CN101379502A - 量化hiv表型或趋向性试验 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及用于预测感染人类免疫缺陷病毒(HIV)的患者的量化表型例如gag－表型、整合酶表型或趋向性的方法。

Description

量化HIV表型或趋向性试验
技术领域
本发明涉及用于预测感染人类免疫缺陷病毒(HIV)的患者中的量化表型例如gag-表型、整合酶表型或趋向性的方法。
背景技术
人类免疫缺陷病毒，通常称为HIV，是主要感染人类免疫系统的重要组成部分诸如CD4+T细胞、巨噬细胞和树突细胞的逆转录病毒。HIV甚至直接地或者间接地破坏CD4+T细胞。当已有足够多的CD4+T细胞被HIV破坏时，免疫系统几乎不能发挥作用，这将导致AIDS(获得性免疫缺陷综合征)。此外，HIV直接攻击器官，诸如肾、心脏和大脑，导致急性肾功能衰竭、心肌病、痴呆和脑病。感染HIV的人们所面对的许多问题源自于免疫系统不能保护其免受机会性感染和癌症。据认为AIDS源自于二十世纪的撒哈拉以南的非洲地区，现在则为全球流行。在2004年末，UNAIDS估计近4千万人携带HIV。世界卫生组织估计AIDS流行已夺走超过3百万人的生命，同年则有5百万人感染HIV。目前，估计已有2千8百万人死亡，仅非洲就感染9千万人，仅在非洲大陆就导致最低估计1千8百万的孤儿。
为感染细胞，病毒必须首先能够进入其中。HIV是包膜病毒，通过融合病毒细胞膜和细胞质膜实现进入细胞。该过程通过病毒包膜蛋白gp120和gp41进行，它们作为切割之前的单一160kD蛋白而被合成。此切割的产物保持相连直至病毒进入细胞的过程开始。gp120结合CD4+T淋巴细胞和单核细胞/巨噬细胞系的细胞上的CD4。此结合事件以及gp120和细胞辅助受体之间的进一步相互作用导致gp120脱离gp41。所述gp120的脱离作为gp41的构象变化的一部分发生，所述构象变化使gp41处于“融合活性”形式。此形式的gp41能介导所述细胞和病毒膜之间的融合。HIV进入的主要细胞受体是CD4。然而，在目标细胞上CD4的表达对HIV进入和感染是必要但不充分的。在细胞表面与CD4共表达时，数种趋化因子受体用作辅因子以允许HIV进入。
CCR5和CXCR4是HIV所使用的进入人类细胞的主要辅助受体。根据该辅助受体的使用，在1998年建立了新的HIV分类，即，CCR5-趋向性(R5)、CXCR-趋向性(X4)，或双趋向性(R5/X4)HIV毒株。早几年已鉴定出病毒表型(即，非合胞体诱导型，NSI或合胞体诱导型，SI)和HIV毒株的毒力之间的关系。
目前的知识显示，在体外，R5病毒通常响应于T-细胞系上的NSI并能够在单核细胞-巨噬细胞(M-趋向性)中复制，所有特征先前关联于更小毒力的毒株。相反，X4毒株是T-细胞系上的SI并优选在T淋巴细胞上复制(T-趋向性)，致病性更强的病毒株的所有特征。基于这样的知识，认为HIV辅助受体的使用与疾病进程相关。
这些辅因子中第一个被鉴别的是CXCR4，或融合素，其在T细胞上表达(Feng等，HIV-1 entry cofactor:functional cDNA cloning of aseven-transmembrane，G protein-coupled receptor.Science 1996 May 10；272(5263):872-877.)。CXCR4和CD4在细胞上的共表达允许T-趋向性HIV分离物与细胞融合并感染之。CXCR4在许多T细胞上表达，但通常不在巨噬细胞上表达，因此不允许与巨噬细胞-趋向性(M-趋向性)HIV分离物相融合(Feng等，1996)。
在鉴别出CXCR4之后不久，鉴别出另一辅助受体。在巨噬细胞和一些T细胞群体上表达的CCR5也能与CD4协同作用从而允许HIV膜融合(Deng等，Identification of a maj or co-receptorfor primary isolates ofHIV-1.Nature 1996 Jun 20；381(6584):661-6.)。HIV gp120与CCR5结合是CD4-依赖性的，因为CD4的抗体抑制能减少87％的与CCR5的结合(Trkola等，CD4-dependent，antibody-sensitive interactions betweenHIV-1 and its co-receptor CCR-5.Nature 1996 Nov 14；384(6605):184-7)。M-趋向性HIV分离物似乎使用CCR5作为其辅助受体以感染巨噬细胞和一些T细胞。
该两种更大的HIV受体，如上所述已知为CCR5和CXCR4，的存在意味着不同的病毒变种分类为三类:R5、X4和R5X4，依次与它们能唯一地通过所述两种受体中的一种或者能通过两种受体进入细胞的能力相符合。CCR5和CXCR4属于7次跨膜G蛋白-偶联受体家族(seven-transmembrane G protein-coupled receptorfamily)。它们呈现为由四个跨膜结构域、三个细胞外环和一个N-端结构域构成的α-螺旋结构。所述CD4-gp120复合体通过gp120的V3可变域与辅助受体相结合，虽然其他pg120区域诸如V1/V2和C4也牵涉在该相互作用之中。然而，V3的氨基酸序列似乎是CCR5或CXCR4的使用的主要决定因素。
术语病毒趋向性(viral tropism)是指所述病毒所感染并在其中进行复制的细胞类型。目前，病毒趋向性的测定不是作为诊断测试而进行的，但其的确代表了在HIV研究的某些领域中的极其有用的参数。此外，靶向HIV进入，更具体为靶向所述辅助受体CCR5或CXCR4的特定药物的引入，意味着在开始治疗前，HIV感染患者的病毒趋向性的表征将变得非常重要。辅助受体拮抗剂构成了很有前景的新类型的抗HIV-1药物，其中数种先导化合物目前正处在全面临床开发之中。
已开发出多种试验用于测定HIV趋向性。目前依然不清楚哪一种是最简便和可靠的方法。MT-2试验在1980年代后期广泛使用以测试HIV分离物的细胞病理效果并用以建立了将HIV毒株分为SI和NSI病毒的分类。所述MT-2细胞试验是基于在那些细胞表面上的CXCR4的单一表达，而非CCR5。然而主要缺点是需要由受刺激的患者PBMC(外周血单核细胞)获得病毒原液。所述MT-2测试可能并非最适合用于经辅助受体拮抗剂治疗的患者。另一种用于病毒趋向性测定的工具是采用重组病毒趋向性试验诸如Phenoscript(VIRalliance，巴黎)和PhenoSense(MonogramBiosciences，旧金山)。两种试验从患者血浆样品中扩增HIV-1包膜糖蛋白基因序列以分别制得可复制的或复制缺陷的重组病毒。然后将这些病毒用于感染表达CD4以及CCR5或者CXCR4辅助受体的细胞系，这将允许测定病毒趋向性。这些试验的严重局限是X4病毒在混合群体(R5+X4)中的检测阈，即，在混合病毒群体的存在下少数准种(minority quasispecies)的检测阈。该局限在用CCR5拮抗剂进行治疗的患者中具有重要含义，在所述患者体内，X4病毒的出现作为基线处的少数群体将是优化的。
在开始用CCR5拮抗剂进行治疗之前的辅助受体利用率(或趋向性)的测试对避免在感染CXCR4或双趋向性毒株的患者体内使用这些化合物是非常关键的。HIV趋向性的分子基础目前仍在研究之中，但一些研究者表示可能涉及所述gp120包膜蛋白的V3环。已开展研究鉴别在所述V3结构域中哪些残基在确定病毒辅助受体的使用中被牵涉到。似乎没有单一的变化对趋向性负责，但多个基因型簇能确定病毒趋向性。已做出多种算法根据V3基因序列预测HIV辅助受体的使用。
然而，急切需要病毒包膜趋向性确定试验，其能够准确地高灵敏度地确定病毒株的辅助受体使用。由于成功的进入抑制剂的开发，着眼于评价病毒包膜变异对于抗进入抑制剂和融合抑制剂的耐性的影响的试验对于指导HIV治疗将将毫无疑问地变得非常重要。
由于感染HIV的患者体内有多种病毒亚型，每一种都有其自身的辅助受体使用，因此非常重要的是分析在整个患者病毒群体中的趋向性表型分布。此外，由于预测趋向性表型的方法是根据高度可变区的核苷酸和/或氨基酸序列，因此必须在克隆水平测定序列。
因此，对于允许对患者体内的HIV感染中的病毒趋向性进行表征的可靠的方法明确地存在未能被满足的需求，这将对我们对于在临床分离物中CCR5和CXCR4-趋向性准物种的可变性和分布的知识贡献良多，所采用的技术是对于任何分析实验室而言简单的和能用到的，系统是目前还不可得的。
发明内容
本公开描述了鉴别HIV辅助受体使用(HIV co-receptor usage)作为疾病进程标志的方法和由此而得的趋向性测试。
至少两种趋向性预测算法PSSMhttp://ublk.microbiol.washington.edu/computing/pssm和Geno2Pheno(G2P)(被指明为是支持向量机方法的工具(SVM))http://coreceptor.bioinf.mpi-sb.mpg.de/cqi-bin/coreceptor.pl/是公开提供的，二者均基于所述HIV-1env的V3-环的特殊氨基酸特性的分析。然而，这些算法的预测值依然是有局限的。
采用克隆V3env序列，在由所述PSSM得到的预测和通过SVM模型得到的预测之间进行比较。在两种程序模型之间发现R5-趋向性分离物(R5-tropic isolates)的高度一致，而X4预测则明显具有更小的一致性。
更具体而言，本公开描述了用于预测在感染HIV的患者体内的量化表型例如gag-表型、整合酶表型或趋向性(tropism)的方法，所述方法包括
a)使用来自所述患者的含有病毒基因材料的样品；
b)从所述样品中提取病毒基因材料，随后进行单基因组测序，包括以下步骤:
1.特定HIV区域的病毒基因材料的扩增
2.扩增子完整性(amplicon integrit)的分析和样品收集(pooling ofsamples)
3.所收集的扩增子的纯化
4.将扩增子集合(pool of amplicons)连接到载体中并将所连接的产物转化入感受态细胞
5.获得的各个转化体的分析
6.对所得单克隆进行测序以得到单克隆基因型序列；
c)利用预测算法使用所述基因型序列对具体表型例如gag-表型、整合酶表型或趋向性进行预测，包括以下步骤:
1.在所述基因型序列中鉴定基因模式(genetic pattern)，其中至少一种自然变异(natural variability)、获得性变异、药物选择突变或突变模式(mutation pattern)与所述量化表型结果，例如gag表型、整合酶表型或趋向性相关，
2.搜索基因型/表型相关数据库(genotype/phenotype correlativedatabase)中至少一条基因型条目，其具有与在步骤c1的所述基因序列中鉴定的至少一种自然变异、获得性变异、药物选择突变或突变模式相似的基因模式，
3.在所述相关基因型/表型数据库中获得所述至少一条具有与匹配表型相似基因模式的基因型条目，和
4.从所述至少一条具有相似基因模式的基因型条目的数据库中预测所述HIV表型；
d)对HIV感染患者的样品中存在的每一个单一序列克隆，根据步骤c1～c4中获得的信息预测所述量化表型例如gag表型、整合酶表型或趋向性。
本发明的方法可进一步在步骤(c)之后和步骤(d)之前包括以下两步附加步骤，其中
1.在单一克隆生物表型试验(single clone biological phenotypingassay)中分析没有可预测表型的克隆序列和
2.在所述分析后获得的信息输入在步骤(c)中使用的相关基因型-表型数据库。
以上单一克隆生物表型试验包括以下步骤:
1.生成克隆的部分或全长HIV基因组
2.用所述基因组转染哺乳动物细胞，或者与合适的主干一起进行以获得重组HIV，或者直接作为全长的HIV-1基因组
3.通过所述重组HIV对细胞系的感染确定其中发生感染过程的生物表型。
4.随后，获得的信息输入在步骤(c)中使用的相关基因型-表型数据库。
上述步骤中的两步即步骤2(转染)和步骤3(感染)可以一步进行。
在步骤(b1)中的特殊HIV区域的病毒基因材料的扩增或者通过RT-PCR或者通过PCR进行。在步骤(b4)中使用的感受态细胞是大肠杆菌、杆菌(Bacillus)或酵母。
上述感染过程可以或者通过在所述全长HIV基因组中导入的标记基因或者通过在指示细胞系(indicator cell line)中导入的标记基因，或者显微地通过细胞病变效果评分，或者通过合胞形成(syncitia formation)进行监测。
在本发明的另一实施方式中，在报道所述表型或趋向性后，根据量化表型例如gag表型、整合酶表型或趋向性的预测算法，将由感染HIV的患者的样品获得和测序的HIV序列输入相关基因型-表型数据库。
gag表型是指例如蛋白酶或gag抑制剂耐受性，而整合酶表型是指例如进入抑制剂耐受性(entry inhibitor resistance)。
来自患者用于进行所述方法的样品是获得自选自血液样品、活组织检查(biopsy)样品、血浆样品、唾液样品、组织样品和体液或粘液样品的生物样品。
除目前的方法之外，根据本发明，在感染HIV的患者的样品中确定病毒载量。
本发明的一部分是所述量化趋向性的预测，作为HIV-1辅助受体使用的量化偏移，例如由或者CCR5至CXCR4，由CXCR4至CCR5，或者由双趋向性病毒至CCR5或者CXCR4。
在本发明的另一实施方式中，量化gag-表型的预测与HIV-1蛋白酶活性相关，这是在所述gag开放阅读框和/或在gag-切割位点的自然变异或药物-诱导/选择变异的结果。
作为另外一种选择，本发明的一部分是所述量化整合酶表型的预测，将其与HIV-1整合酶活性相关，这是在所述整合酶开放阅读框和/或整合酶供体/受体位点的自然变异或药物-诱导/选择变异的结果。
作为本发明的方法的最终结果，生成一份报告，其中所述报告包括所预测的表型或趋向性，向治疗医师提供HIV疗法或治疗的指导。
本发明的一部分是计算机可读的介质，其中包括利用根据本发明进行的任何方法所预测的表型或趋向性。
具有SEQ ID NO:6的载体pHXB2D-ΔNH2-V4-eGFP和所述具有SEQ ID NO:6的载体pHXB2D-ΔNH2-V4-eGFP的用途也属于本发明。
附图说明
在图1中，流程图显示了在本发明中使用的方法概要。
图2显示了重组临床envNH2-V4扩增子进入pHXB2D-ΔNH2-V4-eGFP主干，克隆到细菌之中，在293T细胞中全长HIV基因组重组质粒的核转染和重组病毒进入U87-CD4(-CXCR4或-CCR5)细胞的感染的图解示意。
图3.按照克隆编号的PSSM分数。根据其通过PSSM和SVM的预测将克隆分组。为表型而选择的克隆用其相应的数字标记。
图4.序列标示表示在所述60个克隆中存在的V3环的变异。在所述标示中每个堆叠的总高度指示了在该位置的序列保守性，而在所述堆叠中每个字母的高度与其在该位置的相对频率成比例。
图5.被研究的HIV感染受试对象的系统发育树。根据基于PSSM和SVM的预测的分类对分支进行着色:深绿色:两个程序均预测的R5；浅绿色:PSSM预测的R5而SVM未预测；蓝色:PSSM的R5预测和SVM的X4预测；红色:两个程序均为X4预测。所述X4序列的Bootstrap值显示在其分支底部。刻度指示了根据核苷酸比对的遗传距离。
图6.经选择的12个克隆的NH2-V4区域的核苷酸比对和HXB2D保守碱基对以蓝色显示，而相同的碱基对以黄色显示。Env V1、V2、V3和V4环以红线显示。
图7.用经选择的12个克隆感染的U87-CD4-CXCR4和U87-CD4-CCR5和阳性对照(HXB2D-eGFP和HXB2D-JRCSF-eGFP)和阴性对照(HXB2D-ΔNH2-V4-eGFP)的荧光显微图。
实施例
实施例1
RNA提取
随机选择三种临床血浆样品，并标注为患者1、2&3。从总共300μl血浆中，采用EasyMagTM RNA提取平台(Biomérieux，Boxtel，荷兰)提取总RNA。在25μl洗脱缓冲液中洗脱之后，5μl的洗出液用于病毒载量测量，其使用
Figure A200780004470D00121
EasyQ HIV-1v1.1系统(Biomérieux，Boxtel，荷兰)。其余的RNA样品用于形成扩增子。
扩增子形成
剩余的20μl RNA与2×反应缓冲液、0.2μM引物Env_6210F(CAGAAGACAGTGGCAATGAGAGTGA)(SEQ ID NO:1)，0.2μM引物HMA_R3(ATGGGAGGGGCATACATTGCT)(SEQ ID NO:2)和2单位获得自SuperScriptTM IIIOne-Step RT-PCR系统(Invitrogen，Merelbeke，比利时)的
Figure A200780004470D00122
 TaqHigh Fidelity相混合，总体积为120μl。该混合物分为8个反应，每个15μl，反转录在53℃进行30分钟。初始变性在94℃进行2分钟，热循环由50个循环的在92℃变性15秒，在55℃退火30秒和在68℃延伸1分钟20秒构成。最终延伸在68℃进行7分钟。收集所得的扩增子，用LC90平台(Caliper，Mountainview，加利福尼亚)进行分析，随后用QiaQuick凝胶纯化试剂盒(Qiagen，Hilden，德国)进行纯化。所述纯化扩增子收集物的最终体积为30μl。
TOPO-TA
Figure A200780004470D00123
总共2μl的纯化扩增子收集物用于连接入来自于TOPO TA测序试剂盒(Invitrogen，Merelbeke，比利时)的载体(商售可获得)，根据生产商说明书将一等分的One
Figure A200780004470D00126
 TOP10化学感受态细胞(Invitrogen，Merelbeke，比利时)用2μl的克隆反应混合物进行转化。
菌落PCR
使用无菌移液枪头，选出(手动或使用机器人)每临床样品中总共95个菌落(加上一个空白对照反应)接种到50μl PCR反应混合物中。后者由10×PCR缓冲液，25mM dNTP，0.33μM引物T3(ATTAACCCTCACTAAAGGGA)(SEQ ID NO:3)，0.33μM引物T7(TAATACGACTCACTATA GGG)(SEQ ID NO:4)和0.03单位的扩展高保真酶混合物(Expand High Fidelity Enzyme Mix)(Roche，Penzberg，德国)构成。热循环开始于在94℃的10分钟变性，10个循环的在94℃变性15秒，在50℃退火30秒，并在72℃延伸2分钟。随后是20循环的在94℃变性15秒，在50℃退火30秒和在72℃延伸2分钟并每个循环增加5秒。最终延伸在72℃进行7分钟。菌落PCR产物用Qiagen 9600 PCR纯化平台进行纯化，以50μl进行洗脱(Qiagen，Hilden，德国)。
循环测序
从每个经纯化的菌落PCR产物，取1μl与2.5×稀释缓冲液，1μl BigDye终止子混合物(Big Dye Terminator Mix)和0.2μM测序引物相混合，总体积为11.5μl。在独立的反应中用引物T3和T7对每个产物进行测序。热循环由25循环的在96℃变性10秒，在50℃退火5秒和在60℃延伸4分钟构成。用乙醇/乙酸钠沉淀移除过量的Big Dye，产物在95℃变性2分钟并在ABI3730毛细管测序仪上进行分析。
粗测序分析
从ABI3730毛细管测序仪得到毛细管电泳谱图并输入到Seqscapev2(Applied Biosystems，Foster City，CA，USA)。序列末端根据质量值和JR-CSF参考序列的长度进行修整；后者覆盖扩增引物之间的区域。
当生成序列时从所述分析中去掉某些克隆:
·没有覆盖所述扩增引物序列之间的令人感兴趣的整个区域
·含有终止STOP密码子
趋向性预测
1.V3-环氨基酸序列提取
因为所述PSSM预测算法要求氨基酸序列，所以进行了覆盖Env的氨基末端部分至所述V4-环部分的整个范围的核苷酸序列中所述V3-区域的正确翻译。通过对比含有HXB2 V3-环氨基酸序列的小数据库进行所翻译的核苷酸序列(在所有6个框架中)的BLAST搜索，可以划分出与V3最高匹配的区域。然后将这些区域提取出并进行翻译。
2.PSSM趋向性预测
通过上传所述V3-环氨基酸序列至:http://ublk.microsfu.washington.edu/computing/pssm(根据Jensen，M.A.，F.S.Li，A.B.van’t Wout，D.C.Nickle，D.Shriner，H.X.He，S.McLaughlin，R.Shankarappa，J.B.Margolick，和J.I.Mullins.2003Improved coreceptor usage prediction and genotypic monitoring ofR5-to-X4 transition by motif analysis of human immunodeficiency virustype 1 env V3 loop sequences.J Virol 77:13376-88.)生成所述位点特异性计分矩阵(PSSM)预测。
3.支持向量机(SVM)算法可在geno2pheno趋向性预测工具中获 得
由于所述geno2pheno辅助受体预测工具(称之为SVM)并不允许批量提交核苷酸序列，因此编写了Perl脚本自动提交所有序列，然后用另一Perl脚本解析HTML输出(SVM)以生成每名患者的geno2pheno趋向性预测。
4.SVM和PSSM趋向性预测的比较
SAS脚本将所有预测放入1个数据集并针对每个患者生成列联表(contingency tables)。
结果
随机选择三个临床分离物。由每个分离物，将病毒RNA逆转录，扩增数次，然后收集、纯化所得的扩增子，并在细菌细胞中克隆。对超过50个随机选择的克隆进行测序并提交至两个预测程序。该分析的结果显示在表1中。
表1.对获得自临床分离物的各个V3克隆的趋向性预测
Figure A200780004470D00141
G2P:采用SVM方法在http://coreceptor.bioinf.mpi-sb.mpg.de/cqi-bin/coreceDtor.pl/提供的预测工具；PSSM:在http://ublk.microbiol.washington.edu/computing/pssm提供的预测工具
双:预测V3序列感染同时表达CCR5和CXCR4的细胞。
无:标准设置下在SVM中不能提供预测。
对于在此研究中进行测试的每名患者，都有大量的克隆序列其在所述SVM算法中没有预测，而在所述PSSM方法中获得预测。所述预测工具的进一步改进是基于需要更大型的关系数据库以对这些预测进行微调。单克隆表型试验有助于建立这样的数据库。
实施例2
单克隆表型试验
将构成完整gp160或部分gp160的来自于患者的克隆序列通过BDIn融合系统导入到hXB2D-eGFP主干中，所述hXB2D-eGFP主干中的完整gp160或其部分已分别被去掉(SEQ ID NO:5)。HXB2D-eGFP是含有GFP以替代nef的载体(Chen等(1997)，J Virol 71:5495-5504)。替代作为标记的eGFP，其他公知的标记诸如荧光素酶或其他商售提供的荧光蛋白也可用在本试验中。对于每一个以此方式生成的来自于患者的全长重组HIV-eGFP克隆，准备了DNA并通过限制酶切分析进行核查。采用Amaxa核转染技术将一μg的正克隆转染至293T细胞。在转染后24～48小时收获病毒培养上清液，并用以感染U87细胞(U87亲代，U87-CD4，U87-CD4-CXCR4和U87-CD4-CCR5细胞)。通过荧光显微镜在感染后24～96小时测定辅助受体使用。作为另外一种选择，病毒培养上清液用以感染含有CXCR4-CCR5嵌合受体的U87(Karlsson等(2003)AIDS 17:2561-2569)。在此方法中，进行了关于由使用CCR5的病毒变化为CXCR4-趋向性病毒的潜力的预测
实施例3
未经治疗的HIV-1感染受试对象样品的基因型V3-环趋向性预测的 克隆表型确认
RNA提取和VircoTypeTM
从随机选择的HIV-1感染受试对象获得的总共300μl血浆中，采用EasyMagTM RNA提取平台(Biomérieux，Boxtel，荷兰)提取RNA。病毒载量通过NucliSens
Figure A200780004466D0021085136QIETU
 EasyQ HIV-1 v1.1系统(Biomérieux；输出为IU/ml)进行测定。生成VircoTypeTM。
扩增
使用SuperscriptTM III One-Step RT-PCR系统和
Figure A200780004470D0016092324QIETU
Taq HighFidelity(Invitrogen，Merelbeke，比利时)以7倍量逆转录和扩增RNA。将正向引物放置在Env的起始密码子之前，反向引物在EnvC4区域。PCR片段称为NH2-V4扩增子。
克隆测序
在收集后，所述扩增子克隆到
Figure A200780004470D0016092344QIETU
载体(Invitrogen)中。在转化到感受态TOP10 E.coli细胞中后，挑选单独的克隆，插入物通过菌落PCR用正向和反向质粒引物进行扩增。在纯化后，用BigDye终止子循环测序试剂盒(Applied Biosystems，Foster City，加利福尼亚，美国)进行测序，并在ABI 3730 XL自动测序仪上运行。用SeqScape v2.5(Applied Biosystems)进行序列编辑和重叠群组装(contig assembly)。
数据分析
用ClustalW进行比对(http://www.ebi.ac.uk/clustalw)，并用作建立序列标志(logo)的输入(http://weblogo.berkeley.edu/logo.cgi)。采用在所述网页上提供的标准设置，通过所述PSSM算法SVM(http://ubik.microbiol.washington.edu/computing/pssm)和(http://coreceptor.bioinf.mpi-sb.mpg.de/cgi-bin/coreceptor.pl/)根据所述V3环序列预测病毒趋向性。系统发育分析是基于完整NH2-V4序列(～1260bp)的核苷酸比对。计算距离(DNADIST)，构建树(NEIGHBOR)，并最终，建立一致树(CONSENSE)。通过EMBOSS程序patmatdb(http://bioweb.pasteur.fr/docs/EMBOSS/patmatdb.html)评估所述V3-环的N-连接糖基化。通过将所有的克隆序列与下载自Los Alamos网页(http://hiv-web.lanl.gov/content:index)的66个HIV-1分化枝参考株的相同区域进行比对从而进行基于NH2-V4序列的分化。得到相似性表并记录显示出与所有克隆有最高百分比同一性的参考毒株。
克隆表型
使用In-FusionTM CF Dry-Down Cloning Kit(BD Biosciences，Erembodegem，比利时)将克隆NH2-V4扩增子重组到pHXB2D-ΔNH2-V4-eGFP，基于hXB2D的含有eGFP的NH2-V4-删除主干(SEQ ID NO:6)。替代作为标记的eGFP，其他公知的标记诸如荧光素酶或其他商售提供的荧光蛋白也可用在本试验中。在转化入MAXEfficiency Stbl细胞(Invitrogen)之后，用QiaPrep Spin Miniprep Kit(Qiagen，Hilden德国)制备DNA。在用所述Amaxa核转染技术将重组质粒转染入293T细胞之后，所生成的病毒用于感染U87-CD4、U87-CD4-CXCR4和U87-CD4-CCR5细胞。(图2)。在37℃温育120小时以后，通过荧光显微镜观测感染。采用BigDye终止子循环测序试剂盒(BigDye Terminator cycle sequencing kit)(Applied Biosystems)对重组质粒和病毒原液进行测序，并在ABI 3730 XL自动测序仪上运行。用SeqScape v2.5(Applied Biosystems)进行序列编辑和重叠群组装(contig assembly)。
结果
克隆基因型V3-环趋向性预测
随机选择一名HIV-1-感染受试对象用于克隆基因型和表型趋向性分析。VircoTypeTM分析显示所选择的HIV-1毒株易感于所有FDA-批准的蛋白酶和RT抑制剂。此外，所述含有5.48log IU/ml的病毒载量的血浆样品指示出所述受试对象未经过治疗(treatment-
Figure A200780004470D0017092515QIETU
)。基于GPRT(VircoTypeTM)和基于Env NH2-V4-序列的分化(clading)均显示出所选择的毒株是分化株B。
在RNA提取之后，在单轮RT-PCR反应中，将所述NH2-V4区域扩增7倍。在收集和克隆所述NH2-V4扩增子进入所述pCR4-TOPO载体之后，挑选总共95个菌落进行测序。两个克隆不含有NH2-V4插入片段，4个克隆含有过早的终止密码子。
在所述剩余的89个克隆中，选择60个用于通过算法PSSM(位点特异性计分矩阵)和SVM(支持向量机)进行的趋向性预测。对四个不同的分类进行表征:RR、XX、RX和RU，其中R＝R5-趋向性，X＝X4-趋向性，U＝不可预测，由此在每个字母对中的首字母代表PSSM进行的预测，而第二个字母代表SVM进行的预测。在所述2种算法之间，观察到11.7％一致的R5和16.7％一致的X4预测。几乎12％的克隆显示出不一致的预测(PSSM预测为R5而SVM预测为X4)，而60％的克隆未由SVM做出预测。PSSM图(图3)和序列标志(图4)证明了在所选择的HIV-1毒株中的巨大可变性。此外，观察到所述PSSM分数由以下顺序逐渐增加1)两个程序均预测为R5的克隆(RR组)至2)PSSM预测为R5而SVM没有预测的克隆(RU组)至3)具有不一致的结果的克隆(PSSM预测为R5而SVM预测为X4，RX组)至4)一致的X4克隆(XX组)。最后，能观察到仅有一个克隆(来自于RX组)处于R5预测截止(-7.3)和X4预测截止(-3.2)之间的中间区。
为证明所述序列间的相关性，对完整的NH2-V4核苷酸区进行了系统发育分析(图5)。除所述巨大可变性之外，明确的是X4克隆簇集在一起和X4簇和R5簇之间的遗传距离相对较短。X4簇通过bootstraping评价为显著的。
对所有克隆进行筛选核查N-连接糖基化基序N{P}S/T{P}的存在，其在R5gp120和CCR5的相互作用中可能被涉及到，而它可能排除CXCR4使用。总体而言，11个克隆缺乏糖基化基序:10个克隆来自于XX组，1个克隆来自于RX组，其位于PSSM计分的中间区域(克隆30)。
克隆表型趋向性确定
选择十二个克隆用于表型趋向性确定:克隆1和74(RR组)，克隆14和83(RU组)，克隆27和30(RX组)和克隆23、54、59、72、80和87(XX组)。进行了包括所选择的克隆的一些特征的NH2-V4核苷酸比对并显示在图6中。
每个克隆NH2-V4区重组入pHXB2D-ΔNH2-V4-eGFP(SEQ ID NO:6)主干载体以获得HIV完整基因组质粒，在nef中携带eGFP。在转染入293T细胞之后，获得能够复制的重组病毒原液。对重组质粒和重组病毒原液的包括所述重组位点的NH2-V4区进行测序，显示与在所述克隆基因型试验中获得的原始克隆序列相比较没有错配。通过U87-CD4、U87-CD4-CXCR4和U87-CD4-CCR5的感染对重组病毒原液进行表型测试(图7)。选自RR组和RU组的克隆仅为R5-趋向性，而选自XX组的克隆仅显示出CXCR4使用。选自RX组的一个克隆显示出CCR5使用(克隆27)，而选自该组的另一克隆表型为双趋向性(克隆30)。令人感兴趣的是，后述克隆显示出-7.11的中间PSSM分数。
对未经治疗的HIV-1感染受试对象的克隆基因型和表型趋向性分析揭示了R5-、双-，和X4-趋向性病毒株的存在。对于与其辅助受体有明确亲合性的分离物，趋向性算法是准确的(RR和XX组，RU组也可能)，而对显示出不一致的预测的分离物需要进行改进(RX，RU组也可能)。
以上说明了该平台能够进行量化(NH2-V4克隆测序和NH2-V4克隆表型)趋向性测试，并具有在原始患者样品中存在的病毒准物种的准确复制。此外，NH2-V4群体表型(phenotyping)在40个不同的HIV-1样品上进行，并且在V3群体测序和所述NH2-V4群体表型之间观察到很好的相关性。
序列表
Figure A200780004470E00202
Figure A200780004470E00211
Figure A200780004470E00221
Figure A200780004470E00241
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Figure A200780004470E00361
Figure A200780004470E00391
Figure A200780004470E00401
Figure A200780004470E00411
Figure A200780004470E00431
Figure A200780004470E00441

Claims (19)

1.用于预测感染HIV的患者的量化表型例如gag-表型、整合酶表型或趋向性的方法，所述方法包括
a)使用来自所述患者的含有病毒基因材料的样品；
b)从所述样品中提取病毒基因材料，随后进行单基因组测序，包括以下步骤：
1.特定HIV区域的病毒基因材料的扩增
2.扩增子完整性的分析和样品收集
3.所收集的扩增子的纯化
4.将扩增子集合连接到载体中并将所连接的产物转化入感受态细胞
5.获得的各个转化体的分析
6.对所得单克隆进行测序以得到单克隆基因型序列；
c)利用预测算法使用所述基因型序列对具体表型例如gag-表型、整合酶表型或趋向性进行预测，包括以下步骤：
1.在所述基因型序列中鉴定基因模式，其中至少一种自然变异、获得性变异、药物选择突变或突变模式与所述量化表型结果，例如gag表型、整合酶表型或趋向性相关，
2.搜索基因型/表型相关数据库中至少一条基因型条目，其具有与在步骤c1的所述基因序列中鉴定的至少一种自然变异、获得性变异、药物选择突变或突变模式相似的基因模式，
3.在所述相关基因型/表型数据库中获得所述至少一条具有与匹配表型相似基因模式的基因型条目，和
4.从所述至少一条具有相似基因模式的基因型条目的数据库中预测所述HIV表型；
d)对HIV感染患者的样品中存在的每一个单一序列克隆，根据步骤c1～c4中获得的信息预测所述量化表型例如gag表型、整合酶表型或趋向性。
2.如权利要求1所述的方法，进一步在步骤(c)之后和步骤(d)之前包括以下步骤，其中
1.在单一克隆生物表型试验中分析没有可预测表型的克隆序列
2.在所述分析后获得的信息输入在步骤(c)中使用的相关基因型-表型数据库。
3.如权利要求2所述的方法，其中所述单一克隆生物表型试验包括以下步骤：
1.生成克隆的部分或全长HIV基因组
2.用所述基因组转染哺乳动物细胞，或者与合适的主干一起进行以获得重组HIV，或者直接作为全长的HIV-1基因组
3.通过所述重组HIV对细胞系进行感染以确定其中发生感染过程的生物表型。
4.随后，获得的信息输入在步骤(c)中使用的相关基因型-表型数据库。
4.如权利要求3所述的方法，其中步骤2(转染)和步骤3(感染)在单一步骤中进行。
5.如权利要求1～4所述的方法，其中在步骤(b1)中的特殊HIV区域的病毒基因材料的扩增或者通过RT-PCR或者通过PCR进行。
6.如权利要求1～5所述的方法，其中在步骤(b4)中使用的感受态细胞是大肠杆菌、酵母或杆菌(Bacillus)。
7.如权利要求3～6中任一项所述的方法，其中所述感染过程或者通过在所述全长HIV基因组中导入的标记基因或者通过在指示细胞系中导入的标记基因，或者显微地通过细胞病变效果评分，或者通过合胞形成进行监测。
8.如前述权利要求中任一项所述的方法，在报道所述表型或趋向性后，根据量化表型例如gag表型、整合酶表型或趋向性的预测算法，将由感染HIV的患者的样品获得和测序的HIV序列输入相关基因型-表型数据库。
9.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中来自患者的样品是获得自选自血液样品、活组织检查样品、血浆样品、唾液样品、组织样品和体液或粘液样品的生物样品。
10.如前述权利要求中任一项所述的方法，其中附加地在感染HIV的患者的样品中确定病毒载量。
11.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中所述量化趋向性的预测是HIV-1辅助受体使用的量化偏移，例如由或者CCR5至CXCR4，或者由CXCR4至CCR5。
12.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中量化gag-表型的预测与HIV-1蛋白酶活性相关，这是在所述gag开放阅读框和/或在gag-切割位点的自然变异或药物-诱导/选择变异的结果。
13.如权利要求1～10中任一项所述的方法，其中将所述量化整合酶表型的预测与HIV-1整合酶活性相关，这是在所述整合酶开放阅读框和/或在整合酶供体/受体位点的自然变异或药物-诱导/选择变异的结果。
14.生成报告的方法，其中所述报告包括采用权利要求1～13的方法中任何一种方法所预测的表型或趋向性。
15.计算机可读的介质，所述计算机可读的介质包括采用权利要求1～13的方法中任何一种方法所预测的表型或趋向性。
16.具有SEQ ID NO：6的载体pHXB2D-ΔNH2-V4-eGFP。
17.具有SEQ ID NO：6的载体pHXB2D-ΔNH2-V4-eGFP在如权利要求1～14中所述的任何一种方法中的用途。
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