JP5297814B2 - 量的hiv表現型又は向性アッセイ - Google Patents
量的hiv表現型又は向性アッセイ Download PDFInfo
- Publication number
- JP5297814B2 JP5297814B2 JP2008552821A JP2008552821A JP5297814B2 JP 5297814 B2 JP5297814 B2 JP 5297814B2 JP 2008552821 A JP2008552821 A JP 2008552821A JP 2008552821 A JP2008552821 A JP 2008552821A JP 5297814 B2 JP5297814 B2 JP 5297814B2
- Authority
- JP
- Japan
- Prior art keywords
- hiv
- tropism
- phenotype
- genotype
- sequence
- Prior art date
- Legal status (The legal status is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the status listed.)
- Expired - Fee Related
Links
Classifications
-
- C—CHEMISTRY; METALLURGY
- C12—BIOCHEMISTRY; BEER; SPIRITS; WINE; VINEGAR; MICROBIOLOGY; ENZYMOLOGY; MUTATION OR GENETIC ENGINEERING
- C12Q—MEASURING OR TESTING PROCESSES INVOLVING ENZYMES, NUCLEIC ACIDS OR MICROORGANISMS; COMPOSITIONS OR TEST PAPERS THEREFOR; PROCESSES OF PREPARING SUCH COMPOSITIONS; CONDITION-RESPONSIVE CONTROL IN MICROBIOLOGICAL OR ENZYMOLOGICAL PROCESSES
- C12Q1/00—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions
- C12Q1/70—Measuring or testing processes involving enzymes, nucleic acids or microorganisms; Compositions therefor; Processes of preparing such compositions involving virus or bacteriophage
- C12Q1/701—Specific hybridization probes
- C12Q1/702—Specific hybridization probes for retroviruses
- C12Q1/703—Viruses associated with AIDS
Landscapes
- Health & Medical Sciences (AREA)
- Chemical & Material Sciences (AREA)
- Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
- Virology (AREA)
- Organic Chemistry (AREA)
- Wood Science & Technology (AREA)
- Immunology (AREA)
- Zoology (AREA)
- Engineering & Computer Science (AREA)
- Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
- Analytical Chemistry (AREA)
- Biotechnology (AREA)
- Microbiology (AREA)
- Molecular Biology (AREA)
- Physics & Mathematics (AREA)
- AIDS & HIV (AREA)
- Biophysics (AREA)
- Biochemistry (AREA)
- Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
- General Engineering & Computer Science (AREA)
- General Health & Medical Sciences (AREA)
- Genetics & Genomics (AREA)
- Measuring Or Testing Involving Enzymes Or Micro-Organisms (AREA)
Description
に、より病原性でない株に結びつけられた。対照的に、X4株はT−細胞系上のSIであり、Tリンパ球上で好適に複製し(T−向性)、すべてより病原性のウイルス株の特徴である。この知識に基づき、HIV共−受容体使用は疾患の進行と関連すると思われる。
ce,Paris)及びPhenoSense(Monogram Biosciences,San Francisco)のような組換えウイルス向性アッセイの使用である。両アッセイは、患者の血漿試料からのHIV−1包膜糖タンパク質遺伝子配列を増幅し、それぞれ複製−感応又は複製能−欠損組換えウイルスを作る。次いでこれらのウイルスを用いて、CCR5又はCXCR4共−受容体と組み合わせてCD4を発現する細胞系に感染させ、それはウイルス向性の決定を可能にする。これらのアッセイの重大な限界は、混合集団(R5+X4)中のX4ウイルスの検出に関する閾値、すなわち混合ウイルス集団の存在下における少数派の準種(quasispecies)の検出に関する閾値である。
Feng et al.著,HIV−1 entry cofactor:functional cDNA cloning of a seven−transmembrane,G protein−coupled receptor.,Science 1996 May 10;272(5263):872−877 Deng et al.著,Identification of a major co−receptor for primary isolates of HIV−1.,Nature 1996 Jun 20;381(6584):661−6 Trkola et al.著,CD4−dependent,antibody−sensitive interactions between HIV−1 and its co−receptor CCR−5.,Nature 1996 Nov 14;384(6605):184−7
a)患者からのウイルス遺伝物質を含んでなる試料を用い;
b)該試料からウイルス遺伝物質を抽出し、続いて以下の段階:
1.特定のHIV領域のウイルス遺伝物質を増幅し、
2.アンプリコン一体性を分析し且つ試料をプールし、
3.プールされたアンプリコンを精製し、
4.アンプリコンのプールをベクター中に連結し、そして連結された生成物をコンピテント細胞中に形質転換し、
5.得られる個々の形質転換細胞を分析し、
6.得られる単クローン(single clone)を配列決定して単クローン遺伝子型配列を得る
段階を含んでなる単ゲノム配列決定を行い;
c)該遺伝子型配列を用いて、以下の段階:
1.該遺伝子型配列において、少なくとも1つの自然の可変性(variability)、後天的可変性、薬剤選択突然変異又は突然変異パターンが量的表現型の結果、例えばgag表現型、インテグラーゼ表現型又は向性と関連する遺伝子パターン(genetic pattern)を同定し、
2.段階c1において遺伝子配列中で同定される自然の可変性、後天的可変性、薬剤選択突然変異又は突然変異パターンの少なくとも1つに類似の遺伝子パターンを有する少なくとも1つの遺伝子型エントリーに関して遺伝子型/表現型相関データベースを検索し、
3.相関遺伝子型/表現型データベースにおいて適合する表現型を有する類似の遺伝子パターンを有する該少なくとも1つの遺伝子型エントリーを得、そして
4.類似の遺伝子パターンを有する少なくとも1つの遺伝子型エントリーのデータベースからHIV表現型を予測する
段階を含んでなる予測アルゴリズムを用いて特定の表現型、例えばgag表現型、インテグラーゼ表現型又は向性を予測し;
d)HIV感染患者の試料中に存在するすべての単配列クローンに関し、段階c1〜c4で得られる情報に基づいて量的表現型、例えばgag表現型、インテグラーゼ表現型又は向性を予測する
ことを含んでなる。
1.予測可能な表現型を含まないクローン配列を単クローン生物学的表現型決定アッセイにおいて分析し、
2.該分析の後に得られる情報を段階(c)で用いられる相関遺伝子型−表現型データベースに負荷する(loaded)
追加の段階をさらに含んでなることができる。
1.クローン部分的もしくは全−長HIVゲノムを形成し、
2.該ゲノムを用いて、組換えHIVを得るのに適した主鎖と一緒に又は全長HIV−1ゲノムとして直接、哺乳類細胞をトランスフェクションし、
3.細胞系を該組換えHIVに感染させ、感染プロセスが起こっているそれらの生物学的表現型を決定し、
4.その後、得られる情報を段階(c)で用いられる相関遺伝子型−表現型データベースに負荷する
段階を含んでなる。
図1において、フロー−チャートは、本発明において用いられる方法を概述して示す。
RNA抽出
3つの臨床的血漿試料を無作為に選び、患者1、2及び3と呼んだ。合計で300μlの血漿から、EasyMagTM RNA抽出プラットフォーム(Biomerieux,Boxtel,The Netherlands)を用いて全RNAを抽出した。25μlの溶出緩衝液中における溶出の後、溶出液の5μlを、NucliSens(R) EasyQ HIV−1 v1.1システム(Biomerieux,Boxtel,The Netherlands)を用いるウイルス負荷量測定に用いた。RNA試料の残りをアンプリコン生成のために用いた。
残る20μlのRNAを、2x反応緩衝液、0.2μM プライマー Env 6210F(CAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA)(配列番号:1)、0.2μM プライマー HMA R3(ATGGGAGGGGCATACATTGCT)(配列番号:2)及び2単位のSuperScriptTM III One−Step RT−PCR SystemからのPlatinum(R) Taq High Fidelity(Invitrogen,Merelbeke,Belgium)と、120μlの合計体積において混合した。この混合物をそれぞれ15μlの8回の反応を経て分割し、53℃で30分間、逆転写を行なった。初期変性は94℃で2分間であり、熱サイクリングは92℃における15秒間の変性、55℃における30秒間のアニーリング及び68℃における1分20秒間の伸張の50サイクルから成った。最終的伸張を68℃で7分間行なった。得られるアンプリコンをプールし、LC90プラットフォーム(Caliper,Mountainview,California)を用いて分析し、続いてQiaQuickゲル精製キット(Qiagen,Hilden,Germany)を用いて精製した。精製されたアンプリコンプールの最終的な体積は30μlであった。
配列決定のためのTOPO TA Cloning(R)キット(Invitrogen,Merelbeke,Belgium)からのpCR(R)4−TOPO(R)ベクター(商業的に入手可能)中への連結のために、合計で2μlの精製されたアンプリコンプールを用い、2μlのクローニング反応混合物を用いて1アリコートのOne Shot(R) TOP10化学的コンピテント細胞(Invitrogen,Merelbeke,Belgium)を、製造者の指示に従って形質転換した。
50μlのPCR反応混合物に接種するために、臨床的試料当たり合計で95個のコロニー(プラス1個のブランク標準反応)を、無菌のチップ(tip)を用いて採取した(手動でか又はロボットを用いて)。PCR反応混合物は10xPCR緩衝液、25mM dNTPs、0.33μM プライマー T3(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)(配列番号:3)、0.33μM プライマー T7(TAATACGACTCACTATA GGG)(配列番号:4)及び0.03単位のExpand High Fidelit Enzyme Mix(Roche,Penzberg,Germany)から成った。94℃における10分間の変性、94℃における15秒間の変性、50℃における30秒間のアニーリング及び72℃における2分間の伸張の10サイクルで熱サイクリングを開始した。これに、94℃における15秒間の変性、50℃における30秒間のアニーリング及び72℃における2分間の伸張の伸張の20サイクルが続き、伸張の時間をサイクル当たり5秒間づつ増加させた。最後の伸張を72℃において7分間行なった。Qiagen 9600 PCR精製プラットフォームを用い、50μlで溶出させて(Qiagen,Hilden,Germany)コロニーPCR生成物を精製した。
各精製されたコロニーPCR生成物から1μlを、2.5x 希釈緩衝液、1μl Big Dye Terminator Mix及び0.2μM 配列決定プライマーと、11.5μlの合計体積において混合した。プライマーT3及びT7を用い、別々の反応において各生成物を配列決定した。熱サイクリングは、96℃における10秒間の変性、50℃における5秒間のアニーリング及び60℃における4分間の伸張の25サイクルから成った。エタノール/酢酸ナトリウム沈降を用いて過剰のBig Dyeを除去し、生成物を95℃において2分間変性させ、ABI3730キャピラリーシークエンサー上で分析した。
ABI3730キャピラリーシークエンサーから電気泳動図を回収し、Seqscape v2(Applied Biosystems,Foster City,CA,USA)中に移した。特性値(quality value)及びJR−CSF参照配列の長さに基づいて配列末端をトリミングした(trimmed);参照配列は増幅プライマー間の領域に及んだ。
●増幅プライマー配列の間の問題の全領域に及ばない
●STOPコドンを含有する
場合、あるクローンを分析から除去した。
1.V3−ループアミノ酸配列抽出
PSSM予測アルゴリズムはアミノ酸配列を必要とするので、Envのアミノ末端部分からV4−ループまでの全領域に及ぶヌクレオチド配列からV3−領域の正しい翻訳を行なった。HXB2 V3−ループアミノ酸配列を含有する小さいデータベースに対して翻訳されたヌクレオチド配列のBLAST検索を行なうことにより(6個の枠すべてにおいて)、V3と最も高い適合を有する領域を境界付けることができた。続いてこれらの領域を抽出し、翻訳した。
V3−ループアミノ酸配列を:http://ubik.microslu.washington.edu/computing/pssm/に、Jensen,M.A.,F.S.Li,A.B.van’t Wout,D.C.Nickle,D.Shriner,H.X.He,S.McLaughlin,R.Shankarappa,J.B.Margolick,and J.I.Mullins.2003.Improved coreceptor usage prediction and genotypic monitoring of R5−to−X4 transition by motif analysis of human immonodeficiency virus type 1 env V3 loop sequences.J Virol 77:13376−88に従って負荷する(uploading)ことにより、位置特異的スコアリングマトリックス(PSSM)予測を作成した。
geno2pheno共受容体予測手段(SVMと示される)は、ヌクレオチド配列のバッチ寄託(batch submitting)を許さないので、すべての配列の寄託(submission)を自動化するPerlスクリプトを書き、次いでHTML出力(SVM)を他のperlスクリプトと一緒に分析して(parsed)、患者ごとにgeno2pheno向性予測を与えた。
SASスクリプトはすべての予測を1つのデータセットとし、各患者に関する分割表を作る。
3つの臨床的単離物を無作為に選択した。各単離物からウイルスRNAを逆転写し、数回増幅し、得られるアンプリコンをプールし、精製し、バクテリア細胞中にクローニングした。50個より多い無作為に選ばれたクローンを配列決定し、2つの予測プログラムに寄託した。この分析の結果を表1に示す。
DUAL:CCR5及びCXCR4発現細胞の両方に感染すると予測されるV3配列。
NONE:標準的な設定でのSVMにおいて予測が得られない。
単クローン表現型決定アッセイ
完全なgp160又はgp160の一部を構成する患者−由来クローン配列を、それぞ
れ完全なgp160又はその一部が欠失したhXB2D−eGFP主鎖(配列番号:5)中に、BD In Fusionシステムを介して導入した。HXB2D−eGFPは、nefの代わりにGFPを含有するベクターである(Chen et al著,(1997),J Virol 71:5495−5504)。マーカーとしてのeGFPの代わりに、他の周知のマーカー、例えばルシフェラーゼ又は他の商業的に入手可能な蛍光タンパク質を本アッセイにおいて用いることができる。この方法で作られるすべての患者−由来全−長組換えHIV−eGFPクローンに関し、DNAを調製し、制限分析により検査した。1μgの正のクローンを、Amaxaヌクレオフェクション法を用いて293T細胞にトランスフェクションした。トランスフェクションから24〜48時間後に上澄みウイルス培養物を収穫し、U87細胞(U87を親とする、U87−CD4、U87−CD4−CXCR4及びU87−CD4−CCR5細胞)の感染に用いた。感染から24〜96時間後に、蛍光顕微鏡により共受容体使用を決定した。あるいはまた、上澄みウイルス培養物を用いて、CXCR4−CCR5キメラ受容体を含有するU87に感染させた(Karlsson et al.著(2003) AIDS 17:2561−2569)。この方法で、CCR5−使用ウイルスがCXCR4−向性ウイルスにシフトするポテンシー(potency)に関する予測が行なわれる。
前以て処置を受けていない(treatment−naive)HIV−1感染患者試料についての遺伝子型的V3−ループ向性予測のクローン表現型的確証
RNA抽出及びVirco TypeTM
無作為に選択されたHIV−1−感染患者から得た合計で300μlの血漿から、EasyMagTM RNA抽出プラットフォーム(Biomerieux,Boxtel,The Netherlands)を用いてRNAを抽出した。NucliSens(R) EasyQ HIV−1 v1.1システム(Biomerieux;IU/mlにおいて出力)によりウイルス負荷量を決定した。Virco TypeTMを作成した。
Platinum(R) Taq High Fidelityを有するSuperScriptTM III One−Step RT−PCR System(Invitrogen,Merelbeke,Belgium)を用い、RNAを逆転写して7−倍において増幅した。前進プライマーをEnvの開始コドンの前に置き、逆プライマーをEnv C4領域中に置いた。PCRフラグメントをNH2−V4アンプリコンと呼んだ。
プールした後、アンプリコンをpCR4−TOPO(R)ベクター(Invitrogen)中にクローニングした。感応TOP10 E.コリ細胞中への形質転換の後、個々のクローンを採取し、前進及び逆プラスミドプライマーを用いるコロニーPCRにより挿入断片を増幅した。精製の後、BigDye Terminatorサイクル配列決定キット(Applied Biosystems,Foster City,California,USA)を用いてコロニーPCR生成物を配列決定し、ABI 3730 XL自動シークエンサー上に流した(run on)。SeqScape v2.5(Applied Biosystems)を用いて配列修正及びコンティグ集合(contig assembly)を行なった。
ClustalW(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)を用いて整列を構築し、配列ロゴの作成のための入力として用いた(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)。PSSMアルゴリズム(http://ubik.microbiol.washington.edu/computing/pssm)及びSVM(http://coreceptor.bioinf.mpi−sb.mpg.de/cgi−bin/coreceptor.pl)により、ウェブサイト上に与えられる標準的な設定を用いて、V3ループ配列に基づいてウイルス向性を予測した。系統発生的分析は、全NH2−V4配列(〜1260bp)のヌクレオチド整列に基づいた。距離を計算し(DNADIST)、ツリーを構築し(NEIGHBOR)、そして最後にコンセンサスツリー(consensus tree)を組み立てた(CONSENSE)。V3−ループのN−結合グリコシル化を、EMBOSSプログラムpatmatdb(http://bioweb.pasteur.fr/docs/EMBOSS/patmatdb.html)により評価した。すべてのクローン配列を、Los Alamosウェブサイト(http://hiv−web.lanl.gov/content:index)からダウンロードされた66個のHIV−1クレード(clade)参照株の同じ領域と整列させることにより、NH2−V4配列に基づくクレーディング(clading)を行なった。類似性の表を回収し、すべてのクローンとの同一性の最高のパーセンテージを示す参照株を記録した。
クローンNH2−V4アンプリコンを、hXB2Dに基づくeGFP−含有NH2−V4−欠失主鎖(配列番号:6)であるpHXB2D−ΔNH2−V4−eGFP中に、In−FusionTM CF Dry−Down Cloning Kit(BD Biosciences,Erembodegem,Belgium)により組み換えた。マーカーとしてのeGFPの代わりに他の周知のマーカー、例えばルシフェラーゼ又は他の商業的に入手可能な蛍光タンパク質を本アッセイにおいて用いることができる。MAX Efficiency Stbl細胞(Invitrogen)中への形質転換の後、QiaPrep Spin Miniprep Kit(Qiagen,Hilden,Germany)を用いてDNAを調製した。Amaxaヌクレオフェクション法を用いて組換えプラスミドを293T細胞中にトランスフェクションした後、調製されたウイルスを、U87−CD4、U87−CD4−CXCR4及びU87−CD4−CCR5細胞の感染に用いた(図2)。37℃における120時間のインキュベーションの後、蛍光顕微鏡により感染を視覚化した。BigDye Terminatorサイクル配列決定キット(Applied Biosystems)を用いて組換えプラスミド及びウイルス株を配列決定し、ABI 3730 XL−自動シークエンサー上に流した。SeqScape v2.5(Applied Biosystems)を用いて配列修正及びコンティグ集合を行なった。
クローン遺伝子型的V3−ループ向性予測
一人のHIV−1−感染患者を、クローン遺伝子型的及び表現型的向性分析のために無作為に選んだ。Virco TypeTM分析は、選ばれたHIV−1株がすべてのFDAに承認されたプロテアーゼ及びRT阻害剤に感受性であることを示した。さらに、血漿試料は5.48 log IU/mlのウイルス負荷量を含有し、患者が前以て処置を受けていないことを示した。GPRT(Virco Type TM)及びEnv NH2−V4−配列の両方に基づくクレーディングは、選ばれた株がクレードBであることを示した。
Specific Scoring Matrix)及びSVM(Support Vector Machine)による向性予測のために選択した。4種のカテゴリー:R=R5−向性、X=X4−向性、U=予測不可能であるRR、XX、RX及びRUを特性化し、ここでそれぞれの二重項(duplet)中の第1の文字はPSSMによる予測を示し、第2の文字はSVMによる予測を示す。2つのアルゴリズムの間で、11.7%の一致したR5予測及び16.7%の一致したX4予測が観察された。クローンのほとんど12%は一致しない予測(PSSMによりR5及びSVMによりX4)を示し、クローンの60%はSVMにより予測を与えなかった。PSSMプロット(図3)及び配列ロゴ(図4)は、選ばれたHIV−1株における大きな可変性を示した。さらに、PSSMスコアは、1)両プログラムによりR5と予測されたクローン(RR群)から2)SVMによる予測なしに対してPSSMによるR5を有するクローン(RU群)に、3)一致しない結果を有するクローン(PSSMによりR5及びSVMによりX4,RX群)に、4)一致したX4クローン(XX群)に徐々に増加することが観察された。最後に、R5予測に関するカット−オフ(−7.3)とX4予測に関するカット−オフ(−3.2)の間の中間区域内に1個のみのクローン(RX群から)が位置することを観察することができた。
12個のクローン:クローン1及び74(RR群)、クローン14及び83(RU群)、クローン27及び30(RX群)ならびにクローン23、54、59、72、80及び87(XX群)を、表現型的向性決定のために選択した。選ばれたクローンのいくつかの特性を含むNH2−V4ヌクレオチド整列を行い、図6に示した。
にした。向性アルゴリズムは、単離物の共−受容体に関して明白な親和性を有する単離物(RR及びXX群、おそらくRU群も)に関しては正確であり、一致しない予測を示す単離物(RX及びおそらくRU群)のためには改善を要する。
Claims (9)
- HIVに感染した患者におけるCCR5からCXCR4又はCXCR4からCCR5へのHIV−1共−受容体使用における量的シフトである量的向性を予測するための各種データの収集方法であって、
a)患者から予め得られたウイルス遺伝物質を含む試料を用意する工程、
b)該試料からウイルス遺伝物質を抽出し、続いて、
1.特定のHIV領域のウイルス遺伝物質を増幅する段階、
2.アンプリコン一体性を分析し且つ試料をプールする段階、
3.プールされたアンプリコンを精製する段階、
4.アンプリコンのプールをベクター中に連結し、そして連結された生成物をコンピテント細胞中に形質転換する段階、
5.得られる個々の形質転換細胞を分析する段階、
6.得られる単クローン(single clones)を配列決定して単クローン遺伝子型配列を得る段階
を含む単ゲノム配列決定を行う工程、
c)該遺伝子型配列を用い、以下の
1.該遺伝子型配列において、少なくとも1つの自然の可変性(variability)、後天的可変性、薬剤選択突然変異又は突然変異パターンが量的向性と関連する遺伝子パターン(genetic pattern)を同定する段階、
2.段階1において遺伝子配列中で同定される自然の可変性、後天的可変性、薬剤選択突然変異又は突然変異パターンの少なくとも1つに類似の遺伝子パターンを有する少なくとも1つの遺伝子型エントリーに関して遺伝子型/表現型相関データベースを検索する段階、
3.相関遺伝子型/表現型データベースにおいて適合する表現型を有する類似の遺伝子パターンを有する該少なくとも1つの遺伝子型エントリーを得る段階、次いで
4.類似の遺伝子パターンを有する少なくとも1つの遺伝子型エントリーのデータベースからHIV表現型を予測する段階
を含む予測アルゴリズムを用いて特定の向性を予測する工程、
d)さらなる工程であって、
1.予測可能な向性を含まないクローン配列を単クローン生物学的表現型決定アッセイにおいて分析する段階、
2.該分析の後に得られる情報をc)工程で用いられる相関遺伝子型−表現型データベースに負荷する(loaded)段階
をさらに含み、かつ、該単クローン生物学的表現型決定アッセイが以下の
(1)配列番号:6を有するベクターpHXB2D−ΔNH2−V4−eGFPを用いることによりクローンの部分的もしくは全長HIVゲノムを形成する段階、
(2)該ゲノムを用いて、組換えHIVを得るのに適した主鎖と一緒に又は全長HIV−1ゲノムとして直接、哺乳類細胞をトランスフェクションする段階、
(3)細胞系を該組換えHIVに感染させ、感染プロセスが起こっているそれらの生物学的表現型を決定する段階、
(4)その後、得られる情報をc)工程で用いられる相関遺伝子型−表現型データベースに負荷する段階
を含む、工程、並びに
e)HIV感染患者の試料中に存在するすべての単配列クローンに関し、c)工程の段階1〜4で得られる情報に基づいて前記向性を予測する工程、
を含んでなる、前記量的向性を予測するための各種データの収集方法。 - d)工程の単クローン生物学的表現型決定アッセイにおける、段階(2)のトランスフェクション及び段階(3)の感染を一段階で行なうことを特徴とする、請求項1に記載の方法。
- b)工程の段階1における特定のHIV領域のウイルス遺伝物質の増幅をRT−PCR又はPCRにより行なうことを特徴とする、請求項1又は2に記載の方法。
- b)工程の段階4で用いられるコンピテント細胞がE.コリ(E.Coli)、酵母又はバチルス(Bacillus)であることを特徴とする、請求項1〜3のいずれかに記載の方法。
- 全長HIVゲノム中に導入されるマーカー遺伝子によるか、若しくは指示細胞系(indicator cell line)中に導入されるマーカー遺伝子によるか、又は細胞変性効果スコアリング(scoring)又はシンシチウム(syncitia)形成により顕微鏡的に感染プロセスを監視することを特徴とする、請求項1〜4のいずれかに記載の方法。
- HIVに感染した患者の試料から得られ且つ配列決定されたHIV配列を量的向性の予測のためのアルゴリズムに続いて相関遺伝子型−表現型データベース中に負荷し、その後、該向性を報告することを特徴とする、請求項1〜5のいずれかに記載の方法。
- 患者からの試料が血液試料、生検試料、血漿試料、唾液試料、組織試料及び体液又は粘液試料から選ばれる生物学的試料から得られることを特徴とする、請求項1〜6のいずれかに記載の方法。
- さらにHIVに感染した患者の試料においてウイルス負荷量(viral load)を決定することを特徴とする、請求項1〜7のいずれかに記載の方法。
- 報告が請求項1〜8記載のいずれかの方法を用いて予測される表現型又は向性を含む報告の作成法。
Applications Claiming Priority (5)
Application Number | Priority Date | Filing Date | Title |
---|---|---|---|
EP06101294.4 | 2006-02-03 | ||
EP06101294 | 2006-02-03 | ||
EP06115363 | 2006-06-13 | ||
EP06115363.1 | 2006-06-13 | ||
PCT/EP2007/051035 WO2007088201A1 (en) | 2006-02-03 | 2007-02-02 | Quantitative hiv phenotype or tropism assay |
Publications (2)
Publication Number | Publication Date |
---|---|
JP2009525035A JP2009525035A (ja) | 2009-07-09 |
JP5297814B2 true JP5297814B2 (ja) | 2013-09-25 |
Family
ID=38009204
Family Applications (1)
Application Number | Title | Priority Date | Filing Date |
---|---|---|---|
JP2008552821A Expired - Fee Related JP5297814B2 (ja) | 2006-02-03 | 2007-02-02 | 量的hiv表現型又は向性アッセイ |
Country Status (6)
Country | Link |
---|---|
US (1) | US8790870B2 (ja) |
EP (1) | EP1987458A1 (ja) |
JP (1) | JP5297814B2 (ja) |
AU (1) | AU2007211495B2 (ja) |
CA (1) | CA2637307A1 (ja) |
WO (1) | WO2007088201A1 (ja) |
Families Citing this family (5)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
JP2010521156A (ja) * | 2007-03-16 | 2010-06-24 | 454 ライフ サイエンシーズ コーポレイション | Hiv薬物耐性バリアントの検出のためのシステムおよび方法 |
WO2009100284A2 (en) * | 2008-02-06 | 2009-08-13 | University Of Massachusetts | Detection of human immunodeficiency virus co-receptor tropism in aviremic subjects |
WO2009115594A2 (en) * | 2008-03-21 | 2009-09-24 | Virco Bvba | Genetic detection of hiv-1 strains that use the cxcr4 co-receptor |
US9265843B2 (en) | 2008-03-27 | 2016-02-23 | The Ohio State University | Treatment of metabolic-related disorders using hypothalamic gene transfer of BDNF and compositions therefor |
US7888034B2 (en) * | 2008-07-01 | 2011-02-15 | 454 Life Sciences Corporation | System and method for detection of HIV tropism variants |
Family Cites Families (15)
Publication number | Priority date | Publication date | Assignee | Title |
---|---|---|---|---|
US6057102A (en) * | 1996-08-08 | 2000-05-02 | The Aaron Diamond Aids Research Center | HIV coreceptor mutants |
US6214450B1 (en) * | 1998-02-25 | 2001-04-10 | Tremco Incorporated | High solids water-borne surface coating containing hollow particulates |
DE60022036T2 (de) * | 1999-05-28 | 2006-06-08 | Virco N.V. | Neue mutationsprofile der hiv-1 reverse transcriptase in verbindung mit phänotypischem medikamentresistenz |
AU1331701A (en) | 1999-10-12 | 2001-04-23 | Board Of Regents, The University Of Texas System | Screening for disease susceptibility by genotyping the ccr5 and ccr2 genes |
AU2001233513A1 (en) * | 2000-02-04 | 2001-08-14 | K.U. Leuven Research And Development | Hiv-1 resistance assay |
DE60135366D1 (de) * | 2000-04-18 | 2008-09-25 | Virco Bvba | Methode zur bestimmung der resistenz gegen medikamente |
WO2002027321A2 (en) * | 2000-09-26 | 2002-04-04 | Health Research Incorporated | Analysis of hiv-1 coreceptor use in the clinical care of hiv-1-infected patients |
BR0115132A (pt) * | 2000-10-20 | 2004-06-15 | Virco Bvba | Perfis mutacionais em transcriptase reversa de hiv-1 correlacionados com resistência à droga fenotìpica |
DE10113042B4 (de) * | 2001-03-09 | 2006-12-21 | Bernhard-Nocht-Institut für Tropenmedizin | HIV-Inhibitor Screening-System |
US7097970B2 (en) * | 2001-06-04 | 2006-08-29 | Monogram Biosciences, Inc. | Methods of evaluating viral entry inhibitors using patient derived envelope protein constructs |
US20040110125A1 (en) * | 2001-06-04 | 2004-06-10 | Petropoulos Christos J. | Compositions and methods for evaluating viral receptor/co-receptor usage and inhibitors of virus entry using recombinant virus assays |
US6958211B2 (en) * | 2001-08-08 | 2005-10-25 | Tibotech Bvba | Methods of assessing HIV integrase inhibitor therapy |
DE60327768D1 (de) | 2002-07-01 | 2009-07-09 | Tibotec Pharm Ltd | Mutationsprofile bei mit phänotypischer medikamentenresistenz korrelierter hiv-1-protease |
WO2004111907A2 (en) * | 2003-06-10 | 2004-12-23 | Virco Bvba | Computational method for predicting the contribution of mutations to the drug resistance phenotype exhibited by hiv based on a linear regression analysis of the log fold resistance |
JP5213228B2 (ja) * | 2004-03-02 | 2013-06-19 | ビルコ・ビーブイビーエイ | 臨床的カット−オフ値の推測 |
-
2007
- 2007-02-02 AU AU2007211495A patent/AU2007211495B2/en not_active Ceased
- 2007-02-02 JP JP2008552821A patent/JP5297814B2/ja not_active Expired - Fee Related
- 2007-02-02 US US12/159,813 patent/US8790870B2/en not_active Expired - Fee Related
- 2007-02-02 CA CA002637307A patent/CA2637307A1/en not_active Abandoned
- 2007-02-02 EP EP07704322A patent/EP1987458A1/en not_active Ceased
- 2007-02-02 WO PCT/EP2007/051035 patent/WO2007088201A1/en active Application Filing
Also Published As
Publication number | Publication date |
---|---|
AU2007211495B2 (en) | 2012-11-15 |
JP2009525035A (ja) | 2009-07-09 |
AU2007211495A1 (en) | 2007-08-09 |
EP1987458A1 (en) | 2008-11-05 |
CA2637307A1 (en) | 2007-08-09 |
WO2007088201A1 (en) | 2007-08-09 |
US8790870B2 (en) | 2014-07-29 |
US20090047661A1 (en) | 2009-02-19 |
Similar Documents
Publication | Publication Date | Title |
---|---|---|
US6958211B2 (en) | Methods of assessing HIV integrase inhibitor therapy | |
Strain et al. | Genetic composition of human immunodeficiency virus type 1 in cerebrospinal fluid and blood without treatment and during failing antiretroviral therapy | |
US20170198330A1 (en) | Method for designing a drug regime for hiv-infected patients | |
Nelson et al. | Evolutionary variants of the human immunodeficiency virus type 1 V3 region characterized by using a heteroduplex tracking assay | |
JP5297814B2 (ja) | 量的hiv表現型又は向性アッセイ | |
US7718356B2 (en) | Heteroduplex tracking assay | |
Ndung'u et al. | HIV-1 subtype C in vitro growth and coreceptor utilization | |
US7306901B2 (en) | Methods and means for assessing HIV envelope inhibitor therapy | |
Coetzer et al. | Longitudinal analysis of HIV type 1 subtype C envelope sequences from South Africa | |
US20050142540A1 (en) | Methods and reagents for molecular detection of HIV-1 groups M, N and O | |
Curran et al. | Concordance between semen‐derived HIV‐1 proviral DNA and viral RNA hypervariable region 3 (V3) envelope sequences in cases where semen populations are distinct from those present in blood | |
Chaudhary et al. | Correlation between CD4 T cell counts and virus compartmentalization in genital and systemic compartments of HIV-infected females | |
AU2008203488A1 (en) | Heteroduplex Tracking Assay | |
CN101379502A (zh) | 量化hiv表型或趋向性试验 | |
JP3351773B2 (ja) | Hiv−1のサブタイプ決定法 | |
Land et al. | Full-length HIV type 1 proviral sequencing of 10 highly exposed women from Nairobi, Kenya reveals a high proportion of intersubtype recombinants | |
Yabar et al. | Polymorphism, recombination, and mutations in HIV type 1 gag-infecting Peruvian male sex workers | |
Ait‐Khaled et al. | Sequence variation within the human immunodeficiency virus V3 loop at seroconversion | |
Song et al. | Rapid CD4 cell loss is caused by specific CRF01_AE cluster with V3 signatures favoring CXCR4 usage | |
Abisi | HIV-1 Genetic Diversity in Nairobi Female Sex Workers | |
Santos‐Costa et al. | Molecular characterization of the env gene of two CCR5/CXCR4‐independent human immunodeficiency 2 primary isolates | |
Wei et al. | Distribution and quantification of human immunodeficiency virus type 1, strain JC499, proviral DNA in tissues from an infected chimpanzee | |
Jain et al. | Genetic polymorphisms of Hiv-1 resistance-conferring polymorphisms (Sdf1-3′ A, Ccr2-64i and Ccr5-Δ32) in Population of Madhya Pradesh | |
Chopera | Impact of Cytotoxic T Lymphocyte (CTL) escape mutations in acute/Early HIV-1 Subtype C Infection on Disease Progression | |
US20150299814A1 (en) | Reagents and methods for HIV coreceptor tropism genotyping |
Legal Events
Date | Code | Title | Description |
---|---|---|---|
A621 | Written request for application examination |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A621 Effective date: 20091228 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20120424 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120724 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120731 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20120824 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20120831 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120924 |
|
A131 | Notification of reasons for refusal |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A131 Effective date: 20121030 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130130 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130206 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130220 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130227 |
|
A601 | Written request for extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A601 Effective date: 20130319 |
|
A602 | Written permission of extension of time |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A602 Effective date: 20130327 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130411 |
|
A521 | Written amendment |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20120924 Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A523 Effective date: 20130411 |
|
TRDD | Decision of grant or rejection written | ||
A01 | Written decision to grant a patent or to grant a registration (utility model) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A01 Effective date: 20130528 |
|
A61 | First payment of annual fees (during grant procedure) |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: A61 Effective date: 20130617 |
|
R150 | Certificate of patent or registration of utility model |
Free format text: JAPANESE INTERMEDIATE CODE: R150 |
|
LAPS | Cancellation because of no payment of annual fees |