法。
6. 前記膜の第一の面が上面となっており、前記膜の第二の面が下面となっていることを特徴とする請求項１乃至５何れか記載の検査方法。
7. 前記閉塞物質は、ポリテトラフルオルエチレン、ラテックス、アルミナ、ポリスチレン、ポリメチルメタルクリレート、シリカ、ガラスのうちの何れかから成ることを特徴とする請求項１乃至６何れか記載の検査方法。
8. 前記閉塞物質の密度が、前記試液の液体成分密度の０．９倍〜１．１倍の間にあることを特徴とする請求項１乃至７何れか記載の検査方法。
9. 前記閉塞物質の前記試液中における濃度が、０．００１個／μｌ〜１個／μｌであることを特徴とする請求項１乃至８何れか記載の検査方法。
10. 前記試液は、水、リン酸緩衝液、液体培地のうちの少なくとも何れか一つを含むことを特徴とする請求項１乃至９何れか記載の検査方法。

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