JP5249933B2 - 精子の保存及び制御された送達/解放 - Google Patents
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Description
− 容積を増大するため
− AI用量中の精子数を標準化するため
− 緩衝能を遂行するため
− 浸透性に関して生理学的環境を提供するため
− 精子細胞への栄養を支持するため
− 微生物学的汚染を制御するため(抗生物質)、又は冷凍保存の場合:
− 冷凍損傷及び解凍損傷から精子細胞を保護するため。
材料及び方法
材料
以下の化学物質を用いた:CaCl2・H2O、K2HPO4、NaH2PO4、NaCl及びクエン酸ナトリウム(Riedel de Haen, Seelze, Germany);グルコース一水和物(Norsk Medisinaldepot, Oslo, Norway);アルギン酸ナトリウム(PROTANAL LF 10/60)(FMC Biopolymer A/S, Drammen, Norwayから供給)。
ウシ精子を、Geno施設(Hallsteingard, Trondheim, Norway)で収集した。雄ブタ精子を、Norsvin施設(Hamar, Norway)で収集した。ウシ精子を、射精直後にミルク増量剤中で1+2で希釈した。雄ブタ精子を、TRI X−CELL(商標)(IMV Technologies, L’Aigle Cedex, France)中で1+4で希釈した。この希釈に関しては、希釈緩衝液の選択は、固定化手法又は固定化後の精子の長期生存のためには重要でないが、しかし精子がさらに処理され得るまで貯蔵を手助けするために単に実行される。
以下の培地を用いた。改良IVT:3gl−1グルコース、20gl−1クエン酸ナトリウム、2.1gl−1NaHCO3、1.16gl−1NaCl、3gl−1EDTA、pH7.35。BTS(3mMのCaを有する):37gl−1グルコース、0.44gl−1CaCl2、4.5gl−1クエン酸ナトリウム、1.25gl−1NaHCO3、1.25gl−1EDTA、0.74gl−1KCl、1gl−1ネオマイシン、pH7.2。ビーズゲル化溶液:7.3gl−1CaCl2、5.96gl−1NaCl。ミルク増量剤:110gl−1Molicoスキムミルク、120mll−1卵黄、6.25gl−1ストレプトマイシン、1.5mlI.El−1ペニシリン。
精子細胞をGeno施設又はNorsvin施設で収穫し、上記のように希釈した。固定化前に、遠心分離(800g、20分、20℃)により精子を濃縮した。各バッチ中の除去されるべき上清の量は、完成ビーズ中の精子の所望の濃度によって変わる。余分量の上清の除去後、軽く振盪することにより細胞ペレットを静かに再懸濁する。次に細胞懸濁液を滅菌6%(w/v)アルギン酸ナトリウム溶液とゆっくり混合する。アルギン酸塩溶液を、2部の細胞懸濁液対1部のアルギン酸塩溶液の容積比で付加する(アルギン酸塩の濃度、アルギン酸塩溶液の容積比及び細胞懸濁液の多数の異なる組合せが検査された。典型的値及び手法をここに示す)。
固定化手法の一目的は、精子が授精前に貯蔵され得る時間を延長することである。したがって、精子を緩衝溶液中で周囲温度で生体外で貯蔵する実験を実行した。同一射精からの非固定化精子を有する参照試料が、すべての実験に含まれる。貯蔵期間中の異なる時点での運動性の測定により、精子の質を評価する。各時点で、試料を分析し、固定化精子の運動性及び対照試料の運動性を記録する。実験系を最適化するために、貯蔵容積及び細胞密度の多数の組合せを検査した(データは示されていない)。下記の実験条件は典型的であり、そして以下に報告する実験に用いられた。
生理学的温度での精子の生存を査定するために、37℃での精子の貯蔵中に精子の運動性を記録した。ウシ精子を、37℃での貯蔵実験の前に緩衝溶液に移した。上記のように、同一射精からの参照試料が、すべての実験に含まれる。各管中に総容積8mlを有する13ml遠心管中で、試験を実施した。参照試料を、貯蔵溶液中で1+4で希釈した。固定化精子に関しては、精子を含有するビーズ3mlを6mlの緩衝溶液に付加し、13ml遠心管中に貯蔵した。雄ブタ精子を同様に処理したが、但し、標準BTS(3mMのCaを含む)を用いた。
精子の運動性を、顕微鏡評価により査定した。試料(典型的には1ml)を貯蔵容器から抜き出して、1.5mlエッペンドルフ管に移した。管を、査定前に37℃でヒートブロック中で最低15分間予熱させた。測定時に、2.5μlの試料を予熱顕微鏡スライドに付加し、光学顕微鏡を用いて直ちに検査した。各試料中の運動性精子の数を概算し、最も近くて5%間隔であった。実際に可能な場合、オペレーターは、査定中の試料の素性を知らされずにいた。
固定化精子の生存
参照試料(非固定化精子を用いる)並びに固定化精子を用いる試料における精子の貯蔵に関する実験からのデータを、ウシ及び雄ブタ精子の両方に関して図1に示す。雄ブタ精子に関しては、2つの異なるビーズサイズからのデータを示す。この理由は、現行の利用可能な設備を用いて子宮内授精用のビーズを使用するため、ビーズサイズが1mmより小さくなければならないからである。
1群において合計9匹の成熟雌ブタで、授精試験を実施した。成熟雌ブタは、子ブタの事前の同腹子の離乳直後に選び取るためであったが、しかし選び取りは、授精後約4週まで延期された。
一つの特定の理論に限定されずに考えると、精子の固定化は、精子によるエネルギー消費の低減を生じ、そしてこれは保存寿命及びそれらの受精能に関して有益であると考えられる。したがってこの理論を精査するために、ウシ精子を約150×106精子/mlの濃度でアルギン酸塩ゲル中に固定し、ビーズ容積のミルク希釈緩衝液に2回付加した。ミルク希釈緩衝液中に同一総濃度の精子/総容積を含有する同一射精液から、自由懸濁精子を用いた参照試料を調製した。20℃での貯蔵前に、N2で洗い流すことにより、試料を嫌気性にした。ミルク希釈緩衝液の試料を貯蔵期間中に採取し、試料中の精子からの乳酸塩の産生をHPLCにより測定した。結果を、表3に示す。
3匹の成体アカギツネ(Vulpes vulpes)雄からの良質の混合性液をEDTA増量剤中に希釈して、228×106精子細胞/mlとして、実験室に運んだ。収集及び希釈の3時間後に、精液のアリコートを、2000rpmで10分間、遠心分離した。沈殿物をアルギン酸塩(LF 10/60)と混合し、本特許出願に記載したようにビーズを形成した。ビーズを18℃で改質Biladyl中に貯蔵した。残りの精液を、対照として18℃でEDTA中に貯蔵した。
3匹の成熟雄ブタからの混合精液を本発明に従って処理し、臨月妊娠後に分娩した雌ブタの子宮内授精のためにビーズを用いた。雌ブタは、2007年2月8日に事前の同腹仔から引き離されており、2007年2月12日に一度アルギン酸塩ビーズ中に固定化された精液で授精された。その雌ブタは、2007年6月10日に16匹の生きて産まれた仔ブタを出産した。同腹仔中に死産仔ブタはなく、すべての仔ブタが臨床検査で正常に見えた。
2匹のAI雄ヒツジからの精液を人工膣で収集し、10分以内に実験室に運んだ。精液をスキムミルクベースの増量剤中に1+3で希釈した(Curtis PG, Forteath AD, Polge C. Survival of bull sperm frozen in milk diluents containing varying concentrations of glycerol and fructose. Proc IVth Int Congr Anim Reprod 1961; 3: 952-956)後、アルギン酸塩を付加し、特許出願第0613288.0号、実施例1に記載されたようにビーズを形成した。5℃で又は周囲温度で、スキムミルクベースの増量剤中にビーズを貯蔵した。固定化精子をビーズから解放した後、運動性精子細胞%として運動性の顕微鏡的評価を、固定化の24時間後及び48時間後に実施した。実際的理由のため、対照はこの試験に含まれなかった。しかしながら生存能力パラメーター、例えば運動性は、5℃又は20℃で30時間の液体雄羊精液の貯蔵中に減損される(Paulenz H, Soderquist L, Perez-Pe R, Berg KA. Effect of different extenders and storage temperatures on sperm viability of liquid ram semen. Theriogenology 2002: 57(2): 823-36)。
Claims (33)
- 精子の保存のためのバイオポリマー粒子であって、前記精子がバイオポリマーゲル網状構造中に包埋され、前記精子を包埋する前記バイオポリマーがグルロン酸に富むアルギン酸塩を含む、バイオポリマー粒子。
- 前記精子を包埋する前記バイオポリマーがアルギン酸カルシウムを含む、請求項1に記載の粒子。
- 前記アルギン酸塩の濃度が少なくとも0.1%である、請求項1または2のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記アルギン酸塩の濃度が少なくとも0.1%〜6%アルギン酸塩である、請求項3に記載の粒子。
- 前記アルギン酸塩の濃度が少なくとも1%である、請求項4に記載の粒子。
- 前記アルギン酸塩の濃度が少なくとも2%である、請求項3に記載の粒子。
- 前記アルギン酸塩の濃度が6%である、請求項3に記載の粒子。
- 少なくとも0.1×106精子/mlの精子濃度を有する、請求項1〜7のいずれか一項に記載の粒子。
- 少なくとも100×106精子/mlの精子濃度を有する、請求項8に記載の粒子。
- 少なくとも2.5×109精子/mlの精子濃度を有する、請求項8に記載の粒子。
- 溶液中に貯蔵される、請求項1〜10のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記貯蔵溶液:前記バイオポリマー粒子の比が少なくとも1:1〜1:100である、請求項11に記載の粒子。
- 前記精子が1つ又は複数の酸化防止剤と同時包埋される、請求項11又は12に記載の粒子。
- 前記酸化防止剤が、ピルビン酸塩、2,2,6,6−テトラメチルペペリジン−1−オキシル、4−ヒドロキシ−2,2,6,6−テトラ―メチル−ペペリジン−1−オキシル、スーパーオキシド−ジスムターゼ、カタラーゼ、グルタチオンペルオキシダーゼ、ブチル化ヒドロキシトルエン、ブチル化ヒドロキシアニソールから成る群から選択される、請求項13に記載の粒子。
- 前記粒子がコーティングされる、請求項1〜14のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記コーティングが、ポリリシン、キトサン、硫酸セルロース、ヒドロキシルプロピルメチルセルロース又は塩化ポリジアリルジメチルアンモニウムから成る群から選択される、請求項15に記載の粒子。
- 前記精子がさらに、受精能力及び/又は動物の健康のために有益である化合物又は作用物質と同時包埋される、請求項1〜16のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記精子が、増量剤、凍結保護物質、抗生物質、抗体、酸化防止剤、タンパク質及びホルモンから成る群から選択される化合物又は作用物質の1つ又は複数と同時包埋される、請求項17に記載の粒子。
- 前記精子が、ブタ、畜牛、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、家禽、ペット、毛皮動物、水生動物及び絶滅危惧動物種から成る群から選択される動物から生じる、請求項1〜18のいずれか一項に記載の粒子。
- 前記精子が、ブタ、畜牛、毛皮動物及びウマから成る群から選択される動物から収集される、請求項19に記載の粒子。
- 前記精子が精液中に含入される、請求項1〜20のいずれか一項に記載の粒子。
- 脱水、冷凍保存又は凍結乾燥によりさらに処理される、請求項1〜21のいずれか一項に記載の粒子。
- 精液容器中で直接形成される、請求項1〜22のいずれか一項に記載の粒子。
- アルギン酸塩及び精子の混合物がゲル化溶液に付加される、請求項1〜23のいずれか一項に記載の粒子の調製方法。
- 前記ゲル化溶液が、カルシウム、ナトリウム、バリウム、マグネシウムから成る群から選択されるイオンのうちの1つ又は複数を含む、請求項24に記載の方法。
- 前記ゲル化溶液がカルシウムイオン及びナトリウムイオンを含む、請求項25に記載の方法。
- 前記粒子が脱水、冷凍保存又は凍結乾燥によりさらに処理される、請求項24〜26のいずれか一項に記載の方法。
- ヒトを除く動物の繁殖における請求項1〜23のいずれか一項に記載のバイオポリマー粒子の使用。
- 前記粒子が、ブタ、畜牛、ウマ、ヒツジ、ヤギ、ウサギ、家禽、ペット、毛皮動物、水生動物及び絶滅危惧動物種から成る群から選択される動物の繁殖に用いられる、請求項28に記載の使用。
- 前記粒子が直接授精される、請求項28又は29に記載の使用。
- 前記粒子が授精前に溶解される、請求項28又は29に記載の使用。
- 前記粒子が自由精子と一緒に用いられる、請求項28又は29に記載の使用。
- 請求項1〜23に記載の粒子中に保存される精子が、ヒトを除くレシピエント雌動物中に導入される動物の受精方法。
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