CN110035656A - 缓释组合物 - Google Patents

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Abstract

本发明涉及缓释组合物，特别是包含埋入基质(例如聚合物基质)中的精子的缓释组合物。通过含有至少两个具有不同溶出速率的部分，基质将确保精子长时间释放，从而使相对于排卵的授精时间不那么关键。此外，本发明还涉及一种制备缓释组合物的方法，包含缓释组合物的容器和缓释组合物在动物繁殖中的用途。

Description

缓释组合物
技术领域
本发明涉及缓释组合物，特别是包含埋入基质(例如聚合物基质)中的精子的缓释组合物。通过含有至少两个具有不同溶出速率的部分，基质将确保精子长时间释放，从而使相对于排卵的授精时间不那么关键。此外，本发明还涉及一种制备缓释组合物的方法，包含缓释组合物的容器和缓释组合物在动物繁殖中的用途。
背景技术
人工授精(AI)是一项通过人工方式而不是通过自然交配将精子置于动物的子宫或子宫颈中的技术。该技术自20世纪40年代开始使用，现在被广泛用作一种配种方法，并且被广泛用于动物育种以繁殖所需的性状，特别是对于农场动物例如牛、猪、绵羊、家禽和马，以及对于宠物例如纯种狗、水生动物和濒危物种而言。
对现代AI发展以及育种人员在使用人工授精和保藏精子方面所面临的挑战的综述公开于R.H.Foote(2002)，American Society of Animal Science和“Reproduction infarm animals”，B.Hafez，E.S.E.Hafez.编著-第7版，Philadelphia，LippincottWilliams&Wilkins，2000.-XIII，ISBN 0-683-30577-8(ib.)。
通常，精子被收集、稀释且然后例如通过低温贮藏进行保藏。低温贮藏技术的使用预先假定来自特定动物物种的精子耐受这种处理而不会导致精子质量、活力和受精能力的过度衰退。然后通常将低温贮藏的或新鲜储存的精子(无论哪种都是合适的)输送至雌性动物的部位。至关重要的是，所述精子直至授精时仍保持活力，并且授精后该活力在雌性动物体内保持足够长的时间直至卵细胞到达受精部位。
对保藏方法进行了大量的关注和研究，旨在提供确保精子在授精后也能长时间保持受精能力的储存方法和手段，这对于整个养殖业来说是有益的，因为相对于排卵的授精时间将不那么关键。
WO2008/004890公开了一种保藏系统，其中精子埋入海藻酸盐中。据说所述保藏系统通过在授精后较长时间给予精子受精能力而提供益处。
EP2526768公开了一种组合物，其包含增量剂组合物中的精子和基质聚合物。海藻酸盐的目的是增加增量剂的密度，从而避免沉淀出精子。
WO2015/181496的目的是减少精子的损失，特别是减少在填充期间被吸收到人工授精吸管的塞子中的精子的数量。该目的通过用快速作用的交联剂(即非惰性交联剂)例如BaCl2浸渍塞子来实现，所述交联剂将在填充过程中快速与海藻酸钠反应以形成凝胶。凝胶将确保在填充过程中精子不会被吸收到塞子中。
尽管已经公开了良好的保藏系统，但仍然需要在储存期间、授精之前和之后均提供更高的生存力的改进的保藏系统。使育种人员不太依赖于匹配相对于排卵的最优选的授精时间点的系统将提供更大的灵活性并导致成功受精的增加。
发明内容
本发明人通过提供缓释组合物，特别是包含埋入基质(例如聚合物基质)中的精子的缓释组合物解决了这种需要。通过含有至少两个具有不同溶出速率的部分，基质确保具有高受精能力的精子长时间释放，因此使得相对于排卵的授精时间不那么关键。
本发明的第一方面提供了一种缓释组合物，其包含埋入基质中的待释放的物质，所述基质包含离子交联的聚合物并且含有具有不同机械强度的至少第一和第二部分；其中离子交联聚合物是离子交联的海藻酸盐，海藻酸盐优选具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基。
根据具体实施方案，待释放的物质是精子。
根据具体实施方案，离子交联的海藻酸盐是二价阳离子交联的海藻酸盐，海藻酸盐优选具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基。
根据具体实施方案，第一部分的机械强度比第二部分的机械强度高至少10％，例如高至少20％。
根据具体实施方案，第二部分的机械强度为10至190g/mm，并且第一部分的机械强度比第二部分的机械强度高至少10％，例如高至少20％。
根据具体实施方案，第二部分的机械强度为10至190g/mm，并且第一部分的机械强度为10至190g/mm，条件是第一部分和第二部分具有不同的机械强度。
根据具体实施方案，第一部分的机械强度：第二部分的机械强度比至少为1.1，例如至少为1.2。
根据具体实施方案，
-待释放的物质是精子；和
-离子交联聚合物是二价阳离子交联的海藻酸盐，海藻酸盐具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基。
本发明的第二方面提供了一种制备本发明第一方面的缓释组合物的方法，该方法包括以下步骤：
-将待释放的物质与包含可离子交联的海藻酸盐的组合物混合，从而形成预混合物；
-使预混合物与惰性交联剂和活化剂组合物接触；和
-使离子和可离子交联的海藻酸盐形成离子交联的海藻酸盐，从而得到本发明第一方面的缓释组合物；
其中
可离子交联的海藻酸盐具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基；
惰性交联剂能够在活化时释放离子，所述离子适用于交联可离子交联的海藻酸盐；和
所述活化剂组合物包含一种或多种能够活化惰性交联剂的化合物。
根据具体实施方案，待释放的物质是精子。
根据具体实施方案，当暴露于pH≤8，例如pH≤7.5或pH≤7或pH≤6时，惰性交联剂释放离子，例如二价离子。根据具体实施方案，惰性交联剂是二价阳离子碳酸盐，如CaCO3、BaCO3或其任何混合物。
根据具体实施方案，惰性交联剂和/或活化剂组合物是以固体形式。当它们是以固体形式时，它们不能相互反应。
根据具体实施方案，活化剂组合物包含葡糖酸-δ-内酯(GDL)。
根据具体实施方案，活化剂组合物直接活化惰性交联剂或引发一系列导致惰性交联剂活化的事件。
根据具体实施方案，使预混合物与惰性交联剂接触，然后加入活化剂组合物。
根据具体实施方案，使预混合物与活化剂组合物接触，然后加入惰性交联剂。
根据具体实施方案，使预混合物与活化剂组合物和惰性交联剂接触，并将活化剂组合物和惰性交联剂同时加入预混合物中。
根据具体实施方案，预混合物还包含水解酶；活化剂组合物包含可被水解酶水解的底物。
根据具体实施方案，活化剂组合物包含水解酶；预混合物还包含可被水解酶水解的底物。
根据具体实施方案，惰性交联剂是以固体形式。
根据具体实施方案，
-待释放的物质是精子；
-惰性交联剂是二价阳离子碳酸盐，如CaCO3、BaCO3或其任何混合物；
-惰性交联剂是以固体形式；和
-活化剂组合物包含水解酶，预混合物还包含可被水解酶水解的底物；或
预混合物还包含水解酶，并且活化剂组合物包含可被水解酶水解的底物；或
活化剂组合物包含GDL。
本发明的第三方面提供了根据本发明第一方面的缓释组合物，所述缓释组合物可通过根据本发明第二方面的方法获得。
本发明的第四方面提供了一种容器，例如授精吸管或管，其包含根据本发明第一方面或第三方面的缓释组合物；其中待释放的物质是精子。
本发明的第五方面提供了根据本发明第一方面或第三方面的缓释组合物在动物繁殖中的用途，其中待释放的物质是精子。
附图简要说明
图1示出了一种授精吸管(1)，其包括在第一端(2)和第二端(3)之间延伸的管，并且包括透气的液密塞(4)，所述塞设置在管的第一端附近的管中并在第一端(朝向管的第一端(2))和第二端(朝向管的第二端(3))之间延伸。以固体形式的CaCO3和GDL的混合物(6)位于透气的液密塞(4)的面向管(3)的第二端的端部附近。将包含精子和海藻酸盐的混合物引入吸管(5)中，从而形成具有埋入的精子的离子交联聚合物。深灰色表示高度交联，灰色表示中度交联，浅灰色表示低度交联。
发明详述
除非本文特别定义，否则所用的所有技术和科学术语具有与聚合物工程、生物化学、分子生物学和动物育种领域的技术人员通常理解的含义相同的含义。
在本文中陈述数值限制或范围的情况下，包括端点。此外，数字限制或范围内的所有值和子范围都被明确地包括在内，就像明确写出一样。
与本文所述的那些方法和物质类似或等同的所有方法和物质可用于本发明的实践或测试中，其中本文描述了合适的方法和物质。本文提及的所有出版物、专利申请、专利和其他参考文献都通过引用作为整体纳入本文中。如有冲突，以本说明书(包括定义)为准。
先前已经表明，将精子包埋在海藻酸盐基质中通过在授精后给予精子更长时间的受精能力来提供益处。假设包埋导致精子在海藻酸盐基质内固定，并且受限制的移动导致精子的能量消耗减少，这对于保质期和受精能力是有益的。
基于以上所述，似乎可以合理地假设固定程度会影响精子的能量消耗，从而影响其保质期和受精能力。由于固定程度通常将根据基质的特性(例如机械强度)而变化，这些特性预计会对保质期和受精能力产生直接影响。
与具有高交联度的离子交联聚合物相比，具有低交联度的交联聚合物(例如离子交联聚合物)将具有降低的机械强度。这种基质在基质内具有较少的限制并允许更高程度的移动，鉴于上述情况，预计其在保质期和受精能力方面是不利的。
本发明基于以下令人惊讶的发现：基质的机械强度可以显著降低，而不会不利地影响所埋入的精子的保质期和受精能力。由于机械强度与基质的溶出速率直接相关，因此该发现使得可以调节基质的溶解曲线而不会不利地影响所埋入的精子的保质期和受精能力。
通过能够调节溶解曲线而不会不利地影响保质期和受精能力，可以设计一种系统，其中精子在授精后长时间从聚合物基质中连续释放。由于保质期和受精能力在埋入聚合物基质中时得以保持，连续释放确保了存在在授精后长时间内可用于受精的高质量精子，从而使相对于排卵的授精时间不那么关键。
应当理解，即使本发明被设计用于动物饲养，特别是人工授精，本发明的概念也可以找到其他利用领域。其他利用领域的实例可以是治疗剂(例如治疗活性化合物、诊断剂或生物学物质，例如细胞，特别是干细胞)的施用。
因此，本发明的第一方面涉及缓释组合物，其包含埋入基质(例如聚合物基质)中的待释放的物质，所述基质包含离子交联聚合物并且含有具有不同机械强度的至少第一和第二部分；其中离子交联聚合物是离子交联的海藻酸盐，所述海藻酸盐具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基。
本文所述的缓释组合物被设计成以预定速率释放物质，以确保在特定时间段内连续供应物质，并同时确保未释放的物质保留在基质内直至释放点。
术语“缓释”包括控制释放、延长释放(prolonged release)、限时释放、阻滞释放、持续释放(extended release)和延缓释放。
在一个实施方案中，待释放的物质在授精后释放至少2小时，例如授精后释放至少4小时、授精后释放至少8小时、授精后释放至少16小时、授精后释放至少32小时或授精后释放至少144小时。在另一个实施方案中，待释放的物质在授精后释放2-144小时，例如授精后释放4-120小时、授精后释放8-96小时、授精后释放16-72小时、授精后释放24-96小时、授精后释放24-120小时或授精后释放24-144小时。
在根据本发明的一个实施方案中，待释放的物质选自生物学物质(例如细胞，特别是干细胞)、治疗剂、诊断剂或其任何混合物。在根据本发明的一个优选实施方案中，待释放的物质是精子。
如本文所用的术语“精子”包括精子本身以及精液中含有的精子，即，当形成根据本发明的缓释组合物时，可以直接使用精液。然而，从精液中分离的精子，任选地包含在其他合适的储存溶液中，也可用于形成根据本发明的缓释组合物。
待释放的物质埋入基质中。如本文所用的术语“埋入”是指防止待释放的物质具有其自然移动的可能性。固定程度将根据基质的特征(如机械强度)而变化。但是，应该理解的是，防止根据本发明埋入基质中的待释放的物质(如精子)具有其自然移动的可能性，否则如果存储在液体中，例如在胶囊的液体核心中，待释放的物质将具有其自然移动的可能性。
如本文所用的术语“基质”是指待释放的物质埋入其中的基质。基质提供降低的移动可能性，并且固定程度通常根据基质的特征(如机械强度)而变化。然而，不仅固定程度而且基质的溶出速率通常都根据基质的特性而变化。具有高交联度的基质通常比具有低交联度的基质具有更高的机械强度并因此具有更低的溶出速率。因此，通过组合具有不同机械强度的两种基质，组合的基质将具有两个具有不同机械强度的部分。由于高机械强度与低溶出速率相关并且低机械强度与高溶出速率相关，因此两个部分将具有不同的溶出速率。
根据本发明的基质含有具有不同机械强度的至少第一和第二部分。如果基质含有具有不同机械强度的两个部分，则其中一个部分的机械强度低于另一个部分。如果基质具有三个或更多个部分，则这些部分中的至少两个将具有不同的机械强度。
在根据本发明的一个实施方案中，基质含有具有不同机械强度的至少三个部分，例如至少四个部分、至少五个部分、至少六个部分、至少七个部分、至少八个部分、至少九个部分或至少十个部分。在根据本发明的另一个实施方案中，基质含有具有不同机械强度的多个部分。
根据其他实施方案，基质含有具有不同机械强度的至少第一、第二和第三部分。更优选地，基质含有具有不同机械强度的至少第一、第二、第三和第四部分。甚至更优选地，基质含有具有不同机械强度的至少第一、第二、第三、第四、第五、第六、第七、第八、第九和第十部分。
根据其他实施方案，具有不同机械强度的部分的数量为＞10，更优选＞50，甚至更优选＞100，最优选＞200。
如果各部分之间的机械强度差异小，则基质实际上将一部分一部分逐渐溶解。然而，如果各部分之间的机械强度差异大，则基质通常将遵循时间交错的溶解曲线。
根据本发明的缓释组合物可以分成预定数量的部分。每个部分代表缓释组合物的一部分。这些部分可以具有相同或不同的体积尺寸。
在一个实施方案中，具有不同机械强度的第一和第二部分的体积尺寸相似或相等。具有不同机械强度的第一和第二部分可以在缓释组合物中彼此相邻放置，或者可以在缓释组合物中不彼此相邻放置。
在根据本发明的一个实施方案中，基质含有具有不同机械强度的至少三个部分，例如至少五个部分、至少七个部分、至少九个部分、至少十一个部分、至少十三个部分、至少十五个部分、至少十七个部分或至少二十个部分。
根据本发明的缓释组合物原则上可以采用任何三维形状，例如球体、圆环形、圆柱形、圆锥体、立方体、长方体、三棱锥、正方棱锥、三棱柱或其任何组合。
在根据本发明的一个实施方案中，基质具有圆柱形、圆锥体、立方体、长方体、三棱锥、正方棱锥或三棱柱的形状。在一个实施方案中，基质沿着三维形状的长度方向具有增加的机械强度。在另一个实施方案中，基质沿三维形状的宽度方向具有增加的机械强度。
在根据本发明的另一个实施方案中，基质具有球体、圆环形或立方体的形状。在一个实施方案中，基质沿着从圆周朝向形状中心延伸的轴具有增加的机械强度。在另一个实施方案中，基质沿着从圆周朝向形状中心延伸的轴线具有降低的机械强度。
术语“溶出速率”量化溶解过程的速度。由于溶出速率可以根据参数(诸如温度和溶剂的化学性质)而变化，因此如本文所用的溶出速率根据实施例4中所述的方法测量。
在根据本发明的一个实施方案中，如本文所用的溶出速率根据实施例4中所述的方法，特别是在不存在钙的情况下评估溶出速率的体外方法进行测量。如果通过实施例4中所述的方法，特别是在不存在钙的情况下评估溶出速率的体外方法测量的相同条件下，第一部分的溶出速率与第二部分的溶出速率显著不同，则认为两个部分具有不同的溶出速率。
在根据本发明的替代实施方案中，如本文所用的溶出速率根据实施例4中所述的方法，特别是在钙存在下评估溶出速率的体外方法进行测量。如果通过实施例4中所述的方法，特别是在钙存在下评估溶出速率的体外方法测量的相同条件下，第一部分的溶出速率与第二部分的溶出速率显著不同，则认为两个部分具有不同的溶出速率。
基质的一部分的溶出速率反映了在该部分内完全溶解基质所需的时间。当不存在剩余尺寸大于1mm的部件时，认为基质完全溶解。在球体的情况下，1mm的尺寸是指球体的最长直径。类似地，在圆柱形颗粒的情况下，1mm的尺寸是指圆柱形颗粒的最长长度。类似适用于其他几何形状。
如本文所用的术语“机械强度”根据实施例5中所述的方法进行测量。如通过实施例5中所述的方法所测量的，如果其中一个部分的机械强度与另一个部分的机械强度显著不同，则认为两个部分具有不同的机械强度。在一个实施方案中，如果第一部分的机械强度：第二部分的机械强度的比不等于1，则认为两个部分具有不同的机械强度。
在根据本发明的一个实施方案中，第一部分的机械强度比第二部分的机械强度高至少5％，例如高至少10％、高至少15％、高至少20％、高至少25％、高至少30％、高至少35％、高至少40％、高至少45％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少100％、高至少200％或高至少400％。根据实施例5中所述的方法测量机械强度。如果一个部分的机械强度为20g/mm且第二部分的机械强度为40g/mm，则后一部分的机械强度比所述第一部分的机械强度高100％。
在根据本发明的另一个实施方案中，第二部分的机械强度为10至190g/mm，例如10至170g/mm、10至150g/mm、10至130g/mm、10至110g/mm、10至90g/mm、10至70g/mm、10至50g/mm或10至30g/mm。在根据本发明的另一个实施方案中，第二部分的机械强度为30至190g/mm，例如50至190g/mm、70至190g/mm、90至190g/mm、110至190g/mm、130至190g/mm、150至190g/mm或170至190g/mm。通过实施例5中所述的方法测量该部分的机械强度。
在根据本发明的另一个实施方案中，第二部分的机械强度为10至190g/mm，例如10至170g/mm、10至150g/mm、10至130g/mm、10至110g/mm、10至90g/mm、10至70g/mm、10至50g/mm或10至30g/mm，第一部分的机械强度为10至190g/mm，例如10至170g/mm、10至150g/mm、10至130g/mm、10至110g/mm、10至90g/mm、10至70g/mm、10至50g/mm或10至30g/mm；条件是第一和第二部分的机械强度不相同，即第一和第二部分的机械强度不同。优选地，第一部分的机械强度比第二部分的机械强度高至少5％，例如高至少10％、高至少15％、高至少20％、高至少25％、高至少30％。高至少35％、高至少40％、高至少45％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少100％、高至少200％或高至少400％。
在根据本发明的另一个实施方案中，第二部分的机械强度为10-190g/mm，且第一部分的机械强度比第二部分的机械强度高至少5％，例如高至少10％、高至少15％、高至少20％、高至少25％、高至少30％、高至少35％、高至少40％、高至少45％、高至少50％、高至少60％、高至少70％、高至少80％、高至少90％、高至少100％、高至少200％或高至少400％。根据实施例5中所述的方法测量机械强度。
在根据本发明的另一个实施方案中，第二部分的机械强度为10至190g/mm，并且第一部分的机械强度高于第二部分的机械强度。通过实施例5中所述的方法测量各部分的机械强度。
在根据本发明的另一个实施方案中，第二部分的机械强度为10-190g/mm且第一部分的机械强度为10-190g/mm，条件是第一部分和第一部分具有不同的机械强度。通过实施例5中所述的方法测量各部分的机械强度。
在根据本发明的另一个实施方案中，第一部分的机械强度：第二部分的机械强度的比为1.1至20，例如1.2至20、1.3至20、1.4至20、1.5至20、1.6至20、1.7至20、1.8至20、2至20、4至20或8至20。如果第一部分的机械强度为40g/mm且第二部分的机械强度为20g/mm，则第一部分的机械强度：第二部分的机械强度的比为2。可以理解的是，第一部分的机械强度高于第二部分的机械强度。
根据本发明的基质包含离子交联的聚合物。基质可包括其他有机聚合物(无论是天然存在的还是合成的，以及无论是均聚物或共聚物)。优选地，基质是生物相容性基质，例如生物相容性聚合物基质，意味着基质通过了适当的用于短期或长期毒性的生物学试验。在根据本发明的一个实施方案中，基质不包括其他聚合物，特别是其他离子交联的聚合物。
术语“可离子交联的聚合物”是指其直链或支链大分子可通过离子键彼此连接以形成三维聚合物网络的聚合物。一旦可离子交联的聚合物通过离子键彼此连接，该聚合物被称为离子交联的聚合物。
可离子交联的聚合物本质上可以是阴离子或阳离子的，并且可以包括但不限于羧酸、硫酸盐，以及胺官能化聚合物，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺，多糖如海藻酸、果胶酯酸、羧甲基纤维素、透明质酸、肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸肝素、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉，及其盐。优选的可离子交联的聚合物是海藻酸、果胶酯酸、羧甲基纤维素、透明质酸、壳多糖，及其盐。最优选的可离子交联的聚合物是海藻酸及其盐，例如海藻酸盐且特别是海藻酸钠。
交联离子通常分为阴离子或阳离子。合适的交联离子包括但不限于包含选自以下的离子的阳离子：钙离子、镁离子、钡离子、锶离子、硼离子、铍离子、铝离子、铁离子、铜离子、钴离子、铅离子和银离子，以及选自以下的阴离子：磷酸根离子、柠檬酸根离子、硼酸根离子、琥珀酸根离子、马来酸根离子、己二酸根离子和草酸根离子。更广泛地，阴离子衍生自多元有机酸或无机酸。优选的交联阳离子是钙离子、钡离子、铁离子和铝离子。最优选的交联阳离子是钙。
在根据本发明的一个实施方案中，交联离子是二价离子，例如钙离子或钡离子，并且可离子交联的聚合物是海藻酸盐，例如海藻酸钠。
海藻酸盐是1，4-连接的-β-D-甘露糖醛酸和α-L-古洛糖醛酸的阴离子共聚物。各种形式的海藻酸盐可商购获得。这些形式通常是60％的1，4-连接的-β-D-甘露糖醛酸和40％的α-L-古洛糖醛酸；或30％的1，4-连接的-β-D-甘露糖醛酸和70％的α-L-古洛糖醛酸。
在根据本发明的一个实施方案中，离子交联的聚合物是海藻酸盐，其具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基。在具体的实施方案中，离子交联的聚合物是海藻酸盐，其包括＞50％的古洛糖醛酸残基，例如＞60％的古洛糖醛酸残基，＞70％的古洛糖醛酸残基或＞80％的古洛糖醛酸残基。基于海藻酸盐聚合物中残基的总数计算百分比。具有100个古洛糖醛酸残基和400个甘露糖醛酸残基的离子交联的聚合物由20％古洛糖醛酸残基和80％甘露糖醛酸残基组成。
海藻酸盐被广泛使用，例如在食品工业中，用作例如稳定剂以及用于粘度控制，在制药和化妆品工业中，用作例如崩解剂。出于各种目的，可以获得分别富含古洛糖醛酸或甘露糖醛酸的两种海藻酸盐(Mancini等人，(1999)，Journal of Food Engineering 39，369-378)以及用于生产富含古洛糖醛酸的海藻酸盐的各种方法是已知的，参见WO 8603781、US4,990,601、US 5,639,467)。
具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基的可离子交联的海藻酸盐是可商购的。一个实例是可从FMC Biopolymer AS，Drammen，Norway获得的PROTANAL LF 10/60，其古洛糖醛酸含量为约70％。
在根据本发明的一个优选实施方案中，本发明的缓释组合物提供待释放的物质的持续释放。术语“持续释放”的含义是指随着时间的推移越来越多的物质被释放的情况，即在开始释放和完成之间的时间内不存在没有物质释放的时间点。为了确保物质持续释放，在从开始释放到完成期间，应始终存在至少有一个部分是释放物质的。
认为缓释组合物的所有部分同时开始溶解，但溶出速率通常根据每个部分的机械强度而变化。具有最低机械强度的部分将具有最高的溶出速率，而具有最高机械强度的部分将具有最低的溶出速率，条件是这些部分具有相同的形状和体积尺寸。如果在每个部分中待释放的物质的密度/浓度相同并且所有部分具有相同的形状和体积尺寸，则可以在一定程度上预期缓释组合物从开始到完成提供降低的释放速率，即，与完成时的释放速率相比，释放开始时的释放速率更高。这种效果可以通过以下来解释，例如由于在高机械强度的部分中具有更高密度的待释放的物质，或者由于在高机械强度的部分中增加缓释组合物的表面积。
为了说明的目的，参考具有三个不同机械强度的部分的缓释组合物，其中各部分之间的机械强度的差异很高。每个部分具有相同的形状和体积尺寸，并且每个部分中待释放的物质的密度/浓度是相同的。认为所有部分同时开始溶解，但各部分之间的溶出速率将根据每个部分的组合物的机械强度而变化。机械强度最低的部分具有最高的溶出速率。由于每个部分中待释放的物质的密度/浓度相同，因此机械强度最低的部分每单位时间将比其他部分释放更多的物质。因此，当机械强度最低的部分已经完全溶解时，可以预期从缓释组合物中释放的速率将降低。当下一部分完全溶解时，可能预计释放速率将进一步下降。
只要缓释组合物每单位时间释放足够量的物质以确保达到所需的结果，上述效果就没有实际意义。但是，如果出于某种原因，应该希望确保从开始到完成接近恒定的释放速率，上述效果可以通过以下来解释，例如确保i)具有较高机械强度的部分比具有较低机械强度的部分的待释放的物质的密度/浓度更高；和/或ii)具有较高机械强度的部分比具有较低机械强度的部分具有更大的表面积。
具有高机械强度和高密度/浓度的待释放的物质的部分可与具有低机械强度和低密度/浓度的待释放的物质的部分具有相同的释放速率。类似地，具有高机械强度和大的表面积的部分可以与具有低机械强度和小的表面积的部分具有相同的释放速率。
本文提及的术语“释放速率”旨在表示每单位时间从缓释组合物释放的“待释放的物质”的量。释放速率从释放开始到完成(即直到缓释组合物的所有部分已经完全溶解)可以是恒定的、波动的或变化的。
在根据本发明的一个实施方案中，释放速率从释放开始到完成基本恒定。在根据本发明的另一个实施方案中，所述第一和第二部分的释放速率基本相同，更优选所有部分的释放速率基本相同。在根据本发明的另一个实施方案中，释放速率从释放开始到完成波动或变化。
与缓释组合物是否提供从释放开始直至完成的基本恒定的释放速率、波动的释放速率或变化的释放速率无关；优选缓释组合物在至少1小时，例如至少5小时、至少10小时、至少12小时、至少18小时、至少24小时，如至少48小时的时间内提供待释放的物质的持续释放。
在根据本发明的一个实施方案中，缓释组合物的离子交联的海藻酸盐不是通过使包含海藻酸盐的组合物与多价的，特别是二价(例如钡、钙或镁)或三价阳离子(例如铝或铬)盐接触而获得的，所述盐在水中(25℃，pH＝7)的溶解度高于1g/L，如高于10g/L或高于100g/L。CaCl2和BaCl2在水中的溶解度(25℃，pH＝7)分别约为811g/L和358g/L。
在根据本发明的优选实施方案中，本发明的缓释组合物的离子交联的海藻酸盐通过使包含海藻酸盐的组合物与多价，特别是二价(例如钡、钙或镁)或三价阳离子(例如铝或铬)盐接触而获得，所述盐在水中(25℃，pH＝7)的溶解度低于1g/L，如水溶解度低于0.5g/L、低于0.05g/L或低于0.04g/L。CaCO3和BaCO3在水中的溶解度(25℃，pH＝7)分别约为0.013g/L和0.024g/L。
在根据本发明第一方面的一个实施方案中，本发明的缓释组合物的离子交联的海藻酸盐通过使包含海藻酸盐的组合物与惰性交联剂(如下面关于本发明第二方面所述)接触而获得。应理解的是，提及本发明第二方面的惰性交联剂的所有段落也与本发明第一方面相关。
在根据本发明第一方面的另一个实施方案中，本发明的缓释组合物的离子交联的海藻酸盐不是通过使包含海藻酸盐的组合物与速效交联剂如易于溶解的钡、钙或镁盐；或易于溶解的多价阳离子(如三价阳离子，特别是铝或铬阳离子)盐接触而获得的。
在根据本发明第一方面的另一个实施方案中，本发明的缓释组合物的离子交联的海藻酸盐是通过使包含海藻酸盐的组合物与多价阳离子(特别是二价阳离子如钡、钙或镁离子，或三价阳离子如铝或铬离子)源接触而获得。所述多价阳离子源优选是以确保当引入溶液时阳离子从多价阳离子源缓释的形式。
在根据本发明第一方面的另一个实施方案中，本发明的缓释组合物的离子交联的海藻酸盐是通过使包含海藻酸盐的组合物与多价阳离子(特别是二价阳离子如钡、钙或镁离子，或三价阳离子如铝或铬离子)源接触而获得。
在一个优选的实施方案中，本发明涉及缓释组合物，其包含埋入基质中的待释放的物质，所述基质包含离子交联的聚合物并且含有具有不同机械强度的至少第一和第二部分；其中
-待释放的物质是精子；和
-离子交联的聚合物是二价阳离子交联的海藻酸盐，例如Ca2+交联的海藻酸盐，所述海藻酸盐具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基。
本发明的第二方面涉及制备本发明第一方面的缓释组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
-将待释放的物质与包含可离子交联的海藻酸盐的组合物混合，从而形成预混合物；
-使预混合物与惰性交联剂和活化剂组合物接触；和
-使离子和可离子交联的海藻酸盐形成离子交联的海藻酸盐，从而得到本发明第一方面的缓释组合物；
其中，
可离子交联的海藻酸盐具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基；
惰性交联剂能够在活化时释放离子，所述离子适用于交联可离子交联的海藻酸盐；和
所述活化剂组合物包含一种或多种能够活化惰性交联剂的化合物。
根据本发明第二方面的方法的第一步包括将待释放的物质与包含可离子交联的聚合物的组合物混合，从而形成预混合物。
在根据本发明的一个实施方案中，待释放的物质选自生物学物质(例如细胞，特别是干细胞)、治疗剂、诊断剂或其任何混合物。在根据本发明的一个优选实施方案中，待释放的物质是精子。
术语“可离子交联的聚合物”是指其直链或支链大分子可通过离子键彼此连接以形成三维聚合物网络的聚合物。
可离子交联的聚合物本质上可以是阴离子或阳离子，并且可以包括但不限于羧酸、硫酸盐，以及胺官能化聚合物，如聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚乙烯胺，多糖如海藻酸、果胶酯酸、羧甲基纤维素、透明质酸、肝素、壳聚糖、羧甲基壳聚糖、羧甲基淀粉、羧甲基葡聚糖、硫酸肝素、硫酸软骨素、阳离子瓜尔胶、阳离子淀粉，及其盐。优选的可离子交联的聚合物是海藻酸、果胶酯酸、羧甲基纤维素、透明质酸、壳多糖，及其盐。最优选的可离子交联的聚合物是海藻酸及其盐，例如海藻酸盐且特别是海藻酸钠。
在根据本发明的一个实施方案中，离子交联的聚合物是海藻酸盐，其具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基。在具体的实施方案中，离子交联的聚合物是海藻酸盐，其包含＞50％的古洛糖醛酸残基，例如＞60％的古洛糖醛酸残基、＞70％的古洛糖醛酸残基或＞80％的古洛糖醛酸残基。
根据本发明第二方面的方法的第二步包括使第一步的产物与惰性交联剂和活化剂组合物接触。
术语“惰性交联剂”是指需要通过活化剂组合物活化以便能够释放离子的化合物，所述离子适合用于交联可离子交联的海藻酸盐。如果惰性交联剂未被活化剂组合物活化，则惰性交联剂不能释放适用于交联可离子交联的海藻酸盐的离子。换句话说，如果在不存在活化剂组合物的情况下在中性pH下将“惰性交联剂”与海藻酸钠溶液混合，则不形成离子交联的海藻酸盐。但是，如果在活化剂组合物存在下将“惰性交联剂”与海藻酸钠溶液混合，将形成离子交联的海藻酸盐。惰性交联剂通常是当与在25℃下，pH＞8的水接触时不释放离子的化合物；离子适合用于于交联可离子交联的海藻酸盐。因此，根据本文提供的定义，CaCl2和BaCl2不是惰性交联剂，而CaCO3和BaCO3是惰性交联剂的实例。
在根据本发明的一个实施方案中，惰性交联剂是二价阳离子盐，其在水(25℃，pH＝7)中的溶解度低于1g/L，例如水溶解度低于0.5g/L、低于0.05g/L或低于0.04g/L。满足这些要求的二价阳离子盐的实例是二价阳离子碳酸盐，例如CaCO3和BaCO3。最优选地，“惰性交联剂”是CaCO3。
在根据本发明的一个实施方案中，惰性交联剂是响应于pH降低而释放离子(例如阳离子，特别是二价阳离子)的化合物。二价阳离子碳酸盐，例如CaCO3或BaCO3，是响应于pH降低而释放离子的惰性交联剂的实例。
术语“活化剂组合物”是指包含一种或多种能够活化惰性交联剂的化合物的组合物。当惰性交联剂被活化时，适用于交联可离子交联的海藻酸盐的离子将从活化的交联剂中释放出来。
如果惰性交联剂是CaCO3，则活化剂组合物可以是能够与CaCO3相互作用，使得游离钙离子从碳酸盐中释放出来的任何组合物。
能够活化CaCO3的活化剂组合物的一个实例是包含GDL的组合物。GDL是一种简单的有机分子，其在溶液中缓慢水解形成葡萄糖酸。该水解导致溶液pH逐渐降低，直至可以由二价阳离子碳酸盐(如CaCO3或BaCO3)释放活性离子形成碳酸以诱导海藻酸盐凝胶化的点。GDL水解(并因此开始凝胶化)的速率，可以通过例如改变溶液的温度来改变。随着凝胶化在活化的交联剂-海藻酸盐接触表面上进行，交联的海藻酸盐大分子的体积将减少，这反过来又降低了海藻酸盐溶液剩余部分中的有效浓度。该过程在胶凝化过程中持续，结果产生异质水凝胶，在活化的交联剂-海藻酸盐接触表面上具有更高浓度的海藻酸盐。
活化剂组合物的另一个实例记载于WO2013/076232中，其通过引用整体纳入本文。所述文献中公开的活化系统涉及使用水解酶和可被水解酶水解的底物。如果可被水解酶水解的底物与惰性交联剂一起存在，则水解酶可被认为是活化剂组合物。如果水解酶与惰性交联剂一起存在，则可以认为可被水解酶水解的底物构成活化剂组合物。如果水解酶和可被水解酶水解的底物都不与惰性交联剂一起存在，则认为水解酶和可被水解酶水解的底物构成活化剂组合物。因此，活化剂组合物可以直接活化惰性交联剂或引发一系列导致惰性交联剂活化的事件。
如本文所用的术语“水解酶”意指包括能够在将包含底物的溶液与包含水解酶的另一种溶液混合时产生H3O+的水解酶。根据本发明的一个实施方案，水解酶是脂肪酶。根据本发明的另一个实施方案，脂肪酶是酰基水解酶，更优选三酰基甘油脂酶，例如从酵母皱落念珠菌(Candida rugosa)分离出的三酰基甘油脂酶。合适的脂肪酶可自Sigma-AldrichCo.LLC(L1754-型VII或L3001型I，CAS编号9001-62-1)获得。
应当理解，根据本发明可以使用在与其底物结合时产生H3O+的任何水解酶。因此，可以使用的水解酶可以选自羧酸酯水解酶、草酰乙酸酶、糖苷酶、醚水解酶和作用于碳-氮键而不是线性酰胺中的肽键的水解酶，例如壳多糖脱乙酰酶。
羧酸酯水解酶的非限制性实例是羧酸酯酶、三甘油脂肪酶、乙酰酯酶、甾醇酯酶、L-阿拉伯糖酸内酯酶、葡糖酸内酯酶、酰基甘油脂肪酶、g-乙酰葡萄糖脱乙酰酶、脂蛋白脂肪酶、脂肪酰乙酯合酶、聚(3-羟基丁酸酯)解聚酶和二酰基甘油酰基水解酶。草酰乙酸酶的非限制性实例是富马酰乙酰基乙酰酶、酰基丙酮酸水解酶和乙酰丙酮酸水解酶。
糖苷酶的非限制性实例是α-葡糖醛酸糖苷酶。醚水解酶的非限制性实例是异分支酸酶。
用于形成根据本发明的基质的底物是在与酶结合后产生H3O+的底物。因此，底物可以取决于根据本发明使用的水解酶的类型而变化。
根据本发明的合适的底物是有机酸(如羧酸)的酯。
根据本发明的一个实施方案，所述底物是式I的化合物：
其中R1、R2和R3独立地是相同的或不同的，并且代表直链或支链、取代或未取代的C1-C12烷基羰基链，例如，甲酮、乙酮、丙酮、丁酮、戊酮、己酮、庚酮、辛酮、壬酮、癸酮、十二酮等。根据一个实施方案，R1、R2和R3各自为甲酮。根据另一个实施方案，R1、R2和R3各自为乙酮。根据另一个实施方案，R1、R2和R3为丙酮。当使用三酰基甘油脂肪酶作为根据本发明的水解酶形成基质时，式I的底物特别有用。结合后，所述式I的酯分解成甘油和羧酸，即由此得到H3O+。
烷基羰基链可以是支化或未支化的。此外，烷基羰基链可以是取代的或未取代的。基于本文的教导，技术人员将认识到可以使用由式I涵盖的各种底物，并且可以基于本文的教导选择根据本发明待使用的合适的底物。因此，技术人员将认识到烷基链长度可以变化而不影响酶产生甘油和底物的羧酸的能力，从而导致H3O+离子的释放。
根据本发明的一个优选实施方案，所述底物选自下式的三乙酸甘油酯、三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯：
因此，根据一个实施方案，R1、R2和R3代表C1-C4烷基羰基。
根据本发明的另一个实施方案，存在的底物选自三丙酸甘油酯和三丁酸甘油酯。
根据本发明，水解酶和上面定义的底物的混合导致H3O+的产生。所述H3O+还导致从惰性交联剂中释放离子。
即使水解酶不直接活化惰性交联剂，仍然认为表示作为水解酶的活化剂组合物引发一系列导致惰性交联剂活化的事件。
因此，在根据本发明的一个实施方案中，活化剂组合物直接活化惰性交联剂。这种活化剂组合物的实例是酸，例如盐酸。
在根据本发明的一个优选实施方案中，活化剂组合物通过引发一系列导致惰性交联剂活化的事件而间接活化惰性交联剂。这种活化剂组合物的一个实例是水解酶，其水解底物，导致酸的形成，酸又与CaCO3相互作用，导致从所述碳酸盐中释放游离钙离子。间接活化惰性交联剂的活化剂组合物的另一个实例是GDL，其需要在能够活化惰性交联剂之前水解成酸形式。
当制备本发明的缓释组合物时，优选使用间接活化惰性交联剂的活化剂组合物。通过使用间接活化惰性交联剂的活化剂组合物，可以控制活化速率，从而确保凝胶化不会发生得太快。
在根据本发明的一个实施方案中，惰性交联剂和/或活化剂组合物是以固体形式。
在根据本发明的一个实施方案中，活化剂组合物直接活化惰性交联剂或引发一系列导致惰性交联剂活化的事件。
在根据本发明的一个实施方案中，活化剂组合物包含水解酶，并且预混合物还包含可被水解酶水解的底物；或者预混合物还包含水解酶，并且活化剂组合物包含可被水解酶水解的底物。
在根据本发明的一个优选实施方案中，
-待释放的物质是精子；
-惰性交联剂是二价阳离子碳酸盐，例如CaCO3、BaCO3或其任何混合物；
-惰性交联剂是以固体形式；和
-活化剂组合物包含水解酶，预混合物还包含可被水解酶水解的底物；或
预混合物还包含水解酶，活化剂组合物包含可被水解酶水解的底物；或
活化剂组合物包含GDL。
本发明的第三方面涉及一种缓释组合物，优选根据本发明第一方面的缓释组合物，其可通过根据本发明第二方面的方法获得。
本发明的第四方面涉及一种容器，例如授精吸管或授精管，其包含根据本发明第一方面的缓释组合物或根据本发明第三方面的缓释组合物；其中待释放的物质优选是精子。
在根据本发明的一个实施方案中，所述容器是授精吸管(1)，其包括在第一端(2)和第二端(3)之间延伸的管，并且包括透气的液密塞(4)，所述塞设置在管的第一端附近并在第一端(朝向管的第一端(2))和第二端(朝向管的第二端(3))之间延伸。
在根据本发明的第二个实施方案中，所述容器是授精管(1)，其包括在第一端(2)和第二端(3)之间延伸的管。适用于像猪这样的动物的授精的授精管不具有透气的液密塞，如关于适于像牛这样的动物的授精的授精吸管所提及的透气的液密塞。
本发明的第五方面涉及根据本发明的第一方面的缓释组合物或根据本发明的第三方面的缓释组合物在动物繁殖中的用途，其中待释放的物质是精子。
已经概括性地描述了本发明，通过参考某些具体实施例可以获得进一步的理解，在本文中提供这些实施例仅出于说明的目的，并且除非另有说明，否则不旨在是限制性的。
实施例
实施例1：在授精吸管内具有不同机械强度的海藻酸盐凝胶中的牛精子制备
材料
使用以下化学品：来自Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)的三羟甲基氨基甲烷(Trizma)盐酸盐、EDTA、D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯、NaHCO3、NaCl、甘油(＞99％)、果糖和柠檬酸钠。来自Apro(奥斯陆，挪威)的葡萄糖无水物。来自Brenntag Specialties(SouthPlainfield，USA)的ViCality AlbaFil和ViCality超重碳酸钙和来自NovaMatrix，FMCBioPolymer AS(Sandvika，挪威)的海藻酸钠。
精子来源
在挪威的Stange的Store Ree和特隆赫姆的的Geno工厂收集了牛的精子。
缓冲液
使用以下增量剂溶液：
-第一次稀释精子的增量剂：1.45g l-1三羟甲基氨基甲烷盐酸葡萄糖、0.4g l-1柠檬酸钠、1g l-1果糖和200ml l-1蛋黄。通过加入NaOH将溶液的pH调节至6.4。
-第二次稀释精子的增量剂溶液：1g l-1ViCality Albafil碳酸钙、54g l-1果糖、170g l-1甘油和10g l-1海藻酸钠。两种增量剂均含有标准抗生素混合物，其至少提供EUdir 88/407中要求的最终浓度。
制备包含精子的缓释组合物
在Geno工厂收集牛精子。收集后立即将精子在增量剂溶液中稀释至浓度为133×106个细胞/ml，进行第一次稀释。然后将所得的含有精子的溶液冷却至4℃。冷却至4℃后，将溶液与等体积的增量剂溶液混合进行二次稀释。
用5mg D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯或5mg D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯和ViCality超重CaCO3的比例为1∶1的混合物填充授精吸管。含有D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯或D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯和CaCO3的粉末放置在授精吸管中密封塞的液体侧。然后将含有精子的溶液转移到授精吸管中并在4℃下平衡约6小时。将授精吸管转移至N2-冷冻器中，并在4℃下在平衡期后根据公牛精液的标准程序进行冷冻。
实施例2：评估运动性、机械强度和pH
根据实施例1中所述的方法制备的冷冻精液吸管通过将吸管保持在37℃的水浴中30秒来解冻。将解冻的授精吸管内的凝胶切成四等份，并在四个切片的每一个中检查精子的机械强度、pH和运动性。
使用显微镜评估评价精子的运动性。在测量运动性之前，通过将授精吸管的内容物加入到在Eppendorf管中的0.9ml改良的IVT溶液中并将管在管式翻转器上小心摇动约10分钟，从而将海藻酸盐凝胶在改良的IVT溶液(3g l-1葡萄糖，20g l-1柠檬酸钠，2.1g l- 1NaHCO3，1.16g l-1NaCl，3g l-1EDTA，pH 7.35)中液化。在评估运动性之前，将管在37℃的加热块中预热至少15分钟。将约3μl的溶液加入预热的显微镜载玻片中并立即用光学显微镜检查。每个样本中活动精子的数量估计为最接近的5％区间。
在授精吸管内形成的所有4个部分的凝胶中，大约50-60％的精子是活动的。然而，在四个部分中观察到机械强度的显著差异。在距离CaCO3/D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯粉末位于吸管内所在的位置最远的部分接近液态，而在靠近粉末所在的位置的部分中观察到刚性凝胶。在吸管的中间部分观察到不同的机械强度，在距离粉末所在的位置最远的部分中观察到最弱的机械强度。在所有4个部分中测量pH，并且pH从在距粉末在吸管中所在的位置最远的部分中的7.4变化到最接近粉末在授精吸管内所在的位置的部分中的6.8。
实施例3：评估海藻酸盐凝胶的不同部分的精子质量
通过将吸管保持在37℃的水浴中30秒将冷冻的精液吸管(根据如表1所示的修改的实施例1中所述的方法制备)解冻。将解冻的授精吸管内的凝胶切成四个相等的部分，并且对距离CaCO3/D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯粉末位于吸管内所在的位置的最远的部分和紧邻CaCO3/D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯粉末位于吸管内所在的位置的部分通过流式细胞术(BDAccuriTM C6细胞计数器，Franklin Lakes，新泽西州，美国)分析活力和顶体完整性，并且通过CASA(精子类分析仪，SCA，Microptic，S.L.；巴塞罗那，西班牙)分析运动性和进行性运动性。将来自每个实验的吸管中位置相同的两个凝胶部分在位于Eppendorf管中的200μl稀释缓冲液(4.271g 1-1NaCL，4.771g l-1HEPES(MW 238.3)，5.21 1g l-1HEPES盐(MW260.29)，3.01g l-1葡萄糖，101g l-1柠檬酸钠，1.51g l-1EDTA，pH 7.4，渗透压313)中混合。在流式细胞术和CASA分析之前，将管在37℃下小心混合15min。CASA分析在上述稀释缓冲液中以及在800xg下离心5min后进行，并在相同量的预热TALP缓冲液(20mM HEPES，20mMHEPES盐，87mM NaCl，3.1Mm KCl，0.4mM MgCl2，0.3mM HaH2PO4，2mM CaCl2，1mM NaPyr，10mMNaHCO3，21.6mM乳酸钠，5mM葡萄糖，50μg/ml庆大霉素，6mg/ml BSA，osm 292pH 7.4)中溶解丸粒(pellet)。
通过CASA评估运动性和进行性运动性
将每个精液样品轻轻倾斜五次，然后将3μl的等分试样加载到预热的Leja载玻片(Leja BV，Nieuw Vennep，The Netherlands)中。在SCA(精子类分析仪，Microptic，Barcelona，Spain)上平行分析每个精液样品。相差显微镜在38℃和100×放大倍数下提供预热阶段。每个平行分析的精子数量至少为600个精子细胞。通过30-70μm2的头部面积鉴定精子细胞。总运动性定义为精子细胞的百分比，平均VCL＞15μm/s。进行性定义为高于70％STR。
对于来自距粉末最远的部分的精子细胞，初始平均百分比(SD)运动性和进行性运动性为45(7)和36(6)，对于来自距粉末在吸管中所在的那一端最近的部分的精子细胞分别为51(16)和39(15)。在TALP缓冲液中，趋势是相同的。
通过流式细胞术评估活力和顶体完整性(AccuriC6)
对于死亡的精子细胞，将样品用碘化丙啶(PI，P4864，Sigma-Aldrich)染色，对于顶体反应的精子细胞，将样品用与488(PNA-Alexa 488，L21409，Invitrogen)缀合的Arachis hypogaea(花生)的凝集素PNA染色。另外，将精子用Mitotracker Orange(MO，M7510，Invitrogen)染色。简言之，将精子细胞在PBS中稀释至浓度为1-2百万精子/ml(38℃)，荧光探针的最终浓度为0.15μM MO、7.5μM PI和0.05μg/mlPNA-Alexa 488。在流式细胞术分析之前，将精子样品在室温下温育15分钟。使用配备有蓝色激光(488nm)和红色激光(633nm)、两个光散射检测器和四个具有滤光器的荧光检测器(FL1-4：533/30，585/40，670LP，675/25)的流式细胞仪(BD AccuriTM C6 Cytometer，Franklin Lakes，New Jersey，USA)进行精子细胞分析。每天运行所有四个荧光通道FL1-4的验证珠(Spherotech 8-峰验证珠(FL1-FL3)和Spherotech 6-峰验证珠(FL4)，BDBiosciences，Franklin Lakes，New Jersey，USA)。与在FL3(670LP)中的PI(由488激光激发)组合的在FL2中的MO(由488激光激发)鉴定出精子细胞。PNA-Alexa 488被488激光激发并在FL1(533/30)中检测到。通过运行未染色和单染色样品进行补偿控制。对于每个样品，在300至500个精子/秒的流速下评估至少6000个独立精子。使用BD Accuri C6软件分析流式细胞术数据。
对于来自距离粉末最远的部分的精子细胞，平均百分比(SD)顶体完整的活的(AIL)精子细胞为37(6)，对于来自距离粉末在吸管中所在的那一端最近的部分的精子细胞为37(4)。
实施例4：溶出速率的评估
通过将吸管保持在37℃的水浴中30秒将冷冻的精液吸管(根据如表2所示的修改的实施例1中所述的方法制备)解冻。将解冻的授精吸管内的凝胶切成三个相等的部分，并且对距离CaCO3/D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯粉末在吸管内所在的位置最远的部分和紧邻CaCO3/D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯粉末在吸管内所在的位置的部分进行体外溶出速率的分析。
在不存在钙的情况下体外评估溶出速率
将3cm的精液吸管从每个末端转移至在15ml Falcon管中的3ml预热缓冲液(133mMNaCl，3.5mM KCl，1.5mM MgSO4×7HO，4mM KH2PO4，3.5mM葡萄糖，20mM HEPES，0.1mM NaPyr，1.1mM NaLactat，1μg/ml庆大霉素)中，并非常温和地倾斜在38℃温育(PMR-30，Grant，England)，以观察溶出速率。凝胶首先变薄，然后溶解成几个部分。当来自授精吸管的所有凝胶溶解成小颗粒，并且所有部分的尺寸小于1mm时，凝胶被认为是溶解的。分析来自每次处理的两个样品。如表2所示，距离粉末最远的凝胶在8分钟内溶解，而最接近粉末的凝胶在8X至18X较长时间(59-140分钟)后溶解，符合较长的溶出速率。
在钙存在下体外评估溶出速率
将3cm的精液吸管从每个末端转移至在15ml Falcon管中的3ml预热缓冲液(0.2mMCaCl2，133mM NaCl，3.5mM KCl，1.5mM MgSO4×7HO，4mM KH2PO4，3.5mM葡萄糖，20mM HEPES，0.1mM NaPyr，1.1mM NaLactat，1μg/ml庆大霉素)中，并非常温和地倾斜在38℃温育(PMR-30，Grant，England)，以观察溶出速率。1小时后，第1部分由几个小片组成，而第2部分仍然是凝胶。3小时后，第1部分溶解，同时将第2部分分解成片。第2部分在一段时间内变为更加溶解的，但在24小时后仍未完全溶解。
体外溶出速率取决于钙离子的浓度。通过增加缓冲液中的钙浓度，凝胶的溶解时间也增加，但具有不同凝胶强度的凝胶之间的差异保持不变。
已知离子(包括钙和镁)在输卵管和子宫液的形成中起重要作用(vet.2012Spring；3(2)：137-141)。它们通过子宫的上皮细胞进入生殖道的内腔中，引起浓度梯度，这反过来引起渗透梯度，提供驱动力，以通过渗透将水从上皮细胞输送到子宫腔中。因此，似乎很清楚的是，生殖道中钙离子的存在将影响海藻酸钙在体内情况下的溶出速率。为了进一步研究这一点，已经进行了实验以研究在接近体内环境中的海藻酸钙溶出速率。
“类似体内”评估溶出速率
还在更多类似体内条件下评估凝胶的溶解。在屠宰场收集来自母牛的繁殖器官(接近排卵时间)。用剪刀打开子宫，如上所述制备的精液吸管作为细绳定位在子宫中。关闭子宫并在室温下温育过夜。20小时后，凝胶的第1部分几乎完全溶解，而第2部分仍然是坚固且透明的凝胶。
实施例5：用固定的精子细胞测定不同海藻酸盐凝胶的机械强度
材料
使用以下化学品：来自Sigma-Aldrich(St.Louis，USA)的三羟甲基氨基甲烷(Trizma)盐酸盐、EDTA、D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯、NaHCO3、NaCl、甘油(＞99％)、果糖和柠檬酸钠。来自Apro(奥斯陆，挪威)的葡萄糖无水物。来自KSL staubtechnik gmbh(Lauingen，德国)的Eskal500碳酸钙和来自NovaMatrix，FMC BioPolymer AS(Sandvika，挪威)的海藻酸钠(UP LVG和UP VLVG)。标准授精吸管0.25ml(法国迷你吸管(IMV，L′Aigle，法国))。
精子来源
在挪威的Stange的Store Ree和特隆赫姆的的Geno工厂收集了牛的精子。
缓冲液
使用以下增量剂溶液：
第一次稀释精子的增量剂：1.45g l-1三羟甲基氨基甲烷盐酸葡萄糖、0.4g l-1柠檬酸钠、1g l-1果糖和200ml l-1蛋黄。通过加入NaOH将溶液的pH调节至6.4。
第二次稀释精子的增量剂溶液：0.5g l-1Eskal500碳酸钙，54g l-1果糖，170g l-1甘油和12g l-1海藻酸钠(UP LVG和UP VLVG的混合物)。两种增量剂均含有标准抗生素混合物，至少提供EU dir 88/407中要求的最终浓度。
公牛精子的稀释、固定和低温保藏
在Geno工厂收集牛精子。收集后立即将精子在增量剂溶液中稀释至浓度为133×106个细胞/ml，进行第一次稀释。然后将所得的含有精子的溶液冷却至4℃。冷却至4℃后，将溶液与等体积的增量剂溶液混合用于二次稀释。向混合物中加入D-(+)-葡萄糖酸δ-内酯至终浓度为55mM，以初始化胶凝，并填充在精液吸管上。将吸管在4℃下储存约4.5小时，并根据低温保藏的标准程序在液氮中冷冻。改变用于二次稀释的溶液中UP LVG和UP VLVG的比例，以产生具有不同机械强度的海藻酸盐凝胶。
评估机械强度
每次处理将10个冷冻精液的吸管在37℃下解冻1分钟，然后紧密接触并以金属板为中心来平行排列。使用配备有P/35探针(35mM DIA CYLINDER ALUMINUM)的质地分析仪TAXT Plus(Stable micro systems，Godalming，Surrey，UK)，以量化来自精液吸管的凝胶的机械强度。使用1kg测力传感器以0.1mm/s的测试速度进行测量(测试模式压缩)至80％应变(strain)。将机械强度量化为对抗凝胶变形的力的初始线性倾斜(在0.05至0.1mm之间)。通过如实施例1中的手动评估，表征为弱的或温和的来自吸管的凝胶的机械强度测量为43g/mm。通过人工评估表征为强的来自吸管的凝胶的机械强度测量为90g/mm。

Claims (16)

1.一种缓释组合物，其包含埋入基质中的待释放的物质，所述基质包含离子交联的聚合物并且含有具有不同机械强度的至少第一和第二部分；其中离子交联的聚合物是离子交联的海藻酸盐，所述海藻酸盐具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基。
2.权利要求1的缓释组合物，其中离子交联的海藻酸盐是二价阳离子交联的海藻酸盐。
3.权利要求1或权利要求2的缓释组合物，其中待释放的物质是精子。
4.权利要求1的缓释组合物，其中
第一部分的机械强度比第二部分的机械强度高至少10％，例如高至少20％；或
第二部分的机械强度范围为10至190g/mm，且第一部分的机械强度比第二部分的机械强度高至少10％，例如高至少20％；或
第二部分的机械强度范围为10至190g/mm，且第一部分的机械强度范围为10至190g/mm，条件是第一和第二部分具有不同的机械强度；或
第一部分的机械强度：第二部分的机械强度的比至少为1.1，例如至少为1.2。
5.制备权利要求1的缓释组合物的方法，所述方法包括以下步骤：
—将待释放的物质与包含可离子交联的海藻酸盐的组合物混合，从而形成预混合物；
—使预混合物与惰性交联剂和活化剂组合物接触；和
—使离子和可离子交联的海藻酸盐形成离子交联的海藻酸盐，从而得到权利要求1的缓释组合物；
其中，
可离子交联的海藻酸盐具有比甘露糖醛酸残基更多的古洛糖醛酸残基；
惰性交联剂能够在活化时释放离子，所述离子适用于交联可离子交联的海藻酸盐；和
所述活化剂组合物包含一种或多种能够活化惰性交联剂的化合物。
6.权利要求5的方法，其中待释放的物质是精子。
7.权利要求5的方法，其中惰性交联剂是二价阳离子碳酸盐，例如CaCO3、BaCO3或其任何混合物。
8.权利要求5的方法，其中惰性交联剂和/或活化剂组合物是以固体形式。
9.权利要求5的方法，其中活化剂组合物直接活化惰性交联剂，或引发导致惰性交联剂的活化的一系列事件。
10.权利要求5的方法，其中，
—使预混合物与惰性交联剂接触，然后加入活化剂组合物；或
—使预混合物与活化剂组合物接触，然后加入惰性交联剂；或
—使预混合物与活化剂组合物和惰性交联剂接触，并将活化剂组合物和惰性交联剂同时加入预混合物中。
11.权利要求5的方法，其中活化剂组合物包含葡糖酸-δ-内酯。
12.权利要求5的方法，其中活化剂组合物包含水解酶，并且预混合物还包含可被水解酶水解的底物；或者预混合物还包含水解酶，并且活化剂组合物包含可被水解酶水解的底物。
13.权利要求5的方法，其中
—待释放的物质是精子；
—惰性交联剂是二价阳离子碳酸盐，例如CaCO3、BaCO3或其任何混合物；
—惰性交联剂是以固体形式；和
—活化剂组合物包含水解酶，预混合物还包含可被水解酶水解的底物；或
预混合物还包含水解酶，活化剂组合物包含可被水解酶水解的底物；或
活化剂组合物包含葡糖酸-δ-内酯。
14.可通过权利要求5的方法获得的缓释组合物。
15.一种容器，其包含根据权利要求1的缓释组合物或根据权利要求14的缓释组合物；其中待释放的物质是精子。
16.根据权利要求1的缓释组合物或根据权利要求14的缓释组合物在动物繁殖中的用途，其中待释放的物质是精子。
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