JP5257072B2 - 複合体の形成方法及び分離方法 - Google Patents
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Description
近年、その技術が発展し、種々の研究がなされている、微小流体装置(マイクロフルイディクスデバイス)を用いる微細総分析システム〔Micro Total Analysis System(μ-TAS)〕においては、このような複数の溶液を細管外で予め混合して反応させた後、その混合液を細管(チャネル)内に導入する方法や複数の溶液を同時に混合用細管(チャネル)内に導入して、これらを混合・反応させる方法(特許文献1)が知られている。
しかしながら、前者の方法では、予め混合するためにマイクロリットル(μl)オーダーの試料や試液が必要となり、ナノリットル(nl)乃至ピコリットル(pl)オーダーの試料や試液で微量分析が行えるというμ-TASのメリットが得られなくなる。また、後者の方法では、導入時に細管内に生じる相流により複数の溶液は容易に混合されず、分子拡散に依存することとなるので、分子量や粘度が異なる複数の溶液を混合する場合には、拡散係数の変動によりこれらの溶液を完全に混合させる時間が変化してしまうという問題点や、混合する溶液の粘度比が変化すると、チャネル内に導入される複数の溶液の体積比も変動してしまうので、混合させる溶液の種類により混合比率が変化し一定の混合比率で混合することができない等の問題点がある。
また、上記以外の方法として、Bao,J.M, Regnier, F. E, J. Chromatogr. 1992, 608, 217-224(非特許文献1)や特表平10-512371号公報(特許文献2)に開示されて方法がある。
これらの方法は、分析用細管内に、電気泳動移動度の高い分子を含む溶液を電気泳動移動度の低い分子を含む溶液の後ろになるように配置させた後、電界印加によって電気泳動移動度の高い分子が、電気泳動移動度の低い分子を追い越すことによってこれら分子同士の反応を行う方法である。これらの方法は、分子拡散に依存した従来の混合方法に比べて、分子混合を均一且つ短時間に行うことが可能である。
しかしながら、これらの方法では、反応効率が満足できるものではなく、試料中の分析物を高感度に検出するためには、反応に供する分子濃度を増加させたり或いは電気泳動による分子移動速度を遅らせて反応時間を長くする等の十分な反応効率を確保するための方策が必要である。
1.以下の工程を含む複合体の形成方法。
(1)細管内に、(a)分析物又はそのアナログを含有する溶液と、(b)1種以上の、当該CFSを含有する溶液とを、これらの溶液のうちより高い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液をそれよりも低い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液の上流にそれぞれ別々のゾーンとして配置させる工程、及び
(2)これらの溶液が均一に混合される前に、これらの溶液が配置された細管の両末端から細管内に配置された溶液に電圧を印加することによって、当該分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSを電気泳動的に濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログとCFSとをこれらの電気泳動移動度の差を利用して接触させ、当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させる工程。
(1)細管内に、(a)分析物又はそのアナログを含有する溶液と、(b)1種以上の、当該CFSを含有する溶液とをこれらの溶液のうちより高い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液をそれよりも低い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液の上流にそれぞれ別々のゾーンとして配置させる工程、
(2)これらの溶液が均一に混合される前に、これらの溶液が配置された細管の両末端から細管内に配置された溶液に電圧を印加することによって、当該分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSを電気泳動的に濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログとCFSとをこれらの電気泳動移動度の差を利用して接触させ、当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させる工程、及び
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、更に電気的に移動させて分離する工程。
(1)細管内に、(a)分析物又はそのアナログを含有する溶液と、(b)1種以上の、当該CFSを含有する溶液とをこれらの溶液のうちより高い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液をそれよりも低い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液の上流にそれぞれ別々のゾーンとして配置させる工程、
(2)これらの溶液が均一に混合される前に、これらの溶液が配置された細管の両末端から細管内に配置された溶液に電圧を印加することによって、当該分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSを電気泳動的に濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログとCFSとをこれらの電気泳動移動度の差を利用して接触させ、当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させる工程、
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、更に電気的に移動させて分離する工程、及び
(4)分離された複合体の量、又は当該複合体の形成に関与しなかったCFS又はアナログの量を測定し、その結果に基づいて分析物の量を求める工程。
本発明の方法は、(a)分析物又はそのアナログを含有する溶液と、CFSを含有する溶液とを、これらの溶液を細管外で予め混合させてこれらの複合体を形成させることなく、これらの溶液を、それぞれ別々のゾーンとなるように細管内に導入・配置させ、次いで、(b)当該細管に電圧を印加して、これらの溶液が細管内で均一に混合される前に、当該分析物又はそのアナログ、又は/及びCFSを電気泳動的に濃縮させながらこれらを接触させて、当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させることを特徴とする。
(1)細管内に、(a)分析物又はそのアナログを含有する溶液と、(b)1種以上の、CFSと当該分析物又はそのアナログを含有する溶液とを、これらの溶液を予め混合することなく且つ当該細管に電圧を印加することにより当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体が形成されるように配置させる工程(導入工程)、及び
(2)これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、当該分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSを濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログとCFSとを接触させ、当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させる工程(濃縮反応工程)。
本発明の工程(1)は、分析物又はそのアナログを含有する溶液と、1種以上のCFSを含む溶液とを、これらの溶液を細管外で予め混合せずに、細管に電圧を印加することにより、即ち、後述する本発明の工程(2)を実施した際に、分析物又はそのアナログとCFSとの複合体が形成されるように、これらの溶液を細管内に導入・配置させる工程である。
ここで、「細管に電圧を印加することにより、分析物又はそのアナログとCFSとの複合体が形成されるように」とは、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の上流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させることを意味する。
即ち、本発明は、(1)分析物又はそのアナログ、若しくは分析物又はそのアナログとあるCFSとの複合体と、(2)少なくとも1種のCFS(注:先のCFSとは異なるもの)との複合体を、細管に電圧を印加することによって、細管内で形成させればい。言い換えれば、本発明は、分析物又はそのアナログと全てのCFSとの複合体が細管内のみで形成される場合だけでなく、例えば、2種以上のCFSを使用する場合には、分析物又はそのアナログと2種以上のCFSのうちの一部のCFSとの複合体(中間複合体)を予め細管外又は電圧を印加せずに細管内で形成させた後、当該中間複合体と残りの1種以上のCFSとを、細管に電圧を印加することにより細管内で接触させて予め形成されている中間複合体と残りの1種以上の複合体形成物質との複合体を形成させる場合も包含される。
例えばCFSを2種使用する場合にあっては、(1)分析物又はそのアナログと1種のCFSとの複合体(中間複合体)、及び当該中間複合体と残りの1種のCFSとの複合体を、細管に電圧を印加することによって、細管内で形成させる場合はもちろんのこと、(2)分析物又はそのアナログと1種のCFSとの中間複合体を予め細管外又は電圧を印加せずに細管内で形成させた後、当該中間複合体と残りの1種のCFSとの複合体を、細管に電圧を印加することによって、細管内で形成させる場合も包含される。また、例えばCFSを3種使用する場合にあっては、(1)分析物又はそのアナログと1種のCFS(CFS-1)との複合体(中間複合体1)、当該中間複合体1と残りの1種のCFS(CFS-2)との複合体(中間複合体2)、及び当該中間複合体2と残りの1種のCFS(CFS-3)との複合体を、細管に電圧を印加することによって、細管内で形成させる場合はもちろんのこと、(2)分析物又はそのアナログとCFS-1との中間複合体1を予め細管外又は電圧を印加せずに細管内で形成させた後、当該中間複合体1とCFS-2との中間複合体2、並びに当該中間複合体2と複合体形成物質CFS-3との複合体を、細管に電圧を印加することによって、細管内で形成させる場合、或いは、(3)分析物又はそのアナログとCFS-1との中間複合体1、及び当該中間複合体1とCFS-2との中間複合体2を予め細管外又は電圧を印加せずに細管内で形成させた後、当該中間複合体2とCFS-3との複合体を、細管に電圧を印加することによって、細管内で形成させる場合も包含される(尚、4種以上のCFSを使用する場合も、これらと同様の考え方である。)。
従って、本発明において、「溶液を予め混合することなく」とは、分析物又はそのアナログを含有する溶液と、少なくとも1種のCFSを含有する溶液とを予め混合しないことを意味し、分析物又はそのアナログを含有する溶液と、CFSを含有する溶液とを予め一切混合しないことを意味するものではない(言い換えれば、分析物を含む試料と全てのCFSを含有する溶液、要すればアナログを含有する溶液とを、一切混合しないことを意味しない。)。
本発明においては、電圧を印加した場合に最終的に形成される分析物又はそのアナログと1種以上のCFSとの複合体が移動していく方を「下流」側、その反対を「上流」側と定義する。(以下、同様である。)
また、本発明において、「(分析物又はそのアナログ、CFS等の電気泳動にかけられるものの)電気泳動速度が遅い」又は「(分析物又はそのアナログ、CFS等の電気泳動にかけられるものの)電気泳動移動度が低い」とは、これ以外の少なくとも1種以上の物質よりも電気泳動速度が遅い(電気泳動移動度が低い)場合)だけでなく、これ以外の少なくとも1種以上の物質と逆方向に移動する場合も意味する。
表1−1〜1―5に、分析物又はそのアナログを含有する溶液とCFSを含む溶液の配置順序と、分析物又はそのアナログ、及びCFSの電気泳動移動度(電気泳動速度)の関係を示すが、これらに限定されるものではない。
尚、表1−1〜1―5においては、1種乃至3種のCFSを用いる場合を示したが、4種以上のCFSを使用する場合も、表1−1〜1―5と同様の考え方で適宜配置すればよい。
表1−1〜1―5において、Anaは分析物又はそのアナログを、CFS−1はCFS-1を、CFS−2はCFS-2を、CFS−3はCFS-3をそれぞれ示す。また、表1−1〜1―5において、細管内の配置順序Aは、分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液のなかで、細管内の最も上流側に配置させる溶液のゾーンを、Bは、ゾーンAの下流側に配置させる溶液のゾーンを、CはゾーンBの下流側に配置させる溶液のゾーンを、DはゾーンCの下流側に配置させる溶液のゾーンを示す。尚、当該細管内の配置順序(A〜D)は、あくまでも分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液の間での順序であり、これらのうち最も下流側に配置された当該溶液の更に下流側やこれらのうち最も上流側に配置された当該溶液の更に上流側に、当該溶液以外の溶液等が配置されていても良いことは言うまでもない。
(1)各ゾーン(分析物又はそのアナログを含有する溶液ゾーン、CFSを含有する溶液ゾーン)を隣接させた際に、これら各ゾーン間の液−液界面付近で生じる分子拡散によって一部前者の複合体と後者の複合体とが同時或いは逆の順序で形成される場合。
(2)分析物又はそのアナログ及び1種以上のCFSの電気泳動移動速度の関係から、一部前者の複合体と後者の複合体とが同時或いは逆の順序で形成される場合。
(3)分析物又はそのアナログ及び1種以上のCFSのうちの少なくとも1種以上のCFSがそれ以外の物質と逆方向に移動することによって、一部前者の複合体と後者の複合体とが同時或いは逆の順序で形成される場合。
このような場合には、表1−1〜1―5と同様の考え方で分析物又はそのアナログを含有する溶液及びCFSを含有する溶液を適宜配置すればよい。
尚、上記の競合法において、細管に電圧を印加することにより、当該分析物とCFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFSとの複合体Bが形成されるように、(1)分析物を含む試料及び標識アナログを含む溶液(分析物及びアナログを含有する溶液)と1種以上のCFS(CFS、反応向上CFS、これらの組合せ)を含有する溶液とを、或いは(2)分析物を含む試料(分析物又はアナログを含有する溶液)と、標識アナログを含有する溶液及び1種以上のCFS(CFS、反応向上CFS、これらの組合せ)を含有する溶液とを、又は、(3)分析物を含む試料及び1種以上のCFS(CFS、反応向上CFS、これらの組合せ)を含有する溶液と標識アナログを含む溶液とを、細管内に配置するには、分析物、標識アナログ及びCFSの電気泳動移動度を考慮して、前述において説明した、分析物又はアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含む溶液との配置順序に準じて、これら溶液の配置順序を決定すればよい。また、細管に電圧を印加することにより、当該分析物と標識CFSとの複合体A及び当該反応向上アナログと標識CFSとの複合体Bが形成されるように、(1)分析物を含む試料及び反応向上アナログを含む溶液(分析物及びアナログを含有する溶液)と分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得る能力を有し且つ標識物質で標識されたCFS(以下、標識結合物質又は標識CFSと略記する。)の1種以上を含有する溶液とを、或い(2)は分析物を含む試料(分析物又はアナログを含有する溶液)と、反応向上アナログを含有する溶液及び1種以上の標識CFSを含有する溶液とを、又は、(3)分析物を含む試料及び1種以上の標識CFSを含有する溶液と反応向上アナログを含む溶液とを、細管内に配置するには、分析物、反応向上アナログ及び標識CFSの電気泳動移動度を考慮して、前述において説明した、分析物又はアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含む溶液との配置順序に準じて、これらの溶液の配置順序を決定すればよい。
また、分析物又はそのアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含む溶液は必ずしも隣接させる必要はなく、これらの溶液の間には、例えば水、生理食塩水、各種緩衝液、有機溶媒等の液体を挿入しても良い。尚、このような緩衝液としては、分析物又はそのアナログと1種以上のCFSとの複合体の形成を阻害しないものであれば、使用可能であり、例えばトリス緩衝液、グッド緩衝液、TE緩衝液、TAE緩衝液、TBE緩衝液、TBS緩衝液、リン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液等の通常この分野で用いられる緩衝液が挙げられる。
尚、分析物又はそのアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含む溶液、要すれば液体は、細管内に、それぞれ別々のゾーンとして形成され、配置される。言い換えれば、分析物又はそのアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含む溶液との間、要すれば分析物又はそのアナログを含有する溶液と液体との間或いは1種以上のCFSを含む溶液と液体との間には、これら溶液、要すれば液体が配置された時点で液−液界面が形成・保持されている。
また、分析物又はそのアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含む溶液とを細管内に導入して配置させる方法としては、自体公知の導入・配置方法が使用可能である。このような自体公知の導入・配置方法としては、例えば、(1)先ず分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液のうちの1種を、上記の如き導入方法により細管の端から細管内に導入し、次いで、残りの溶液のうちの1種を同様に上記の如き導入方法により細管の端から細管内に導入し、これを繰り返して全ての溶液を細管内に配置させる方法、(2)先ず液だめ(ウェル)内に分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液のうちの1種を滴下して、これを上記の如き導入方法により細管内に導入し、次いで液だめ(ウェル)内の溶液を、残りの溶液のうちの1種に交換した後、これを同様に上記の如き導入方法により細管内に導入し、これを繰り返して全ての溶液を細管内に配置させる方法、(3)複数の液だめ(ウェル)のそれぞれに分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液のうちの1種を別々に滴下して、これらを上記の如き導入方法により同一の細管内に別々に導入して全ての溶液を細管内に配置させる方法等が挙げられる。尚、分析物又はそのアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含む溶液とを細管内に導入する方法及び分析物又はそのアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含む溶液とを細管内に導入して配置させる方法は上記の方法に限定されない。
また、分析物を含む試料、分析物を含む試料及び標識アナログ又は反応向上アナログを含む溶液(分析物又はアナログを含有する溶液)、分析物及び1種以上のCFS(例えばCFS、標識CFS、反応向上CFS、これらの組合せ)を含有する溶液、標識アナログを含む溶液又は反応向上アナログを含む溶液を細管内に導入する方法は、上記した、分析物又はアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含む溶液とを細管内に導入する方法と同じである。
本発明の工程(2)は、分子拡散によらず(依存せず)に、当該分析物又はそのアナログ、又は/及びCFSを電気泳動的に濃縮させながら当該分析物又はそのアナログとCFSを接触させて、当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させる工程である。
「溶液(分析物又はそのアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含有する溶液)が均一に混合される前に」とは、本発明の工程(1)により、細管内に配置された、分析物又はそのアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、全て分子拡散によって均一に混合される前を意味する。
尚、本発明において、「界面」とは、分析物又はそのアナログを含有する溶液と1種以上のCFSを含む溶液とが接している境界、要すれば分析物又はそのアナログを含有する溶液と液体とが接している境界或いは1種以上のCFSを含む溶液と液体とが接している境界を意味し、当該界面は、現実には拡散によって必ずしも全然混ざらないということを意味するものではない。
また、分析物のアナログを用いた競合法において標識アナログを使用する場合にあっては、工程(1)により、細管内に配置された、(1)分析物を含む試料及び標識アナログを含む溶液(分析物及びアナログを含有する溶液)と1種以上のCFS(CFS、反応向上CFS、これらの組合せ)を含有する溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)、(2)分析物を含む試料、標識アナログを含有する溶液及び1種以上のCFS(CFS、反応向上CFS、これらの組合せ)を含有する溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)、又は(3)分析物を含む試料及び1種以上のCFS(CFS、反応向上CFS、これらの組合せ)を含有する溶液及び標識アナログを含有する溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。
また、分析物のアナログを用いた競合法において反応向上アナログを使用する場合にあっては、(1)分析物を含む試料及び反応向上アナログを含む溶液(分析物及びアナログを含有する溶液)と1種以上の標識CFSを含有する溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)、(2)分析物を含む試料、反応向上アナログを含有する溶液及び1種以上の標識CFSを含有する溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、又は(3)分析物を含む試料及び1種以上のCFS(CFS、標識CFS、これらの組合せ)を含有する溶液及び反応向上アナログを含有する溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。
尚、「界面」も前述と同じ意味である。
尚、本発明における濃縮の度合い(程度)としては、工程(1)で配置されたゾーン中の分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSの濃度に対する、細管に電圧を印加した際に当該物質が集合した部分(バンド状)の分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSの濃度が、下限が通常1.5倍以上、好ましくは5倍以上、より好ましくは10倍以上、更に好ましくは25倍以上であり、上限は特に限定されないが、通常107倍以下、好ましくは106倍以下、より好ましくは105倍以下である。
上記したように、本発明の工程(2)は、分析物を又はそのアナログを含有する溶液とCFSを含む溶液、要すれば液体とが、分子拡散によって均一に混合される前であって、更にこれらを細管内で物理的に均一に混合することなく、言い換えれば、隣接するこれらの液−液界面を保持させたまま、分析物又はそのアナログ、又は/及びCFSを電気泳動的に濃縮させながら、溶液中の分析物又はそのアナログと溶液中のCFSとを電気泳動的に移動させながら接触させて当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させるものである。
このような条件としては、具体的には、細管内で物質を濃縮する、所謂電気泳動濃縮法で用いられている条件である。
電気泳動濃縮法としては、例えば(1)Field Amplification Sample Stacking法(FASS)〔米国特許公開US2003-0057092 A1;Weiss, D.J., Saunders, K., Lunte, C.E. Electrophoresis 2001, 22, 59-65;Britz-McKibbin, P., Bebault, G.M., Chen, D.D.Y. Anal Chem. 2000, 72, 1729-1735;Ross, D., Locascio, L.E. Anal Chem. 2002, 71, 5137-5145等〕、(2)Field Amplification Sample Injection法(FASI)〔Chien, R.L et al. J. Chromatogr. 1991, 559, 141-148等〕、(3)等速電気泳動法(Isotachophoresis:ITP)〔Everaerts, F.M., Geurts, M. Mikkers, F.E.P., Verheggen, T.P.E.M J Chromatagr. 1976, 119, 129-155;Mikkers, F.E.P., Everaerts, F.M., Peek, J.A.F. J. Chromatogr. 1979, 168, 293-315;Mikkers, F.E.P., Everaerts, F.M., Peek, J.A.F. J. Chromatogr. 1979, 168, 317-332;Hirokawa, T, Okamoto, H. Ikuta, N., and Gas, B., Analytical Sciences 2001, Vol. 17 Supplement il85等〕、(4)Isoelectric Focusing法(IF)〔Wehr T, et al. Am. Biotechnol. Lab. 1990, 8, 22;Kilar F. et al., Electrophoresis 1989, 10, 23-29等〕、(5)Large-volume sample stacking法(LVSS)〔Siri,N. et al., J.Chormatogr.B, (2003), 793, 151-157等〕、(6)pHジャンクション法(pH-mediated stacking)〔P.Britz-McKibbin et al, 2000, Anal.Chem., 72, 1242, P. Britz-McKibbin et al, 2002, Anal. Chem., 74, 3736〕、(7)スウィーピング法(stacking micellar electrokinetic chromatography)〔J.P.Quirino et al.,1998, Science, 282, 465, J.P.Quirino et al., 1999, Anal. Chem., 71, 1638, Y. Sera et al., 2001, Electrophoresis, 22, 3509〕等の、細管内で電気泳動移動度の差異を利用する電気泳動濃縮法等が挙げられるが、これらに限定されない。
従って、本発明の工程(2)をITPにより行う場合には、少なくとも、分析物又はそのアナログ、又は/及び1種以上のCFSよりも電気泳動速度の速いリーディングイオンを含む泳動媒体(リーディングバッファー)、分析物又はそのアナログ、又は/及び1種以上のCFSよりも電気泳動速度の遅いトレーリングイオンを含む泳動媒体(トレーリングバッファー)が必要であり、これらの構成要件も本発明の「分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSが濃縮される条件」に含まれる。
尚、リーディングバッファーは、分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液のうち、細管の最下流に配置された溶液の更に下流側に配置され、トレーリングバッファーは、分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液のうち、細管の最上流に配置された溶液の更に上流側に配置される。
上記において、リーディングイオンとしては、分析物又はそのアナログ、又は/及び1種以上のCFSよりも電気泳動速度の速いイオンであればよく、通常この分野で使用されるものから適宜選択して使用されるが、例えばCl−等が挙げられる。また、リーディングイオンの使用濃度も、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、例えば通常1μM〜10M、好ましくは100μM〜1M、より好ましくは1mM〜500mMである。
このようなリーディングイオンを含むリーディングバッファーも、通常この分野で使用されるものから適宜選択して使用され、例えばグッド緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。その使用濃度及びpHは、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、使用濃度は、例えば通常1μM〜10M、好ましくは100μM〜1M、より好ましくは1mM〜500mMであり、pHは、通常2〜12、好ましくは4〜10、より好ましくは6〜9である。である。
上記において、トレーリングイオンとしては、分析物又はそのアナログ、又は/及び1種以上のCFSよりも電気泳動速度の遅いイオンであればよく、通常この分野で使用されるものから適宜選択して使用されるが、例えばHEPES、TAPS、MES、MOPS等のグッド緩衝液、グリシン、スレオニン等のアミノ酸等が挙げられる。また、トレーリングイオンの使用濃度も、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、例えば通常1μM〜10M、好ましくは100μM〜1M、より好ましくは1mM〜500mMである。
このようなトレーリングイオンを含むトレーリングバッファーも、通常この分野で使用されるものから適宜選択して使用され、例えばグッド緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。その使用濃度及びpHは、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、使用濃度は、例えば通常1μM〜10M、好ましくは100μM〜1M、より好ましくは1mM〜500mMであり、pHは、通常2〜12、好ましくは4〜10、より好ましくは6〜9である。
尚、上記した如き条件(リーディングイオン、リーディングバッファー、トレーリングイオン、トレーリングバッファー等)、その他の試薬類、操作方法、その他の条件等は、前述した如き文献等の記載に準じて適宜選択することができる。
従って、本発明の工程(2)をFASS、LVSS又はFASIにより行う場合には、分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液のうち、少なくとも1種の溶液よりも他の少なくとも1種の溶液が高い電気伝導度を有するようにするか、或いは、分析物又はそのアナログを含有する溶液又は/及び1種以上のCFSを含む溶液よりも高い電気伝導度を有する泳動媒体(高電気伝導度泳動媒体)を別途使用する必要があり、これらの構成要件も本発明の「分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSが濃縮される条件」に含まれる。
尚、高電気伝導度泳動媒体は、分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液のうち、細管の最下流に配置された溶液の更に下流側に配置される。
また、高電気伝導度泳動媒体は、分析物又はそのアナログを含有する溶液又は/及び1種以上のCFSを含む溶液よりも塩濃度が高いものであればよく、通常この分野で使用されるものから適宜選択して使用され、例えばNaCl、KCl等を含む泳動媒体等が挙げられる。泳動媒体としては、例えばグッド緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。その使用濃度及びpHは、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、使用濃度は、例えば通常1μM〜10M、好ましくは100μM〜1M、より好ましくは1mM〜500mMであり、pHは、通常2〜12、好ましくは4〜10、より好ましくは6〜9である。
尚、上記した如き条件(高電気伝導度泳動媒体等)、その他の試薬類、操作方法、その他の条件等は、等は、前述した如き文献等の記載に準じて適宜選択することができる。
従って、本発明の工程(2)をIFにより行う場合には、少なくとも、細管内にpH勾配を形成させ得る泳動媒体が必要であり、これらの構成要件も本発明の「分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSが濃縮される条件」に含まれる。
上記において、細管内にpH勾配を形成させ得る泳動媒体としては、電界印加により細管内にpH勾配を形成させ得るものであればよく、通常この分野で使用されるものから適宜選択して使用される。このような泳動媒体としては、例えばアンフォライト等の細管内にpH勾配を形成させ得る物質を含有する泳動媒体が挙げられる。泳動媒体としては、例えばグッド緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。その使用濃度及びpHも、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、使用濃度は、例えば通常1μM〜10M、好ましくは100μM〜1M、より好ましくは1mM〜500mMである。
尚、上記した如き条件(細管内にpH勾配を形成させ得る物質を含有する泳動媒体等)、その他の試薬類、操作方法、その他の条件等は、等は、前述した如き文献等の記載に準じて適宜選択することができる。
従って、本発明の工程(2)をpHジャンクション法により行う場合には、少なくとも、試料を含有する溶液よりもアルカリ性のpHを有する泳動媒体が必要であり、これらの構成要件も本発明の「分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSが濃縮される条件」に含まれる。
上記において、アルカリ性のpHを有する泳動媒体としては、電界印加により細管内に試料を含有する溶液と当該泳動媒体との間にpHの異なる境界面を形成させ得るものであればよく、通常この分野で使用されるものから適宜選択して使用される。このような泳動媒体としては、例えばHEPES、TAPS、MES、MOPS等のグッド緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。その使用濃度及びpHは、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、使用濃度は、例えば通常1μM〜10M、好ましくは100μM〜1M、より好ましくは1mM〜500mMであり、pHは、通常7〜11、好ましくは7〜10、より好ましくは7〜9である。
尚、上記した如き条件(アルカリ性のpHを有する泳動媒体等)、その他の試薬類、操作方法、その他の条件等は、等は、前述した如き文献等の記載に準じて適宜選択することができる。
即ち、目的物質を含む溶液ゾーンの上流側に、ミセルを形成する荷電物質を含む泳動媒体を配置させる。ここに電界を印加すると、形成されたミセルが目的物質を追い越しながら目的物質とのミセル複合体が形成される。このミセル複合体が目的物質の存在する媒質と目的物質の存在する媒質よりも高い電気伝導度を有する媒質との界面に達した際に、目的物質の電気泳動速度が遅くなり、目的物質が濃縮される。
従って、本発明の工程(2)をスウィーピング法により行う場合には、分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液のうち、少なくとも1種の溶液よりも他の少なくとも1種の溶液が高い電気伝導度を有するようにするか、或いは、分析物又はそのアナログを含有する溶液又は/及び1種以上のCFSを含む溶液よりも高い電気伝導度を有する泳動媒体(高電気伝導度泳動媒体)を別途使用する必要があり、また、分析物又はそのアナログ、又は/及び1種以上のCFSよりも電気泳動速度の速いミセルを形成する荷電物質を含み、且つ高い電気伝導度を有する溶液(或いは泳動媒体)よりも低い電気伝導度を有する泳動媒体が必要であり、これらの構成要件も本発明の「分析物又は/及び少なくとも1種のCFSが濃縮される条件」に含まれる。
尚、高電気伝導度泳動媒体は、分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液のうち、細管の最下流に配置された溶液の更に下流側に配置され、ミセルを形成する荷電物質を含む泳動媒体は、分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液のうち、細管の最上流に配置された溶液の更に上流側に配置される。
上記において、ミセルを形成する荷電物質としては、分析物又はそのアナログ、又は/及び1種以上のCFSよりも電気泳動速度の速いミセルを形成する荷電物質であればよく、通常この分野で使用されるものから適宜選択して使用されるが、例えばSDS等の界面活性剤が挙げられる。また、当該荷電物質の使用濃度も、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、限界ミセル濃度を超える量が使用され、より具体的には例えば通常1μM〜10M、好ましくは100μM〜1M、より好ましくは1mM〜500mMである。
泳動媒体も、通常この分野で使用されるものから適宜選択して使用され、例えばグッド緩衝液、Tris緩衝液、ホウ酸緩衝液、リン酸緩衝液、ヒスチジン緩衝液、イミダゾール緩衝液、グリシン緩衝液等が挙げられる。その使用濃度及びpHは、通常この分野で用いられる範囲から適宜選択すればよく、使用濃度は、例えば通常1μM〜10M、好ましくは100μM〜1M、より好ましくは1mM〜500mMであり、pHは、通常2〜12、好ましくは4〜10、より好ましくは6〜9である。
尚、上記した如き条件〔ミセルを形成する荷電物質、泳動媒体等〕、その他の試薬類、操作方法、その他の条件等は、等は、前述した如き文献等の記載に準じて適宜選択することができる。
また、その他の反応条件(例えばpH、温度、時間等)は、分析物又はそのアナログ、又は/及びCFSの濃縮と、分析物又はそのアナログとCFSとの複合体の形成を妨げない範囲であればよい。
具体的には、分析物又はそのアナログとCFSの性質により異なるため一概には言えないが、pHは下限が通常2以上、好ましくは5以上であり、上限が通常10以下、好ましくは9以下であり、反応温度は、下限が通常0℃以上、好ましくは5℃以上、より好ましくは10℃以上であり、上限が通常50℃以下、好ましくは40℃以下、より好ましくは30℃以下である。反応時間は、使用するCFSの分析物又はそのアナログに対する結合定数によって異なり、結合定数が低い場合は比較的長い反応時間が必要であり、また、結合定数が高い場合は比較的短い反応時間でよい。より具体的には、例えば下限が通常1分以上、好ましくは3分以上、より好ましくは5分以上であり、上限が24時間以下、好ましくは12時間以下、より好ましくは1時間以下、更に好ましくは30分以下である。
本発明において用いられる細管(チャネル)としては、キャピラリー電気泳動法、キャピラリーチップ電気泳動法等の通常この分野で用いられるものであればよく、特に限定されない。
本発明で用いられる細管(チャネル)の材質としては、通常この分野で用いられているものであればよく、分析物又はそのアナログと1種以上のCFSとを接触させて、最終的に分析物又はそのアナログと1種以上のCFSとの複合体を形成することが出来るものであればよく、特に限定されない。細管(チャネル)の材質の具体例としては、例えばガラス,石英,シリコン等のシリカ系化合物、例えばサイクリックオレフィンコポリマー(COC),サイクリックオレフィンポリマー(COP),ポリメチルメタクリレート,ポリメチルシロキサン,ポリビニルクロライド,ポリウレタン,ポリスチレン,ポリスルホン,ポリカーボネート,ポリテトラフルオロエチレン等の合成ポリマー等が挙げられる。また、細管(チャネル)の内径及び長さは、分析物又はそのアナログ、又は/及びCFSの濃縮と、分析物又はそのアナログとCFSとの複合体の形成を充分に行い得るものであればよく特に限定されないが、内径は、通常1〜1000μm、好ましくは1〜200μm、より好ましくは1〜100μmであり、長さは、通常0.1mm〜100cm、好ましくは0.1mm〜20cm、より好ましくは0.1mm〜10cmである。
このような泳動用緩衝液としては、通常この分野で用いられているものであればよく、特に限定されないが、具体的には、例えばトリス緩衝液,リン酸緩衝液,ベロナール緩衝液,ホウ酸緩衝液,グッド緩衝液,SSC緩衝液,TBE緩衝液,TAE緩衝液等のハイブリダイゼーション法,免疫法等の分野で用いられる緩衝液等が挙げられろ。これら緩衝液の濃度としては、通常0.1mM〜10M、好ましくは1mM〜5M、より好ましくは5mM〜1Mである。また、当該緩衝液のpHとしては、物質の分離に悪影響を及ぼさないものであればよいが、通常2〜13、好ましくは4〜11、より好ましくは5〜9である。尚、これら緩衝液は、1種でも2種以上組み合わせて用いても何れでもよい。
細管に充填される充填剤(ポリマー)としては、通常この分野で用いられているものであればよく、特に限定されない。充填剤(ポリマー)の具体例としては、例えばポリエチレンオキサイド(ポリエチレングリコール),ポリプロピレンオキサイド等のポリエーテル類、例えばポリエチレンイミン等のポリアルキレンイミン、例えばポリアクリル酸,ポリアクリル酸エステル,ポリアクリル酸メチル等のポリアクリル酸系ポリマー、例えばポリアクリルアミド,ポリメタクリルアミド等のポリアミド系ポリマー、例えばポリメタクリル酸,ポリメタクリル酸エステル,ポリメタクリル酸メチル等のポリメタクリル酸系ポリマー、例えばポリビニルアセテート,ポリビニルピロリドン,ポリビニルオキサゾリドン等のポリビニル系ポリマー、例えばプルラン,エルシナン,キサンタン,デキストラン,グアガム等の水溶性ヒドロキシルポリマー、例えばメチルセルロース,ヒドロキシエチルセルロース,ヒドロキシプロピルセルロース等の水溶性セルロース化合物、これらの誘導体、及びこれらポリマーを構成するモノマーユニットを複数種含有するコポリマー等が挙げらる。尚、これら充填剤は、1種でも2種以上組み合わせて用いても何れでもよい。
また、上記した如き充填剤の分子量としては、通常500Da〜6000kDa、好ましくは1〜1000kDa、より好ましくは50〜500kDaである。
上記した如き充填剤の使用濃度は、通常この分野で用いられている範囲から適宜選択すればよく、通常0.01〜40%(W/V)、好ましくは0.01〜20%(W/V)、より好ましくは0.1〜10%(W/V)である。
尚、上記充填剤を泳動用緩衝液に添加した際の、泳動用緩衝液の粘度は、通常1〜1000センチポアズ、好ましくは1〜200センチポアズ、より好ましくは1〜10センチポアズである。
(1)分析物
本発明における分析物としては、例えばヌクレオチド鎖(オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖);染色体;ペプチド鎖(例えばC−ペプチド、アンジオテンシンI等)、タンパク質〔例えばプロカルシトニン、免疫グロブリンA(IgA),免疫グロブリンE(IgE),免疫グロブリンG(IgG),免疫グロブリンM(IgM),免疫グロブリンD(IgD),β2−ミクログロブリン、アルブミン、これらの分解産物、フェリチン等の血清タンパク質〕;酵素〔例えばアミラーゼ(例えば膵型,唾液腺型,X型等)、アルカリホスファターゼ(例えば肝性,骨性,胎盤性,小腸性等)、酸性ホスファターゼ(例えばPAP等)、γ−グルタミルトランスファラーゼ(例えば腎性,膵性,肝性等)、リパーゼ(例えば膵型,胃型等)、クレアチンキナーゼ(例えばCK-1,CK-2,,mCK等)、乳酸脱水素酵素(例えばLDH1〜LDH5等)、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(例えばASTm,ASTs等)、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(例えばALTm,ALTs等)、コリンエステラーゼ(例えばChE1〜ChE5等)、ロイシンアミノペプチダーゼ(例えばC-LAP,AA,CAP等)、レニン、プロテインキナーゼ、チロシンキナーゼ等〕;例えば細菌(例えば結核菌,肺炎球菌,ジフテリア菌,髄膜炎菌,淋菌,ブドウ球菌,レンサ球菌,腸内細菌,大腸菌,ヘリコバクター・ピロリ等)、ウイルス(例えばルベラウイルス,ヘルペスウイルス,肝炎ウイルス,ATLウイルス,AIDSウイルス,インフルエンザウイルス,アデノウイルス,エンテロウイルス,ポリオウイルス,EBウイルス,HAV,HBV,HCV,HIV,HTLV等)、真菌(例えばカンジダ,クリプトコッカス等)、スピロヘータ(例えばレプトスピラ,梅毒トレポネーマ等)、クラミジア、マイコプラズマ等の微生物;当該微生物に由来するタンパク質又はペプチド或いは糖鎖抗原;気管支喘息,アレルギー性鼻炎,アトピー性皮膚炎等のアレルギーの原因となる各種アレルゲン(例えばハウスダスト、例えばコナヒョウダニ,ヤケヒョウダニ等のダニ類、例えばスギ、ヒノキ、スズメノヒエ,ブタクサ,オオアワガエリ,ハルガヤ,ライムギ等の花粉、例えばネコ,イヌ,カニ等の動物、例えば米,卵白等の食物、真菌、昆虫、木材、薬剤、化学物質等に由来するアレルゲン等);脂質(例えばリポタンパク質等);プロテアーゼ(例えばトリプシン,プラスミン,セリンプロテアーゼ等);腫瘍マーカータンパク抗原(例えばPSA,PGI,PGII等);糖鎖抗原〔例えばAFP(例えばL1からL3等)、hCG(hCGファミリー)、トランスフェリン、IgG、サイログロブリン、Decay-accelerating-factor(DAF)、癌胎児性抗原(例えばCEA,NCA,NCA-2,NFA等)、CA19−9、PIVKA−II、CA125、前立腺特異抗原、癌細胞が産生する特殊な糖鎖を有する腫瘍マーカー糖鎖抗原、ABO糖鎖抗原等〕;糖鎖(例えばヒアルロン酸、β−グルカン、上記糖鎖抗原等が有する糖鎖等);糖鎖に結合するタンパク質(例えばヒアルロン酸結合タンパク、βグルカン結合タンパク等);レクチン(例えばコンカナバリンA、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチン、ダツラレクチン、小麦胚芽レクチン等);リン脂質(例えばカルジオピリン等);リポ多糖(例えばエンドトキシン等);化学物質(例えばPTH,T3,T4,TSH,インシュリン,LH,FSH,プロラクチン等のホルモン、例えばトリブチルスズ,ノニルフェノール,4−オクチルフェノール,フタル酸ジ−n−ブチル,フタル酸ジシクロヘキシル,ベンゾフェノン,オクタクロロスチレン,フタル酸ジ−2−エチルヘキシル等の環境ホルモン);レセプター(例えばエストロゲン,TSH等に対するレセプター);リガンド(例えばエストロゲン,TSH等);及びこれらに対する抗体等が挙げられる。
具体的には、本発明の方法は、上記したなかでも、糖鎖構造が異なる糖タンパク質、ヌクレオチド鎖(オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖)、ペプチド鎖(ポリペプチドを含む)等の分析(定量)に有用であり、糖鎖構造が異なる糖タンパク質に特に有用である。尚、糖鎖構造が異なる糖タンパク質は、癌などある特定の疾患において糖鎖構造が変化することが知られており、臨床検査上の有用性が報告されているので、本発明の方法を用いることにより臨床検査上の有用性を検証することも可能である。また、ヌクレオチド鎖(オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖)やペプチド鎖(ポリペプチドを含む)等の微小な変異・置換により生じた変異体と野生体の分離も、分子生物学や分子臨床検査の分野では重要な分析対象物質と考えられているので、本発明の方法を用いてこれらを分析(定量)することにより臨床検査上重要な因子等が見出される可能性も高い。
上記した如き本発明に係る分析物を含む試料としては、例えば血清,血漿,髄液,滑液,リンパ液等の体液、尿,糞便のような排泄物、喀たん,膿,皮膚由来物等の生体由来試料、例えば食品,飲料,水道水,海水,湖沼水,河川水,工場廃液,半導体用洗浄水,医療器具等を洗浄した後の洗浄液等の環境試料及びこれらを水や通常この分野で用いられている例えばトリス緩衝液、リン酸緩衝液、ベロナール緩衝液、ホウ酸緩衝液、グッド緩衝液等の緩衝液等に適宜溶解させて再構成して得られた処理物等が挙げられる。尚、本発明に係る試料には、化学的に合成された上記した如き分析物を含有するものも包含される。
本発明で用いられるアナログとは、分析目的である、試料中の分析物に結合するCFSが結合し得る物質、言い換えれば、当該試料中の分析物に存在する、CFSが結合し得る結合部位と同じ結合部位を有する物質である。
このような物質としては、例えば分析目的である試料中の分析物と同じもの、試料中の分析物の構造の一部を修飾、改変、変性、除去等したもの(所謂アナログ)等が挙げられ、具体的には、例えば分析目的である試料中の分析物の一部に変異を導入した組み換え蛋白質、分析目的である試料中の分析物のペプチド配列の一部を改変したペプチド、分析目的である試料中の分析物のヌクレオチド配列の一部を改変したヌクレオチド鎖等が挙げられる。尚、分析目的である試料中の分析物の具体例は、前述した通りである。
尚、本発明で用いられる標識アナログ及び反応向上アナログは、上記した如き物質に、標識物質又は反応向上物質を結合させたものであり、標識物質及び反応向上物質の具体例、好ましい態様等は後述した通りである。また、上記した如き物質に標識物質又は反応向上物質を結合させる方法は、後述する反応向上物質とCFSとを結合する方法や標識物質によりCFSを標識する方法と同様の方法により行えばよい。
アナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)の使用量は、使用するアナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)の種類、CFSの種類や使用濃度等により一概に言えない。
より具体的には、アナログを含有する溶液(例えば分析物及びアナログを含有する溶液、アナログを含有する溶液、アナログ及びCFSとを含有する溶液)中のアナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)の使用量が、下限は通常10pM以上、好ましくは1nM以上、より好ましくは100nM以上であり、上限は通常10μM以下、好ましくは1μM以下、より好ましくは500nM以下となるように、上記した如き溶液中にアナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)を含有させればよい。
本発明における分析物又はそのアナログを含有する溶液とは、上記した如き本発明に係る分析物(それを含む試料)又はアナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)を含む溶液を意味する。
このような溶液としては、(a)上記した如き分析物を含む試料自体、(b)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液(言い換えれば分析物と1種以上のCFSとの複合体を含む溶液)、(c)アナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)を含有する溶液、(d)分析物を含む試料とアナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)とを含有する溶液(言い換えれば分析物とアナログとを含む溶液)、(e)アナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)と1種以上のCFSとを含有する溶液(言い換えればアナログと1種以上のCFSとの複合体を含む溶液)、(f)分析物を含む試料、アナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)及び1種以上のCFSを含む溶液等が挙げられる。
尚、上記の溶液(b)又は(e)としては、例えば、本発明において、2種以上のCFSを使用する場合には、分析物又はそのアナログと最終的に結合する全てのCFSのうちの一部のCFS(全CFSの一部)と分析物又はそのアナログとの複合体(中間複合体)、言い換えれば、最終的に形成される分析物又はそのアナログと2種以上のCFSとの複合体を構成するCFSよりも少ない数のCFSと分析物又はそのアナログとの複合体(中間複合体)、を含有する溶液が具体的に挙げられる。
即ち、例えばCFSを2種使用する場合にあっては、1種のCFSと分析物又はそのアナログとの複合体(中間複合体)を含有する溶液であり、例えばCFSを3種使用する場合にあっては、1種のCFSと分析物又はそのアナログとの複合体(中間複合体)を含有する溶液、及び2種のCFSと分析物又はそのアナログとの複合体(中間複合体)を含有する溶液である(尚、4種以上のCFSを使用する場合も、これらと同様の考え方である。)。
より具体的には、例えば後述するように、CFSとして標識物質及び反応向上物質が結合していないCFSと反応向上CFSとを組み合わせて使用する場合には、分析物と当該CFSとの複合体(中間複合体)を含む溶液及び分析物と反応向上CFSとの複合体(中間複合体)を含む溶液が上記した如き溶液(b)に相当し、CFSとして標識CFSと反応向上CFSとを組み合わせて使用する場合には、分析物と標識CFSとの複合体(中間複合体)を含む溶液及び分析物と反応向上CFSとの複合体(中間複合体)を含む溶液が上記した如き溶液(b)に相当する。また、CFSとして、標識物質及び反応向上物質が結合していないCFSと標識反応向上CFSとを組み合わせて使用する場合には、分析物と当該CFSとの複合体(中間複合体)を含む溶液及び分析物と標識反応向上CFSとの複合体(中間複合体)を含む溶液が上記した如き溶液(b)に相当する。
尚、上記において、分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液は、通常は、前述した如き分析物を含む試料(CFSは含まない)と、後述するCFSを含む溶液とを適宜混合して得られた反応液が一般的である。
上記の溶液(e)としては、より具体的には、例えば、標識アナログ又は反応向上アナログを使用する場合であって、2種以上のCFSを使用する場合には、上記と同様に、標識アナログ又は反応向上アナログと最終的に結合する全てのCFSのうちの一部のCFS(全CFSの一部)と標識アナログ又は反応向上アナログとの複合体(中間複合体)、言い換えれば、最終的に形成される標識アナログ又は反応向上アナログと2種以上のCFSとの複合体を構成するCFSよりも少ない数のCFSと標識アナログ又はアナログとの複合体(中間複合体)、を含有する溶液が挙げられる。尚、上記において、アナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)とを含有する溶液は、通常は、標識アナログ又は反応向上アナログを含む溶液と後述するCFSを含む溶液とを適宜混合して得られた反応液が一般的である。
また、上記の溶液(d)としては、例えば、試料中の分析物と、標識物質により標識されたアナログ(標識アナログ)又は反応向上物質が結合したアナログ(反応向上アナログ)とを含有する溶液が挙げられる。尚、分析物を含む試料とアナログとを含有する溶液は、通常は、分析物を含む試料(CFSは含まない)と、アナログを含む溶液とを適宜混合して得られた混合液が一般的である。
上記の溶液(f)としては、より具体的には、例えば、標識アナログ又は反応向上アナログを使用する場合であって、2種以上のCFSを使用する場合には、上記と同様に、分析物又は/及び標識アナログ(又は反応向上アナログ)と最終的に結合する全てのCFSのうちの一部のCFS(全CFSの一部)と分析物又は/及び標識アナログ(又は反応向上アナログ)との複合体(中間複合体)、言い換えれば、最終的に形成される分析物、又は/及び標識アナログ(又は反応向上アナログ)と2種以上のCFSとの複合体を構成するCFSよりも少ない数のCFSと分析物又は/及び標識アナログ(又は反応向上アナログ)との複合体(中間複合体)、を含有する溶液が挙げられる。尚、分析物を含む試料、アナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)及び1種以上のCFSを含む溶液は、通常は、前述した如き分析物を含む試料と、標識アナログ又は反応向上アナログを含む溶液、及び1種以上のCFSを含む溶液を適宜混合して得られた反応液が一般的である。
このような緩衝液としては、通常pH5〜11の範囲で緩衝作用を有し、例えばトリス緩衝液、グッド緩衝液、TE緩衝液、TAE緩衝液、TBE緩衝液、TBS緩衝液、リン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液等、通常この分野で用いられるものが挙げられ、その使用濃度としては、通常1mM〜2M、好ましくは10mM〜1Mの範囲であり、また、pHは、通常5〜11、好ましくは5〜10、より好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは6〜8、特に好ましくは7付近である。
本発明において、「分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得る物質(CFS)」とは、上記した如き分析物又はそのアナログに結合するか又は他のCFSを介して分析物又はそのアナログと結合して当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体、即ち分析物又はそのアナログとCFSと構成成分として含む複合体を形成し得る性質を有する物質を意味する。
このようなCFSとしては、例えば「抗原」−「抗体」間反応、「糖鎖」−「タンパク質」間反応、「糖鎖」−「レクチン」間反応、「酵素」−「インヒビター」間反応、「タンパク質」−「ペプチド鎖」間反応又は「染色体又はヌクレオチド鎖」−「ヌクレオチド鎖」間反応等の相互反応によって分析物又はそのアナログと結合するもの等を意味し、上記各組合せに於いて何れか一方が分析物又はそのアナログである場合、他の一方がこのCFSである。例えば、分析物又はそのアナログが「抗原」であるときはCFSは「抗体」であり、分析物又はそのアナログが「抗体」であるときはCFSは「抗原」である(以下、その他の上記各組合せにおいても同様である)。
より具体的には、例えばヌクレオチド鎖(オリゴヌクレオチド鎖、ポリヌクレオチド鎖);染色体;ペプチド鎖(例えばC−ペプチド、アンジオテンシンI等)、タンパク質〔例えばプロカルシトニン、免疫グロブリンA(IgA),免疫グロブリンE(IgE),免疫グロブリンG(IgG),免疫グロブリンM(IgM),免疫グロブリンD(IgD),β2−ミクログロブリン、アルブミン、これらの分解産物、フェリチン等の血清タンパク質〕;酵素〔例えばアミラーゼ(例えば膵型,唾液腺型,X型等)、アルカリホスファターゼ(例えば肝性,骨性,胎盤性,小腸性等)、酸性ホスファターゼ(例えばPAP等)、γ−グルタミルトランスファラーゼ(例えば腎性,膵性,肝性等)、リパーゼ(例えば膵型,胃型等)、クレアチンキナーゼ(例えばCK-1,CK-2,,mCK等)、乳酸脱水素酵素(例えばLDH1〜LDH5等)、グルタミン酸オキザロ酢酸トランスアミナーゼ(例えばASTm,ASTs等)、グルタミン酸ピルビン酸トランスアミナーゼ(例えばALTm,ALTs等)、コリンエステラーゼ(例えばChE1〜ChE5等)、ロイシンアミノペプチダーゼ(例えばC-LAP,AA,CAP等)、レニン、プロテインキナーゼ、チロシンキナーゼ等〕;例えば細菌(例えば結核菌,肺炎球菌,ジフテリア菌,髄膜炎菌,淋菌,ブドウ球菌,レンサ球菌,腸内細菌,大腸菌,ヘリコバクター・ピロリ等)、ウイルス(例えばルベラウイルス,ヘルペスウイルス,肝炎ウイルス,ATLウイルス,AIDSウイルス,インフルエンザウイルス,アデノウイルス,エンテロウイルス,ポリオウイルス,EBウイルス,HAV,HBV,HCV,HIV,HTLV等)、真菌(例えばカンジダ,クリプトコッカス等)、スピロヘータ(例えばレプトスピラ,梅毒トレポネーマ等)、クラミジア、マイコプラズマ等の微生物;当該微生物に由来するタンパク質又はペプチド或いは糖鎖抗原;気管支喘息,アレルギー性鼻炎,アトピー性皮膚炎等のアレルギーの原因となる各種アレルゲン(例えばハウスダスト、例えばコナヒョウダニ,ヤケヒョウダニ等のダニ類、例えばスギ、ヒノキ、スズメノヒエ,ブタクサ,オオアワガエリ,ハルガヤ,ライムギ等の花粉、例えばネコ,イヌ,カニ等の動物、例えば米,卵白等の食物、真菌、昆虫、木材、薬剤、化学物質等に由来するアレルゲン等);脂質(例えばリポタンパク質等);プロテアーゼ(例えばトリプシン,プラスミン,セリンプロテアーゼ等);腫瘍マーカータンパク抗原(例えばPSA,PGI,PGII等);糖鎖抗原〔例えばAFP(例えばL1からL3等)、hCG(hCGファミリー)、トランスフェリン、IgG、サイログロブリン、Decay-accelerating-factor(DAF)、癌胎児性抗原(例えばCEA,NCA,NCA-2,NFA等)、CA19−9、PIVKA−II、CA125、前立腺特異抗原、癌細胞が産生する特殊な糖鎖を有する腫瘍マーカー糖鎖抗原、ABO糖鎖抗原等〕;糖鎖(例えばヒアルロン酸、β−グルカン、上記糖鎖抗原等が有する糖鎖等);糖鎖に結合するタンパク質(例えばヒアルロン酸結合タンパク、βグルカン結合タンパク等);レクチン(例えばコンカナバリンA、レンズマメレクチン、インゲンマメレクチン、ダツラレクチン、小麦胚芽レクチン等);リン脂質(例えばカルジオピリン等);リポ多糖(例えばエンドトキシン等);化学物質(例えばPTH,T3,T4,TSH,インシュリン,LH,FSH,プロラクチン等のホルモン、例えばトリブチルスズ,ノニルフェノール,4−オクチルフェノール,フタル酸ジ−n−ブチル,フタル酸ジシクロヘキシル,ベンゾフェノン,オクタクロロスチレン,フタル酸ジ−2−エチルヘキシル等の環境ホルモン);レセプター(例えばエストロゲン,TSH等に対するレセプター);リガンド(例えばエストロゲン,TSH等);及びこれらに対する抗体等が挙げられる。尚、本発明に於いて用いられる抗体には、パパインやペプシン等の蛋白質分解酵素、或いは化学的分解により生じるFab、F(ab')2フラグメント等の分解産物も包含される。
上記した如きCFSは、1種又は2種以上適宜組み合わせて用いても良い。
尚、2種以上のCFSを組み合わせて使用(併用)する場合、分析物又はそのアナログと2種以上のCFSとの複合体を形成し得るものであれば、それぞれのCFSの結合部位は特に限定されない。このようなCFSの結合部位としては、例えば2種以上のCFSの結合部位が全て分析物又はそのアナログ上のみに存在する場合〔結合形態(1)〕、2種以上のCFSのうち、少なくとも1種のCFS(例えばCFS A)の結合部位は分析物又はそのアナログ上のみに存在し、その他の少なくとも1種のCFS(例えばCFS B)の結合部位は分析物又はそのアナログとCFS Aとの複合体が形成されたことによって新たに生じる部位に存在する場合〔結合形態(2)〕、2種以上のCFSのうち、少なくとも1種のCFS(例えばCFS A)の結合部位は分析物又はそのアナログ上のみに存在し、その他の少なくとも1種のCFS(例えばCFS B)の結合部位はCFS A上のみに存在する場合〔結合形態(3)〕等が挙げられる。なかでも、2種以上のCFSの結合部位は、それぞれ異なるものであるのが好ましい。尚、上記結合形態(2)において、新たに生じる部位に特異的に結合する性質を有するもの(CFS)としては、例えば分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を認識してこれに結合し得る抗体、ペプチド鎖、ヌクレオチド鎖等が挙げられる。
反応向上物質を結合させたCFSを用いることによって、CFSの電気泳動移動度を変化させることができ、工程(1)における分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液の配置順序を任意の順序に制御し得、分析物又はそのアナログ、又は/及びCFSの濃縮並びに分析物又はそのアナログとCFSとの反応(複合体形成反応)効率を向上することができる。
また、標識物質を結合させたCFSを用いることによって試料中の分析物を測定(検出)することができる。
反応向上CFSは、分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得且つ分析物又はそのアナログの電気泳動移動度を変化させ得る性質、言い換えれば、分析物又はそのアナログとの複合体を形成することによって、当該分析物又はそのアナログの電気泳動操作に対応する挙動(電気泳動移動度)に差を生ぜしめ得る性質を有するものであり、分析物又はそのアナログと反応向上CFSとの複合体(又は、分析物又はそのアナログと、反応向上CFS以外のCFSとの複合体)の電気泳動移動度を、分析物又はそのアナログ自体(反応向上CFSが結合していない分析物)の電気泳動移動度よりも高く又は低く(電気泳動速よりも速く又は遅く)し得るものである。
上記した如きCFSは、それ自身が何らかの方法により測定(検出)可能であるか、又は標識物質により標識可能なものが一般的である。このような性質のものを用いることによって試料中の分析物を測定(検出)することが可能となる。尚、分析物又はそのアナログ自身が何らかの方法により検出可能なものである場合(例えば酵素等)、或いは分析物又はそのアナログが、CFSを用いずに(介さずに)直接標識物質と結合し得るものである場合には、当該CFSが上記した如き性質を有していなくても、試料中の分析物を測定(検出)することができる。それら自身が何らかの方法により検出可能なものの例としては、酵素、色素、蛍光物質、発光物質、紫外部に吸収を有する物質等がある。
なかでも、本発明に於いて使用されるCFSとしては、分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得且つ標識物質により標識された物質(標識CFS)が好ましい。
更に、本発明においては、CFSとして、標識物質により標識され、分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得且つ分析物の電気泳動移動度を変化させ得る物質(標識反応向上CFS)、即ち、標識物質で標識された反応向上CFSを使用することもできる。尚、標識物質及び反応向上CFSは前述した通りであり、また、標識物質によって、反応向上CFSを標識する方法も、先に述べた如き標識物質によりCFSを標識する方法と同様の方法や国際公開パンフレットWO2002/082083号等に記載の常法により行えばよい。
上記したように、本発明においては、例えば以下のような種々のCFSが用いられる。尚、これらを適宜組合せて使用してもよいことは言うまでもない。
(a)標識物質及び反応向上物質が結合していないCFS
(b)標識CFS
(c)反応向上CFS
(d)標識反応向上CFS
(e)標識物質及び反応向上物質が結合していないCFS及び反応向上CFS
(f)標識CFS及び反応向上CFS
(g)標識物質及び反応向上物質が結合していないCFS及び標識反応向上CFS
上記した如き本発明に係るCFSを含有する溶液としては、分析物又はそのアナログと当該CFSとの複合体の形成を妨げないものであれば良く、例えば水、緩衝液等が挙げられる。
このような緩衝液としては、通常pH5〜11の範囲で緩衝作用を有し、当該複合体形成反応を阻害しないものであればよく、例えばトリス緩衝液、グッド緩衝液、TE緩衝液、TAE緩衝液、TBE緩衝液、TBS緩衝液、リン酸塩緩衝液、ホウ酸塩緩衝液等、通常この分野で用いられるものが挙げられる。これら緩衝液の濃度としては、通常1mM〜2M、好ましくは10mM〜1Mの範囲であり、また、pHは、通常5〜11、好ましくは5〜10、より好ましくは5.5〜8.5、更に好ましくは6〜8、特に好ましくは7付近である。
上記した如き溶液中に含有させるCFSの濃度、即ち、CFSの使用量は、使用するCFSの種類等により一概に言えないが、通常、反応液中(分析物又はそのアナログとCFSとを含有する溶液中)において、設定された検量限界濃度に相当する分析物又はそのアナログ全てと結合し得る濃度以上(好ましくはその2倍濃度以上、より好ましくはその5倍濃度以上)が当該反応液中に存在していることが望ましい。また、使用量の上限は特に限定されないが、経済性等を考慮して、通常設定された検量限界濃度に相当する分析物又はそのアナログ全てと結合し得る濃度の1012倍以下(好ましくは109倍以下、より好ましくは106倍以下)である。
より具体的には、分析物又はそのアナログとCFSとを含有する溶液中のCFSの使用量が、下限は通常10pM以上、好ましくは1nM以上、より好ましくは100nM以上であり、上限は通常10μM以下、好ましくは1μM以下、より好ましくは500nM以下となるように、上記した如き溶液中にCFSを含有させればよい。
本発明の複合体形成方法の実施の形態を以下に具体的に示す。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、CFSを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕のゾーンと1種以上のCFSを含む溶液のゾーンとが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物とCFSとの複合体が形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、上記したように当該分析物又は/及び少なくとも1種のCFSを濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物とCFSとを電気泳動的に接触させて当該分析物とCFSとの複合体を形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕、1種以上のCFSを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物又は/及び少なくとも1種のCFSを濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物又は/及び少なくとも1種のCFSが、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、分析物又は/及び少なくとも1種のCFSが集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含有する溶液(例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液)のゾーン、1種以上のCFSを含む溶液のゾーン〕中の分析物の濃度又は/及び1種以上のCFSの濃度よりも、分析物の濃度又は/及び1種以上のCFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物とCFSとを電気泳動的に接触させる」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物とCFSを接触させることを意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、標識CFSを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕のゾーンと1種以上の標識CFSを含む溶液のゾーンとが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物と標識CFSとの複合体が形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、上記したように当該分析物又は/及び少なくとも1種の標識CFSを濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物と標識CFSとを接触させて当該分析物と標識CFSとの複合体を形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕、1種以上の標識CFSを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物又は/及び少なくとも1種の標識CFSを濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物又は/及び少なくとも1種の標識CFSが、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、分析物又は/及び少なくとも1種の標識CFSが集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含有する溶液(例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液)のゾーン、1種以上の標識CFSを含む溶液のゾーン〕中の分析物の濃度又は/及び少なくとも1種の標識CFSの濃度よりも、分析物の濃度又は/及び少なくとも1種の標識CFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物と標識CFSとを接触させる」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物と標識CFSを接触させることを意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、反応向上CFSを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕のゾーンと1種以上の反応向上CFSを含む溶液のゾーンとが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物と反応向上CFSとの複合体が形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、上記したように当該分析物又は/及び少なくとも1種の反応向上CFSを濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物と反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて当該分析物と反応向上CFSとの複合体を形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕、1種以上の反応向上CFSを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物又は/及び少なくとも1種の反応向上CFSを濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物又は/及び少なくとも1種の反応向上CFSが、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、分析物又は/及び少なくとも1種の反応向上CFSが集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含有する溶液(例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液)のゾーンと1種以上の反応向上CFSを含む溶液のゾーン〕中の分析物の濃度又は/及び少なくとも1種の反応向上CFSの濃度よりも、分析物の濃度又は/及び少なくとも1種の反応向上CFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物と反応向上CFSとを電気泳動的に接触させる」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物と反応向上CFSを接触させることを意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、標識反応向上CFSを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕のゾーンと1種以上の標識反応向上CFSを含む溶液のゾーンとが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物と標識反応向上CFSとの複合体が形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、上記したように当該分析物又は/及び少なくとも1種の標識反応向上CFSを濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物と標識反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて当該分析物と標識反応向上CFSとの複合体を形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕、1種以上の標識反応向上CFSを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物又は/及び少なくとも1種の標識反応向上CFSを濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物又は/及び少なくとも1種の標識反応向上CFSが、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、分析物又は/及び少なくとも1種の標識反応向上CFSが集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含有する溶液(例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液)のゾーンと1種以上の標識反応向上CFSを含む溶液のゾーン〕中の分析物の濃度又は/及び少なくとも1種の標識反応向上CFSの濃度よりも、分析物の濃度又は/及び少なくとも1種の標識反応向上CFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物と標識反応向上CFSとを電気泳動的に接触させる」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物と標識反応向上CFSを接触させることを意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)少なくとも1種の、CFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の、反応向上CFSを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕のゾーン、1種以上のCFSを含む溶液のゾーン及び1種以上の反応向上CFSを含む溶液のゾーンが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物、CFS及び反応向上CFSの複合体が形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、上記したように当該分析物、少なくとも1種のCFS及び少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種を濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物、CFS及び反応向上CFSを接触させて当該分析物、CFS及び反応向上CFSの複合体を形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕、1種以上のCFSを含む溶液、1種以上の反応向上CFSを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物、少なくとも1種のCFS及び少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種を濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物、少なくとも1種のCFS及び少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種が、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、分析物、少なくとも1種のCFS及び少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種が集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含有する溶液(例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液)のゾーン、1種以上のCFSを含む溶液のゾーン及び1種以上の反応向上CFSを含む溶液のゾーン〕中の分析物の濃度、少なくとも1種のCFSの濃度又は少なくとも1種の反応向上CFSの濃度よりも、分析物の濃度、少なくとも1種のCFSの濃度又は少なくとも1種の反応向上CFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物、CFS及び反応向上CFSを接触させる」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物、CFS及び反応向上CFSを接触させることを意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)少なくとも1種の、標識CFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の、反応向上CFSを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕のゾーン、1種以上の標識CFSを含む溶液のゾーン及び1種以上の反応向上CFSを含む溶液のゾーンが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物、標識CFS及び反応向上CFSの複合体が形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、上記したように当該分析物、少なくとも1種の標識CFS及び少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種を濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物、標識CFS及び反応向上CFSを電気泳動的に接触させて当該分析物、標識CFS及び反応向上CFSの複合体を形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕、1種以上の標識CFSを含む溶液、1種以上の反応向上CFSを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物、少なくとも1種の標識CFS及び少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種を濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物、少なくとも1種の標識CFS及び少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種が、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、分析物、少なくとも1種の標識CFS及び少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種が集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含有する溶液(例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液)のゾーン、1種以上の標識CFSを含む溶液のゾーン、1種以上の反応向上CFSを含む溶液のゾーン〕中の分析物の濃度、少なくとも1種の標識CFSの濃度又は少なくとも1種の反応向上CFSの濃度よりも、分析物の濃度、少なくとも1種の標識CFSの濃度又は少なくとも1種の反応向上CFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物、標識CFS及び反応向上CFSを電気泳動的に接触させる」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物、標識CFS及び反応向上CFSを接触させることを意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)少なくとも1種の、CFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の、標識反応向上CFSを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕のゾーン、1種以上のCFSを含む溶液のゾーン及び1種以上の標識反応向上CFSを含有する溶液のゾーンが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物、CFS及び標識反応向上CFSの複合体が形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、上記したように当該分析物、少なくとも1種のCFS及び少なくとも1種の標識反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種を濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物、CFS及び標識反応向上CFSを電気泳動的に接触させて当該分析物、CFS及び標識反応向上CFSの複合体を形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕、1種以上のCFSを含む溶液、1種以上の標識反応向上CFSを含有する溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物、少なくとも1種のCFS及び少なくとも1種の標識反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種を濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物、少なくとも1種のCFS及び少なくとも1種の標識反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種が、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、分析物、少なくとも1種のCFS及び少なくとも1種の標識反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種が集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含有する溶液(例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液)のゾーン、1種以上のCFSを含む溶液のゾーン、1種以上の標識反応向上CFSを含有する溶液のゾーン〕中の分析物の濃度、少なくとも1種のCFSの濃度又は少なくとも1種の標識反応向上CFSの濃度よりも、分析物の濃度、少なくとも1種のCFSの濃度又は少なくとも1種の標識反応向上CFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物、CFS及び標識反応向上CFSをを電気泳動的に接触させる」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物、CFS及び標識反応向上CFSを接触させることを意味する。
(h)標識アナログとCFSとを用いる場合
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)及び(b)1種以上のCFSを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含む試料と標識アナログを含む溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)のゾーン及び1種以上のCFSを含む溶液のゾーンとが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物とCFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFSとの複合体Bが形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、上記したように当該分析物及び標識アナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSを濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物、標識アナログ及びCFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物とCFS、及び標識アナログとCFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物とCFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFSとの複合体Bを形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含む試料と標識アナログを含む溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)、1種以上のCFSを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物及び標識アナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSを濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物及び標識アナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSが、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、分析物及び標識アナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSが集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物及び標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)ゾーン、CFSを含有する溶液ゾーン〕中の分析物及び標識アナログの濃度又は/及びCFSの濃度よりも、分析物及び標識アナログの濃度又は/及びCFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物、標識アナログ及びCFSとを電気泳動的に接触させる(即ち、当該分析物とCFS、及び標識アナログとCFSを電気泳動的に接触させる)」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物、標識アナログ及びCFSとを接触させること(即ち、当該分析物とCFS、及び標識アナログとCFSをそれぞれ接触させて)を接触させることを意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)及び(b)1種以上の反応向上CFSを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含む試料と標識アナログを含む溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)のゾーン及び1種以上の反応向上CFSを含む溶液のゾーンとが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物と反応向上CFSとの複合体A及び当該標識アナログと反応向上CFSとの複合体Bが形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、上記したように当該分析物及び標識アナログ、又は/及び少なくとも1種の反応向上CFSを濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物、標識アナログ及び反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物と反応向上CFS、及び標識アナログと反応向上CFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物と反応向上CFSとの複合体A及び当該標識アナログと反応向上CFSとの複合体Bを形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含む試料と標識アナログを含む溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)、1種以上の反応向上CFSを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物及び標識アナログ、又は/及び少なくとも1種の反応向上CFSを濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物及び標識アナログ、又は/及び少なくとも1種の反応向上CFSが、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、分析物及び標識アナログ、又は/及び少なくとも1種の反応向上CFSが集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含む試料と標識アナログを含む溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)のゾーン、反応向上CFSを含む溶液ゾーン〕中の分析物及び標識アナログの濃度又は/及び反応向上CFSの濃度よりも、分析物及び標識アナログの濃度又は/及び反応向上CFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物、標識アナログ及び反応向上CFSとを電気泳動的に接触させる(即ち、当該分析物と反応向上CFS、及び標識アナログと反応向上CFSを電気泳動的に接触させる)」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物、標識アナログ及び反応向上CFSとを接触させること(即ち、当該分析物と反応向上CFS、及び標識アナログと反応向上CFSをそれぞれ接触させて)を接触させることを意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)、(b)少なくとも1種のCFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の反応向上CFSを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含む試料と標識アナログを含む溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)のゾーン、1種以上のCFSを含む溶液のゾーン及び1種以上の反応向上CFSを含む溶液のゾーンとが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物とCFS及び反応向上CFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFS及び反応向上CFSとの複合体Bが形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、上記したように当該分析物及び標識アナログ、少なくとも1種のCFS並びに少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種を濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物、標識アナログ、CFS及び反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物、CFS及び反応向上CFS、並びに標識アナログ、CFS及び反応向上CFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物とCFS及び反応向上CFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFS及び反応向上CFSとの複合体Bを形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含む試料と標識アナログを含む溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)、1種以上のCFSを含む溶液、1種以上の反応向上CFSを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物及び標識アナログ、少なくとも1種のCFS並びに少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種を濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物及び標識アナログ、少なくとも1種のCFS並びに少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種が、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、当該分析物及び標識アナログ、少なくとも1種のCFS並びに少なくとも1種の反応向上CFSから選ばれる少なくとも1種が集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含む試料と標識アナログを含む溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)のゾーン、1種以上のCFSを含む溶液のゾーン、1種以上の反応向上CFSを含む溶液のゾーン〕中の分析物及び標識アナログの濃度、CFSの濃度、又は反応向上CFSの濃度よりも、分析物及び標識アナログの濃度、CFSの濃度、又は反応向上CFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物、標識アナログ、CFS及び反応向上CFSとを電気泳動的に接触させる(即ち、当該分析物、CFS及び反応向上CFS、並びに標識アナログ、CFS及び反応向上CFSを電気泳動的に接触させる)」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物、標識アナログ、CFS及び反応向上CFSとを接触させること(即ち、当該分析物、CFS及び反応向上CFS、並びに標識アナログ、CFS及び反応向上CFSをそれぞれ接触させて)を接触させることを意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と反応向上アナログを含有する溶液及(又は分析物を含む試料、反応向上アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)び(b)1種以上の標識CFSを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含む試料と反応向上アナログを含む溶液(又は分析物を含む試料、反応向上アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)のゾーン及び1種以上の標識CFSを含む溶液のゾーンとが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物と標識CFSとの複合体A及び当該反応向上アナログと標識CFSとの複合体Bが形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、上記したように当該分析物及び反応向上アナログ、又は/及び少なくとも1種の標識CFSを濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物、反応向上アナログ及び標識CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物と標識CFS、及び反応向上アナログと標識CFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物と標識CFSとの複合体A及び当該反応向上アナログと標識CFSとの複合体Bを形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含む試料と反応向上アナログを含む溶液(又は分析物を含む試料、反応向上アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)、1種以上の標識CFSを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物及び反応向上アナログ、又は/及び少なくとも1種の標識CFSを濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物及び反応向上アナログ、又は/及び少なくとも1種の標識CFSが、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、分析物及び反応向上アナログ、又は/及び少なくとも1種の標識CFSが集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含む試料と反応向上アナログを含む溶液(又は分析物を含む試料、反応向上アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)のゾーン、1種以上の標識CFSを含む溶液のゾーン〕中の分析物及び反応向上アナログの濃度又は/及び標識CFSの濃度よりも、分析物及び反応向上アナログの濃度又は/及び標識CFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物、反応向上アナログ及び標識CFSとを電気泳動的に接触させる(即ち、当該分析物と標識CFS、及び反応向上アナログと標識CFSを電気泳動的に接触させる)」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物、反応向上アナログ及び標識CFSとを接触させること(即ち、当該分析物と標識CFS、及び反応向上アナログと標識CFSをそれぞれ接触させて)を接触させることを意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料及び1種以上のCFSを含有する溶液と(b)標識アナログを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含む試料と及び1種以上のCFSを含む溶液のゾーンと標識アナログを含む溶液のゾーンとが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該標識アナログとCFSとの複合体Bが形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、当該標識アナログ、又は/及び分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかったCFSを濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該標識アナログとCFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該標識アナログと、分析物を含む試料と1種以上のCFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかったCFSとを電気泳動的に接触させて)、標識アナログとCFSとの複合体Bを形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含む試料と及び1種以上のCFSを含む溶液、標識アナログを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該標識アナログ、又は/及び複合体Aの形成に関与しなかったCFSを濃縮させる」とは、前述と同様、当該標識アナログ、又は/及び分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかったCFSが、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、当該標識アナログ又は/及び分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかったCFSが集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含む試料と及び1種以上のCFSを含む溶液のゾーン、標識アナログを含む溶液のゾーン〕中の標識アナログの濃度又は/及び複合体Aの形成に関与しなかったCFSの濃度よりも、標識アナログの濃度又は/及び複合体Aの形成に関与しなかったCFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該標識アナログとCFSとを電気泳動的に接触させる(即ち、当該標識アナログと、分析物を含む試料と1種以上のCFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかったCFSとを電気泳動的に接触させる)」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該標識アナログとCFSとを接触させること(即ち、当該標識アナログと、分析物を含む試料と1種以上のCFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかったCFSとを電気泳動的に接触させること)を意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料及び1種以上の反応向上CFSを含有する溶液と(b)標識アナログを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含む試料及び1種以上の反応向上CFSを含む溶液のゾーンと標識アナログを含む溶液のゾーンとが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該標識アナログと反応向上CFSとの複合体Bが形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、当該標識アナログ、又は/及び分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった反応向上CFSを濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該標識アナログと反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該標識アナログと、分析物を含む試料と1種以上の反応向上CFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて)、標識アナログと反応向上CFSとの複合体Bを形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含む試料と及び1種以上の反応向上CFSを含む溶液、標識アナログを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該標識アナログ、又は/及び複合体Aの形成に関与しなかった反応向上CFSを濃縮させる」とは、前述と同様、当該標識アナログ、又は/及び分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった反応向上CFSが、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、当該標識アナログ又は/及び分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった反応向上CFSが集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含む試料と及び1種以上の反応向上CFSを含む溶液のゾーン、標識アナログを含む溶液のゾーン〕中の標識アナログの濃度又は/及び複合体Aの形成に関与しなかった反応向上CFSの濃度よりも、標識アナログの濃度又は/及び複合体Aの形成に関与しなかった反応向上CFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該標識アナログと反応向上CFSとを電気泳動的に接触させる(即ち、当該標識アナログと、分析物を含む試料と1種以上の反応向上CFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった反応向上CFSとを電気泳動的に接触させる)」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該標識アナログと反応向上CFSとを接触させること(即ち、当該標識アナログと、分析物を含む試料と1種以上の反応向上CFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった反応向上CFSとを電気泳動的に接触させること)を意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と少なくとも1種のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)を含有する溶液、(b)標識アナログを含有する溶液、及び(c)少なくとも1種の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)を含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含む試料と1種以上のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)を含む溶液のゾーン、標識アナログを含む溶液のゾーン、及び1種以上の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)を含む溶液のゾーンとが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該分析物とCFS及び反応向上CFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFS及び反応向上CFSとの複合体Bが形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、当該分析物と少なくとも1種のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)との複合体、標識アナログ、及び少なくとも1種の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)から選ばれる少なくとも1種を濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該分析物、標識アナログ、複合体形成物質及び反応向上結合物質とを電気泳動的に接触させて(即ち、溶液(a)中の分析物とCFS(又は反応向上CFS)との複合体と溶液(c)中の反応向上CFS(又はCFS)、並びに標識アナログ、溶液(a)中の分析物との複合体の形成に関与しなかったCFS(又は反応向上CFS)及び溶液(c)中の反応向上CFS(又はCFS)を電気泳動的に接触させて)、当該分析物とCFS及び反応向上CFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFS及び反応向上CFSとの複合体Bを形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含む試料と1種以上のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)を含む溶液、標識アナログを含む溶液、1種以上の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)を含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該分析物と少なくとも1種のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)との複合体、標識アナログ、及び少なくとも1種の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)から選ばれる少なくとも1種を濃縮させる」とは、前述と同様、当該分析物と少なくとも1種のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)との複合体、標識アナログ、及び少なくとも1種の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)から選ばれる少なくとも1種が、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、当該分析物と少なくとも1種のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)との複合体、標識アナログ、及び少なくとも1種の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)から選ばれる少なくとも1種が集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含む試料と1種以上のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)を含む溶液のゾーン、標識アナログを含む溶液のゾーン、1種以上の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)を含む溶液のゾーン〕中の分析物と少なくとも1種のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)との複合体の濃度、標識アナログの濃度、又は少なくとも1種の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)の濃度よりも、分析物と少なくとも1種のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)との複合体の濃度、標識アナログの濃度、又は少なくとも1種の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)の濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該分析物、標識アナログ、複合体形成物質及び反応向上結合物質とを電気泳動的に接触させる(即ち、溶液(a)中の分析物とCFS(又は反応向上CFS)との複合体と溶液(c)中の反応向上CFS(又はCFS)、並びに標識アナログ、溶液(a)中の分析物との複合体の形成に関与しなかったCFS(又は反応向上CFS)及び溶液(c)中の反応向上CFS(又はCFS)を電気泳動的に接触させる)」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該分析物、標識アナログ、複合体形成物質及び反応向上結合物質とを電気泳動的に接触させること(即ち、溶液(a)中の分析物とCFS(又は反応向上CFS)との複合体と溶液(c)中の反応向上CFS(又はCFS)、並びに標識アナログ、溶液(a)中の分析物との複合体の形成に関与しなかったCFS(又は反応向上CFS)及び溶液(c)中の反応向上CFS(又はCFS)を電気泳動的に接触させること)を意味する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料及び1種以上の標識CFSを含有する溶液と(b)反応向上アナログを含有する溶液とを、これらの溶液を予め細管外で混合することなく、分析物を含む試料と及び1種以上の標識CFSを含む溶液のゾーンと反応向上アナログを含む溶液のゾーンが別々に形成されるように(液−液界面が形成されるように)、且つ細管に電圧を印加した際に当該反応向上アナログと標識CFSとの複合体Bが形成されるように、導入・配置させる。
(2)次いで、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、当該反応向上、又は/及び分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった標識CFSを濃縮させながら、分子拡散に依存せず、また物理的な混合を行うことなく、当該反応向上アナログと標識CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該反応向上アナログと、分析物を含む試料と1種以上の標識CFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった標識CFSとを電気泳動的に接触させて)、反応向上アナログと標識CFSとの複合体Bを形成させる。
上記において、「溶液が均一に混合される前に」とは、工程(1)により、細管内に配置された、分析物を含む試料と及び1種以上の標識CFSを含む溶液、反応向上アナログを含む溶液、要すれば液体のそれぞれのゾーン(液−液界面)が、分子拡散によって均一に混合される前を意味する。尚、「界面」も前述と同じ意味である。
また、上記工程(2)において、「細管に電圧を印加することによって、当該反応向上アナログ、又は/及び複合体Aの形成に関与しなかった標識CFSを濃縮させる」とは、前述と同様、当該反応向上アナログ、又は/及び分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった標識CFSが、細管に電圧を印加した際に、バンド状(プラグ状)に集合してくることを言う。換言すれば、細管に電圧を印加した際に、当該物質が集合し、工程(1)で配置されたゾーン中の物質の濃度よりも、当該物質の濃度の方が高くなるような部分が生じること、即ち、細管に電圧を印加した際に、当該反応向上アナログ、又は/及び分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった標識CFSが集合し、工程(1)で配置された溶液ゾーン〔例えば分析物を含む試料と及び1種以上の標識CFSを含む溶液のゾーン、反応向上アナログを含む溶液のゾーン〕中の反応向上アナログの濃度又は/及び複合体Aの形成に関与しなかった標識CFSの濃度よりも、反応向上アナログの濃度又は/及び複合体Aの形成に関与しなかった標識CFSの濃度の方が高くなるような部分が生じることを意味する。
上記工程(2)において、「当該反応向上アナログと標識CFSとを電気泳動的に接触させる(即ち、当該反応向上アナログと、分析物を含む試料と1種以上の標識CFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった標識CFSとを電気泳動的に接触させる)」とは、前述と同様に、分子拡散によらず(依存せず)に、より高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液を、それよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を含有する溶液の下流に配置させて、電気泳動を行った場合、溶液中のより高い電気泳動移動度(より速い電気泳動速度)を有する物質がそれよりも低い電気泳動移動度(遅い電気泳動速度)を有する物質を追い越すことを利用して、当該反応向上アナログと標識CFSとを接触させること(即ち、当該反応向上アナログと、分析物を含む試料と1種以上の標識CFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった標識CFSとを電気泳動的に接触させること)を意味する。
また、上記方法(a)〜(o)において、「濃縮させながら、接触させる」とは、前述と同様に、濃縮と接触が、同時並行的に行われる場合、或いは、濃縮が実質的に完了した後に接触が行われる場合、の両者を意味し、言うなれば接触が実質的に完了した後に濃縮が行われる場合以外の場合を包含する。
上記方法(a)〜(o)において、工程(2)は、前述同様、工程(1)によって細管内に配置された溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することにより、濃縮、接触及び複合体の形成が行い得る条件下で、当該細管に電圧を印加することにより実施し得る。
このような条件の具体例、好ましい態様等は、前述した通りであり、例えば使用される、分析物、CFS、標識CFS、反応向上CFS、標識反応向上CFS、標識アナログ、反応向上アナログ、これらの2種以上の複合体等の電気泳動移動度、或いはこれらを含む溶液の電気伝導度等を適宜考慮して、前述した濃縮方法に準じて、上記の工程(2)を実施すればよい。
また、工程(2)における、印加電圧、その他の反応条件(例えばpH、温度、時間等)等も、前述した如き範囲から、分析物、CFS、標識CFS、反応向上CFS、標識反応向上CFS、標識アナログ、反応向上アナログ、これらの2種以上の複合体、これらを含む溶液等を考慮して、適宜決定すればよい。
本発明の分離方法は、上記した如き本発明の複合体形成方法により形成された分析物又はそのアナログと1種以上のCFSとの複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、電気的に分離することを特徴とする。
即ち、本発明の工程(2)において、細管内を電気泳動的に移動することによって互いに接触して形成された溶液中の分析物又はそのアナログとCFSとの複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、更に電気泳動的に移動して分離するものである。
本発明の分離方法は、例えば細管を用いて物質を電気的に移動させて分離する自体公知の方法において、分析物又はそのアナログと1種以上のCFSとの複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを電気的に分離する以外は、自体公知の方法に従って実施すれば良く、使用される材料、試薬類等も自体公知の方法で用いられているものを使用すればよい。
従って、本発明の分離方法は、以下の工程(1)〜(3)を含むものである。
(1)細管内に、(a)分析物又はそのアナログを含有する溶液と、(b)1種以上の、複合体形成物質(CFS)と当該分析物又はそのアナログを含有する溶液とを、これらの溶液を予め混合することなく且つ当該細管に電圧を印加することにより当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体が形成されるように配置させる工程(導入工程)、
(2)これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、当該分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSを濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログとCFSとを接触させ、当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させる工程(濃縮反応工程)、及び
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、更に電気的に移動させて分離する工程(分離工程)。
尚、上記において、分析物、アナログ(標識アナログ、反応向上アナログ)、分析物又はそのアナログを含有する溶液、分析物を含む試料、CFS(標識CFS、反応向上CFS、標識反応向上CFS)、それを含む溶液、導入工程〔工程(1)〕、濃縮反応工程〔工程(2)〕等の態様、具体例、好ましい例等は前述した通りである。
上記の如く本発明の工程(1)及び(2)によって得られた分析物又はそのアナログとCFSとの複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、更に電気的に移動させて細管内で分離する。
本発明の分離方法は、分析物又はそのアナログとCFSとの複合体と当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを分離するものであり、より具体的には、(1)当該分析物とCFSとの複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFSとを、更に電気的に移動させて分離するか、或いは(2)当該アナログとCFSとの複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったアナログ、又は当該複合体の形成に関与しなかった当該分析物とCFSとの複合体とを、更に電気的に移動させて分離するものである。
例えば本発明の分離方法を非競合法(例えば後述の方法(a)〜(g)等)で用いる場合において、標識物質を含むCFS(標識CFS又は標識反応向上CFS)を用いる場合には、少なくとも、分析物とCFSとの複合体の形成に関与しなかった(遊離の)標識物質を含むCFSと、分析物を含む複合体とを分離すればよく、標識物質を含まないCFSを必ずしも当該複合体から分離する必要はないが、当該複合体と複合体の形成に関与しなかったCFS(遊離のCFS)の全てとを分離するのが好ましい。
また、例えば本発明の分離方法を競合法(例えば後述の方法(h)〜(o)等)で用いる場合において、標識アナログを用いる場合には、少なくとも、標識アナログと(全ての)CFSとの(最終的な)複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった標識アナログ(遊離の標識アナログ)とを分離すればよく、分析物とCFSとの複合体と、標識アナログと(全ての)CFSとの(最終的な)複合体とを必ずしも分離する必要はない。また、反応向上アナログを用いる場合には、少なくとも、反応向上アナログと標識CFSとの複合体と、分析物と標識CFSとの複合体とを分離すればよい。
具体的には、例えば前述した如きITP、IF、例えば細管内が基本的に泳動緩衝液だけで満たされており、それぞれの物質が荷電の大小によって異なる速度で移動することによって目的物質の分離を行う、所謂キャピラリーゾーン電気泳動法(CZE)〔文献:H.Hisamoto at al., Chem.Commun., (2001), 2662等〕、イオン性のミセルを形成する荷電物質を使用して、当該ミセルとの相互作用によって目的物質の分離を行う、所謂ミセル動電クロマトグラフィー(MEKC)〔文献:S. Terabe, Trends Anal. Chem., (1989), 8, 129等〕、分子篩い効果を有するポリマー等の充填剤を使用し、目的物質の持つ荷電とポリマーとの相互作用を引き起こす分子の大きさによって目的物質を分離する、所謂キャピラリーゲル電気泳動法(CGE)〔文献:S. Hjerten, J.Chromatogr., (1987), 397, 409等〕等の種々の原理(分離モード)に基づく電気泳動法が使用できる。
尚、本発明においては、上記した如き電気泳動法において使用される試薬類等が適宜使用可能である。また、このような試薬類、分離の際の操作方法、条件等は、前述した如き文献等の記載に準じて適宜選択することができる。
本発明の工程(3)において用いられる電気泳動法としては、工程(2)で用いた濃縮法と同じ原理(分離モード)の電気泳動法を用いても、また、工程(2)で用いた濃縮法と異なる原理(分離モード)の電気泳動法を用いてもよい。
尚、工程(2)と同じ原理(分離モード)の電気泳動法を用いると、分析物又はそのアナログとCFSとの複合体と当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとの分離が不十分である場合等においては、工程(2)で用いた濃縮法と異なる原理(分離モード)の電気泳動法を用いて本発明の工程(3)を行うのが望ましい。
このような場合には、工程(2)をITP、FASS等で実施した後、工程(3)をCZE等で実施するのが特に好ましい。
上記したように、本発明の分離方法においては、(i)工程(2)によって、分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSを濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログとCFSとを接触させて当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させた後(言い換えれば、分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSが濃縮される条件下で当該細管に電圧を印加して、当該分析物又はそのアナログとCFSとを接触させて当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させた後)、引き続き、同じ分離モードを用いて印加する電圧を変化させることなく(言い換えれば、工程(2)と同じ条件下で、同じ強さの電圧を印加したまま)、当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、更に電気的に移動させて分離させる場合、或いは(ii)工程(2)によって、分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSを濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログとCFSとを接触させて当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させた後(言い換えれば、分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSが濃縮される条件下で当該細管に電圧を印加して、当該分析物又はそのアナログとCFSとを接触させて当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させた後)、異なる分離モード又は/及び異なる印加電圧を用いて(言い換えれば、工程(2)と条件(用いる分離モード)又は/及び印加する電圧の強さを変化させて)、当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、更に電気的に移動させて分離させる場合を包含する。
また、その他の分離条件(例えばpH、温度、時間等)は、分析物又はそのアナログとCFSとの複合体と当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとが充分に分離される範囲であればよく、通常この分野で用いられている自体公知の方法に従い適宜選択される。
具体的には、分析物又はそのアナログとCFSの性質により異なるため一概には言えないが、pHは下限が通常2以上、好ましくは4以上、より好ましくは5以上であり、上限が通常13以下、好ましくは11以下、より好ましくは9以下である。温度は、下限が通常0℃以上、好ましくは5℃以上、より好ましくは10℃以上であり、上限が通常90℃以下、好ましくは80℃以下、より好ましくは50℃以下、更に好ましくは40℃以下、特に好ましくは30℃以下である。また、時間は、下限が通常1分以上、好ましくは2分以上、より好ましくは3分以上であり、上限が20分以下、好ましくは10分以下である。
また、本発明の工程(3)は、通常、上記した如き細管内(分離領域内)に泳動用緩衝液又は充填剤を含有する当該泳動用緩衝液等の泳動媒体が充填された状態で実施される。尚、泳動媒体の具体例、使用濃度、pH、分子量、粘度、細管への導入方法、導入時期等は前述と同じである。
尚、上記したように、工程(2)で用いた濃縮法と異なる原理(分離モード)の電気泳動法を用いて本発明の工程(3)を行う場合には、工程(2)で使用する泳動媒体と工程(3)で使用する泳動媒体とは同一のものである必要はなく、これらを適宜選択して異なる泳動媒体を使用しても良い。
尚、本発明の工程(2)及び(3)は、通常、同一の細管を用いて(同一の細管内で)行われる。即ち、本発明の分離方法で用いられる細管は、少なくとも、本発明の工程(1)を実施し得る部分、本発明の工程(2)を実施し得る部分、及び本発明の工程(3)を実施し得る部分を有するものである。これらの部分は、細管にそれぞれ独立して存在していても、また、それらの一部或いは全部が重複して存在していても良い。言い換えれば、本発明の分離方法で用いられる細管は、結果的に、その細管内に、(a)分析物又はそのアナログを含有する溶液と、(b)1種以上の、当該分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得る物質(CFS)を含有する溶液とを、これらの溶液を予め混合することなく且つ当該細管に電圧を印加することにより当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体が形成されるように配置させることができ、また、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、当該分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSを濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログとCFSとを接触させて当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させることができ、更には当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、更に電気的に移動させて分離することができるものである。
本発明の分離方法の実施の形態を以下に具体的に示す。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(a)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(a)における工程(2)のように、当該分析物とCFSとを電気泳動的に接触させて当該分析物とCFSとの複合体を形成させる。
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFSとを、細管の分離領域において、更に電気的に移動させて分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、標識CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(b)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(b)における工程(2)のように、当該分析物と標識CFSとを接触させて当該分析物と標識CFSとの複合体を形成させる。
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった標識CFSとを、細管の分離領域において、更に電気的に移動させて分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(c)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(c)における工程(2)のように、当該分析物と反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて当該分析物と反応向上CFSとの複合体を形成させる。
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった反応向上CFSとを、細管の分離領域において、更に電気的に移動させて分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、標識反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(d)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(d)における工程(2)のように、当該分析物と標識反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて当該分析物と標識反応向上CFSとの複合体を形成させる。
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった標識反応向上CFSとを、細管の分離領域において、更に電気的に移動させて分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)少なくとも1種の、CFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の、反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(e)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(e)における工程(2)のように、当該分析物、CFS及び反応向上CFSを接触させて当該分析物、CFS及び反応向上CFSの複合体を形成させる。
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS及び要すれば当該複合体の形成に関与しなかった反応向上CFSとを、細管の分離領域において、更に電気的に移動させて分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)少なくとも1種の、標識CFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の、反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(f)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(f)における工程(2)のように、当該分析物、標識CFS及び反応向上CFSを電気泳動的に接触させて当該分析物、標識CFS及び反応向上CFSの複合体を形成させる。
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった標識CFS及び当該複合体の形成に関与しなかった要すれば反応向上CFSとを、細管の分離領域において、更に電気的に移動させて分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)少なくとも1種の、CFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の、標識反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(g)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(g)における工程(2)のように、当該分析物、CFS及び標識反応向上CFSを電気泳動的に接触させて当該分析物、CFS及び標識反応向上CFSの複合体を形成させる。
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった標識反応向上CFS及び要すればCFSとを、細管の分離領域において、更に電気的に移動させて分離する。
(h)標識アナログとCFSとを用いる場合
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)及び(b)1種以上のCFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(h)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(h)における工程(2)のように、当該分析物、標識アナログ及びCFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物とCFS、及び標識アナログとCFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物とCFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFSとの複合体Bを形成させる。
(3)当該複合体Bと、当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログとを、細管の分離領域において、更に分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)及び(b)1種以上の反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(i)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(i)における工程(2)のように、当該分析物、標識アナログ及び反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物と反応向上CFS、及び標識アナログと反応向上CFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物と反応向上CFSとの複合体A及び当該標識アナログと反応向上CFSとの複合体Bを形成させる。
(3)当該複合体Bと、当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログとを、細管の分離領域において、更に分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)、(b)少なくとも1種のCFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(j)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(j)における工程(2)のように、当該分析物、標識アナログ、CFS及び反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物、CFS及び反応向上CFS、並びに標識アナログ、CFS及び反応向上CFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物とCFS及び反応向上CFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFS及び反応向上CFSとの複合体Bを形成させる。
(3)当該複合体Bと、当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログとを、細管の分離領域において、更に分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と反応向上アナログを含有する溶液及(又は分析物を含む試料、反応向上アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)び(b)1種以上の標識CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(k)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(k)における工程(2)のように、当該分析物、反応向上アナログ及び標識CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物と標識CFS、及び反応向上アナログと標識CFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物と標識CFSとの複合体A及び当該反応向上アナログと標識CFSとの複合体Bを形成させる。
(3)当該複合体Bと、当該複合体Aとを、細管の分離領域において、更に電気的に移動させて分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料及び1種以上のCFSを含有する溶液と(b)標識アナログを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(l)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(l)における工程(2)のように、当該標識アナログとCFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該標識アナログと、分析物を含む試料と1種以上のCFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかったCFSとを電気泳動的に接触させて)、標識アナログとCFSとの複合体Bを形成させる。
(3)当該複合体Bと、当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログとを、細管の分離領域において、更に分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料及び1種以上の反応向上CFSを含有する溶液と(b)標識アナログを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(m)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(m)における工程(2)のように、当該標識アナログと反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該標識アナログと、分析物を含む試料と1種以上の反応向上CFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて)、標識アナログと反応向上CFSとの複合体Bを形成させる。
(3)当該複合体Bと、当該複合体の形成に関与しなかった標識アナログとを、細管の分離領域において、更に分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と少なくとも1種のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)を含有する溶液、(b)標識アナログを含有する溶液、及び(c)少なくとも1種の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)を含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(n)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(n)における工程(2)のように、当該分析物、標識アナログ、複合体形成物質及び反応向上結合物質とを電気泳動的に接触させる(即ち、溶液(a)中の分析物とCFS(又は反応向上CFS)との複合体と溶液(c)中の反応向上CFS(又はCFS)、並びに標識アナログ、溶液(a)中の分析物との複合体の形成に関与しなかったCFS(又は反応向上CFS)及び溶液(c)中の反応向上CFS(又はCFS)を電気泳動的に接触させる)。
(3)当該複合体Bと、当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログとを、細管の分離領域において、更に分離する。
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料及び1種以上の標識CFSを含有する溶液と(b)反応向上アナログを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(o)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(o)における工程(2)のように、当該反応向上アナログと標識CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該反応向上アナログと、分析物を含む試料と1種以上の標識CFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった標識CFSとを電気泳動的に接触させて)、反応向上アナログと標識CFSとの複合体Bを形成させる。
(3)当該複合体Bと、当該複合体Aとを、細管の分離領域において、更に電気的に移動させて分離する。
本発明の分離方法により分離された、分析物又はそのアナログとCFSとの複合体の量、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログの量を、例えば複合体中の標識物質、又は複合体の形成に関与しなかったCFS中の標識物質又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログ中の標識物質の性質に応じた方法により測定すれば、試料中に存在する分析物の量を、簡便且つ高感度に短時間に求めることができる。
従って、本発明の測定方法は、
(1)細管内に、(a)分析物又はそのアナログを含有する溶液と、(b)1種以上の、当該分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得る物質(CFS)を含有する溶液とを、これらの溶液を予め混合することなく且つ当該細管に電圧を印加することにより当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体が形成されるように配置させる工程(導入工程)、
(2)これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、当該分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種のCFSを濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログとCFSとを接触させ、当該分析物又はそのアナログとCFSとの複合体を形成させる工程(濃縮反応工程)、及び
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、更に電気的に移動させて分離する工程(分離工程)、及び
(4)分離された複合体の量、又は当該複合体の形成に関与しなかったCFS又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログの量を測定し、その結果に基づいて分析物の量を求める工程(測定工程)、
を含むことを特徴とする。
尚、上記において、分析物、アナログ(標識アナログ、反応向上アナログ)、分析物又はそのアナログを含有する溶液、分析物を含む試料、CFS(標識CFS、反応向上CFS、標識反応向上CFS)、それを含む溶液、導入工程〔工程(1)〕、濃縮反応工程〔工程(2)〕、分離工程〔工程(3)〕等の態様、具体例、好ましい例等は前述した通りである。
本発明の測定方法は、非競合法及び競合法の何れにも適用可能である。
即ち、非競合法により、本発明の測定法を実施する場合には、例えば以下のようにして行えばよい。
(1)本発明の工程(1)により、細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、CFS(CFS、標識CFS、反応向上CFS、標識反応向上CFS、これらの組合せ)を含有する溶液とを、これらの溶液を予め混合することなく且つ当該細管に電圧を印加することにより当該分析物とCFSとの複合体〔(分析物−CFS)複合体、(分析物−標識CFS)複合体、(分析物−反応向上CFS)複合体、(分析物−標識反応向上CFS)複合体、(CFS−分析物−反応向上CFS)複合体、(標識CFS−分析物−反応向上CFS)複合体、(CFS−分析物−標識反応向上CFS)複合体、これらの組合せ等〕が形成されるように、配置させ、
(2)本発明の工程(2)により、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、当該分析物又は/及び少なくとも1種のCFSを濃縮させながら、当該分析物とCFSとを接触させて当該分析物とCFSとの複合体を形成させ、
(3)本発明の工程(3)により、当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFSとを、更に電気的に移動させて分離し、ついで、
(4)分離された複合体の量又は当該複合体の形成に関与しなかったCFSの量を測定し、その結果に基づいて試料中の分析物の量を求める。
(1)本発明の工程(1)により、細管内に、(i)(a)分析物を含む試料(又は分析物を含む試料及び1種以上のCFSを含む溶液)、(b)標識物質により標識された標識アナログを含有する溶液(又は標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)及び(c)1種以上のCFS(CFS、反応向上CFS、これらの組合せ)を含有する溶液とを、又は(ii)(a)分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)及び(b)1種以上のCFS(CFS、反応向上CFS、これらの組合せ)を含有する溶液とを、或いは(iii)(a)分析物を含む試料と1種以上のCFS(CFS、反応向上CFS、これらの組合せ)を含有する溶液、及び(b)標識アナログを含有する溶液(又は標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)とを、これらの溶液を予め混合することなく且つ当該細管に電圧を印加することにより、当該標識アナログとCFSとの複合体B〔(標識アナログ−CFS)複合体、(標識アナログ−反応向上CFS)複合体、(CFS−標識アナログ−反応向上CFS)、これらの組合せ等〕が形成されるように、或いは当該分析物とCFSとの複合体A〔(分析物−CFS)複合体、(分析物−反応向上CFS)複合体、(CFS−分析物−反応向上CFS)、これらの組合せ〕及び複合体Bが形成されるように、配置させ、
(2)本発明の工程(2)により、これらの溶液が均一に混合される前に、当該細管に電圧を印加することによって、当該分析物、標識アナログ及び少なくとも1種のCFSの少なくとも1種を濃縮させながら、(i)当該標識アナログとCFSとを接触させて(即ち、当該標識アナログと、分析物を含む複合体(複合体A)の形成に関与しなかったCFSを接触させて)、又は(ii)当該分析物、標識アナログ及びCFSを接触させて(即ち、当該分析物とCFS、及び標識アナログとCFSとを接触させて)、当該標識アナログとCFSとの複合体B、又は当該分析物とCFSとの複合体A及び複合体Bを形成させ、
(3)本発明の工程(3)により、当該複合体Bと、当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログとを、更に分離し、
(4)分離された複合体Bの量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログの量を測定し、その結果に基づいて試料中の分析物の量を求める。
(1)本発明の工程(1)により、細管内に、(i)(a)分析物を含む試料(又は分析物を含む試料及び1種以上の複合体形成物質を含む溶液)、(b)反応向上物質が結合したアナログ(反応向上アナログ)を含有する溶液(又は反応向上アナログ及び1種以上の複合体形成物質を含む溶液)及び(c)1種以上の複合体形成物質(複合体形成物質、反応向上結合物質、これらの組合せ)を含有する溶液とを、又は(ii)(a)分析物を含む試料と反応向上アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、反応向上アナログ及び1種以上の複合体形成物質を含む溶液)及び(b)1種以上の複合体形成物質(複合体形成物質、反応向上結合物質、これらの組合せ)を含有する溶液とを、或いは(iii)(a)分析物を含む試料と1種以上の複合体形成物質(複合体形成物質、反応向上結合物質、これらの組合せ)を含有する溶液、及び(b)反応向上アナログを含有する溶液(又は反応向上アナログ及び1種以上の複合体形成物質を含む溶液)とを、これらの溶液を予め混合することなく且つ当該細管に電圧を印加することにより、反応向上アナログと標識CFSとの複合体B、又は分析物と標識CFSとの複合体A及び複合体Bが形成されるように、配置させ、
(2)本発明の工程(2)により、これらの溶液が均一に混合される前に、当該分析物、反応向上アナログ及び少なくとも1種の標識CFSの少なくとも1種を濃縮させながら、(i)当該反応向上アナログと標識CFSとを接触させ(即ち、反応向上アナログと、分析物を含む複合体(複合体A)の形成に関与しなかった標識CFSとを接触させ)、又は(ii)当該分析物、反応向上アナログ及び標識CFSとを接触させて(即ち、当該分析物と標識CFS、及び反応向上アナログと標識CFSを接触させて)、反応向上アナログと標識CFSとの複合体B、又は当該分析物と標識CFSとの複合体A及び複合体Bを形成させ、
(3)本発明の工程(3)により、当該複合体Bと、当該複合体Aとを、更に電気的に移動させて分離し、
(4)分離された複合体Bの量又は複合体Aの量を測定し、その結果に基づいて試料中の分析物の量を求める。
尚、アナログ(標識アナログ又は反応向上アナログ)は、(i)試料中の分析物(即ち、分析物を含む試料)と共存させて、標識アナログ又は反応向上アナログと分析物とを含む溶液(分析物及びアナログを含有する溶液)として、又は、(2)試料中の分析物(即ち、分析物を含む試料)と共存させずに、分析物を含有する溶液とは別の、アナログを含有する溶液として使用される。
本発明の工程(4)において、分離された複合体の量又は当該複合体の形成に関与しなかったCFSの量又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログの量を測定するには、例えば当該複合体中の標識物質又は当該複合体の形成に関与しなかったCFS中の標識物質又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログ中の標識物質の性質に応じた方法により当該標識物質を測定し、その結果に基づいて行えばよい。即ち、非競合法においては、分離された、分析物とCFSとの複合体の量又は当該複合体の形成に関与しなかったCFSの量を、例えば当該複合体中の標識物質又は当該複合体の形成に関与しなかったCFS中の標識物質の性質に応じた方法により当該標識物質を測定し、その結果に基づいて行えばよい。また、競合法においては、分離された、複合体Bの量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログの量(或いは複合体Bの量又は複合体Aの量)を、当該複合体B中の標識物質又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中の標識物質(或いは複合体A中の標識物質)の性質に応じた方法により当該標識物質を測定し、その結果に基づいて行えばよい。
標識物質を測定するには、標識物質の種類に応じて夫々所定の方法に従って行えばよく、例えば、その性質が酵素活性の場合にはEIAやハイブリダイゼーション法等の常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・ 南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、51〜63頁、共立出版(株)、1987年9月10日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、検出物質が放射性物質の場合にはRIAやハイブリダイゼーション法等の常法に従い、該放射性物質の出す放射線の種類及び強さに応じて液浸型GMカウンター,液体シンチレーションカウンター,井戸型シンチレーションカウンター等の測定機器を適宜選択して使用し、測定を行えばよい(例えば医化学実験講座、第8巻、山村雄一監修、第1版、中山書店、1971,生化学実験講座2 トレーサー実験法下、竹村彰祐,本庶佑、501〜525頁、(株)東京化学同人、1977年2月25日発行等参照。)。また、その性質が蛍光性の場合には蛍光光度計や共焦点レーザー顕微鏡等の測定機器を用いるFIAやハイブリダイゼーション法等の常法、例えば「図説 蛍光抗体、川生明著、第1版、( 株)ソフトサイエンス社、1983」、「生化学実験講座2 核酸の化学III、実吉峯郎、299〜318頁、(株)東京化学同人、1977年12月15日発行等に記載された方法に準じて測定を行えばよく、その性質が発光性の場合にはフォトンカウンター等の測定機器を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、252〜263頁、共立出版(株)、1987年9月10日発行」等に記載された方法に準じて測定を行えばよい。更に、その性質が紫外部に吸収を有する性質の場合には分光光度計等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよく、その性質が発色性の場合には分光光度計や顕微鏡等の測定機器を用いる常法によって測定を行えばよい。また、検出物質がスピンの性質を有する物質の場合には電子スピン共鳴装置を用いる常法、例えば「酵素免疫測定法、蛋白質 核酸 酵素 別冊 No.31、北川 常廣・南原利夫・辻章夫・石川榮治編集、264〜271頁、共立出版(株)、1987年9月10日発行」等に記載された方法が挙げられる。
競合法においては、測定された、複合体の量又は当該複合体の形成に関与しなかったCFSの量、即ち、上記の如きして得られた複合体中の標識物質の量又は当該複合体の形成に関与しなかったCFS中の標識物質の量に基づいて、試料中に存在する分析物の量を求めるには、例えば分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行い、得られた分析物の量と、複合体中の標識物質の量又は当該複合体の形成に関与しなかったCFS中の標識物質の量との関係を示す検量線を作製し、この検量線に分析物を含有する試料を用いて測定を行って得られた標識物質の量をあてはめることにより、目的の分析物の量を求めることができる。また、非競合法においては、複合体Bの量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログの量(或いは複合体Bの量又は複合体Aの量)、即ち、上記の如きして得られた複合体B中の標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中の標識物質の量(或いは複合体A中の標識物質の量)に基づいて、試料中に存在する分析物の量を求めるには、例えば分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行い、得られた分析物の量と、複合体B中の標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中の標識物質の量(或いは複合体A中の標識物質の量)との関係を示す検量線を作製し、この検量線に分析物を含有する試料を用いて測定を行って得られた標識物質の量をあてはめることにより、目的の分析物の量を求めることができる。
このような検出可能な物質(内部標準)としては、前述した如き標識物質や蛍光物質等で標識された例えばペプチド、タンパク質、核酸(DNA、RNA)、アミノ酸、蛍光物質、糖、糖鎖等が挙げられる。
また、標識物質としてインターカレーター色素を用いる場合には、本発明の工程(1)において、当該インターカレーター色素を、分析物又はそのアナログを含有する溶液及び1種以上のCFSを含む溶液と共に細管内に導入・配置させる必要はない。また、本発明の工程(2)において、当該インターカレーター色素を、分析物又はそのアナログ及びCFSと接触させる必要もない。少なくとも本発明の工程(3)を、当該インターカレーター色素の存在下で行えばよい。このような場合には、具体的には、例えば本発明の工程(3)で使用する泳動媒体又は/及びバッファー中に当該インターカレーター色素を含有させておけばよい。なかでも、本発明においては、本発明の工程(2)及び工程(3)を当該インターカレーター色素の存在下で行うのが好ましい。この場合には本発明の工程(2)及び(3)で用いられる泳動媒体又は/及びバッファー中に当該インターカレーター色素を含有させておけばよい。
本発明においては、工程(2)を荷電ポリマーの存在下で行うのが好ましい。
即ち、(i)荷電ポリマーの存在下で、分析物又はアナログとCFSとを接触させて当該分析物又はアナログとCFSとの複合体を形成させるか、又は、(ii)荷電ポリマーの存在下で、分析物、アナログ(標識アナログ及びCFSとを接触させて当該分析物とCFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFSとの複合体Bを形成させるか、或いは(iii)荷電ポリマーの存在下で、分析物、反応向上アナログ及び標識CFSとを接触させて当該分析物と標識CFSとの複合体A及び当該反応向上アナログと標識CFSとの複合体Bを形成させれば、試料(特に血清試料)中に共存する、分析に悪影響を及ぼす共存物質の影響を低減することが可能となる。具体的には、例えば、(i)荷電ポリマーの存在下で、分析物とCFSとを接触させて、当該分析物とCFSとの複合体〔(分析物−CFS)複合体、(分析物−標識CFS)複合体、(分析物−反応向上CFS)複合体、(分析物−標識反応向上CFS)複合体、(CFS−分析物−反応向上CFS)複合体、(標識CFS−分析物−反応向上CFS)複合体、(CFS−分析物−標識反応向上CFS)複合体、これらの組合せ等〕を形成させか、又は、(ii)荷電ポリマーの存在下で、分析物、標識アナログ及びCFSとを接触させて(即ち、当該分析物とCFS、及び標識アナログとCFSを接触させて)、当該分析物とCFSとの複合体A〔(分析物−CFS)複合体、(分析物−反応向上CFS)複合体、(CFS−分析物−反応向上CFS)、これらの組合せ等〕及び当該標識アナログとCFSとの複合体B〔(標識アナログ−CFS)複合体、(標識アナログ−反応向上CFS)複合体、(CFS−標識アナログ−反応向上CFS)、これらの組合せ等〕を形成させるか、或いは、(iii)荷電ポリマーの存在下で、分析物、反応向上アナログ及び標識CFSとを接触させて(即ち、当該分析物と標識CFS、及び反応向上アナログと標識CFSを接触させて)、当該分析物と標識CFSとの複合体A及び当該反応向上アナログと標識CFSとの複合体Bを形成させる。
本発明で用いる荷電ポリマーとしては、試料中に存在する共存物質と反対の種類の電荷(プラス又はマイナス)を有するものが使用される。また、使用されるCFSが有する電荷と同じ種類の電荷を有する荷電ポリマーが好ましい。
このような荷電ポリマーとしては、ポリアニオン性ポリマー、ポリカチオン性ポリマーが挙げられる。
ポリアニオン性ポリマーとしては、例えばヘパリン、ヘパリン硫酸、コンドロイチン硫酸、デキストラン硫酸、ポリタングステン酸、タングステンリン酸、ヒアルロン酸、デルマタン硫酸、ポリアネトール硫酸等のポリサッカライド;例えばDNA(プラスミドDNA、仔ウシ胸腺DNA、サケ精子DNA、セルロース連結DNA、合成DNA等)、RNA等のポリヌクレオチド;例えばポリアミノ酸(ポリアスパラギン酸、ポリグルタミン酸等)、合成ポリペプチド等のポリペプチド;例えばポリ-dIdC、ポリビニル硫酸、ポリアクリル酸等の合成高分子化合物;例えばガラス粒子、コロイドガラス、グラスミルク等のセラミック;及びこれらの複合体等が挙げられる。
また、ポリカチオン性ポリマーとしては、例えばキトサン、その誘導体等のポリサッカライド;例えばポリリジン、ポリヒスチジン、ポリアルギニン、プロタミン、ヒストン、オルニチン等のポリペプチド;例えばポリアリルアミン、ポリエチレンイミン、ポリビニルアミン等の合成高分子化合物;例えばスペルミン、スペルミジン等のポリアミン;例えばカチオン性脂質;例えばセラミック;及びこれらの複合体等が挙げられる。
上記したなかでも、アニオン性ポリサッカライドが好ましく、ヘパリン硫酸が特に好ましい。
上記した如き荷電ポリマーは1種でも、また、2種以上を適宜組み合わせて用いても良い。
このような方法としては、例えば上記した如き細管内に充填させる泳動媒体中に荷電ポリマーを共存させておく方法、分析物又はアナログを含有する溶液又は/及びCFSを含有する溶液中に荷電ポリマーを共存させておく方法等が挙げられる。
なかでも、荷電ポリマーは、分析物を含有する溶液(ゾーン)以外の溶液(ゾーン)中に共存させておくのが好ましく、少なくとも分析物を含有する溶液(ゾーン)の上流側又は下流側に隣接配置されている溶液(ゾーン)中に含有させておくのが特に好ましい。
本発明の測定方法の実施の形態を以下に具体的に示す。
非競合法の場合は例えば以下の通りである。
(a)標識物質及び反応向上物質が結合していないCFSを用いる場合
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(a)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(a)における工程(2)のように、当該分析物とCFSとを電気泳動的に接触させて当該分析物とCFSとの複合体を形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(a)における工程(3)のように、当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFSとを、更に電気的に移動させて分離する。
(4)分離された複合体中に含まれるCFSの量又は当該複合体の形成に関与しなかったCFSの量を、CFSの性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量とCFSの量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含有する溶液及びCFS含有溶液の少なくとも1種に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体中に含まれるCFSの量又は当該複合体の形成に関与しなかったCFSの量を、CFSの性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、標識CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(b)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(b)における工程(2)のように、当該分析物と標識CFSとを接触させて当該分析物と標識CFSとの複合体を形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(b)における工程(3)のように、当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった標識CFSとを、更に電気的に移動させて分離する。
(4)分離された複合体中に含まれる標識物質の量又は当該複合体の形成に関与しなかった標識CFS中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含有する溶液及び標識CFS含有溶液の少なくとも1種に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体中に含まれる標識物質の量又は当該複合体の形成に関与しなかった標識CFS中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(c)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(c)における工程(2)のように、当該分析物と反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて当該分析物と反応向上CFSとの複合体を形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(c)における工程(3)のように、当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった反応向上CFSとを、更に電気的に移動させて分離する。
(4)分離された複合体中に含まれる反応向上CFSの量又は当該複合体の形成に関与しなかった反応向上CFSの量を、反応向上CFSの性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と反応向上CFSの量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含有する溶液及び反応向上CFS含有溶液の少なくとも1種に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体中に含まれる反応向上CFSの量又は当該複合体の形成に関与しなかった反応向上CFSの量を、反応向上CFSの性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)1種以上の、標識反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(d)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(d)における工程(2)のように、当該分析物と標識反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて当該分析物と標識反応向上CFSとの複合体を形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(d)における工程(3)のように、当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった標識反応向上CFSとを、更に電気的に移動させて分離する。
(4)分離された複合体中に含まれる標識物質の量又は当該複合体の形成に関与しなかった標識反応向上CFS中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含有する溶液及び標識反応向上CFS含有溶液の少なくとも1種に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体中に含まれる標識物質の量又は当該複合体の形成に関与しなかった標識反応向上CFS中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、得られた測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)少なくとも1種の、CFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の、反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(e)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(e)における工程(2)のように、当該分析物、CFS及び反応向上CFSを接触させて当該分析物、CFS及び反応向上CFSの複合体を形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(e)における工程(3)のように、当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかったCFS及び要すれば当該複合体の形成に関与しなかった反応向上CFSとを、更に電気的に移動させて分離する。
(4)分離された複合体中に含まれるCFSの量、分離された複合体中に含まれる反応向上CFSの量、当該複合体の形成に関与しなかったCFSの量又は当該複合体の形成に関与しなかった反応向上CFSの量を、CFS又は反応向上CFSの性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量とCFS又は反応向上CFSの量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含有する溶液、CFS含有溶液及び反応向上CFS含有溶液の少なくとも1種に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された複合体中に含まれるCFSの量、分離された複合体中に含まれる反応向上CFSの量、当該複合体の形成に関与しなかったCFSの量又は当該複合体の形成に関与しなかった反応向上CFSの量を、CFS又は反応向上CFSの性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)少なくとも1種の、標識CFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の、反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(f)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(f)における工程(2)のように、当該分析物、標識CFS及び反応向上CFSを電気泳動的に接触させて当該分析物、標識CFS及び反応向上CFSの複合体を形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(f)における工程(3)のように、当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった標識CFS及び当該複合体の形成に関与しなかった要すれば反応向上CFSとを、更に電気的に移動させて分離する。
(4)分離された複合体中に含まれる標識物質の量又は当該複合体の形成に関与しなかった標識CFS中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含有する溶液、標識CFS含有溶液及び反応向上CFS含有溶液の少なくとも1種に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体中に含まれる標識物質の量又は当該複合体の形成に関与しなかった標識CFS中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、得られた測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含有する溶液〔例えば(i)分析物を含む試料、(ii)分析物を含む試料と1種以上のCFSとを含有する溶液〕と、(b)少なくとも1種の、CFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の、標識反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(g)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(g)における工程(2)のように、当該分析物、CFS及び標識反応向上CFSを電気泳動的に接触させて当該分析物、CFS及び標識反応向上CFSの複合体を形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(g)における工程(3)のように、当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった標識反応向上CFS及び要すればCFSとを、更に電気的に移動させて分離する。
(4)分離された複合体中に含まれる標識物質の量又は当該複合体の形成に関与しなかった標識反応向上CFS中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含有する溶液、CFS質含有溶液及び標識反応向上CFS含有溶液の少なくとも1種に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体中に含まれる標識物質の量又は当該複合体の形成に関与しなかった標識反応向上CFS中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
競合法の場合は例えば以下の通りである。
(h)標識アナログとCFSとを用いる場合
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)及び(b)1種以上のCFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(h)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(h)における工程(2)のように、当該分析物、標識アナログ及びCFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物とCFS、及び標識アナログとCFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物とCFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFSとの複合体Bを形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(h)における工程(3)のように、当該複合体Bと、当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログとを、更に分離する。
(4)分離された複合体B中の標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中の標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)又はCFS含有溶液に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体B中に含まれる標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、得られた測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)及び(b)1種以上の反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(i)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(i)における工程(2)のように、当該分析物、標識アナログ及び反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物と反応向上CFS、及び標識アナログと反応向上CFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物と反応向上CFSとの複合体A及び当該標識アナログと反応向上CFSとの複合体Bを形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(i)における工程(3)のように、当該複合体Bと、当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログとを、更に分離する。
(4)分離された複合体B中の標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中の標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)又は反応向上CFS含有溶液に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体B中に含まれる標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)、(b)少なくとも1種のCFSを含有する溶液及び(c)少なくとも1種の反応向上CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(j)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(j)における工程(2)のように、当該分析物、標識アナログ、CFS及び反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物、CFS及び反応向上CFS、並びに標識アナログ、CFS及び反応向上CFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物とCFS及び反応向上CFSとの複合体A及び当該標識アナログとCFS及び反応向上CFSとの複合体Bを形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(j)における工程(3)のように、当該複合体Bと、当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログとを、更に分離する。
(4)分離された複合体B中の標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中の標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含む試料と標識アナログを含有する溶液(又は分析物を含む試料、標識アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)、CFS含有溶液及び反応向上CFS含有溶液の少なくとも1種に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体B中に含まれる標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と反応向上アナログを含有する溶液及(又は分析物を含む試料、反応向上アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)び(b)1種以上の標識CFSを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(k)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(k)における工程(2)のように、当該分析物、反応向上アナログ及び標識CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該分析物と標識CFS、及び反応向上アナログと標識CFSを電気泳動的に接触させて)当該分析物と標識CFSとの複合体A及び当該反応向上アナログと標識CFSとの複合体Bを形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(k)における工程(3)のように、当該複合体Bと、当該複合体Aとを、更に電気的に移動させて分離する。
(4)分離された複合体B中の標識物質の量又は複合体A中の標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含む試料と反応向上アナログを含有する溶液及(又は分析物を含む試料、反応向上アナログ及び1種以上のCFSを含む溶液)又は標識CFS含有溶液に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体B中に含まれる標識物質の量又は複合体A中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料及び1種以上のCFSを含有する溶液と(b)標識アナログを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(l)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(l)における工程(2)のように、当該標識アナログとCFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該標識アナログと、分析物を含む試料と1種以上のCFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかったCFSとを電気泳動的に接触させて)、標識アナログとCFSとの複合体Bを形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(l)における工程(3)のように、当該複合体Bと、当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログとを、更に分離する。
(4)分離された複合体B中の標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中の標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含む試料及び1種以上のCFSを含有する溶液又は標識アナログを含有する溶液に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体B中に含まれる標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、得られた測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料及び1種以上の反応向上CFSを含有する溶液と(b)標識アナログを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(m)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(m)における工程(2)のように、当該標識アナログと反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該標識アナログと、分析物を含む試料と1種以上の反応向上CFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった反応向上CFSとを電気泳動的に接触させて)、標識アナログと反応向上CFSとの複合体Bを形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(m)における工程(3)のように、当該複合体Bと、当該複合体の形成に関与しなかった標識アナログとを、更に分離する。
(4)分離された複合体B中の標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中の標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含む試料及び1種以上の反応向上CFSを含有する溶液又は標識アナログを含有する溶液に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体B中に含まれる標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料と少なくとも1種のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)を含有する溶液、(b)標識アナログを含有する溶液、及び(c)少なくとも1種の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)を含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(n)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(n)における工程(2)のように、当該分析物、標識アナログ、複合体形成物質及び反応向上結合物質とを電気泳動的に接触させる(即ち、溶液(a)中の分析物とCFS(又は反応向上CFS)との複合体と溶液(c)中の反応向上CFS(又はCFS)、並びに標識アナログ、溶液(a)中の分析物との複合体の形成に関与しなかったCFS(又は反応向上CFS)及び溶液(c)中の反応向上CFS(又はCFS)を電気泳動的に接触させる)。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(n)における工程(3)のように、当該複合体Bと、当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログとを、更に分離する。
(4)分離された複合体B中の標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中の標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含む試料と少なくとも1種のCFS(又は少なくとも1種の反応向上CFS)を含有する溶液、標識アナログを含有する溶液、及び少なくとも1種の反応向上CFS(又は少なくとも1種のCFS)を含有する溶液の少なくとも1種に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体B中に含まれる標識物質の量又は当該複合体Bの形成に関与しなかった標識アナログ中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、得られた測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量ととを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
この場合、例えば下記の〔方法A〕又は〔方法B〕のように実施することができる。
〔方法A〕:
(1)細管内に、(a)分析物を含む試料及び1種以上の標識CFSを含有する溶液と(b)反応向上アナログを含有する溶液とを、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(o)における工程(1)のように、導入・配置させる。
(2)次いで、前記「1−6.具体的な複合体形成方法」の(o)における工程(2)のように、当該反応向上アナログと標識CFSとを電気泳動的に接触させて(即ち、当該反応向上アナログと、分析物を含む試料と1種以上の標識CFSを含有する溶液中の分析物との複合体(複合体A)の形成に関与しなかった標識CFSとを電気泳動的に接触させて)、反応向上アナログと標識CFSとの複合体Bを形成させる。
(3)前記「2−2.具体的な分離方法」の(o)における工程(3)のように、当該複合体Bと、当該複合体Aとを更に電気的に移動させて分離する。
(4)分離された複合体B中の標識物質の量又は複合体A中の標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、測定結果(測定値)を、分析物濃度既知の試料を用いて同様の方法により測定を行って得られた分析物の量と標識物質の量との関係を示す検量線にあてはめることにより、試料中の分析物の量を算出する。
〔方法B〕:
上記〔方法A〕の(1)の分析物を含む試料及び1種以上の標識CFSを含有する溶液又は反応向上アナログを含有する溶液に濃度既知の検出可能な物質を内部標準として添加し、内部標準を含む溶液を用いて(1)〜(3)の工程を行う。分離された、複合体B中に含まれる標識物質の量又は複合体A中に含まれる標識物質の量を、標識物質の性質(種類)に応じた方法により測定し、得られた測定結果(測定値)と、内部標準として添加した当該物質の量とを比較することによって、試料中の分析物の量を算出する。
本発明のキットは、上記した如き本発明の複合体形成方法、分離方法又は測定方法を実施するために使用されるものである。
このようなキットとしては、以下のようなものが挙げられる。
(1)少なくとも(i)先述した如きCFS、(ii)要すればアナログ及び(iii)前述した如き本発明の複合体形成方法、分離方法又は測定方法での使用のための説明書等を含んでなるもの、又は
(2)(i)前述した如き本発明の工程(1)を実施し得る部分及び工程(2)を実施し得る部分を少なくとも有する細管、好ましくは前述した如き本発明の工程(1)を実施し得る部分、工程(2)を実施し得る部分及び更に本発明の工程(3)を実施し得る部分を有する細管、を具備する電気泳動装置、(ii)CFS、(iii)要すればアナログ及び(iv)前述した如き本発明の複合体形成方法、分離方法又は測定方法での使用のための説明書とを含んでなるもの。
尚、当該「説明書」とは、本発明の方法における特徴・原理・操作手順等が文章又は図表等により実質的に記載されている当該キットの取り扱い説明書、添付文書、或いはパンフレット(リーフレット)等を意味する。
これら構成要件の好ましい態様と具体例は上で述べた通りである。
〔分析物(抗原)〕
α−フェトプロテイン(AFP)(和光純薬工業(株)製)
図1に示した手順に従って、DNAが結合した抗AFP抗体Fab'フラグメントを調製した。
即ち、先ず、常法により5'末端にNH2基が導入された250bpのDNA断片を精製した。次いで、このDNA断片に導入されたNH2基とスルホサクシニミジル 4-(p-マレイミドフェニル)ブチレイト(Sulfo-SMPB)リンカー(スクシンイミド基とマレイミド基を有するリンカー:ピアス社製)のスクシンイミド基とを常法により反応させた。その後、ゲル濾過処理を行い、未反応リンカーを除去して、リンカーが結合した250bpDNA断片を得た。得られたリンカー結合250bpDNA断片と、予め抗AFP抗体WA1(和光純薬工業(株)製)を用いて常法に従い調製した抗AFP抗体WA1Fab’フラグメントとを反応させた。得られた反応物を、夫々DEAEカラムを用いて精製し、250bpDNA断片が結合した抗AFP抗体WA1Fab’フラグメント(250bpDNA標識抗体)を調製した。
WA1抗体とは異なるAFPのエピトープを認識する抗AFP抗体WA2(和光純薬工業(株)製)を常法により処理して抗AFP抗体WA2Fab’フラグメントを得た。当該フラグメントのアミノ基に、常法により蛍光物質Alexa647(モレキュラープローブ社製)を導入して、Alexa647標識抗AFP抗体WA2Fab’フラグメント(蛍光標識抗体)を調製した。
図2に示すレイアウトを有するキャピラリーチップを、「マイクロ科学チップの技術と応用」 北森武彦ほか 2004年出版(丸善株式会社)に記載の方法に従い、以下のように作成した。
即ち、石英基板上に成膜したSi上にフォトレジスト膜を成膜した。このフォトレジストに図2に示すキャピラリデザイン(レイアウト)を有するマスクを用いて露光し、現像を行った。現像によりフォトレジストが除かれた部分のSiをスパッタによって除去した後、フッ化水素溶液を用いてウエットエッチングを行って石英基板にキャピラリチャンネル溝(細管)を作製した。石英基板上に残るフォトレジスト及びSi膜を除去した後、当該石英基板と液だめのための穴を有するカバープレートとをHF接合法によって張り合わせてキャピラリーチップを作製した。
尚、図2中、L1及びL2はリーディングバッファー導入用ウェルを、Sは泳動用試料導入用ウェルを、R1は試液(250bpDNA標識抗体含有溶液)導入用ウェルを、W1及びW2は、ドレイン用ウェルをそれぞれ示す。
(1)泳動用試料
所定濃度のAFP 1μL、2μM 蛍光標識抗体 1μL及び50mM Cl−イオン含有リーディングバッファー 8μLを0.5mLチューブで混合し、10uLの反応液を調製した。反応液は氷上に静置させ、約30分抗原抗体反応させ、〔蛍光標識抗体−AFP〕免疫複合体を形成させた。尚、AFPの最終濃度は、0pM、25pM、50pM又は100pMであり、蛍光標識抗体の最終濃度は、200nMである。
得られた、免疫複合体含有反応液を泳動用試料とした。
20nM 250bpDNA標識抗体を含有するトレーリングバッファー(75mM HEPES含有)を試液とした。
a)泳動用試料及び試液の導入
図1のSウェル(泳動用試料導入用ウェル)に泳動用試料(〔蛍光標識抗体−AFP〕免疫複合体含有溶液) 10μLを滴下し、R1ウェル(試液導入用ウェル)に試液(DNA標識抗体含有溶液) 10μLを滴下し、L1ウェル及びL2ウェルにリーディングバッファー 10μLをそれぞれを滴下し、W1(ドレイン用ウェル)−W2(ドレイン用ウェル)間に 100秒間、-5psiの圧力を印加して、泳動用試料、試液及びリーディングバッファーをチャネルに導入した。キャプラリー内の泳動用試料と試液の配置関係を、図3に模式的に示す。尚、図3中、斜線部分は泳動用試料の配置部分を、また、点部分は試液の配置部分をそれぞれ示す。
R1ウェル−L1ウェル間に、312V、625V又は2500Vの電圧を印加して、10℃で、試液中の250bpDNA標識抗体を濃縮させながら、試液中の250bpDNA標識抗体を泳動用試料中の〔蛍光標識抗体−AFP〕免疫複合体と接触させて、〔蛍光標識抗体−AFP−250bpDNA標識抗体〕免疫複合体を形成させた。
尚、反応時間は、312V印加時で約200秒、625V印加時で約100秒、2500V印加時で約25秒である。
〔蛍光標識抗体−AFP−250bpDNA標識抗体〕免疫複合体が、L2チャンネルとメインチャンネルとのクロス部分を通過したところで、L2ウェルに2800V、L1ウェルに300Vの電圧を100秒間印加して、当該免疫複合体の分離と検出を行った。
尚、検出は、635nmレーザー励起によりL2チャネルクロス部分から2cmのキャピラリー部分の蛍光強度を蛍光顕微鏡(BX-50;KSオリンパス(株)製)により経時的に測定することによって行った。
図4に、AFP濃度とピーク面積の関係(直線性)を、図5に、AFP濃度 0pM及び100pMの泳動用試料を用いた場合の電気泳動クロマトグラムをそれぞれ示す。尚、図4において、縦軸はピーク面積を、横軸はAFP濃度をそれぞれ示す。また、図5において、実線(−)はAFP濃度 100pMの泳動用試料を用いた場合の結果を、点線(・・・)はAFP濃度 0pMの泳動用試料を用いた場合の結果をそれぞれ示す。
尚、AFP反応比率は、予めキャピラリー外で蛍光標識抗体、AFP及び250bpDNA標識抗体を10℃で30分間反応させ、200nM 蛍光標識抗体、100pM AFP及び20nM 250bpDNA標識抗体を含有する反応液 10μLを得た後、得られた反応液をSウェルから導入し、上記と同様に検出した場合のAFPシグナル(ピーク面積)を100%とした場合の相対値である。
〔分析物(抗原)〕
実施例.1と同じものを使用した。
〔反応向上CFS(DNA標識抗体)〕
実施例.1と同じものを使用した。
〔標識CFS(蛍光標識抗体)〕
実施例.1と同じものを使用した。
図6に示すレイアウトを有するキャピラリーチップを、「マイクロ科学チップの技術と応用」 北森武彦ほか 2004年出版(丸善株式会社)に記載の方法に従い、以下のように作成した。
即ち、石英基板上に成膜したSi上にフォトレジスト膜を成膜した。このフォトレジストに図6に示すキャピラリデザイン(レイアウト)を有するマスクを用いて露光し、現像を行った。現像によりフォトレジストが除かれた部分のSiをスパッタによって除去した後、フッ化水素溶液を用いてウエットエッチングを行って石英基板にキャピラリチャンネル溝(細管)を作製した。石英基板上に残るフォトレジスト及びSi膜を除去した後、当該石英基板と液だめのための穴を有するカバープレートとをHF接合法によって張り合わせてキャピラリーチップを作製した。
尚、図6中、L1及びL2はリーディングバッファー導入用ウェルを、SRは泳動用試料、第1試液(250bpDNA標識抗体含有溶液)及び第2試液(蛍光標識抗体含有溶液)導入用ウェルをそれぞれ示す。
(1)泳動用試料
0nM、0.8nM、4nM、20nM、50nM及び100nMのAFPを含有するリーディングバッファー(50mM Cl−イオン含有)をそれぞれ泳動用試料とした。
100nM 250bpDNA標識抗体を含有するリーディングバッファー(50mM Cl−イオン含有)を第1試液とした。
400nM 250bp蛍光標識抗体を含有するリーディングバッファー(50mM Cl−イオン含有)を第2試液とした。
a)泳動用試料、第1試液及び第2試液の導入
図6のチャネル全体をリーディングバッファーで満たした後、SRウェルに第2試液(蛍光標識抗体含有溶液) 10μL滴下し、L1ウェルに2秒間、-5psiの圧力を印可して、第2試液をチャネル内に導入した。次に、SRウェルの第2試液を泳動用試料(AFP含有溶液) 10μLに交換して、同様にL1ウェルに2秒間、-5psiの圧力を印可して泳動試料をチャネル内に導入した。更に、SRウェルの泳動用試料を第1試液(250bpDNA標識抗体含有溶液) 10μLに交換して、L1ウェルに2秒間、-5psiの圧力を印可して第1試液をチャネル内に導入した。これにより、下流側から第2試液ゾーン、泳動用試料ゾーン、第1試液ゾーンをチャネル内に形成させた。キャプラリー内の泳動用試料、第1試液及び第2試液の配置関係を、図7に模式的に示す。尚、図7中、縦線部分は第1試液の配置部分を、斜線部分は泳動用試料の配置部分を、また、点部分は第2試液の配置部分をそれぞれ示す。
その後、SRウェルの第1試液を75mM HEPES含有トレーリングバッファー 10μLに交換して、L1ウェルに2秒間、-5psiの圧力を印可して、第1試液ゾーンの上流側にトレーリングバッファーを導入・配置させた。
SRウェル−L1ウェル(リーディングバッファー導入用ウェル)間に、312V印加して、10℃で、第1試液中のDNA標識抗体、泳動用試料中のAFP及び第2試液中の蛍光標識抗体とを、これらを濃縮させながら接触させて、〔蛍光標識抗体−AFP−250bpDNA標識抗体〕免疫複合体を形成させた。
尚、反応時間は、約200秒である。
〔蛍光標識抗体−AFP−250bpDNA標識抗体〕免疫複合体が、L2チャンネルとメインチャンネルとのクロス部分を通過したところで、L2ウェルに2800V、L1ウェルに300Vの電圧を100秒間印加して、当該免疫複合体の分離と検出を行った。
尚、検出は、635nmレーザー励起によりL2チャネルクロス部分から2cmのキャピラリー部分の蛍光強度を蛍光顕微鏡(BX-50;KSオリンパス(株)製)により経時的に測定することによって行った。
図8に、AFP濃度とピーク面積の関係(直線性)を示す。また、図9に、AFP低濃度領域(AFP濃度 0nM、0.8nM、4nM及び20nMの泳動用試料を用いた場合の結果)におけるAFP濃度とピーク面積の関係(直線性)を示す。尚、図8及び9において、縦軸はピーク面積を、横軸はAFP濃度をそれぞれ示す。また、比較例として、予めキャピラリー外で蛍光標識抗体、AFP及び250bpDNA標識抗体を10℃で30分間反応させて得られた反応液をSRウェルから導入した後、上記と同様に検出した場合の結果を、図8及び9に併せて示す。尚、反応時の蛍光標識抗体の最終濃度は、200nMであり、AFPの最終濃度は、0nM、0.8nM、4nM、20nM、50nM又は100nMであり、250bpDNA標識抗体の最終濃度は、20nMである。
図8及び9中、●は実施例2の方法で得られた結果を、また、○は比較例の方法で得られた結果をそれぞれ示す。また、図9中、実線は実施例2の方法で得られた結果における回帰直線を、点線は比較例の方法で得られた結果における回帰直線をそれぞれ示す。
本発明によれば、溶液中の分析物又はそのアナログと溶液中の当該分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得る物質(CFS)との反応を、短時間で且つ高い反応効率で行うことができる。その結果、当該分析物と当該分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得る物質(CFS)との複合体と、複合体の形成に関与しなかったCFS又はアナログとを迅速、簡便且つ高精度に分離することが可能となり、更には分離された、複合体の量又は複合体の形成に関与しなかったCFS又はアナログの量に基づいて試料中の分析物を高感度に測定するすることが可能となる。
Claims (15)
- 以下の工程を含む複合体の形成方法。
(1)細管内に、(a)分析物又はそのアナログを含有する溶液と、(b)1種以上の、当該分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得る物質(複合体形成物質)を含有する溶液とを、これらの溶液のうちより高い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液をそれよりも低い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液の上流にそれぞれ別々のゾーンとして配置させる工程、及び
(2)これらの溶液が均一に混合される前に、これらの溶液が配置された細管の両末端から細管内に配置された溶液に電圧を印加することによって、当該分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種の複合体形成物質を電気泳動的に濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログと複合体形成物質とをこれらの電気泳動移動度の差を利用して接触させ、当該分析物又はそのアナログと複合体形成物質との複合体を形成させる工程。 - 前記工程(2)をITP(等速電気泳動)又はFASS(フィールド・アンプリフィケーション・サンプル・スタッキング)により行う請求項1に記載の方法。
- 1種以上の複合体形成物質が、標識物質、又は/及び分析物又はそのアナログの電気泳動移動度を変化させ得る物質(反応向上物質)が結合したものである、請求項1又は2に記載の方法。
- 複合体形成物質を2種以上使用し且つそれらの複合体形成物質をそれぞれ含有する2種以上の溶液を使用する場合であって、(1)少なくとも1種の複合体形成物質が、標識物質が結合したものであり、それ以外の少なくとも1種の複合体形成物質が、分析物又はそのアナログの電気泳動移動度を変化させ得る物質(反応向上物質)が結合したものであるか、又は(2)少なくとも1種の複合体形成物質が、標識物質及び、分析物又はそのアナログの電気泳動移動度を変化させ得る物質(反応向上物質)が結合したものである、請求項1又は2に記載の方法。
- 複合体形成物質の1種が、分析物又はそのアナログに対する抗体、或いは分析物又はそのアナログに結合するタンパク質である、請求項1に記載の方法。
- 以下の工程を含む複合体の分離方法。
(1)細管内に、(a)分析物又はそのアナログを含有する溶液と、(b)1種以上の、当該分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得る物質(複合体形成物質)を含有する溶液とをこれらの溶液のうちより高い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液をそれよりも低い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液の上流にそれぞれ別々のゾーンとして配置させる工程、
(2)これらの溶液が均一に混合される前に、これらの溶液が配置された細管の両末端から細管内に配置された溶液に電圧を印加することによって、当該分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種の複合体形成物質を電気泳動的に濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログと複合体形成物質とをこれらの電気泳動移動度の差を利用して接触させ、当該分析物又はそのアナログと複合体形成物質との複合体を形成させる工程、及び
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった複合体形成物質又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、更に電気的に移動させて分離する工程。 - 前記工程(2)をITP(等速電気泳動)又はFASS(フィールド・アンプリフィケーション・サンプル・スタッキング)により行う請求項6に記載の方法。
- 1種以上の複合体形成物質が、標識物質、又は/及び分析物又はそのアナログの電気泳動移動度を変化させ得る物質(反応向上物質)が結合したものである、請求項6又は7に記載の方法。
- 複合体形成物質を2種以上使用し且つそれらの複合体形成物質をそれぞれ含有する2種以上の溶液を使用する場合であって、(1)少なくとも1種の複合体形成物質が、標識物質が結合したものであり、それ以外の少なくとも1種の複合体形成物質が、分析物又はそのアナログの電気泳動移動度を変化させ得る物質(反応向上物質)が結合したものであるか、又は(2)少なくとも1種の複合体形成物質が、標識物質及び、分析物又はそのアナログの電気泳動移動度を変化させ得る物質(反応向上物質)が結合したものである、請求項6又は7に記載の方法。
- 複合体形成物質の1種が、分析物又はそのアナログに対する抗体、或いは分析物又はそのアナログに結合するタンパク質である、請求項6に記載の方法。
- 以下の工程を含む分析物の測定方法。
(1)細管内に、(a)分析物又はそのアナログを含有する溶液と、(b)1種以上の、当該分析物又はそのアナログとの複合体を形成し得る物質(複合体形成物質)を含有する溶液とをこれらの溶液のうちより高い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液をそれよりも低い電気泳動移動度を有する物質を含有する溶液の上流にそれぞれ別々のゾーンとして配置させる工程、
(2)これらの溶液が均一に混合される前に、これらの溶液が配置された細管の両末端から細管内に配置された溶液に電圧を印加することによって、当該分析物又はそのアナログ、又は/及び少なくとも1種の複合体形成物質を電気泳動的に濃縮させながら、当該分析物又はそのアナログと複合体形成物質とをこれらの電気泳動移動度の差を利用して接触させ、当該分析物又はそのアナログと複合体形成物質との複合体を形成させる工程、
(3)当該複合体と、当該複合体の形成に関与しなかった複合体形成物質又は当該複合体の形成に関与しなかったアナログとを、更に電気的に移動させて分離する工程、及び
(4)分離された複合体の量、又は当該複合体の形成に関与しなかった複合体形成物質又はアナログの量を測定し、その結果に基づいて分析物の量を求める工程。 - 前記工程(2)をITP(等速電気泳動)又はFASS(フィールド・アンプリフィケーション・サンプル・スタッキング)により行う請求項11に記載の方法。
- 1種以上の複合体形成物質が、標識物質、又は/及び分析物又はそのアナログの電気泳動移動度を変化させ得る物質(反応向上物質)が結合したものである、請求項11又は12に記載の方法。
- 複合体形成物質を2種以上使用し且つそれらの複合体形成物質をそれぞれ含有する2種以上の溶液を使用する場合であって、(1)少なくとも1種の複合体形成物質が、標識物質が結合したものであり、それ以外の少なくとも1種の複合体形成物質が、分析物又はそのアナログの電気泳動移動度を変化させ得る物質(反応向上物質)が結合したものであるか、又は(2)少なくとも1種の複合体形成物質が、標識物質及び、分析物又はそのアナログの電気泳動移動度を変化させ得る物質(反応向上物質)が結合したものである、請求項11又は12に記載の方法。
- 複合体形成物質の1種が、分析物又はそのアナログに対する抗体、或いは分析物又はそのアナログに結合するタンパク質である、請求項11に記載の方法。
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