JP5277440B2 - 核酸内包高分子ミセル複合体 - Google Patents
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Description
そこで近年、様々な合成高分子を用いた新たな非ウィルス型ベクターが開発されており、遺伝子の発現効率は大幅に改善されつつある。しかし、非ウィルス型ベクター及びウィルス型ベクターは、いずれも、遺伝子の発現を位置選択的に制御することが極めて困難である。多くの疾患においてタンパク質の発現は局所的な異常を見せるため、標的細胞への選択的な遺伝子の導入及び発現は極めて重要な課題である。
ところで、近年、紫外線、可視光及び赤外光等の光に反応する化合物を体内に取り入れ、標的箇所に光を照射することにより標的箇所を治療する、光力学療法(Photodynamic Therapy)が注目されている。この方法は、光照射がされた箇所においてのみ化合物が反応し、標的箇所、つまり標的組織の細胞を選択的に破壊する治療法である。
この光力学療法では、標的組織の細胞に対して高い親和性を有し、効率よく光励起される光反応性化合物(光増感性物質(光増感剤))が使用される(例えば、ポルフィリン化合物)。当該化合物は、光照射により周囲の酸素分子と反応し、光励起させ、酸化力の強い一重項酸素(Singlet Oxygen)に変換することができ、この一重項酸素が、周辺細胞を酸化して破壊する。
Bergらは、遺伝子、核酸医薬及びタンパク質医薬のエンドソームから細胞質への移行性を光選択的に高める手段として、Photochemical Internalization(PCI)及び光化学的遺伝子導入法を提案した(K.Berg et al.,Cancer Research,59,1180−1183(1999);A.Hogset et al.,Human Gene Therapy,11,869−880(2000)を参照)。これらの方法では、汎用の光増感性物質の存在下で細胞を培養し、遺伝子等を細胞に作用させた後、光照射を行うことにより、エンドソーム膜に光障害を与え、当該遺伝子等の細胞質への移行性を高めることができる。
しかし、この方法によると、原理的には、遺伝子等の機能発現を光照射により制御することができるが、光増感性物質がエンドソーム以外の細胞小器官にも非特異的に集積するため、細胞全体への顕著な光毒性を与えることがあり、実用化への大きな問題がある。実際に、Bergらにより、最大の遺伝子発現効率が得られる条件下では約50%の細胞が死滅することが報告されている(A.Hogset et al.,Human Gene Therapy,11,869−880(2000)を参照)。
このような問題を解決するためには、エンドソームに特異的に集積し、エンドソーム選択的に光障害を与える新しい光増感性物質の開発が必要である。そこで、光増感性物質をイオン性ポリマーで内包したミセル構造体が開発された。そして、核酸を内包したミセル構造体も別途調製し、両ミセル構造体を同時に標的細胞に作用させた後、細胞質内に核酸をデリバリーする技術が提案された(特開2005−120068号公報を参照)。
しかしこの方法においては、両ミセル構造体はそれぞれ別の物体であるため、両方をどのエンドソームにおいても共存させることは困難であり、標的細胞への核酸導入の効率化には限界があった。
そこで、上記共存の困難性を解決するものとして、コアとなる「核酸」に「カチオン性ポリマー」を結合させた構造体(核酸ポリプレックス)を得、さらにその表面に「アニオン性光増感性物質」(デンドリマー型等)を静電的に相互作用させて形成した三元系の複合体(ポリイオンコンプレックス)が開発された(N.Nishiyama et al.,Nature Materials,4,934−941(2005)を参照)。
しかしながら、この複合体は、血清存在下において、前記光増感性物質が血清中のアニオン性タンパク質と置換されやすく、容易に構造が不安定化する。そのため、静脈投与によるデリバリーは困難であり、実用性に乏しい。
本発明者は、上記課題を解決するべく鋭意検討を行った。その結果、ポリイオンコンプレックスの構成成分となるカチオン性ポリマーとして、核酸と複合化し得る側鎖を有するブロック部分と、アニオン性光増感性物質と複合化し得る側鎖を有するブロック部分とを含有する特定のブロックコポリマーを用いれば、上記課題を解決できることを見出し、本発明を完成した。
すなわち、本発明は以下の通りである。
(1)下記一般式(1)で示されるカチオン性ポリマーと核酸とを含むことを特徴とする、核酸ポリプレックス。
〔式中、R1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表し、
R3及びR4は、それぞれ独立して、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、
R5は、チオール基又はその置換基を含有する残基を表し、
L1は、NH、CO、下記一般式(5):
−(CH2)p1−NH− (5)
(式中、p1は1〜5の整数を表す。)
又は下記一般式(6):
−L2a−(CH2)q1−L3a− (6)
(式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜5の整数を表す。)
で示される基を表す。
aは100〜500の整数を表し、bは5〜100の整数を表し、cは20〜100の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された各モノマー単位の存在数の比及び配列順序が任意であることを表す。〕
本発明の核酸ポリプレックスにおいては、前記ポリマー中の−R3基及び/又は−R4基としては、例えば、下記一般式(2):
−〔NH−(CH2)m1〕m2−X1 (2)
(式中、X1は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。m1及びm2は、それぞれ独立し、かつ〔NH−(CH2)m1〕ユニット間で独立して、m1は1〜5の整数を表し、m2は1〜5の整数を表す。)
で示される基などが挙げられる。
本発明の核酸ポリプレックスとしては、例えば、前記ポリマー中の−NH2基と前記核酸とが静電的相互作用により結合したものが挙げられる。また、前記核酸がコア部分を形成し、前記ポリマーがシェル部分を形成したものも挙げられる。
(2)上記(1)に記載の核酸ポリプレックスと、アニオン性の光増感性物質とを含むことを特徴とする、ポリイオンコンプレックス。
本発明のポリイオンコンプレックスにおいては、前記光増感性物質としては、例えば、デンドリマーなどが挙げられる。また、当該デンドリマーとしては、例えば、金属ポルフィリン環を有するものが挙げられる。
本発明のポリイオンコンプレックスとしては、例えば、前記ポリマー中の−R3基及び/又は−R4基と前記光増感性物質とが静電的相互作用により結合したものが挙げられる。また、前記核酸が前記光増感性物質により被覆されてコア部分を形成し、前記ポリマーがシェル部分を形成したものも挙げられる。さらに、当該シェル部分が前記ポリマーのうち少なくともポリエチレングリコール鎖を含む部分により形成されたものも挙げられる。
(3)上記(2)に記載のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とする、細胞内への核酸送達デバイス。
(4)一般式(1)(前記と同様)で表されるカチオン性ポリマーと、アニオン性の光増感性物質とを含む、細胞内への核酸送達用キット。
(5)一般式(1)(前記と同様)で表されるカチオン性ポリマー。
また、本発明の他の一態様としては、一般式(1)(前記と同様)で示されるカチオン性ポリマーとアニオン性物質とを含むことを特徴とするポリプレックスを挙げることができ、さらに、当該ポリプレックスと、アニオン性の光増感性物質とを含むことを特徴とするポリイオンコンプレックスを挙げることもできる。
図2は、本発明の核酸ポリプレックスの模式図である。
図3は、本発明のポリイオンコンプレックスの模式図であり、(a)は各構成成分を、(b)は形成されたポリイオンコンプレックスを示している。
図4は、本発明の核酸ポリプレックス及びポリイオンコンプレックスの吸光スペクトルのチャートを示す図である。
図5は、本発明のポリイオンコンプレックスのゼータ電位の測定結果を示すグラフである。
図6は、本発明のポリイオンコンプレックスにおける、光照射強度と細胞毒性との関係を示すグラフである。
図7は、本発明のポリイオンコンプレックスにおける、光照射時間と遺伝子発現量との関係を示すグラフである。
図8は、本発明のポリイオンコンプレックスにおける、光照射時間と細胞毒性との関係を示すグラフである。
2 核酸と静電結合する側鎖を持つブロック部分
3 アニオン性光増感性物質と静電結合する側鎖を持つブロック部分
4 PEG鎖のブロック部分
5 核酸ポリプレックス
6 核酸
7 アニオン性光増感性物質
8 ポリイオンコンプレックス
なお、本明細書は、本願優先権主張の基礎となる特願2006−054327号明細書の全体を包含する。また、本明細書において引用された全ての先行技術文献、並びに公開公報、特許公報及びその他の特許文献は、参照として本明細書に組み入れられる。
1.本発明の概要
本発明者は、前述した従来のポリイオンコンプレックスにおける構造不安定性の問題を解決するためには、アニオン性光増感性物質が血清存在下で他のタンパク質等と容易に置換されないよう、十分に一体化した複合体を形成する必要があると考えた。そのためには、従来のように核酸ポリプレックス(核酸+カチオン性ポリマー)の表面にアニオン性光増感性物質を複合させること(被覆型)では十分ではなく、核酸ポリプレックスの内部にアニオン性光増感性物質を複合させること(内包型)が重要であることに着目し、これを実現する手段について鋭意検討した。
その結果、本発明者は、核酸ポリプレックスを形成する際に用いるカチオン性ポリマーとして、特定のブロック構造を有するポリマーを開発し、これを用いて前記内包型のポリイオンコンプレックスを構築することに成功した。
具体的には、カチオン性ポリマーとして、図1(概略図)に示すブロックコポリマー1を構築した。このポリマー1は、核酸と静電結合(静電的相互作用による結合)する側鎖を持つブロック部分2、及び、アニオン性光増感性物質と静電結合する側鎖を持つブロック部分3を含有する。また、ブロック部分4はポリエチレングリコール(PEG)鎖からなるブロック部分であり、生体親和性を高める等の点で重要な部分である。
次に、本発明者は、核酸6とブロックコポリマー1とを相互作用させることにより、図2に示すミセル状構造体(核酸ポリプレックス5)を得た。この核酸ポリプレックス5は、核酸6とポリマー1中のブロック部分2が静電結合してコア部分を形成しており、ポリマー1中の他の部分(ブロック部分3,4など)は外側に広がってシェル部分(外殻部分)を形成した状態となっている。その後、図3(a)に示すように、核酸ポリプレックス5に、アニオン性光増感性物質7を作用させた。
その結果、図3(b)に示すように、核酸ポリプレックス5のシェル部分に光増感性物質7が内包(又は埋包)された状態の、高分子ミセル複合体(ポリイオンコンプレックス8)を構築することができた。
なお、このポリイオンコンプレックス8では、ブロックコポリマー1のうちブロック部分4(PEG鎖)を含むポリマー部分が、光増感性物質7をさらに外側から覆う状態となり、より一層構造安定性に優れた複合体となる。
2.核酸ポリプレックス
本発明の核酸ポリプレックスは、特定のカチオン性ポリマーと核酸とを含むことを特徴とするものであり、当該核酸がコア部分を形成し、当該ポリマーがシェル部分を形成する、ミセル状の複合体である。
(1)カチオン性ポリマー
本発明の核酸ポリプレックスの構成成分である特定のカチオン性ポリマーは、下記一般式(1)で示されるブロックコポリマーとしての構造を有する。
一般式(1)の構造式中、「−/−」で示した結合部分の表記は、この結合部分を介して左右に示された各モノマー単位について、それらの存在数の比及び配列順序が任意であることを意味する表記である。例えば、1つのブロック部分を構成する「−A−」及び「−B−」というモノマー単位が、上記結合部分の表記を用いて「−A−/−B−」と示されている場合は、構成単位であるAとBの数の比には限定がなく、また、個々のAとBは互いにどのような並び順で連結(ただし直鎖状に連結)していてもよいことを意味する。したがって、例えば、AとBのいずれか一方の数が0であってもよいし、また、AとBがブロック重合していてもランダムに重合していてもよい。なお、AとBの合計数は、AとBから構成されるブロック部分について規定されている重合度(繰り返し単位数;例えば一般式(1)では「b」及び「c」)の範囲内の数となる。
一般式(1)中、ポリマーの末端部となるR1及びR2は、それぞれ独立して、水素原子、又は置換されていてもよい炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基を表す。
上記炭素数1〜12の直鎖状若しくは分枝状のアルキル基としては、例えば、メチル基、エチル基、n−プロピル基、イソプロピル基、n−ブチル基、sec−ブチル基、tert−ブチル基、n−ペンチル基、n−ヘキシル基、デシル基及びウンデシル基等が挙げられる。
また上記アルキル基の置換基としては、例えば、アセタール化ホルミル基、シアノ基、ホルミル基、カルボキシル基、アミノ基、炭素数1〜6のアルコキシカルボニル基、炭素数2〜7のアシルアミド基、シロキシ基、シリルアミノ基、及びトリアルキルシロキシ基(各アルキルシロキシ基は、それぞれ独立に、炭素数1〜6である)等が挙げられる。
上記置換基がアセタール化ホルミル基である場合、酸性の温和な条件下で加水分解することにより、他の置換基であるホルミル基(アルデヒド基;−CHO)に転化することができる。また、上記置換基(特にR1における置換基)がホルミル基、又はカルボキシル基若しくはアミノ基の場合は、例えば、これらの基を介して、抗体若しくはその断片又はその他の機能性若しくは標的指向性を有するタンパク質等を結合させることができる。
一般式(1)中、R3及びR4は、それぞれ独立して、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表す。−R3基及び/又は−R4基としては、例えば、下記一般式(2):
−〔NH−(CH2)m1〕m2−X1 (2)
〔一般式(2)中、X1は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。m1及びm2は、それぞれ独立し、かつ〔NH−(CH2)m1〕ユニット間で独立して、m1は1〜5(好ましくは2〜3)の整数を表し、m2は1〜5(好ましくは2〜5、より好ましくは2)の整数を表す。〕
で示される基が好ましい。
一般式(2)中、末端の−X1基(アミン化合物残基)としては、例えば、−NH2、−NH−CH3、−N(CH3)2、及び下記式(i)〜(viii)に示される基が好ましく挙げられる。ここで、下記式(vi)中、Yとしては、例えば、水素原子、アルキル基(炭素数1〜6)、及びアミノアルキル基(炭素数1〜6)等が挙げられる。
一般式(1)中、R5は、チオール基(−SH)を含有する残基、又はチオール基の置換基を含有する残基を表す。−R5基としては、例えば、下記一般式(3):
−CO−(CH2)n−SH (3)
〔式(3)中、nは1〜5(好ましくは2〜3)の整数である。〕
で示される残基、及び下記一般式(4):
〔式(4)中、rは1〜5(好ましくは2〜3)の整数である。〕
で示される残基等が好ましく挙げられる。
一般式(1)中、リンカー部分となるL1は、NH、CO、下記一般式(5):
−(CH2)p1−NH− (5)
〔式(5)中、p1は1〜5(好ましくは2〜3)の整数を表す。〕
で示される基、又は下記一般式(6):
−L2a−(CH2)q1−L3a− (6)
〔式(6)中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜5(好ましくは2〜3)の整数を表す。〕
で示される基を表す。
一般式(1)中、a〜cは、各ブロック部分の繰り返し単位の数(重合度)を表す。
具体的には、aは、100〜500(好ましくは200〜300)の整数を表す。
また、bは、5〜100(好ましくは20〜50)の整数を表す。
さらに、cは、20〜100(好ましくは40〜80)の整数を表す。なかでも、−R5を含む側鎖を有するモノマー単位は、限定はされないが、計1〜20個存在することが好ましく、より好ましくは計1〜10個である。
以上より、一般式(1)で示されるポリマーは、以下の3つのブロック部分を構成要素として有するブロックコポリマーであると言える。
・ポリエチレングリコール(PEG)鎖からなるブロック部分(重合度aのブロック部分)
・アニオン性光増感性物質と静電結合する側鎖を持つブロック部分(側鎖に−R3及び/又は−R4を有する重合度bのブロック部分)
・核酸と静電結合する側鎖を持つブロック部分(側鎖に−NH2及び/又は−NH−を有する重合度cのブロック部分)
なお、重合度cのブロック部分に、−R5基(チオール基又はその置換基を含有する残基)を含む側鎖が含まれる場合は、一般式(1)で示されるポリマーどうしの間で反応し、架橋構造が形成され得る。この架橋により、シェル部分の構造が安定化し、複合体全体としてもさらに構造安定性に優れたものとなる。
一般式(1)で示されるポリマーの分子量(Mw)は、限定はされないが、5,000〜50,000であることが好ましく、より好ましくは10,000〜30,000である。
一般式(1)で示されるポリマーの製造方法は、限定はされないが、例えば、PEG鎖のブロック部分と−R1基とを含むセグメント(PEGセグメント)を予め合成しておき、このPEGセグメントの片末端(−R1基と反対の末端)に、所定のモノマーを順に重合し、その後必要に応じて側鎖を置換又は変換する方法、あるいは、上記PEGセグメントと、所定の側鎖を有するブロック部分とを予め合成しておき、これらを互いに連結する方法などが挙げられる。当該製法における各種反応の方法及び条件は、常法に従い選択又は設定することができる。
上記PEGセグメントは、例えば、WO 96/32434号公報、WO 96/33233号公報、WO 97/06202号公報に記載のブロックコポリマーのPEGセグメント部分の製法を用いて調製することができる。PEGセグメントのうち−R1基と反対側の末端は、一般式(1)においてL1となる部分であり、−NH2、−COOH、下記一般式(7):
−(CH2)p2−NH2 (7)
〔式(7)中、p2は1〜5(好ましくは2〜3)の整数を表す。〕
で示される基、又は一般式(8):
−L2b−(CH2)q2−L3b (8)
〔式(8)中、L2bは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3bは、NH2又はCOOHを表す。q2は1〜5(好ましくは2〜3)の整数を表す。〕
で示される基であることが好ましい。
一般式(1)で示されるポリマーの具体的な製造方法としては、例えば、末端にアミノ基を有するPEGセグメント誘導体を用いて、そのアミノ末端に、β−ベンジル−L−アスパルテート及びNε−Z−L−リシン等の保護アミノ酸のN−カルボン酸無水物(NCA)を重合させてブロックコポリマーを合成し、その後、各ブロック部分の側鎖が前述した所定の特性を有する側鎖となるよう置換又は変換する方法が挙げられる。
(2)核酸
本発明の核酸ポリプレックスにおいて、コア部分の構成成分となる核酸としては、限定はされず、遺伝子治療等に用い得る各種DNA及びRNA、又はPNA(ペプチド核酸)が挙げられるが、プラスミドDNA、アンチセンスオリゴDNA、及びsiRNA等が好ましく挙げられる。
核酸分子が集合したコア部分はポリアニオンとなるため、上述したカチオン性ポリマーの所定のブロック部分の側鎖と静電的相互作用により結合することができる。
なお本発明においては、必要に応じ、上記核酸と共に、生理活性タンパク質や各種ペプチドなど、細胞内で機能発現する様々な物質をコア部分に含有させることもできる。
また、本発明の他の一態様においては、コア部分の構成成分として、高分子量又は低分子量の「アニオン性物質」を用いることができ、例えば、ペプチドホルモン、タンパク質、酵素及び核酸(DNA、RNA又はPNA)等の高分子物質、あるいは分子内に荷電性官能基を有する低分子物質(水溶性化合物)等が挙げられる。但し、当該アニオン性物質は、後述するアニオン性光増感性物質を含まないものとする。また、当該アニオン性物質としては、複数の異なる帯電状態の官能基(アニオン性基及びカチオン性基)を有する分子について、pHを変化させることにより分子全体としての帯電状態をアニオン性に変化させることができるものも含む。これらアニオン性物質は、1種のみ用いてもよいし2種以上を併用してもよく、限定はされない。
(3)核酸ポリプレックス
核酸ポリプレックスは、核酸と、カチオン性ポリマーの一部分(核酸と静電結合する側鎖を持つ部分)とが相互作用してコア部分を形成し、前記カチオン性ポリマーの他の部分(アニオン性光増感性物質と静電結合する側鎖を持つブロック部分と、PEG鎖からなるブロック部分とを含む部分)が上記コア部分の周囲にシェル部分を形成した状態の、コア−シェル型のミセル状複合体である(図2参照)。本発明では、カチオン性ポリマーとして、前記一般式(1)で示されるポリマーが使用される。
本発明の核酸ポリプレックスは、例えば、核酸とカチオン性ポリマーとをバッファー中で混合することにより容易に調製することができる。
カチオン性ポリマーと核酸との混合比は、限定はされないが、例えば、カチオン性ポリマー中のアミノ基の総数(N)と、核酸中のリン酸基の総数(P)との比(N/P比)が、0.5〜5であることが好ましく、より好ましくは1〜2である。N/P比が上記範囲のときは、遊離のポリマーが存在しない等の点で好ましい。なお、上記カチオン性ポリマー中のアミノ基とは、一般式(1)で重合度「d」と表記されたブロック部分の側鎖の末端アミノ基(−NH2)を意味し、核酸中のリン酸基と静電的に相互作用してイオン結合を形成し得る基である。
本発明の核酸ポリプレックスの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法による粒径が50〜300nmであることが好ましく、より好ましくは50〜200nmである。
本発明の核酸ポリプレックスは、後述する本発明のポリイオンコンプレックスの構成成分として用いることができる。また、場合により、公知の各種光増感性物質との併用により、エンドソームを介した標的細胞への核酸送達デバイスとして用いることもできる。
3.ポリイオンコンプレックス
本発明のポリイオンコンプレックスは、上述した核酸ポリプレックスと、アニオン性の光増感性物質とを含むことを特徴とする、三元系(核酸/アニオン性光増感性物質/カチオン性ポリマー)の高分子ミセル複合体である。
また、本発明のポリイオンコンプレックスの他の一態様としては、上述した核酸ポリプレックスにおいてコア部分の構成成分としてアニオン性物質を用いたポリプレックスと、アニオン性の光増感性物質とを含む、三元系(アニオン性物質/アニオン性光増感性物質/カチオン性ポリマー)の高分子ミセル複合体も挙げられる。
(1)アニオン性光増感性物質
本発明のポリイオンコンプレックスの構成成分であるアニオン性光増感性物質としては、限定はされず、公知のアニオン性の各種光増感性物質を用いることができる。光増感性物質は、紫外線、可視光及び赤外線等のいずれの波長領域の光によって励起されるものであってもよいが、光源の価格が手頃で扱いやすい紫外線及び可視光に反応性のあるものが好ましい。
アニオン性光増感性物質としては、アニオン性デンドリマーの光増感性物質が好ましい。特に、アニオン性デンドリマーとしては金属ポルフィリン環を有するものが好ましく、金属フタロシアニンを含有するものがより好ましい(例えば後述する一般式(c)のデンドリマー)。ここで、金属ポルフィリン環とは、下記一般式(a)で示される環状構造である。
(一般式(a)中、Mは金属原子を表す。)
上記金属ポルフィリン環については、中心金属となる金属原子Mの種類によって、励起状態が異なり、酸素の酸化形態も異なる。金属原子Mとしては、生体中において安定な金属ポルフィリン環含有化合物を形成しながら、一重項酸素を生成することができる金属であることが好ましく、例えば、Zn、Mg、Fe、Cu、Co、Ni及びMn等の様々な金属原子が好ましく挙げられる。中でも特に、光励起状態でのエネルギーが高く、一重項酸素の生成に有利なZnが好ましい(後述する一般式(e)、(f)及び(g)中の金属原子Mについても同様)。
アニオン性デンドリマーの光増感性物質としては、例えば、下記式(b)〜(d)で示されるものが好ましく挙げられる。
q(−)PM (b)
q(−)PcM (c)
q(−)NcM (d)
〔式(b)〜(d)中、qはデンドリマー外面の荷電原子の数を表し、(−)は荷電の種類(すなわち負であること)を表す。また、式(b)中のPM、式(c)中のPcM、及び式(d)中のNcMは、それぞれ順に、下記一般式(e)、(f)及び(g)で示されるデンドリマーを表す。〕
上記一般式(e)、(f)及び(g)中、Mは金属原子を表し、R6、R7、R8及びR9は、それぞれ独立に、アニオン性置換基、又はアニオン性置換基を含むデンドロンサブユニットを表す。
ここで、アニオン性置換基としては、限定はされないが、酸アニオン基が好ましく、例えば、カルボン酸基、スルホン酸基、及びリン酸基等が挙げられる。
また上記アニオン性置換基を含むデンドロンサブユニットとしては、例えば、下記一般式(h)の構造体が好ましく挙げられる。
〔一般式(h)中、X2は、それぞれ独立に、1個以上の酸素原子又は炭素原子を含む構造部分(好ましくは−O−)を表し、sは1〜25(好ましくは1〜4)の整数を表す。また、Wは、それぞれ独立に、単一又は複数の、アニオン性置換基、若しくは当該置換基を含む残基を表し、ベンゼン環に結合していてもよい。〕
ここで、当該デンドロンサブユニットにおけるアニオン性置換基については、前記と同様である。また、アニオン性置換基を含む残基としては、例えば、スペーサー分子鎖の末端にアニオン性置換基を持つ残基が好ましい。スペーサー分子鎖としては、例えば、炭化水素鎖等が好ましく挙げられ、具体的には、アルキル鎖が好ましく、より好ましくは炭素数25以下のアルキル鎖である。また下記一般式(j)で示される分子鎖も、スペーサー分子鎖として好ましい。
−C(X3)−X4R10−(CH2R11R12)t− (j)
〔一般式(j)中、X3及びX4は、それぞれ独立に、酸素原子(O)、イオウ原子(S)及び窒素原子(N)から選ばれる1種を表す。また、R10はX4がNの場合のみ存在して炭化水素基を表し、R11及びR12は炭化水素基を表すか又は存在しない基である。tは1〜25(好ましくは1〜6)の整数を表す。〕
ここで、R10、R11及びR12が炭化水素基の場合、その炭素数は25以下であることが好ましく、より好ましくは10以下である。
上述したアニオン性デンドリマーは、公知の製法、すなわち、デンドリマー中心から外側(端部)に向かって合成するDivergent法(D.A.Tomalia,et al.,Polymer J.,17,117(1985))や、デンドリマーの外側から中心に向かって合成するConvergent法(C.Hawker,et al.,J.Chem.Soc.Chem.Commun.,1010(1990))等の方法により合成することができる。例えば、前記式(6)で示されるアニオン性のフタロシアニンデンドリマー(DPc)の製法については、まず、フェノール性水酸基を有するイソフタレートに、デンドリマーのモノマーとなる3,5−ジヒドロキシメチルフェノール誘導体を反応させ、次いで、保護されていたフェノール性水酸基を脱保護化し、さらに上記モノマーの反応を繰り返すことによって、デンドリマー部を得る。その後、デンドリマーのコアとなるフタロニトリルを導入し、次いで、金属(M)の存在下で酸化的還元反応を行うことにより、アニオン性フタロシアニンデンドリマーが得られる。
(2)ポリイオンコンプレックス
本発明のポリイオンコンプレックスは、前述した本発明の核酸ポリプレックスのシェル部分に複数内包されたアニオン性光増感性物質がコア部分の周囲を覆い、さらに当該光増感性物質の外側に上記シェル部分中のPEG鎖を含む部分が存在した状態の、コア−シェル型の三元系高分子ミセル複合体である(図3(b)参照)。前述したように、本発明では、上記シェル部分に一般式(1)で示されるカチオン性ポリマーの一部分が用いられるが、この部分は、アニオン性光増感性物質と静電的に相互作用する部分(側鎖)を含むものである。よって、この相互作用により「核酸/アニオン性光増感性物質/カチオン性ポリマー」の三元系高分子ミセル複合体が形成される。
本発明のポリイオンコンプレックスは、例えば、前述した核酸ポリプレックスと、アニオン性光増感性物質とをバッファー中で混合することで容易に調製できる。
核酸ポリプレックスとアニオン性光増感性物質との混合比は、限定はされないが、例えば、光増感剤中のアニオン性基の総数(A)と、図1のセグメント3中のカチオン性基の総数(C)との比(A/C;以下「r比」)が0.1〜10であることが好ましく、より好ましくは1〜3である。特に、アニオン性光増感性物質が前述したデンドリマー型の光増感性物質である場合は、r比が1〜5であることが好ましく、より好ましくは1〜3である。r比が上記範囲であるときは、遊離の光増感剤が存在しない等の点で好ましい。
本発明のポリイオンコンプレックスの大きさは、限定はされないが、例えば、動的光散乱測定法による粒径が50〜300nmであることが好ましく、より好ましくは50〜200nmである。
本発明のポリイオンコンプレックスは、後述するように、エンドソームを介した標的細胞への核酸送達デバイスとして好ましく用いることができる。
4.核酸送達デバイス
本発明においては、上述したポリイオンコンプレックス(三元系の高分子ミセル複合体)を含む核酸送達デバイスが提供される。本発明の核酸送達デバイスは、光力学療法の原理を利用し、ポリイオンコンプレックスのコア部分に内包した所望の核酸を、エンドソームを介して標的細胞に選択的かつ効率的に導入する手段として使用できる。
具体的には、所望の核酸を内包したポリイオンコンプレックスを含む溶液を、被験動物に投与することにより、体内の各種細胞のエンドソームに上記ポリイオンコンプレックスを取り込ませる。その後、核酸を導入しようとする標的細胞(標的組織)に光照射をする。光照射された細胞では、ポリイオンコンプレックス中の光増感性物質の作用により、エンドソーム選択的な光障害が発生する。これにより、標的細胞のみにおいて、上記核酸をエンドソームから放出し細胞質内へ移行させることができる。
本発明の核酸送達デバイスは、ヒト、マウス、ラット、ウサギ、ブタ、イヌ、ネコ等の各種動物に適用することができ、限定はされない。被験動物への投与方法は、通常、点滴静注などの非経口用法が採用され、投与量、投与回数及び投与期間などの各条件は、被験動物の種類及び状態に合わせて適宜設定することができる。標的細胞への光照射には、紫外線(波長400nm以下)、可視光(波長400〜700nm)又は赤外線(波長700nm以上)等を照射する各種光源が使用でき、光照射エネルギーも適宜設定できる。また、細胞毒性への影響を考慮し、光照射時間は、0.1〜60分(より好ましくは1〜30分)とすることが好ましいが、これに限定はされない。
本発明の核酸送達デバイスは、各種疾患の原因となる細胞に所望の核酸を導入する治療(遺伝子治療)に用いることができる。よって本発明は、前述したポリイオンコンプレックスを含む医薬組成物、及び、前述したポリイオンコンプレックス(核酸送達デバイス)を用いる各種疾患の治療方法(特に遺伝子治療方法)を提供することもできる。なお、投与や光照射の方法及び条件は前記と同様である。
上記医薬組成物については、薬剤製造上一般に用いられる賦形材、充填材、増量剤、結合剤、湿潤剤、崩壊剤、潤滑剤、界面活性剤、分散剤、緩衝剤、保存剤、溶解補助剤、防腐剤、矯味矯臭剤、無痛化剤、安定化剤及び等張化剤等を適宜選択して使用し、常法により調製することができる。また、医薬組成物の形態は、通常、静脈内注射剤(点滴を含む)が採用され、例えば、単位投与量アンプル又は多投与量容器の状態等で提供される。
上記医薬組成物及び治療方法は、各種疾患の中でも特に癌に対して有効に適用される。
5.核酸送達用キット
本発明の核酸送達用キットは、前述したカチオン性ポリマー及びアニオン性光増感性物質を含むことを特徴とする。当該キットは、癌細胞等の各種標的細胞に対する遺伝子治療などに好ましく用いることができる。
本発明のキットにおいて、カチオン性ポリマー及びアニオン性光増感性物の保存状態は特に限定はされず、それぞれの安定性(保存性)及び使用容易性等を考慮して溶液状又は粉末状など任意の状態に設定することができる。
本発明のキットは、上記カチオン性ポリマー及びアニオン性光増感性物以外に他の構成要素を含んでいてもよい。他の構成要素としては、限定はされないが、例えば、各種バッファー、各種核酸(プラスミドDNA、アンチセンスオリゴDNA、siRNA等)、溶解用バッファー及び使用説明書(使用マニュアル)等を挙げることができる。
本発明のキットは、標的細胞内に導入する所望の核酸をコア部分としたポリイオンコンプレックスを調製するために使用される。調製したポリイオンコンプレックスは、エンドソームを介した標的細胞への核酸送達デバイスとして有効に用いることができる。
以下に、実施例を挙げて本発明をより具体的に説明するが、本発明はこれらに限定されるものではない。
(1)カチオン性ブロックコポリマーの合成
下記反応式(A)に従ってカチオン性ブロックコポリマーを合成した。具体的には、まず、片末端にアミノ基を有するポリエチレングリコールを開始剤とし、40倍等量のβ−ベンジル−L−アスパルテート N−カルボン酸無水物(BLA−NCA)を30℃のジメチルホルムアミド(DMF)/ジクロロメタン混合溶媒中で開環重合した。48時間後に、ポリマー溶液を、過剰量のジエチルエーテル中に滴下し、フィルターでろ過回収後、エーテル洗浄、ろ過回収を行うことでPEG−b−PBLAの白色粉末を得た。得られたポリマーの構造確認は、1H−NMR測定とゲル浸透クロマトグラフィー(GPC)測定により行った。次に、合成されたジブロックコポリマーをDMF中に溶解し、PLBA部分の末端アミノ基からε−ベンジルオキシカルボニル(Z)−L−リシン N−カルボン酸無水物(Lys(Z)−NCA)をさらに重合(40℃,48時間)し、エーテル再沈殿により回収した。また、無水酢酸で処理することによりポリマーの末端アミノ基をアセチル化した。得られたポリマー(PEG−b−PBLA−b−Lys(Z))の構造確認は、1H−NMR測定とGPC測定により行った(分子量分布Mw/Mn:1.18)。
上述のようにして得られたPEG−b−PBLA−b−Lys(Z)400mgをDMF8mL中に溶解し、BLA残基に対して10倍モル量の4−(3−aminopropyl)morpholineを加え、40℃で24時間反応させた。得られた反応液をエーテル再沈殿により回収後、トリフルオロ酢酸に溶解し、30%HBr/酢酸を加えて1時間攪拌することにより、Z基の脱保護を行った。その後、ジエチルエーテル中に再沈殿し、0.01N HClに対する透析後、凍結乾燥を行うことで、PEG−b−PMPA−b−PLLの白色粉末を得た(311mg)。
その後、内包したDNAの架橋安定化のためのPLL鎖へのチオール基の導入を行った。チオール基の導入反応は、PEG−b−PMPA−b−PLLとSPDPをそれぞれ5重量%のLiClを添加したN−メチル−2−ピロリドンに溶解し、24時間反応させた後に、エーテル再沈殿により回収した。
得られたブロックコポリマーの各ブロック部分の重合度は、それぞれ、a=272、b=36、c=50であり、分子量(Mw)が30,200であった。また、SPDPの反応により、50残基のPLLの17残基にチオール基(−SS−Py)が導入された。
反応式(A)
(2)使用する核酸
細胞内送達用の核酸としては、レポーター遺伝子であるルシフェラーゼ発現プラスミド(以下「pDNA」)を使用した。
(3)核酸ポリプレックスの調製
10mMトリス緩衝液(pH7.4)中で、10mgの還元剤ジチオスレイトール(DTT)で前処理したカチオン性ブロックコポリマーと、pDNAとを混合することにより、pDNAをコア部分に内包する核酸ポリプレックスを調製した。混合比(ポリマーのアミノ基(N)/pDNAのリン酸基(P);N/P比)は2とした。保護基である−SS−Pyと還元剤DTTを除去し、さらに核酸ポリプレックスの内核においてPLL鎖間でジスルフィド結合を形成させるため、酸化剤として2%のジメチルスルホキシド(DMSO)を含有する10mMトリス緩衝液に(pH7.4)対し、分画分子量1,000の透析膜を用いて72時間透析を行った。
調製された核酸ポリプレックスは、動的光散乱測定法による粒径が106nmであった。
(1)デンドリマー型アニオン性光増感性物質の合成
下記反応式(B1)に従ってデンドロンサブユニットを合成し、次に反応式(B2)に従ってデンドリマーを合成した。
詳しくは、反応式(B1)では、まず、ジメチル−5−ヒドロキシフタレートをt−ブチルジフェニルシリルクロリドを用いて保護し、水素化リチウムアルミニウムを用いて還元した後、モノマーであるジメチル−5−ヒドロキシフタレートと反応させる。その後、保護基であるt−ブチルジフェニルシリル基を外す。さらに、得られた化合物を、前記と同様に保護及び還元した化合物に対して反応させる。この反応を繰り返し行うことにより、デンドロンサブユニットを合成した。
反応式(B2)では、デンドロンサブユニットにニトロフタロニトリルを塩基存在下で結合させ、ペンタノールを溶媒で酢酸亜鉛を加えて還流して、デンドリマーを合成した。
反応式(B1)
反応式(B2)
さらに、反応式(B)により得られたデンドリマーをNaOH水溶液で処理し、各デンドロンサブユニットの末端の官能基をカルボン酸基にして、下記に示されるアニオン性フタロシアニンデンドリマー([32(−)(L3)4PcZn])を得た。
得られたフタロシアニンデンドリマーは、濃度10mMとなるように、Na2HPO4に溶解し、少量のNaOHを添加して完全に溶解させた。
(2)ポリイオンコンプレックスの調製
実施例1で得られた核酸ポリプレックスを含む溶液と、上記アニオン性フタロシアニンデンドリマー(DPc)の溶液とを混合することにより、pDNA/アニオン性フタロシアニンデンドリマー/カチオン性ブロックコポリマーの三元系の高分子ミセル複合体(ポリイオンコンプレックス)を含む溶液を得た。
なお、ポリイオンコンプレックスは、下記表1に示す混合比(光増感剤中のアニオン性基の総数/PMPA鎖中のカチオン性基の総数;r比)のものをそれぞれ個別に調製した。ポリイオンコンプレックスの粒径及び分散度は、動的光散乱測定法により測定した。その結果、混合比が1〜3(特に2及び3)のポリイオンコンプレックスが、粒径及び分散度の点からも好適な複合体であった。
実施例2で調製したポリイオンコンプレックス(r=1、DNA換算:100μg/ml in 10mM PBS)のアニオン性フタロシアニンデンドリマー(DPc)に由来する可視光吸収スペクトルを図4に示す。
その結果、核酸ポリプレックスの存在によって、DPcの680nm付近の吸収が減少し、630nm付近の吸収が増加することが確認された。これは、DPcが核酸ポリプレックスと複合化したことに由来するものであり、ポリイオンコンプレックスが形成されたことを示している。
実施例2で調製したr比の異なるポリイオンコンプレックス(r=0〜5)のゼータ電位を、ゼータサイザー(シスメックス(株))により測定した。
その結果、図5に示すように、r比の増加に伴い、ゼータ電位はわずかに正電荷を帯びた状態から負電荷を帯びた状態に変化することが確認された。
DPcを添加していない状態(r=0)では、核酸ポリプレックスの中間層には、フリーのカチオン性高分子の層が存在するために正電荷を帯びている(シェル部分がPEG層で覆われているために絶対値としては低い)が、DPcを添加すること(r比の増加)によって、中間層に負電荷を有するDPcが相互作用し、そのために、負のゼータ電位を持つようになると考えられる。
24穴マルチプレートに10,000個のヒト肝ガンHuh−7細胞を播種し、10%のウシ胎児血清を添加したDMEM培地中で24時間培養した後、実施例2で調製したr比の異なるポリイオンコンプレックス(r=0,1,2,3;DNA換算:1μg)を加え、6時間培養した。その後、リン酸緩衝液による洗浄、培地交換を行い、照射光の強度を変化させて光照射(波長:400〜700nm)を行った。光照射後に、さらに48時間培養し、細胞の生存率をMTTアッセイにより評価した。その結果を図6に示す。
24穴マルチプレートに10,000個のヒト肝ガンHuh−7細胞を播種し、10%のウシ胎児血清を添加したDMEM培地中で24時間培養した。その後、実施例2で調製したr比の異なるポリイオンコンプレックス(r=0,1,2,3;DNA換算:1μg)を加え、6時間培養した。その後、リン酸緩衝液による洗浄、培地交換を行い、300Wのハロゲンランプを光源とする0.030W/cm2の照射光を用いて光照射(波長:400〜700nm)を行った。光照射後に、さらに48時間培養し、遺伝子発現効率をルシフェラーゼ法により評価した。遺伝子発現量はRelative Light Unit(RLU)/mgタンパク量の単位で得られる。その結果を図7に示す。
図7に示すように、r=2のポリイオンコンプレックスの場合、30分の光照射によって遺伝子発現効率が50倍以上に増加することが確認された。また、他のr比(r=1,3)のポリイオンコンプレックスの場合においても光照射による遺伝子発現効率の上昇について同様の傾向が確認された。このように、ポリイオンコンプレックスを用いることによって、光選択的かつ効率的な遺伝子導入を達成することができた。
実施例6と同様の実験条件において、細胞の生存率をMTTアッセイにより評価した。その結果を図8に示す。
図7において最も高い遺伝子発現効率が示されたr=2及び3のポリイオンコンプレックスを用い、30分間光照射を行った条件においては、細胞生存率が30〜40%まで減少することが確認され、この条件では、効率的な遺伝子発現が得られる一方で、光毒性も顕著であることが分かった。しかしながら、r=1及び2のポリイオンコンプレックスを用い、20分間光照射を行った条件においては、遺伝子発現効率が光照射によって1桁以上も上昇したにもかかわらず(図7)、図8に示したような有意な細胞生存率の減少は認められなかった。この結果より、本発明のポリイオンコンプレックスは、光毒性を惹起することなく、光選択的かつ効率的な遺伝子導入を達成し得ることが確認された。
本発明のポリイオンコンプレックスは、標的細胞に対して効率的かつ選択的な核酸導入が可能であることに加え、血清中での高い構造安定性のため静脈投与による核酸デリバリーを効果的に行うことができ、極めて実用性及び有用性に優れたものである。
また本発明のポリイオンコンプレックスは、その表面にPEGを含むポリマー鎖(カチオン性ポリマーの一部)が存在するため、生体適合性に優れ、しかも血中でのイオン性タンパク質との相互作用を最小限に抑えることができる。この点からも、血清中での構造安定性が高められている。
また本発明によれば、上記ポリイオンコンプレックスを用いる核酸送達デバイス、及び上記ポリイオンコンプレックスの構成成分(カチオン性ポリマー、アニオン性光増感性物質)を含む核酸送達用キットを提供することもできる。
Claims (19)
- 下記一般式(1)で示されるカチオン性ポリマーと核酸とを含むことを特徴とする、核酸ポリプレックス。
R3及びR4は、それぞれ独立して、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、
R5は、チオール基又はその置換基を含有する残基を表し、
L1は、NH、CO、下記一般式(5):
-(CH2)p1-NH- (5)
(式中、p1は1〜5の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(6):
-L2a-(CH2)q1-L3a- (6)
(式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜5の整数を表す。)
で示される基を表す。
aは100〜500の整数を表し、bは5〜100の整数を表し、cは20〜100の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された各モノマー単位の存在数の比及び配列順序が任意であることを表す。〕 - 前記ポリマー中の-R3基及び/又は-R4基が、下記一般式(2):
-〔NH-(CH2)m1〕m2 -X1 (2)
(式中、X1は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。m1及びm2は、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)m1〕ユニット間で独立して、m1は1〜5の整数を表し、m2は1〜5の整数を表す。)
で示される基を表す、請求項1記載の核酸ポリプレックス。 - 前記ポリマー中の-NH2基と前記核酸とが静電的相互作用により結合したものである、請求項1又は2記載の核酸ポリプレックス。
- 前記核酸がコア部分を形成し、前記ポリマーがシェル部分を形成したものである、請求項1〜3のいずれか1項に記載の核酸ポリプレックス。
- 請求項1〜4のいずれか1項に記載の核酸ポリプレックスと、アニオン性の光増感性物質とを含むことを特徴とする、ポリイオンコンプレックス。
- 前記光増感性物質がデンドリマーである、請求項5記載のポリイオンコンプレックス。
- 前記デンドリマーが金属ポルフィリン環を有するものである、請求項6記載のポリイオンコンプレックス。
- 前記ポリマー中の-R3基及び/又は-R4基と前記光増感性物質とが静電的相互作用により結合しているものである、請求項5〜7のいずれか1項に記載のポリイオンコンプレックス。
- 前記核酸がコア部分を形成し、シェル部分に前記光増感性物質が内包されたものである、請求項5〜8のいずれか1項に記載のポリイオンコンプレックス。
- 前記シェル部分における前記光増感性物質が、ポリエチレングリコール鎖を含むポリマー部分によりさらに被覆されたものである、請求項9記載のポリイオンコンプレックス。
- 請求項5〜10のいずれか1項に記載のポリイオンコンプレックスを含むことを特徴とする、細胞内への核酸送達デバイス。
- 下記一般式(1)で表されるカチオン性ポリマーと、アニオン性の光増感性物質とを含む、細胞内への核酸送達用キット。
R3及びR4は、それぞれ独立して、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、
R5は、チオール基又はその置換基を含有する残基を表し、
L1は、NH、CO、下記一般式(5):
-(CH2)p1-NH- (5)
(式中、p1は1〜5の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(6):
-L2a-(CH2)q1-L3a- (6)
(式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜5の整数を表す。)
で示される基を表す。
aは100〜500の整数を表し、bは5〜100の整数を表し、cは20〜100の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された各モノマー単位の存在数の比及び配列順序が任意であることを表す。〕 - 下記一般式(1)で示されるカチオン性ポリマー。
R3及びR4は、それぞれ独立して、一級アミンを有するアミン化合物由来の残基を表し、
R5は、チオール基又はその置換基を含有する残基を表し、
L1は、NH、CO、下記一般式(5):
-(CH2)p1-NH- (5)
(式中、p1は1〜5の整数を表す。)
で示される基、又は下記一般式(6):
-L2a-(CH2)q1-L3a- (6)
(式中、L2aは、OCO、OCONH、NHCO、NHCOO、NHCONH、CONH又はCOOを表し、L3aは、NH又はCOを表す。q1は1〜5の整数を表す。)
で示される基を表す。
aは100〜500の整数を表し、bは5〜100の整数を表し、cは20〜100の整数を表す。
「/」の表記は、その左右に示された各モノマー単位の存在数の比及び配列順序が任意であることを表す。〕 - 請求項5記載のポリイオンコンプレックスの製造方法であって、
a)下記一般式(1)で示されるカチオン性ポリマーを構築すること、
b)核酸と、前記a)で構築されたカチオン性ポリマーとを相互作用させることにより核酸ポリプレックスを得ること、
c)アニオン性の光増感性物質を、前記b)で得られた核酸ポリプレックスに作用させること、及び
d)前記光増感性物質が、前記核酸ポリプレックスのコア部分を被覆するシェル部分に内包された、ポリイオンコンプレックスを得ること
を特徴とする、前記方法。
- 前記ポリマー中の-R3基及び/又は-R4基が、下記一般式(2):
-〔NH-(CH2)m1〕m2 -X1 (2)
(式中、X1は、一級、二級若しくは三級アミン化合物又は四級アンモニウム塩由来のアミン化合物残基を表す。m1及びm2は、それぞれ独立し、かつ〔NH-(CH2)m1〕ユニット間で独立して、m1は1〜5の整数を表し、m2は1〜5の整数を表す。)
で示される基を表すものである、請求項14記載の方法。 - 前記光増感性物質がデンドリマーである、請求項14又は15記載の方法。
- 前記デンドリマーが金属ポルフィリン環を有するものである、請求項16記載の方法。
- 前記ポリイオンコンプレックスは、前記シェル部分における前記光増感性物質が、ポリエチレングリコール鎖を含むポリマー部分によりさらに被覆されたものである、請求項14〜17のいずれか1項に記載の方法。
- 非ヒト被験動物の体内の標的細胞に核酸を送達する方法であって、
a)請求項5〜10のいずれか1項に記載のポリイオンコンプレックスを含む溶液を非ヒト被験動物に投与し、該動物の体内の各種細胞のエンドソームに該ポリイオンコンプレックスを取り込ませること、
b)前記核酸を導入しようとする標的細胞に、光照射すること、
c)前記標的細胞のエンドソームから細胞質内に、前記核酸を放出させること
を特徴とする、前記方法。
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