KR20210075278A - 신규한 염소정자 동결보존용 조성물 및 이의 용도 - Google Patents

Abstract

본 발명은 신선유로부터 분리한 우유단백질 분획물을 포함하는 염소정자 동결보존용 조성물 및 상기 조성물을 염소 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 염소 정자의 동결보존 방법에 관한 것이다. 본 발명에서 제공하는 염소정자 동결보존액을 사용하면, 동결보존을 위하여 사용되는 복잡하고 값비싼 원료 대신에 우유로부터 유래된 성분을 사용하여 염소정자를 효과적으로 동결보존시킬 수 있으므로, 간단하면서도 경제적으로 염소품종의 관리에 활용될 수 있을 것이다.

Description

신규한 염소정자 동결보존용 조성물 및 이의 용도{Novel composition for cryopreservating goat sperm and uses thereof}

본 발명은 신규한 염소정자 동결보존용 조성물 및 이의 용도 및 이의 용도에 관한 것으로, 보다 구체적으로 본 발명은 신선유로부터 분리한 우유단백질 분획물을 포함하는 염소정자 동결보존용 조성물 및 상기 조성물을 염소 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 염소 정자의 동결보존 방법에 관한 것이다.

정자의 동결과 저온 보관은 가축 등의 품종의 보존과 번식에 유용하며 생명공학 분야에서 활발히 연구되고 있는 분야이다. 특히, 동결 과정 중에 정자는 세포 내 빙정 형성, 삼투압의 차이 그리고 저온 스트레스에 의해 손상을 받게 되는데, 이러한 손상을 감소시키는 물질이 동결보존제이며 대표적인 물질로는 글리세롤(Glycerol)이 있다. 동결과정에 쓰이는 원 정액은 농도가 높기 때문에 희석액을 사용하여 묽히게 되는데, 희석 과정 중에 동결보존제가 희석액과 함께 투여된다.

특히, 소, 염소 등을 포함하는 반추위 동물의 경우에는 육종을 위한 기초 기술로서 많은 연구를 통하여 동결보존기술이 최적화되어 있는데, 이들의 인공수정에는 활력있는 정자의 수가 2×10^6 내지 4×10^6 정도는 되어야 하는 것으로 알려져 있으며 최소 40% 이상의 정자가 생존하여야 인공수정으로 산자의 생산을 보증할 수 있다고 알려져 있다.

이러한 동결보존(cryopreservation)은 실험 및 인공수정(artificial insemination, AI)을 위한 정자 세포의 유용성을 확장시킨다. 다양한 기술적 제약에도 불구하고, 정자에의 접근가능성은 인공수정 및 시험관내 수정(in vitro fertilization, IVF)의 발전을 가능케 하였다. 그러나, 동결-융해된 정자는 신선 정자(fresh sperm)와 같은 동일한 수정능(fertilizing potential)을 가지지 못하는데, 이는 22℃에서 1℃로 냉각되는 동안 냉각 과정이 세포막 내 지질 및 단백질 재배열을 유도하기 때문이다.

이같은 정자의 동결보존을 보다 효과적으로 수행하기 위하여 다양한 연구가 수행되고 있다. 예를 들어, 국제특허공개(WO) 01/037655호에는 사람, 소, 말, 돼지, 양 및 바이슨 정자와 같은 포유류 정자에 희석액을 가하고, 동결보존하는 단계를 포함하는 정자세포의 동결보존방법이 개시되어 있고, 한국특허등록 제427850호에는 소형개의 정액을 채취하여 완만동결 또는 초급속동결 방법으로 동결하고 액체질소통에 영구히 보존하면서 인공수정하는 방법이 개시되어 있다.

이러한 배경하에서, 본 발명자들은 염소의 정액을 동결보존할 수 있는 방법을 개발하기 위하여 예의 연구노력한 결과, 신선유로부터 분리한 우유단백질 분획물을 포함하는 염소 정자의 동결보존용 조성물을 이용하여 염소의 정자를 동결보존할 경우, 비교적 높은 수준의 정자 생존율을 나타낼 수 있음을 확인하고, 본 발명을 완성하였다.

본 발명의 하나의 목적은 신선유로부터 분리한 우유단백질 분획물을 포함하는 염소 정자의 동결보존용 조성물을 제공하는 것이다.

본 발명의 다른 목적은 상기 조성물을 정장액이 제거된 염소 정자에 처리하고, 이를 동결보존하는 단계를 포함하는 염소 정자의 동결보존방법을 제공하는 것이다.

상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 실시양태는 신선유로부터 분리한 우유단백질 분획물을 포함하는 염소 정자의 동결보존용 조성물을 제공한다.

염소의 정액에 포함된 정장액에는 지방산 분해 효소(phospholipase A2)가 높은 농도로 포함되어 있어, 통상적으로 정자의 동결보존시 사용되는 난황을 사용할 경우에는 정장액에 포함된 상기 효소에 의해 통상의 기대수준으로 동결보존이 수행되지 못하는 단점이 있다. 이를 해소하기 위하여, 본 발명자들은 염소의 정자를 동결보존하기 위하여, 염소의 정액으로부터 정장액을 제거하고, 상기 정장액에 포함된 지방산 분해 효소에 의한 영향을 최소화하기 위한 동결보호성분으로서 우유단백질을 사용하였다. 상기 우유단백질은 신선유의 가공과정에 따라 단백질의 구조가 손상되고, 이처럼 손상된 구조의 우유단백질은 정자의 동결보존효과를 저하시킬 수 있으므로, 가공되지 않은 신선유로부터 수득한 우유단백질을 동결보호성분으로 사용할 경우, 염소 정자의 동결보존을 보다 효과적으로 수행할 수 있음을 알 수 있었다.

본 발명의 용어 "신선유"란, 젖소, 염소, 양 등으로부터 채유된 후, 가공처리되지 않은 우유를 의미한다. 상기 가공처리는 채유 후 고온살균, 저온살균, 건조, 저온저장 등의 처리를 의미하며, 본 발명에서 제공하는 염소 정자의 동결보존용 조성물에 포함된 우유단백질 분획물은 이러한 가공처리를 수행하지 않은 우유를 원료로 사용한다.

본 발명의 용어 "우유단백질 분획물"이란, 신선유에 포함된 단백질 성분의 농축물을 의미한다.

본 발명에 있어서, 상기 우유단백질 분획물은 신선유의 특성을 그대로 유지하기 위하여, 다른 첨가제를 사용하지 않고 수득한 단백질 농축물을 의미하는 것으로 해석될 수 있고, 이를 위하여 상기 우유단백질 분획물로는 신선유를 원심분리하여 얻어진 침전물 또는 그의 현탁액을 사용할 수 있다. 상기 우유단백질 분획물로서 상기 침전물의 현탁액을 사용할 경우, 신선유에 포함된 농도의 5 내지 20배로 농축된 현탁액을 사용할 수 있다.

본 발명의 용어 "정자"란, 정충이라고도 하고, 정자는 웅성동물의 고환에서 생산되는 성세포를 의미하는데, 길이는 약 0.02㎜이며, 머리, 경부 및 긴 꼬리의 세 부분으로 구성된다. 머리 부분에는 웅성 동물의 DNA가 들어 있고, 머리 부분의 맨 앞쪽에 존재하는 첨체에는 난자의 난막을 녹일 수 있는 효소가 포함되어 있고; 상기 경부에는 에너지 저장고인 당분을 함유한 미토콘드리아가 포함되어 있으며; 상기 꼬리는 가는 실 묶음으로 되어 있는데 가는 실 묶음이 교묘하게 신축하여 꼬리를 움직이게 한다.

본 발명의 목적상 상기 정자는 염소의 정자를 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "동결보존"이란, 냉동을 통해 장기간에 걸쳐 세포를 안정하게 유지시키는 행위를 의미한다.

본 발명의 목적상 상기 동결보존은 염소 정자의 동결보존을 의미하는 것으로 해석될 수 있다.

본 발명의 용어 "동결보존용 조성물"란, 동결보존제 또는 동결보호제라고도 하고, 생물세포를 동결상태에서 산채로 보존할 경우, 동해를 경감할 목적으로 매액(媒液)에 첨가시키는 물질을 의미한다. 본 발명의 목적상 상기 동결보존용 조성물은 염소의 정자를 동결보존하기 위하여 사용되는 조성물로 해석될 수 있는데, 신선유로부터 분리한 우유단백질 분획물을 주성분으로 포함하고, 정자의 동결보존에 사용되는 기타 성분을 추가로 포함할 수 있다.

이때, 상기 동결보존용 조성물에 포함된 우유단백질 분획물의 함량은 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서 30 내지 40%(v/v)가 될 수 있고, 다른 예로서, 33 내지 37%(v/v)가 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 35%(v/v)가 될 수 있다.

본 발명에 있어서, 상기 정자의 동결보존에 사용되는 기타 성분은 정자의 농도를 저하시켜서, 동결보존시 정자간의 충돌로 인하여 발생할 수도 있는 손상을 방지하기 위하여 사용될 수 있는 한, 특별히 이에 제한되지 않으나, 일 예로서, 당류, 유기산, 난황, 항생제 등을 포함하는 완충성분이 될 수 있고, 다른 예로서, 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 덱스트란 등의 당류; 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산 등의 유기산; 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신 등의 항생제; 및 난황을 포함하는 완충성분이 될 수 있으며, 또 다른 예로서, 트릴라딜, eqeux STM 페이스트 등과 같이 다양한 성분을 포함하여 상업적으로 판매되는 물질이 될 수 있다.

본 발명의 다른 실시양태는 상기 염소 정자의 동결보존용 조성물을 이용하여 염소 정자를 동결보존하는 방법을 제공한다.

구체적으로, 본 발명에서 제공하는 염소 정자를 동결보존하는 방법은 (a) 염소 정액으로부터 정장액을 제거하여, 정장액 성분이 제거된 염소 정자를 수득하는 단계; (b) 상기 수득한 정장액 성분이 제거된 염소 정자를 염소 정자의 동결보존용 조성물과 혼합하여 염소 정자 동결보존 시료를 수득하는 단계; 및 (c) 상시 수득한 염소 정자 동결보존 시료를 동결 및 보존하는 단계를 포함한다.

본 발명에서 제공하는 염소 정자의 동결보존 방법에 있어서, 사용되는 염소 정자는 염소 정액으로부터 정장액이 제거된 정자를 사용할 수 있는데, 이는 염소 정액의 정장액에 포함된 지방산 분해 효소(phospholipase A2)의 영향을 배제하기 위한 것이다.

또한, 정장액이 제거된 염소 정자와 염소 정자의 동결보존용 조성물을 혼합할 경우, 염소 정자의 농도를 80~100개/ml로 유지할 수 있는데, 염소 정자의 농도가 이 보다 낮을 경우에는 동결보존시의 부피가 너무 증가하여, 동결보존의 효율이 낮아지고, 염소 정자의 농도가 이 보다 높은 경우에는 동결이전에 정자간의 충돌로 인하여 정자의 손상율이 증가될 가능성이 있다.

상기 동결 및 보존은 정자를 동결보존할 수 있는 한 공지된 모든 수단에 의하여 수행될 수 있으나, 바람직하게는 액화질소를 사용하여 -196℃에서 동결 및 보존을 수행할 수 있고, 상기 동결된 정자는 반영구적으로 보존할 수 있다.

다른 관점에서, 본 발명의 동결보존방법으로 보존된 염소 정자는 상기 동결보존된 염소 정자 동결보존 시료를 융해시켜서 사용할 수 있다.

이때, 상기 동결된 염소 정자를 융해시키는 방법은 상기 동결보존된 동결보존된 염소 정자 동결보존 시료를 정상상태로 회복시킬 수 있다면 특별히 제한되지 않고 사용될 수 있는데, 일 예로서, 동결보존된 염소 정자 동결보존 시료를 상온에서 일정시간 동안 정치시킴으로써 상기 시료에 포함된 냉매를 휘발시켜 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 1 내지 10℃의 물에 2 내지 10분 동안 침지하거나, 30 내지 40℃의 물에 10 내지 30초 동안 침지하거나 또는 60 내지 80℃의 물에 1 내지 5초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 다른 예로서, 동결보존된 염소 정자 동결보존 시료를 상온에서 10 내지 20초 동안 정치시켜서 냉매를 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 4℃의 물에 5분 동안 침지하거나, 37℃의 물에 20초 동안 침지하거나, 70℃의 물에 3초 동안 침지하여 수행될 수 있으며, 또 다른 예로서, 동결보존된 염소 정자 동결보존 시료를 상온에서 20초동안 동안 정치시켜서 냉매를 제거하고, 상기 냉매가 제거된 정자를 37℃의 온수에서 20초 동안 침지함으로써 수행될 수 있다.

본 발명에서 제공하는 염소정자 동결보존액을 사용하면, 동결보존을 위하여 사용되는 복잡하고 값비싼 원료 대신에 우유로부터 유래된 성분을 사용하여 염소정자를 효과적으로 동결보존시킬 수 있으므로, 간단하면서도 경제적으로 염소품종의 관리에 활용될 수 있을 것이다.

도 1은 본 발명의 염소정자 동결보존액을 사용하여 동결보존시킨 염소정자 시료의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.
도 2는 신선유(FM), 전지분유(WF) 또는 탈지분유(DF)로부터 수득한 우유단백질 분획물을 포함하는 염소정자 동결보존액을 사용하여 동결보존시킨 염소정자 시료(T)의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 대조군으로는 대조군으로는 염소정자 동결보존액을 가하지 않고, 동결보존하지 않은 염소정자 시료를 사용하고, 비교군으로는 염소정자 동결보존액과 혼합한 후 동결보존하지 않은 염소정자 시료(D)를 사용하였다.

이하 본 발명을 실시예를 통하여 보다 상세하게 설명한다. 그러나 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위한 것으로 본 발명의 범위가 이들 실시예에 한정되는 것은 아니다.

실시예 1: 우유단백질의 정제

우유를 원심분리하여(30,000 g, 1시간 30분), 카제인 성분을 포함하는 침전물을 수득하고, 수득한 침전물에 우유부피의 10%에 해당하는 초순수를 가하여 현탁시켜서 우유단백질 분획물을 수득한 다음, 상기 수득한 우유단백질 분획물을 냉장보존하였다.

실시예 2: 염소정자 동결보존액의 제조

소 정액의 동결보존에 사용되는 트릴라딜 원액(트릴라딜 농축액 20%(v/v), 난황 20%(v/v) 및 초순수 60%(v/v))의 조성을 변형시켜서, 실시예 1에서 수득한 우유단백질 분획물을 포함하는 염소정자 동결보존액을 제조하였다; 이때, 상기 염소정자 동결보존액은 트릴라딜 농축액 20%(v/v)을 필수로 포함하고 우유단백질 분획물 10, 20, 40, 60 또는 80%(v/v) 및 적량의 초순수를 포함하도록 제조하였다.

실시예 3: 염소정자의 동결보존

먼저, 흑염소의 정액을 채취하였다: 대략적으로, RAU immobilizer와 IM 2000 mini probe를 이용한 전기자극방법을 사용하여 흑염소로부터 정액을 채취하였는데, 상기 IM 2000 mini probe를 분변을 제거한 흑염소의 항문에 15 내지 20cm 삽입하고, 2~3단계에서 서서히 자극강도를 높이면서 외부 생식기의 노출과 정장액의 유출을 확인한 다음, 통전 강도를 서서히 높여 방출되는 정액을 수집하였다.

다음으로, 채취한 정액을 원심분리하여(500 g, 15분), 정장액과 정장액에 포함된 효소가 제거된 정자 침전물을 수득하고, 수득한 정자 침전물에 실시예 2에서 제조한 각각의 가온된 염소정자 동결보존액을 가하여 약 80~100개/ml의 정자농도를 갖는 각각의 염소정자 시료를 수득하였다.

끝으로, 상기 수득한 각각의 염소정자 시료를 중탕 냉각시킨 후, 0.5ml 스트로에 포장하여 액체 질소 위 5cm에서 10분간 노출하고 액체질소에 정자를 침지하여, 염소정자를 동결보존하였다.

실시예 4: 동결보존된 염소정자의 생존성 분석

상기 실시예 3에서 동결보존한 각각의 염소정자 시료를 상온에서 융해시키고, 각 시료의 생존율을 비교하였다(도 1). 이때, 대조군으로는 염소정자 동결보존액을 가하지 않고, 동결보존하지 않은 염소정자 시료를 사용하였다.

도 1은 본 발명의 염소정자 동결보존액을 사용하여 동결보존시킨 염소정자 시료의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프이다.

도 1에서 보듯이, 동결보존하지 않은 대조군의 생존율(95±1.0%)에 비하여, 10 또는 20%의 우유단백질 분획물을 포함하는 염소정자 시료는 현저히 낮은 수준의 생존율(33.7±1.4%, 37.5±3.0%)을 나타내었으나, 40%의 우유단백질 분획물을 포함하는 염소정자 시료는 비교적 우수한 수준의 생존율(79.3±3.9%)을 나타내었고, 60 또는 80%의 우유단백질 분획물을 포함하는 염소정자 시료는 상개적으로 낮은 수준의 생존율(47.9±0.9%, 59.6±0.5%)을 나타냄을 확인하였다.

이에, 상기 우유단백질의 분획물의 농도를 보다 세분화하여 염소정자의 생존율에 미치는 영향을 분석한 결과, 30 내지 40%의 농도로 우유단백질의 분획물을 포함하는 염소정자 동결보존액을 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

실시예 5: 우유단백질의 종류에 따른 염소정자의 생존성 분석

상기 실시예 4의 결과로부터, 40%의 우유단백질 분획물을 포함하는 염소정자 동결보존액을 사용할 경우, 염소정자의 동결보존후 생존율을 높은 수준으로 유지할 수 있음을 확인하였으므로, 상기 우유단백질의 종류에 따른 차이가 있는지를 확인하고자 하였다.

대략적으로, 신선유(FM), 전지분유(WF) 현탁액 또는 탈지분유(DF) 현탁액을 대상으로 실시예 1의 방법을 수행하여 각각의 우유단백질 분획물을 수득하고, 수득한 각각의 우유단백질 분획물을 40%로 포함하는 염소정자 동결보존액을 각각 제조하였다. 상기 제조된 각각의 염소정자 동결보존액을 이용하여 염소정자를 동결보존한 후, 이의 생존성을 비교하였다(도 2).

도 2는 신선유(FM), 전지분유(WF) 또는 탈지분유(DF)로부터 수득한 우유단백질 분획물을 포함하는 염소정자 동결보존액을 사용하여 동결보존시킨 염소정자 시료(T)의 생존율을 비교한 결과를 나타내는 그래프로서, 대조군으로는 대조군으로는 염소정자 동결보존액을 가하지 않고, 동결보존하지 않은 염소정자 시료를 사용하고, 비교군으로는 염소정자 동결보존액과 혼합한 후 동결보존하지 않은 염소정자 시료(D)를 사용하였다.

도 2에서 보듯이, 동결보존을 수행하지 않은 상태에서도 우유단백질 분획물의 종류에 따라 염소정자의 생존율에 큰 차이를 나타내었고, 이러한 경향은 동결보존을 수행한 후에도 유지됨을 확인하였다. 즉, 동결보존을 수행하지 않은 상태에서도 신선유의 우유단백질 분획물을 사용한 경우, 대조군과 가장 유사한 수준의 염소정자 생존율을 나타내었고, 탈지분유의 우유단백질 분획물을 사용한 경우, 신선유의 우유단백질 분획물을 사용한 경우보다도 염소정자의 생존율이 저하되었으며, 전지분유의 우유단백질 분획물을 사용한 경우 상대적으로 가장 낮은 수준으로 염소정자의 생존율이 저하됨을 확인하였다.

또한, 동결보존을 수행한 후에도, 신선유의 우유단백질 분획물을 사용한 경우, 상대적으로 가장 높은 수준의 염소정자 생존율을 나타내었고, 탈지분유의 우유단백질 분획물을 사용한 경우, 신선유의 우유단백질 분획물을 사용한 경우보다도 염소정자의 생존율이 저하되었으며, 전지분유의 우유단백질 분획물을 사용한 경우 상대적으로 가장 낮은 수준으로 염소정자의 생존율이 저하됨을 확인하였다.

상기 도 2의 결과에서 보듯이, 동일한 우유단백질 분획물을 사용하더라도, 상기 우유단백질의 원료에 따라, 염소정자의 생존율이 변화됨을 알 수 있었다.

따라서, 신선유로부터 분리된 우유단백질 분획물을 30 내지 40%로 포함하는 염소정자 동결보존액을 사용함이 바람직함을 알 수 있었다.

이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (9)

1. 신선유로부터 분리한 우유단백질 분획물을 포함하는, 염소 정자의 동결보존용 조성물.
   
2. 제1항에 있어서,
   상기 신선유는 채유된 후, 가공처리되지 않은 우유인 것인, 염소 정자의 동결보존용 조성물.
   
3. 제2항에 있어서,
   상기 가공처리는 고온살균 처리, 저온살균 처리, 건조 처리 또는 저온저장 처리인 것인, 염소 정자의 동결보존용 조성물.
   
4. 제1항에 있어서,
   상기 우유단백질 분획물은 신선유를 원심분리하여 얻어진 침전물 또는 그의 현탁액인 것인, 염소 정자의 동결보존용 조성물.
   
5. 제1항에 있어서,
   상기 우유단백질 분획물의 함량은 30 내지 40%(v/v)인 것인, 염소 정자의 동결보존용 조성물.
   
6. 제1항에 있어서,
   상기 조성물은 글루코스, 프럭토스, 수크로스, 덱스트란, 시트르산, 아세트산, 부티르산, 팔미트산, 옥살산, 타타르산, 스트렙토마이신, 페니실린, 앰피실린, 카나마이신, 난황 및 이들의 조합으로 구성된 군으로부터 선택되는 성분을 추가로 포함하는 것인, 염소 정자의 동결보존용 조성물.
   
7. (a) 염소 정액으로부터 정장액을 제거하여, 정장액 성분이 제거된 염소 정자를 수득하는 단계;
   (b) 상기 수득한 정장액 성분이 제거된 염소 정자를 염소 정자의 동결보존용 조성물과 혼합하여 염소 정자 동결보존 시료를 수득하는 단계; 및
   (c) 상시 수득한 염소 정자 동결보존 시료를 동결 및 보존하는 단계를 포함하는, 염소 정자의 동결보존 방법.
   
8. 제7항에 있어서,
   상기 (b) 단계의 염소 정자 동결보존 시료에 포함된 정자의 농도는 80 내지 100개/ml인 것인, 염소 정자의 동결보존 방법.
   
9. 제7항에 있어서,
   상기 (c) 단계의 동결 및 보존은 액화질소를 사용하여 -196℃에서 수행되는 것인, 염소 정자의 동결보존 방법.
   
   

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