JP5244597B2 - カルシリティック化合物またはカルシウム模倣性化合物を用いて腸液バランスを調節する方法 - Google Patents

Description

本発明は、全般に医薬の分野に関し、さらに詳細に腸液平衡障害の治療法および予防法ならびに腸液分泌および吸収の調節法に関する。

多くの腸の障害は、栄養、電解質および液体の吸収、ならびに廃棄物、過剰の電解質および液体の分泌に関与している腸管における液体バランスの細かく調整された機構における不均衡により、直接的または間接的にもたらされる。分泌および吸収は平行して行われるので、恒常性が維持される。このバランスは、下痢および便秘、ならびに吸収不良および同化不良障害の予防に重要である。

世界的に、下痢は毎年３から５百万人の命を奪い、これらのほとんどが幼児である。適切な水分補給により、これらの死のほぼ全てを予防することができる。より生活水準の高い国においてはこの発生率は遙かに低いが、下痢は、小児救急科を訪れる２つの最も一般的な原因のうちの１つであり、高齢者においてもよく起こる。ＡＩＤＳの患者における下痢および腸管感染症と同様に、子どもにおける下痢および腸管感染症は、腸の吸収面の著しい破壊、栄養失調および長期的結果、例えば、幼児における長期的成長障害および認知発達を伴い、およびＡＩＤＳの患者における抗レトロウイルス薬の吸収不良を伴う。下痢は旅行者が直面する最もありがちな健康問題の１つである。発展途上国への短期旅行者の最高４０％および長期旅行者の最高７０％が少なくとも１回の下痢の発作を経験する。

経口補水塩療法により、下痢による損失を取り戻すことができるが、これは分泌された体液の再吸収を促進せず、結果として下痢を軽減しない。抗生物質は多くの種類の下痢において効果が限定され、５日未満の下痢の治療には使用されるべきではない。さらに、多くの抗生物質は下痢を悪化させ得る。最後に、有効な経口ワクチンは、流行性伝染性下痢には入手可能でない。

便秘は米国における最も一般的な胃腸の病気であり、高齢者にとって特に関心事である。患者が肛門直腸疾患または憩室疾患を発症するまで気付かれないままであることが多い。人口の約２％が便秘の間欠的発現が持続的にまたは頻繁に起こると述べている。一般的な治療は、膨張性、刺激性および浸透圧性下剤、便軟化薬および潤滑剤を含む。しかしながら、下剤、特に刺激性下剤の常用は強く勧められない。

多くの疾患は、通常の吸収メカニズムが損なわれるような方法で胃腸の生理機能を直接的または間接的に変更し、その結果、１以上の食品成分の消化不良または吸収不良が起こる。典型的に、吸収不良は特定の糖、脂肪、タンパク質またはビタミンを吸収できないことであり、または食品の一般的な吸収不良であり得る。下痢、腫脹または筋けいれん、成長障害、頻繁な大量の糞便、筋肉疲労および膨張した腹部が吸収不良に付随して起こる。長期にわたる吸収不良の結果、栄養失調およびビタミン欠乏症が起こり得る。消化不良の患者の管理の根底には２つの基本原則、（１）栄養失調の矯正および（２）可能ならば、原因疾患（例えば、セリアック病、熱帯性スプルー、ホイップル病、膵機能不全および短腸症候群）の治療がある。しかしながら、吸収不良の根底にある疾患の治療が、例えば、疾患の診断が困難であるために難しいならば、消化不良疾患の患者は栄養失調の矯正に取り組む治療から恩恵を受ける。

本発明は、腸液平衡障害の治療または予防法および腸液分泌および吸収の調節法を提供する。

１つの態様において、本発明は、少なくとも１つのカルシウム模倣性またはカルシリティック（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃ）化合物を医薬的に許容される担体とともに含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象における腸液平衡障害を治療する方法を提供する。１つの態様において、腸液平衡障害は異常な腸運動であり得る。例えば、異常な腸運動は下痢であり得る。１つの態様において、下痢は、浸透圧性、分泌性、滲出性または急速通過性下痢であり得る。別の態様において、下痢は急性または慢性下痢であり得る。さらなる態様において、下痢は旅行者下痢症であり得る。下痢は、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）、シゲラ（Ｓｈｉｇｅｌｌａ）、サルモネラ（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ）、カンピロバクター・ジェジュニ（Ｃａｍｐｙｌｏｂａｃｔｅｒ ｊｅｊｕｎｉ）、ビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）、コレラ毒素（ＣＴＸ）；エルトール、ジアルジア症、エンタモエバ・ヒストリカ（Ｅｎｔａｍｏｅｂａ ｈｉｓｔｏｌｙｃａ）、クリプトスポリジウム・パルバム（ｃｒｙｐｔｏｓｐｏｒｉｄｉｕｍ ｐａｒｖｕｍ）；ノーウォークウイルス、ロタウイルス、アデノウイルス、カリチウイルス、アストロウイルスまたはエンテロウイルスを含む様々な感染体の１以上にさらされることにより引き起こされる。１つの態様において、下痢はサイクリックＡＭＰにより媒介される、またはサイクリックＧＭＰにおける上昇を伴う、または上昇から生じ得る。別の態様において、下痢は、下部消化管に影響を及ぼし得る１以上の非感染体、例えば、抗生物質、抗炎症薬、カフェイン、ステロイド、薬物または下剤にさらされることにより引き起こされ得る。さらに別の態様において、下痢は吸収不良または消化不良により引き起こされ得る。さらなる態様において、下痢はラクターゼ欠乏症または短腸症候群により引き起こされ得る。例えば、下痢は胃腸手術、例えば腹部手術に伴うものであり得、または化学療法、放射線治療、炎症または毒性外傷に伴うものであり得る。１つの態様において、対象は幼児または子どもであり得る。別の態様において、対象は成人または高齢者であり得る。

１つの態様において、本発明の方法の実施において用いられる化合物は、カルシウム模倣性であり得る。１つの態様において、カルシウム模倣性化合物は式Ｉ、

（式中、Ｘ_１、Ｘ_２、ｎおよびｍは詳細な説明において定義したとおりである。）の化合物、またはこの医薬的に許容される塩である。別の態様において、カルシウム模倣性化合物は、Ｎ−（３−［２−クロロフェニル］−プロピル）−Ｒ−α−メチル−３−メトキシベンジルアミンまたはこの医薬的に許容される塩であり得る。さらなる態様において、カルシウム模倣性化合物は式ＩＩ、

（式中、Ｒ^１、Ｒ^２、Ｒ^３、Ｒ^４、Ｒ^５およびＲ^６は、詳細な説明において定義したとおりである。）の化合物、またはこの医薬的に許容される塩であり得る。１つの態様において、カルシウム模倣性化合物は、Ｎ−（（６−（メチルオキシ）−４’−（トリフルオロメチル）−１ ，１’−ビフェニル−３−イル）メチル）−１−フェニルエタナミン、またはこの医薬的に許容される塩であり得る。別の態様において、カルシウム模倣性化合物は、ｃｉｎａｃａｌｃｅｔ ＨＣｌであり得る。１つの態様において、この化合物は、例えば、欧州特許第６３７，２３７号、第６５７，０２９号、第７２４，５６１号、第７８７，１２２号、第９０７，６３１号、第９３３，３５４号、第１，２０３，７６１号、第１，２３５ ７９７号、第１，２５８，４７１号、第１，２７５，６３５号、第１，２８１，７０２号、第１，２８４，９６３号、第１，２９６，１４２号、第１，３０８，４３６号、第１，５０９，４９７号、第１，５０９，５１８号、第１，５５３，０７８号；国際公開番号ＷＯ９３／０４３７３、ＷＯ９４／１８９５９、ＷＯ９５／１１２２１、ＷＯ９６／１２６９７、ＷＯ９７／４１０９０、ＷＯ０１／３４５６２、ＷＯ０１／９００６９、ＷＯ０２／１４２５９、ＷＯ０３／０９９７７６、ＷＯ０３／０９９８１４、ＷＯ０４／０１７９０８；ＷＯ０４／０９４３６２、ＷＯ０４／１０６２８０、米国特許第５，６８８，９３８号、第５，７６３，５６９号、第５，９６２，３１４号、第５，９８１，５９９号、第６，００１，８８４号、第６，０１１，０６８号、第６，０３１，００３号、第６，１７２，０９１号、第６，２１１，２４４号、第６，３１３，１４６号、第６，３４２，５３２号、第６，３６２，２３１号、第６，４３２，６５６号、第６，７１０，０８８号、第６，７５０，２５５号、第６，９０８，９３５号および米国特許出願公開番号２００２／０１０７４０６、２００３／０００８８７６、２００３／０１４４５２６、２００３／０１７６４８５、２００３／０１９９４９７、２００４／０００６１３０、２００４／００７７６１９、２００５／００３２７９６、２００５／０１０７４４８、２００５／０１４３４２６（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。）に開示されている化合物であり得る。

本発明の方法は、例えば、異常な腸運動が便秘である場合に実施できる。１つの態様において、便秘は過敏性腸症候群または腸運動障害を伴い得る。別の態様において、便秘は外部薬、例えば、アヘン剤、抗うつ剤、カルシウムまたは下剤の使用に起因し得る。さらなる態様において、便秘は病状、例えば、甲状腺機能低下症、抑鬱、ホルモンの不均衡、真性糖尿病、ヒルシュスプリング病、骨盤底の共同運動障害、血液供給の途絶、術後外傷、閉塞性病変、偽性閉塞または手術に起因し得る。別の態様において、便秘は、貧弱な食生活、コーヒー、茶、またはアルコールの濫用、不活動または運動不足に起因し得る。

１つの態様において、本発明の方法を実施するために使用される化合物はカルシリティックであり得る。例えば、本発明の方法の実施に有用なカルシリティック化合物は、欧州特許および公開番号６３７，２３７、７２４，５６１、９０１，４５９、９７３，７３０、１，２５８，４７１、１，４６６，８８８、１，５０９，５１８；国際公開番号ＷＯ９７／３７９６７、ＷＯ９９／５１５６９、ＷＯ０４／０１７９０８、ＷＯ０４／０４１７５５、ＷＯ０４／０４７７５１、ＷＯ０５／０３０７４６、ＷＯ０５／０３０７４９；米国特許第６，３９５，９１９号、第６，４３２，６５６号、第６，５２１，６６７号、第６，７５０，２５５号、第６，８１８，６６０号、第６，８６４，２６７号、第６，９０８，９３５号、第６，９１６，９５６号および米国特許出願公開番号２００２／００９９２２０、２００４／０００９９８０、２００４／００１４７２３、２００４／０１９２７４１および２００５／００３２８５０、２００５／００３２８５０（この開示は、参照により本明細書に組み込まれる。）において開示されているものである。

本発明はさらに、少なくとも１つのカルシウム模倣性またはカルシリティック化合物および医薬的に許容される担体を含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象における腸液分泌を調節する方法を提供する。１つの態様において、体液分泌は増大させることができ、投与される化合物はカルシリティック物質（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃ）であり得る。別の態様において、体液分泌は減少し、および／または液体の吸収は増加し、投与される化合物はカルシウム模倣性であり得る。これらの方法は、例えば、対象が手術の準備をされる場合に用いることができる。

本発明はまた、少なくとも１つのカルシウム模倣性またはカルシリティック化合物を医薬的に許容される担体とともに含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象の腸管における物質、例えば、薬物、毒または栄養の吸収または分泌の調節法を提供する。１つの態様において、薬物または栄養吸収は増大させることができる。１つの態様において、対象は栄養失調または同化不良に罹っていることがある。１つの態様において、化合物がカルシウム模倣性である。別の態様において、毒、薬物または栄養吸収は減少させることができる。例えば、使用される化合物はカルシリティック物質であり得る。

本発明はさらに、少なくとも１つのカルシウム模倣性またはカルシリティック化合物を医薬的に許容される担体とともに含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む、対象の同化不良または栄養失調の治療法も提供する。１つの態様において、同化不良は混合障害、膵機能不全、腸の胆汁酸塩濃度の減少、不適切な吸収面、粘膜吸収不良、胆汁酸塩の腸肝循環の途絶またはリンパ管の閉塞が原因であり得る。別の態様において、対象は栄養失調に罹っていることがある。

１つの態様において、対象は、ヒト、水生哺乳動物または非水生動物であり得る。

発明の詳細な説明
Ｉ．定義
本明細書において用いられる場合、「対象」なる用語は、治療を必要とする、ヒト、水生哺乳動物または非水性動物を意味することが意図される。この対象は、例えば、腸液平衡障害を有する、または発症のリスクがある。

疾患の「治療する」または「治療」は、（１）疾患を予防、すなわち、疾患を引き起こし得るまたは疾患に罹りやすくする疾患または状態にさらされ得るまたはさらされているが、疾患の症状を経験していないまたは示さない対象において、疾患の臨床症状を発現させないこと、（２）疾患の阻害、すなわち、疾患またはこの臨床症状のいずれかの発現を抑えるまたは軽減すること、または（３）疾患を軽減、すなわち、疾患またはこの臨床症状のいずれかの退縮を引き起こすこと、を含む。

「治療上有効な量」なる語句は、障害の重さおよび発生率の頻度における改善の目標を達成する本発明の化合物の量である。障害の重さにおける改善は、疾患の逆転ならびに疾患の進行の減速を含む。

本明細書において用いられる場合、「カルシウム感知受容体」または「ＣａＳＲ」とは、細胞外カルシウムおよび／またはマグネシウムレベルにおける変化に応答するＧタンパク質共役受容体をさす。ＣａＳＲの活性化は、タプシガルギン感受性細胞内貯蔵所からカルシウムを移動させ、および細胞膜における電位非感受性カルシウムチャンネルを通るカルシウム流入を増大させることにより、細胞質カルシウム濃度において急速で一時的な増加をもたらす（Ｂｒｏｗｎ ｅｔ ａｌ．，Ｎａｔｕｒｅ ３６６：５７５−５８０，１９９３；Ｙａｍａｇｕｃｈｉ ｅｔ ａｌ．，Ａｄｖ Ｐｈａｒｍａｃｏｌ ４７：２０９−２５３，２０００）。

「腸液平衡障害」なる語句は、腸管における異常な液体分泌または吸収により特徴づけられる障害を意味し、例えば、下痢および便秘を含む。

ＩＩ．カルシウム模倣性およびカルシリティック化合物およびこれらを含む医薬組成物、投与および用量
Ａ．カルシウム模倣性化合物、定義
本明細書において用いられる場合、「カルシウム模倣性化合物」または「カルシウム模倣性」なる用語は、カルシウム感知受容体と結合し、内因性リガンドＣａ^２＋により、カルシウム感知受容体活性化の閾値を減少させる構造変化を誘発する化合物を意味する。これらのカルシウム模倣性化合物はまた、カルシウム受容体のアロステリック調節因子とも見なされ得る。

１つの態様において、カルシウム模倣性は次の活性の１以上を有し得る。３０秒未満の期間を有する、内部カルシウムの一時的な増加を引き起こす（例えば、内部カルシウムを移動させることによる。）；［Ｃａ^２＋ _ｉ］において急速な増加を引き起こし、これは３０秒以内で起こる；［Ｃａ^２＋ _ｉ］において持続的な増加（３０秒より長い）を引き起こす（例えば、外部カルシウムの流入を引き起こすことによる。）；イノシトール−１，４，５−トリホスフェートまたはジアシルグリセロールレベルの増加（通常、６０秒未満）を引き起こす；およびドーパミン−またはイソプロテレノールに刺激されたサイクリックＡＭＰ形成を阻害する。１つの態様において、［Ｃａ^２＋ _ｉ］における一時的増加は、細胞を１０分間、１０ｍＭフッ化ナトリウムまたはホスホリパーゼＣの阻害剤で前処理することにより無効にすることができる、または一時的増加は、プロテインキナーゼＣのアクチベーター、例えば、ホルボールミリステートアセテート（ＰＭＡ）、メゼレインまたは（−）インドラクタムＶを用いた細胞の短い前処理（１０分以下）により減少させられる。１つの態様において、カルシウム模倣性化合物は小分子であり得る。別の態様において、カルシウム模倣性物質はＣａＳＲに対する作動性抗体であり得る。

本発明において有用なカルシウム模倣性化合物は、例えば、欧州特許第６３７，２３７号、第６５７，０２９号、第７２４，５６１号、第７８７，１２２号、第９０７，６３１号、第９３３，３５４号、第１，２０３，７６１号、第１，２３５ ７９７号、第１，２５８，４７１号、第１，２７５，６３５号、第１，２８１，７０２号、第１，２８４，９６３号、第１，２９６，１４２号、第１，３０８，４３６号、第１，５０９，４９７号、第１，５０９，５１８号、第１，５５３，０７８号；国際公開番号ＷＯ９３／０４３７３、ＷＯ９４／１８９５９、ＷＯ９５／１１２２１、ＷＯ９６／１２６９７、ＷＯ９７／４１０９０、ＷＯ０１／３４５６２、ＷＯ０１／９００６９、ＷＯ０２／１４２５９、ＷＯ０２／０５９１０２、ＷＯ０３／０９９７７６、ＷＯ０３／０９９８１４、ＷＯ０４／０１７９０８；ＷＯ０４／０９４３６２、ＷＯ０４／１０６２８０、米国特許第５，６８８，９３８号、第５，７６３，５６９号、第５，９６２，３１４号、第５，９８１，５９９号、第６，００１，８８４号、第６，０１１，０６８号、第６，０３１，００３号、第６，１７２，０９１号、第６，２１１，２４４号、第６，３１３，１４６号、第６，３４２，５３２号、第６，３６２，２３１号、第６，４３２，６５６号、第６，７１０，０８８号、第６，７５０，２５５号、第６，９０８，９３５号および米国特許出願公開番号２００２／０１０７４０６、２００３／０００８８７６、２００３／０１４４５２６、２００３／０１７６４８５、２００３／０１９９４９７、２００４／０００６１３０、２００４／００７７６１９、２００５／００３２７９６、２００５／０１０７４４８、２００５／０１４３４２６、欧州特許出願ＰＣＴ／ＥＰ２００６／００４１６６、フランス国出願０５１１９４０において開示されているものを含む。

ある実施形態において、カルシウム模倣性化合物は、式Ｉおよびこの医薬的に許容される塩から選択される。

（式中、
Ｘ_１およびＸ_２は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、ＣＨ_３、ＣＨ_３Ｏ、ＣＨ_３ＣＨ_２Ｏ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＦ_３、ＣＨＦ_２、ＣＨ_２Ｆ、ＣＦ_３Ｏ、ＣＨ_３Ｓ、ＯＨ、ＣＨ_２ＯＨ、ＣＯＮＨ_２、ＣＮ、ＮＯ_２、ＣＨ_３ＣＨ_２、プロピル、イソプロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、アセトキシおよびアセチルラジカルから選択されるラジカルであり、または２つのＸ_１は一緒になって、縮合脂環式環、縮合芳香族環およびメチレンジオキシラジカルから選択されるものを形成し、または２つのＸ_２は一緒になって、縮合脂環式環、縮合芳香族環およびメチレンジオキシラジカルから選択されるものを形成してもよい；ただし、Ｘ_２は３−ｔ−ブチルラジカルでなく；
ｎは０から５の範囲であり；
ｍは１から５の範囲であり；および
アルキルラジカルはＣ１−Ｃ３アルキルラジカルから選択され、これは場合により、飽和および不飽和、直鎖、分枝および環状Ｃｌ−Ｃ９アルキル基、ジヒドロインドリルおよびチオジヒドロインドリル基ならびに２−、３−および４−ピペリド（イン）イル基から選択される少なくとも１つの基で置換されている。）。

カルシウム模倣性化合物はまた、式ＩＩ

（式中、
Ｒ^１はアリール、置換アリール、ヘテロサイクリル、置換ヘテロサイクリル、シクロアルキルまたは置換シクロアルキルであり；
Ｒ^２はアルキルまたはハロアルキルであり；
Ｒ^３はＨ、アルキルまたはハロアルキルであり；
Ｒ^４はＨ、アルキルまたはハロアルキルであり；
存在する各Ｒ^５は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロゲン、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＲ^ｄＳ（＝Ｏ）_ｍＲ^ｄ、−ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）ＮＲ^ｄＲ^ｄ、−ＮＲ^ｄＳ（＝Ｏ）_ｍＮＲ^ｄＲ^ｄまたは−ＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｄからなる群から独立して選択され；
Ｒ^６はアリール、置換アリール、ヘテロサイクリル、置換ヘテロサイクリル、シクロアルキルまたは置換シクロアルキルであり；
各Ｒ^ａは独立して、Ｈ、アルキルまたはハロアルキルであり；
各Ｒ^ｂは独立して、アリール、アラルキル、ヘテロサイクリルまたはヘテロサイクリルアルキルであり、このそれぞれは置換されていなくまたはアルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルコキシ、シアノおよびニトロからなる群から選択される最高３個の置換基で置換されており；
各Ｒ^ｃは独立して、アルキル、ハロアルキル、フェニルまたはベンジルであり、このそれぞれは、置換されていても置換されていなくてもよく；
各Ｒ^ｄは独立して、Ｈ、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロサイクリル、またはヘテロサイクリルアルキルであり、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロサイクリルおよびヘテロサイクリルアルキルは、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロ、Ｒ^ｂ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^Ｃ、−ＯＲ^ｂ、−ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＮＲ^ａＲ^ｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^Ｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^Ｃ、−ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｃ、−ＮＲ^ａＳ（＝Ｏ）_ｎＲ^ｃおよび−Ｓ（＝Ｏ）_ｎＮＲ^ａＲ^ａから選択される０、１、２、３または４個の置換基で置換されており；
ｍは１または２であり；
ｎは０、１または２であり；および
ｐは０、１、２、３または４であり；
ただし、Ｒ^２がメチルであり、ｐが０であり、Ｒ^６が非置換フェニルであるならば、Ｒ^１は２，４−ジハロフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，４，６−トリハロフェニルまたは２，３，４−トリハロフェニルでないとする。）
の化合物およびこの医薬的に許容される塩から選択することもできる。これらの化合物は、公開された米国特許出願番号２００４００８２６２５（参照により本明細書に組み込まれる。）において詳細に記載されている。

本発明の１つの態様において、式ＩＩの化合物は式

を有し得る。

本発明のある実施形態において、カルシウム模倣性化合物は式ＩＩＩの化合物およびこの医薬的に許容される塩から選択され得る。

式中、
- - - - - -は二重結合または単結合を表し；
Ｒ^１はＲ^ｂであり；
Ｒ^２はＣ_１−８アルキルまたはＣ_１−４ハロアルキルであり；
Ｒ^３はＨ、Ｃ_１−４ハロアルキルまたはＣ_１−８アルキルであり；
Ｒ^４はＨ、Ｃ_１−４ハロアルキルまたはＣ_１−４アルキルであり；
Ｒ^５は独立して、それぞれの場合において、Ｈ、Ｃ_１−８アルキル、Ｃ_１−４ハロアルキル、ハロゲン、−ＯＣ_１−６アルキル、−ＮＲ^ａＲ^ｄまたはＮＲ^ｄＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｄであり；
Ｘは−ＣＲ^ｄ＝Ｎ−、−Ｎ＝ＣＲ^ｄ−、Ｏ、Ｓまたは−ＮＲ^ｄ−であり；
- - - - - -が二重結合である場合、Ｙは＝ＣＲ^６−または＝Ｎ−であり、Ｚは−ＣＲ^７＝または−Ｎ＝であり；- - - - - -が単結合である場合、Ｙは−ＣＲ^aＲ^６−または−ＮＲ^ｄ−であり、Ｚは−ＣＲ^ａＲ^７−または−ＮＲ^ｄ−であり；および
Ｒ^６はＲ^ｄ、Ｃ_１−４ハロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^Ｃ、−ＯＣ_１−６アルキル、−ＯＲ^ｂ、−ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＮＲ^ａＲ^ｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^Ｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｃ、−ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｃ、シアノ、ニトロ、−ＮＲ^ａＳ（＝Ｏ）_ｍＲ^ｃまたは−Ｓ（＝Ｏ）_ｍＮＲ^ａＲ^ａであり；
Ｒ^７はＲ^ｄ、Ｃ_１−４ハロアルキル、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^Ｃ、−ＯＣ_１−６アルキル、−ＯＲ^ｂ、−ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＮＲ^ａＲ^ｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^Ｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｃ、−ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｃ、シアノ、ニトロ、−ＮＲ^ａＳ（＝Ｏ）_ｍＲ^ｃまたは−Ｓ（＝Ｏ）_ｍＮＲ^ａＲ^ａであり；または
Ｒ^６およびＲ^７は一緒になって、０、１、２または３のＮ原子およびＳおよびＯから選択される０、１、または２の原子を含有する３から６員飽和または不飽和ブリッジを形成し、前記ブリッジは、Ｒ^５から選択される０、１または２個の置換基により置換され；Ｒ^６およびＲ^７がベンゾブリッジを形成する場合、このベンゾブリッジは、ＮおよびＯから選択される１または２個の原子を含有する３−または４−原子ブリッジによりさらに置換されていてもよく、このブリッジは、Ｃ_１−４アルキルから選択される０または１個の置換基で置換されており；
Ｒ^ａは独立して、それぞれの場合、Ｈ、Ｃ_１−４ハロアルキルまたはＣ_１−６アルキルであり；
Ｒ^ｂは独立して、それぞれの場合、フェニル、ベンジル、ナフチルまたは飽和または不飽和５−または６員複素環であり、この複素環は、１、２または３個のＮ、ＯおよびＳから選択される原子（ＯおよびＳから選択される原子の２以上を有しない。）を含有し、このフェニル、ベンジルまたは複素環は、Ｃ_１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ_１−４ハロアルキル、−ＯＣ_１−６アルキル、シアノおよびニトロから選択される０、１、２または３個の置換基で置換されており；
Ｒ^ｃは独立して、それぞれの場合、Ｃ_１−６アルキル、Ｃ_１−４ハロアルキル、フェニルまたはベンジルであり；
Ｒ^ｄは独立して、それぞれの場合、Ｈ、Ｃ_１−６アルキル、フェニル、ベンジルまたは飽和もしくは不飽和の５−もしくは６員複素環［この複素環はＮ、ＯおよびＳから選択される１、２または３個の原子（ＯおよびＳから選択される原子の２以上を有しない。）を含有する。］であり、このＣ_１−６アルキル、フェニル、ベンジル、ナフチルおよび複素環は、Ｃ_１−６アルキル、ハロゲン、Ｃ_１−４ハロアルキル、−ＯＣ_１−６アルキル、シアノおよびニトロ、Ｒ^ｂ、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ^ｃ、−ＯＲ^ｂ、−ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＮＲ^ａＲ^ｂ、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ^Ｃ、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ^ａＲ^ａ、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ^Ｃ、−ＮＲ^ａＣ（＝Ｏ）Ｒ^ｃ、−ＮＲ^ａＳ（＝Ｏ）_ｍＲ^ｃおよび−Ｓ（＝Ｏ）_ｍＮＲ^ａＲ^ａから選択される０、１、２、３または４個の置換基により置換されており；
ｍは１または２である。

式ＩＩＩの化合物は、米国特許出願２００４００７７６１９（参照により本明細書に組み込まれる。）において詳細に記載されている。

１つの態様において、カルシウム模倣性化合物は、Ｎ−（３−［２−クロロフェニル］−プロピル）−Ｒ−α−メチル−３−メトキシベンジルアミン ＨＣｌ（化合物Ａ）である。別の態様において、カルシウム模倣性化合物は、Ｎ−（（６−（メチルオキシ）−４’−（トリフルオロメチル）−１、１’−ビフェニル−３−イル）メチル）−１−フェニルエタナミン（化合物Ｂ）である。

１つの態様において、本発明のカルシウム模倣性化合物は式ＩＶから選択することができる。

式中、
Ｙは酸素または硫黄であり；
Ｒ_１およびＲ’_１は、同一または異なり、それぞれ、アリール基、ヘテロアリール基を表し、または
Ｒ_１およびＲ’_１はこれらが結合している炭素原子と一緒になって、式、

の縮合環構造を形成し、
Ａは単結合、メチレン基、ジメチレン基、酸素、窒素または硫黄を表し、前記硫黄は、場合により、スルホキシドまたはスルホン形態であり、Ｒ_１およびＲ’_ｌのそれぞれは、またはこれにより形成される前記縮合環構造は、場合により、基ｃから選択される少なくとも１つの置換基で置換されており、
基ｃは、ハロゲン原子、ヒドロキシル、カルボキシル、直鎖および分枝アルキル、ヒドロキシアルキル、ハロアルキル、アルキルチオ、アルケニルおよびアルキニル基；直鎖および分枝アルコキシル基；直鎖および分枝チオアルキル基；ヒドロキシカルボニルアルキル；アルキルカルボニル；アルコキシカルボニルアルキル；アルコキシカルボニル；トリフルオロメチル；トリフルオロメトキシル；−ＣＮ；−ＮＯ_２；アルキルスルホニル基（場合により、スルホキシドまたはスルホン形態）からなり；アルキル成分のいずれも１から６個の炭素原子を有し、アルケニルまたはアルキニル成分のいずれも２から６個の炭素原子を有し、
１個より多い置換基が存在する場合、前記置換基のそれぞれは同じでありまたは異なり、
Ｒ_２およびＲ_２’は、同一であっても異なっていてもよく、それぞれ、水素原子であり、１から６個の炭素原子を含有し、場合により少なくとも１つのハロゲン原子、ヒドロキシまたは１から６個の炭素原子を含有するアルコキシ基で置換されていてもよい直鎖または分枝アルキル基であり、アルキルアミノアルキルまたはジアルキルアミノアルキル基であり、各アルキル基は１から６個の炭素原子を含有し、または
Ｒ_２およびＲ_２’は、これらが結合している窒素原子と一緒になって、０、１または２個の追加のヘテロ原子を含有し、５、６、または７個の環原子を有する飽和または不飽和複素環を形成し（前記複素環は、場合により、前記定義の基ｃから選択される少なくとも１つの置換基により置換されており、１より多い置換基が存在する場合、前記置換基は同一であっても異なっていてもよい。）、
Ｒ_３は、式

の基を表し、
Ｂは酸素原子または硫黄原子を表し；ｘは０、１または２であり；ｙおよびｙ’は、同じでありまたは異なり、それぞれ０または１であり；ＡｒおよびＡｒ’は、同じでありまたは異なり、それぞれアリールまたはヘテロアリール基を表し；ｎおよびｎ’は、同じでありまたは異なり、ｙまたはｙ’が０を有するとき、それぞれ１であり、ｙまたはｙ’が１であるとき、結合しているＡｒまたはＡｒ’上の置換され得る位置の数に等しく；Ｎ_ｘを有する上記縮合環は５または６員ヘテロアリール環であり；ＲおよびＲ’は、同じであってよくまたは異なっていてよく、それぞれ水素原子または基ａから選択される置換基を表し、
ここで、基ａは、ハロゲン原子；ヒドロキシル；カルボキシル；アルデヒド基；直鎖および分枝アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ハロアルキル、ハロアルケニルおよびハロアルキニル基；直鎖および分枝アルコキシル基；直鎖および分枝チオアルキル基；アルアルコキシ基；アリールオキシ基；アルコキシカルボニル；アルアルコキシカルボニル；アリールオキシカルボニル；ヒドロキシカルボニルアルキル；アルコキシカルボニルアルキル；アルアルコキシカルボニルアルキル；アリールオキシカルボニルアルキル；パーフルオロアルキル；パーフルオロアルコキシ；−ＣＮ；アシル；アミノ、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルアミノ、ジアラルキルアミノ、ジアリールアミノ、アシルアミノおよびジアシルアミノ基；アルコキシカルボニルアミノ、アルアルコキシカルボニルアミノ、アリールオキシカルボニルアミノ、アルキルカルボニルアミノ、アラルキルカルボニルアミノおよびアリールカルボニルアミノ基；アルキルアミノカルボニルオキシ、アラルキルアミノカルボニルオキシおよびアリールアミノカルボニルオキシ基；アミノ、アルキルアミノ、アラルキルアミノ、アリールアミノ、ジアルキルアミノ、ジアラルキルアミノ、ジアリールアミノ、アシルアミノ、トリフルオロメチルカルボニル−アミノ、フルオロアルキルカルボニルアミノ、またはジアシルアミノ基で置換されたアルキル基；ＣＯＮＨ_２；アルキル−、アラルキル−およびアリール−アミド基；アルキルチオ、アリールチオおよびアラルキルチオおよびこの酸化スルホキシドおよびスルホン形態；スルホニル、アルキルスルホニル、ハロアルキルスルホニル、アリールスルホニルおよびアラルキルスルホニル基；スルホンアミド、アルキルスルホンアミド、ハロアルキルスルホンアミド、ジ（アルキルスルホニル）アミノ、アラルキルスルホンアミド、ジ（アラルキルスルホニル）アミノ、アリールスルホンアミドおよびジ（アリールスルホニル）アミノ；および飽和および不飽和ヘテロサイクリル基からなり、前記ヘテロサイクリル基は、単環または二環式であり、同じでまたは異なっていてもよい基ｂから選択される１以上の置換基で場合により置換されており、
基ｂは、ハロゲン原子；ヒドロキシル；カルボキシル；アルデヒド基；直鎖および分枝アルキル、アルケニル、アルキニル、ヒドロキシアルキル、ヒドロキシアルケニル、ヒドロキシアルキニル、ハロアルキル、ハロアルケニルおよびハロアルキニル基；直鎖および分枝アルコキシル基；直鎖および分枝チオアルキル基；アルコキシカルボニル；ヒドロキシカルボニルアルキル；アルコキシカルボニルアルキル；パーフルオロアルキル；パーフルオロアルコキシ；−ＣＮ；アシル；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノおよびジアシルアミノ基；アミノ、アルキルアミノ、ジアルキルアミノ、アシルアミノ、またはジアシルアミノ基で置換されたアルキル基；ＣＯＮＨ_２；アルキルアミド基；アルキルチオおよび酸化スルホキシドおよびこのスルホン形態；スルホニル、アルキルスルホニル基；およびスルホンアミド、アルキルスルホンアミドおよびジ（アルキルスルホニル）アミノ基からなり、
基ａおよび基ｂにおいて、アルキル成分のいずれも１から６個の炭素原子を有し、アルケニルまたはアルキニル成分のいずれも２から６個の炭素原子を有し、場合により少なくとも１つのハロゲン原子またはヒドロキシ基で置換されており、これらは、アリール成分のいずれも場合によりヘテロアリール基である。

本発明の方法において有用なカルシウム模倣性化合物は、前記のカルシウム模倣性化合物、ならびに前記のいずれかの立体異性体、エナンチオマー、多形体、水和物および医薬的に許容される塩を含む。

Ｂ．カルシリティック化合物、定義
本明細書において用いられる場合、「カルシリティック化合物」または「カルシリティック物質（ｃａｌｃｉｌｙｔｉｃｓ）」なる用語は、カルシウム感知受容体（ＣａＳＲ）活性を、例えば細胞外Ｃａ^２＋により引き起こされた１以上のカルシウム受容体活性を減少させることにより、阻害、ブロックまたは減少させる化合物をさす。１つの態様において、カルシリティック物質は、細胞外Ｃａ^２＋の増大した濃度の、（ａ）［Ｃａ^２＋ _ｉ］を増加させる能力；（ｂ）細胞内Ｃａ^２＋を移動させる能力；（ｃ）イノシトール−１，４，５−トリホスフェートの形成を増大させる能力；および（ｄ）ドーパミンまたはイソプロテレノールに刺激されたサイクリックＡＭＰ形成を減少させる能力を、部分的にまたは完全にブロックすることができる。１つの態様において、カルシリティック化合物は、小分子であり得る。別の態様において、カルシリティックは拮抗性抗体であり得る。

本発明において有用なカルシリティック化合物は、例えば欧州特許および公開番号６３７，２３７、７２４，５６１、９０１，４５９、９７３，７３０、１，２５８，４７１、１，４６６，８８８、１，５０９，５１８；国際公開番号ＷＯ９７／３７９６７、ＷＯ９９／５１５６９、ＷＯ０４／０１７９０８、ＷＯ０４／０４１７５５、ＷＯ０４／０４７７５１、ＷＯ０５／０３０７４６、ＷＯ０５／０３０７４９；米国特許第６，３９５，９１９号、第６，４３２，６５６号、第６，５２１，６６７号、第６，７５０，２５５号、第６，８１８，６６０号、第６，８６４，２６７号、第６，９０８，９３５号、第６，９１６，９５６号および米国特許出願公開番号２００２／００９９２２０、２００４／０００９９８０、２００４／００１４７２３、２００４／０１９２７４１および２００５／００３２８５０に、開示されているものを含む。

本発明の方法において有用なカルシリティック化合物は、前述のカルシリティック化合物、ならびに前記のいずれかの立体異性体、エナンチオマー、多形体、水和物および医薬的に許容される塩を含む。

Ｃ．カルシウム模倣性およびカルシリティック活性を評価する方法
１つの態様において、ＣａＳＲ−活性調節部位に結合する化合物は、例えば、競合的測定法形式において前記部位と結合する標識された化合物を用いて同定することができる。

化合物のカルシウム模倣またはカルシウム分解活性は、例えば、国際公開ＷＯ９３／０４３７３、ＷＯ９４／１８９５９およびＷＯ９５／１１２１１に記載されている技術を用いて決定できる。

化合物のカルシウム模倣性またはカルシリティック活性を評価するために使用できる他の方法を以下に記載する。

ＨＥＫ ２９３細胞検定
ヒト副甲状腺ＣａＳＲ（ＨＥＫ ２９３ ４．０−７）を発現するように処理されたＨＥＫ ２９３細胞は、すでに記載されている（Ｎｅｍｅｔｈ ＥＦ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ ９５：４０４０−４０４５）。このクローン細胞系は、ＣａＳＲの作動物質、アロステリック調節因子および拮抗物質を選別するために広く用いられてきた（Ｎｅｍｅｔｈ ＥＦ ｅｔ ａｌ．（２００１）Ｊ．Ｐｈａｒｍａｃｏｌ．Ｅｘｐ．Ｔｈｅｒ．２９９：３２３−３３１）。

細胞質性カルシウム濃度を測定するために、細胞を組織培養フラスコから、リン酸塩緩衝塩溶液（ＰＢＳ）中０．０２％エチレンジアミン四酢酸（ＥＤＴＡ）で簡単に処理し、次いで０．１％ウシ血清アルブミン（ＢＳＡ）および１ｍｇ／ｍｌ Ｄ−グルコースで補足された緩衝液Ａ（１２６ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＣａＣｌ_２、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．７ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４、２０ｍＭ Ｎａ−Ｈｅｐｅｓ、ｐＨ ７．４）で洗浄し、再懸濁することにより回収する。これらの細胞を、３０分間、３７℃で、緩衝液Ａおよび２μＭ ｆｕｒａ−２ アセトキシメチルエステル中で温置することにより、ｆｕｒａ−２をロードする。これらの細胞を緩衝液Ｂ（緩衝液Ｂは、スルフェートおよびホスフェートがなく、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有し、０．５％ ＢＳＡおよび１ｍｇ／ｍｌ Ｄ−グルコースで補足された緩衝液Ａである。）で洗浄し、再懸濁させて、室温で密度４から５ｘ１０^６細胞／ｍｌの密度にする。蛍光シグナルを記録するために、細胞を一定して撹拌しながら、予熱された（３７℃）緩衝液Ｂ中に５倍に希釈する。励起および発光波長はそれぞれ３４０および５１０ｎｍである。蛍光シグナルをリアルタイムで、ストリップ・チャートレコーダーを用いて記録する。

蛍光イメージングプレートリーダー（ＦＬＩＰＲ）分析に関して、ＨＥＫ ２９３細胞は、１０％ウシ胎児血清（ＦＢＳ）および２００μｇ／ｍｌハイグロマイシンを含むＤｕｌｂｅｃｃｏの修飾イーグル培地（ＤＭＥＭ）中に維持される。分析の２４時間前に、細胞をトリプシン処理し、側面が黒色の、底面が透明なコラーゲン１で被覆された９６穴プレート中の前記培地中に１．２ｘ１０^５細胞／ウェルにてプレートする。プレートを１,０００ｒｐｍにて２分間遠心分離し、５％ＣＯ_２下、３７℃にて一夜温置する。細胞に次いで６μＭ ｆｌｕｏ−３ アセトキシメチルエステルを６０分間室温にて負荷する。全ての分析は、１２６ｍＭ ＮａＣｌ、５ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＣｌ_２、２０ｍＭ Ｎａ−Ｈｅｐｅｓを含有し、１．０ｍｇ／ｍｌ Ｄ−グルコースおよび１．０ｍｇ／ｍｌＢＳＡフラクションＩＶ（ｐＨ ７．４）で補足された緩衝液中で行われる。

１つの態様において、ＣａＳＲ活性化合物のＥＣ_５０’は、１ｍＭ Ｃａ^２＋の存在下で測定できる。細胞質性カルシウム濃度のＥＣ_５０は、０．５ｍＭの細胞外Ｃａ^２＋レベルで出発して決定できる。ＦＬＩＰＲ実験は、０．８Ｗのレーザー設定および０．４秒ＣＣＤカメラシャッタースピードを用いて行われる。これら細胞をカルシウム、ＣａＳＲ活性化合物またはビヒクル（２０μｌ）に曝露し、蛍光を１秒間隔で５０秒間モニターする。次に、カルシウム、ＣａＳＲ活性化合物、またはビヒクルの２回目の曝露（５０μｌ）を行うことができ、蛍光シグナルをモニターする。蛍光シグナルは、サンプル期間内の応答のピーク高さとして測定される。各応答を次にプレートにおいて観察される最大ピークに標準化して、最大蛍光（％）を決定する。

ウシ副甲状腺細胞
ＰＴＨ分泌のＣａＳＲ依存性調節に対するカルシウム模倣性またはカルシリティック化合物の効果を、分離されたウシ副甲状腺細胞の初代培養を用いて評価できる。コラゲナーゼ消化により分離された細胞を得ることができ、プールし、次いでＰｅｒｃｏｌｌ精製緩衝液中に再懸濁させ、１４，５００ｘｇにて２０分間４℃にて遠心分離することにより精製する。分離された副甲状腺細胞を移し、Ｈａｍ’ｓ Ｆ−１２およびＤＭＥＭ（Ｆ−１２／ＤＭＥＭ）（０．５％ ＢＳＡ、１００Ｕ／ｍｌペニシリン、１００μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび２０μｇ／ｍｌゲンタマイシンで補足）の１：１混合物中にて洗浄する。細胞を最後に、１０Ｕ／ｍｌペニシリン、１０μｇ／ｍｌストレプトマイシンおよび４μｇ／ｍｌゲンタマイシンを含有するＦ−１２／ＤＭＥＭ中に再懸濁させ、ＢＳＡをＩＴＳ＋（インシュリン、トランスフェリン、亜セレン酸、ＢＳＡおよびリノール酸；Ｃｏｌｌａｂｏｒａｔｉｖｅ Ｒｅｓｅａｒｃｈ、Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で置換した。細胞を、空気中５％ＣＯ_２の加湿雰囲気中、Ｔ−７５フラスコ中、３７℃で温置する。

一夜培養後、傾瀉することにより、細胞をフラスコから除去し、０．１％ＢＳＡおよび０．５ｍＭ ＣａＣｌ_２を含有する副甲状腺細胞緩衝液（１２６ｍＭ ＮａＣｌ、４ｍＭ ＫＣｌ、１ｍＭ ＭｇＳＯ_４、０．７ｍＭ Ｋ_２ＨＰＯ_４／ＫＨ_２ＰＯ_４、２０ｍＭ Ｎａ−Ｈｅｐｅｓ、２０；ｐＨ ７．４５および特定された様々な量のＣａＣｌ_２）にて洗浄する。細胞をこの同じ緩衝液中に再懸濁させ、一部（０．３ｍｌ）を、適切な対照、ＣａＳＲ活性化合物、および／または様々な濃度のＣａＣｌ_２を含有するポリスチレンチューブに添加する。各実験条件を３回行う。３７℃での温置を２０分間行い、チューブを氷上に置くことにより停止できる。遠心分離（１５００ｘｇ、５分、４℃）により細胞をペレット化し、０．１ｍｌの上清を直ちに分析する。細胞の一部を温置期間の間、氷上に放置し、次いで他のサンプルと平行して処理する。氷上に保持されたチューブからの上清中のＰＴＨの量を「基礎放出」と定義し、他のサンプルから差し引く。ＰＴＨは、製造業者の指示に従って、ラットＰＴＨ−（１−３４）免疫放射定量測定法キット（Ｉｍｍｕｎｏｔｏｐｉｃｓ，Ｓａｎ Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，ＣＡ）を用いて測定される。

ＭＴＣ ６−２３細胞カルシトニン放出
ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入した、ラットＭＴＣ ６−２３細胞（クローン６）を増殖培地（カルシウムを含むＤＭＥＭ高グルコース／１５％ ＨＩＨＳ）（３から４日ごとに交換）中に維持する。培養物を毎週１：４分割比で継代接種する。処方された増殖培地中のカルシウム濃度は、３．２ｍＭと計算される。細胞を９０％Ｏ_２／１０％ ＣＯ_２の雰囲気中、３７℃で温置する。実験前に、サブコンフルーエント培養物からの細胞を吸引し、トリプシン溶液で１回リンスする。フラスコを再度吸引し、室温で、新鮮なトリプシン溶液とともに５から１０分間温置して、細胞を分離する。分離された細胞を３．０ｘ１０^５細胞／ｍＬの密度で増殖培地中に懸濁させ、コラーゲンで被覆された４８穴プレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中、１．５ｘ１０^５細胞／ウェル（０．５ｍＬ細胞懸濁液）の密度で播種する。播種後５６時間、細胞を接着させ、その後、増殖培地を吸引し、０．５ｍＬのアッセイ培地（ＤＭＥＭ 高グルコース／２％ ＦＢＳなし）に置換する。次に細胞を、カルシウムに刺激されたカルシトニン放出の決定前に１６時間温置する。この培地中の実際のカルシウム濃度は０．０７ｍＭ未満と計算される。カルシトニン放出を測定するために、アッセイ培地中、０．３５ｍＬの試験試薬を各ウェルに添加し、この培地中のカルシトニン含量測定前に４時間温置する。カルシトニンレベルを製造業者の指示に従い、ラットカルシトニン免疫放射定量測定法キット（Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ，Ｓａｎ Ｃｌｅｍｅｎｔｅ，ＣＡ）を用いて定量化する。

イノシトールホスフェートアッセイ
化合物のカルシウム模倣性またはカルシリティック特性は、ラット脳からのクローンされたＣａＳＲを含有する［ＣＨＯ（ＣａＳＲ）］または含有しない［ＣＨＯ（ＷＴ）］発現ベクターにて形質移入されたチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に関して行われる生化学分析においても評価することができる（Ｒｕａｔ Ｍ．，Ｓｎｏｗｍａｎ ＡＭ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１，１９９６，ｐ５９７２）。ＣＨＯ（ＣａＳＲ）は、Ｃａ^２＋および他の二価カチオンおよびＮＰＳ ５６８によるＣａＳＲの活性化に際して、トリチウム化イノシトールホスフェート（［^３Ｈ］ＩＰ）蓄積を刺激することが示されている（Ｒｕａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１，１９９６）。従って、１０μＭの各ＣａＳＲ活性化合物により２ｍＭの細胞外カルシウムの存在下で生成される［^３Ｈ］ＩＰ蓄積を測定することができ、１０ｍＭ細胞外カルシウム（最大ＣａＳＲ活性を惹起する濃度）によりもたらされる効果と比較することができる（Ｄａｕｂａｎ Ｐ．ｅｔ ａｌ，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０，２０００，ｐ２００１）。

Ｄ．医薬組成物および投与
本発明において有用なカルシウム模倣性およびカルシリティック化合物は、無機酸または有機酸から誘導される医薬的に許容される塩の形態において用いることができる。これらの塩は、以下に限定されないが、次のものを含む。アセテート、アジペート、アルギネート、シトレート、アスパルテート、ベンゾアート、ベンゼンスルホネート、ビスルフェート、ブチレート、カンフォレート、カンファースルホネート、ジグルコネート、シクロペンタンプロピオネート、ドデシルスルフェート、エタンスルホネート、グルコヘプタノエート、グリセロホスフェート、ヘミスルフェート、ヘプタノエート、ヘキサノエート、フマレート、塩酸塩、臭化水素酸塩、ヨウ化水素酸塩、２−ヒドロキシ−エタンスルホネート、ラクテート、マレエート、マンデレート、メタンスルホネート、ニコチネート、２−ナフタレンスルホネート、オキサレート、パルモエート、ペクチネート、パースルフェート、２−フェニルプロピオネート、ピクレート、ピバレート、プロピオネート、サリチレート、スクシネート、スルフェート、タータレート、チオシアネート、トシレート、メシレートおよびウンデカノエート。本発明の化合物が酸性官能基、例えばカルボキシ基を含む場合、カルボキシ基の好適な医薬的に許容される塩は、当業者に周知であり、例えば、アルカリ金属、アルカリ土類金属、アンモニウム、第四アンモニウムカチオンなどを含む。「医薬的に許容される塩」のさらなる例については、以下およびＢｅｒｇｅ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｐｈａｒｍ．Ｓｃｉ．６６：１，１９７７参照。本発明のある実施形態において、塩酸塩およびメタンスルホン酸塩を用いることができる。

本発明のいくつかの態様において、カルシウム受容体活性化合物は、シナカルセット、すなわち、Ｎ−（ｌ−（Ｒ）−（ｌ−ナフチル）エチル）−３−［３−（トリフルオロメチル）フェニル］−ｌ−アミノプロパン、シナカルセットＨＣｌおよびシナカルセットメタンスルホネートから選択することができる。カルシウム模倣性化合物、例えばシナカルセットＨＣｌおよびシナカルセットメタンスルホネートは、様々な形態、例えば、アモルファス粉末、結晶性粉末およびこの混合物であってよい。結晶性粉末は、多形体、擬似多形体、晶癖、ｍｉｃｒｏｍｅｒｅｔｉｃｓおよび粒子形態を含む形態であり得る。

投与に関して、本発明において有用な化合物は、通常、指示された投与経路に適切な１以上のアジュバントと組み合わせられる。これらの化合物は、ラクトース、シュークロース、デンプン粉末、アルカン酸のセルロースエステル、ステアリン酸、タルク、ステアリン酸マグネシウム、酸化マグネシウム、リン酸および硫酸のナトリウムおよびカルシウム塩、アカシア、ゼラチン、ナトリウムアルギネート、ポリビニル−ピロリドンおよび／またはポリビニルアルコールと混合し、従来の投与のために錠剤化またはカプセル化することができる。あるいは、本発明において有用な化合物は、生理食塩水、水、ポリエチレングリコール、プロピレングリコール、エタノール、コーン油、ピーナッツ油、綿実油、ゴマ油、トラガカント・ゴムおよび／または様々な緩衝液中に溶解させることができる。他のアジュバントおよび投与様式は製薬分野において周知である。担体または希釈剤は、時間遅延物質、例えばグリセリルモノステアレートまたはグリセリルジステアレートを単独にてまたはワックスもしくは当分野において周知の他の物質とともに含むことができる。

医薬組成物は、固体形態（顆粒、粉末または坐剤を含む）または液体形態（例えば、溶液、懸濁液または乳液）において構成されていてよい。医薬組成物は、従来の調剤操作、例えば滅菌に付すことができおよび／または従来のアジュバント、例えば、保存料、安定剤、湿潤剤、乳化剤、緩衝液等を含有することができる。

経口投与用固体投与形態は、カプセル、錠剤、丸薬、粉末および顆粒を含む。このような固体投与形態において、活性化合物は少なくとも１つの不活性希釈剤、例えば、シュークロース、ラクトースまたはデンプンと混合される。このような投与形態はさらに、通常の実施例におけるように、不活性希釈剤以外の追加の物質、例えば、潤滑剤、例えばステアリン酸マグネシウムを含むことができる。カプセル、錠剤および丸薬の場合、投与形態は緩衝剤も含むことができる。錠剤および丸薬は、さらに、腸溶性被膜を用いて調製することができる。

経口投与用の液体投与形態は、医薬的に許容される乳液、溶液、懸濁液、シロップおよびエリキシル（当分野において通常用いられる不活性希釈剤、例えば水を含有する。）を含む。このような組成物は、アジュバント、例えば、湿潤剤、甘味料、フレーバーおよび香料も含むことができる。

本発明において有用な組成物におけるカルシウム受容体活性化合物の治療上有効な量は、対象につき、約０．１ｍｇから約１８０ｍｇ、例えば約５ｍｇから約１８０ｍｇ、または約１ｍｇから約１００ｍｇの範囲のカルシウム模倣性化合物である。いくつかの態様において、組成物中のカルシウム受容体活性化合物の治療上有効な量は、約０．１ｍｇ、約１ｍｇ、５ｍｇ、約１５ｍｇ、約２０ｍｇ、約３０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７５ｍｇ、約９０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１８０ｍｇから選択される。

カルシウム受容体活性化合物を対象に単独で投与することが可能であるが、投与される化合物は、通常、医薬組成物において活性成分として存在する。従って、本発明の医薬組成物は、少なくとも１つのカルシウム模倣性化合物の治療上有効な量、または少なくとも１つのカルシウム模倣性化合物の有効投薬量を含むことができる。

ここに用いられるとき、「有効投与量」は、単回投与、複数回投与または部分投与とされるとき．カルシウム受容体活性化合物の治療上有効量を提供する量である。このように、本発明のカルシウム受容体活性化合物の有効投与量は、この化合物［例えば、２つまたはそれ以上の投薬単位（錠剤、カプセル等）がこの化合物の有効量を投与するために必要である医薬組成物、あるいは、この化合物の一部分を投与することによりこのカルシウム模倣性化合物の有効量が投与される複数回投与医薬組成物（粉剤、液剤等）］の有効量より少ない、有効量に等しいまたは有効量より多い量を含む。

あるいは、２つまたはそれ以上の投薬単位（錠剤、カプセル等）がカルシウム受容体活性化合物の有効量を投与するために必要である医薬組成物は、例えば、個々の対象について有効な量を確認するために、個々の対象を可能性のある副作用について感作を減じるためにまたは個々の対象に投与された１つまたはそれ以上の他の治療薬の有効な投与を再調整することをもしくは他の治療薬を減少させることを可能にするために、１回またはそれ以上の時間間隔（例えば、１日１回投与および１日２回投与）にて、有効量より少ない量にて投与されてよい。

本発明において有用な医薬組成物の有効投与量は、約１ｍｇから約３６０ｍｇの範囲の単位投与形態、例えば、約５ｍｇ、約１５ｍｇ、約３０ｍｇ、約５０ｍｇ、約６０ｍｇ、約７５ｍｇ、約９０ｍｇ、約１２０ｍｇ、約１５０ｍｇ、約１８０ｍｇ、約２１０ｍｇ、約２４０ｍｇ、約３００ｍｇまたは約３６０ｍｇの単位投与形態の範囲であり得る。

本発明のいくつかの態様において、本明細書において開示される組成物は、下痢の治療または予防についてカルシウム受容体活性化合物の治療上有効な量を含む。例えば、ある実施形態において、カルシウム模倣性化合物例えば、シナカルセト（ｃｉｎａｃａｌｃｅｔ）ＨＣｌは、この組成物の合計重量に対する重量基準で、約１％から約７０％、例えば、約５％から約４０％、約１０％から約３０％または約１５％から約２０％の範囲の量で存在し得る。

本発明において有用な組成物は、本カルシウム感知受容体活性化合物に加えて、１以上の活性成分を含有することができる。この追加の活性成分は、別のカルシウム模倣性またはカルシリティック化合物であってもよいし、または異なる治療活性を有する活性成分であってよい。このような追加の活性成分の例は、ビタミンおよびその類似体、例えば、抗生物質、ランタン炭酸塩、抗炎症薬（ステロイド系および非ステロイド系）および炎症誘発性サイトカインの阻害剤（ＥＮＢＲＥＬ（登録商標）、ＫＩＮＥＲＥＴ（登録商標））が挙げられる。組み合わせとして投与される場合、これらの治療薬は、同時または異なる時に投与される、独立した組成物として処方することができ、またはこれらの治療薬は１つの組成物として投与できる。

１つの態様において、本発明の方法において有用な医薬組成物は、胃腸管を通る通過時間を遅くするための追加の化合物を含むことができ、これにより、滞留時間を延長し、本発明の組成物の接触を促進する。このような化合物の例は、例えば、米国特許出願公開番号２００３００１３６７６において記載されている。１つの態様において、これら組成物は、ｃＧＭＰ（すなわち、環状グアノシン３’，５’−環状一リン酸塩；グアノシン３’，５’−一リン酸塩；３’，５’−ＧＭＰ；ｃＧＭＰ；グアノシン３’，５’−（リン酸水素塩）；グアノシン３’，５’−環状一リン酸塩；およびグアノシン３’，５’−環状リン酸塩）を含むことができる。

別の態様において、本発明の方法を実施するために用いられる化合物は、生物学的に活性な成分が上部胃腸管（例えば胃および腸）にて実質的に放出されることなく結腸において放出される経口投与のために調合され得る。例えば、本発明の医薬組成物は、ペクチンおよびガラクトマンナン、多糖類（どちらも結腸の細菌酵素により分解され得る。）（米国特許第６，４１３，４９４号）等の薬物担体と共に使用できる。ペクチンまたはガラクトマンナンは、薬物担体として単独で使用されたとき、擬似胃液および擬似腸液中に容易に溶解するが、ｐＨ約７以上で調製されたとき、これら２つの多糖類の混合物は、擬似胃および腸液中にて溶解または崩壊しない強力な柔軟性の不溶性ゲルを生成する。従って、これら２つの多糖類の混合物は、この混合物で被覆された薬物が上部胃腸管にて放出されることから保護する。このペクチンおよびガラクトマンナンの混合物は、結腸に到達すると、結腸の細菌酵素の相乗作用により迅速に分解される。さらに別の態様において、本発明の組成物は、結腸酵素により分解され得るゼラチンおよびアニオン性多糖類（例えば、ペクチネート、ペクテート、アルギネート、コンドロイチン硫酸、ポリガラクトウロン酸、トラガカント・ゴム、アラビアゴムおよびこれらの混合物）の複合体の医薬マトリックス（米国特許第６，３１９，５１８号）と共に使用できる。

ＩＩＩ．治療法
１つの態様において、本発明は、対象における腸液平衡障害の治療法を提供する。通常の生理条件下で、毎日ほぼ１．５Ｌの液体が結腸に流入するが、約１００から２００ｍＬのみが大便中に排泄される。結腸における水および電解質輸送の調節は、体液性パラクリンおよび中性調節経路間の複雑な相互作用が関与している。腸液平衡障害は、腸管における異常な液体分泌または吸収により特徴づけられ、例えば下痢および便秘を含む。

Ａ．下痢
１つの態様において、本発明は、異常な腸の運動障害、例えば下痢を治療する方法を提供する。本発明の方法は、個体に治療上有効な量のカルシウム模倣性化合物を投与することを含む。

本明細書において用いられる場合、「下痢」なる用語は、１日あたり２００ｇより多い体積の、２４時間で３回またはそれ以上の定形のない大便の状態を意味する。１つの態様において、下痢は浸透圧性（すなわち、腸の内容物の浸透圧が血清よりも高い場合に起こる。）であり得る。この状態は、脂肪の消化不良（例えば、セリアック病において）またはラクトースの消化不良（例えば、腸のラクターゼ欠乏症において）に起因し、または、ある下剤（例えば、ラクツロース、水酸化マグネシウム）または人工甘味料（例えば、ソルビトール、マンニトール）の使用により起こり得る。別の態様において、下痢は分泌性であり得る。すなわち、内腔中への正味の水の分泌がある場合に起こる。これは、細菌毒素（例えば、イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）およびビブリオ・コレレ（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）により産生されるもの）、またはホルモン、例えば、まれな島細胞腫により産生される血管作用性腸ポリペプチド（膵性コレラ）により起こり得る。浸透圧性下痢および分泌性下痢はどちらも、回盲部を通る水の流れが結腸の吸収能を上回るような、小腸における異常から起こる。

さらなる態様において、下痢は滲出性下痢であり得る。すなわち、小腸または大腸粘膜の直接的損傷の結果生じる。この種類の下痢は、腸の感染症または炎症性疾患により起こり得る。１つの態様において、滲出性下痢は、化学療法、放射線治療、炎症または毒性外傷に伴い得る。別の態様において、滲出性下痢は、胃腸または腹部の手術に伴い得る。

別の態様において、下痢は、腸の通過の促進によるものであり得る（急速通過性下痢）。このような状態は、急速な流動は、腸の水を吸収する能力を損なうために起こり得る。

本明細書において用いられる場合、「急性下痢」なる用語は、１４日未満にわたり１日あたり２００ｇより多い便重量により特徴づけられる状態をさし、通常頻度が増加した排便を伴う。急性下痢の原因の例を以下の表１にまとめる。

本明細書において用いられる場合、「旅行者下痢症」なる用語は、腹部痙攣、吐き気、腫脹、尿意逼迫、熱および倦怠を含む症状を伴う、不定形の排便の増大した頻度（通常１日あたり４から５回の軟便）により特徴づけられる症候群をさす。旅行者下痢症は、旅行期間中または帰宅後すぐに突然始まることにより特徴づけられる。１つの態様において、旅行者下痢症は、腸毒素産生性イー・コリ（Ｅ．ｃｏｌｉ）により引き起こされ得る。別の態様において、旅行者下痢症は、サルモネラ胃腸炎菌（Ｓａｌｍｏｎｅｌｌａ ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｉｔｉｓ）、シゲラ赤痢菌（Ｓｈｉｇｅｌｌａ ｄｙｓｅｎｔｅｒｙ）、またはウイルス性腸病原体により引き起こされ得る。

本明細書において用いられる場合、「慢性下痢」なる用語は、１４日よりも長い間、１日あたり２００ｇより多い大便重量により特徴付けられる状態をさし、通常排便の増大した頻度を伴う。慢性下痢の病態生理学的メカニズムを以下の表２にまとめる。

１つの態様において、下痢は、サイクリックＡＭＰ媒介性であり得る。別の態様において、下痢は、サイクリックＧＭＰにおける増加と関連し、またはこれから生じる。さらなる態様において、下痢は抗炎症薬、カフェイン、ステロイド、薬物または下剤により引き起こされ得る。別の態様において、下痢は短腸症候群により引き起こされ得る。

１つの態様において、本発明は、異常な胃液分泌／吸収障害の治療を、例えば下痢などのこの根底にある原因の治療と共に、または他の治療法と共に行う方法を提供する。１つの態様において、カルシウム模倣性物質は、経口補水塩療法前、その後または同時に対象に投与することができる。例えば、経口補水塩療法は、次の成分、ナトリウム、カリウム、クロリド、ビカーボネート、シトレートおよびグルコースを含有することができる。別の態様において、カルシウム模倣性物質は、対象に、腸運動抑制薬、例えば、ロペラミド（Ｉｍｏｄｉｕｍ）、ジフェノキシレートまたはビスマスサブサリチレート（Ｐｅｐｔｏ−Ｂｉｓｍｏｌ）の前、後または同時に投与することができる。別の態様において、カルシウム模倣性物質は、抗生物質（例えば、トリメトプリム−スルファメトキサゾール（Ｂａｃｔｒｉｍ ＤＳ）、シプロフロキサシン（Ｃｉｐｒｏ）、ノルフロキサシン（Ｎｏｒｏｘｉｎ）、オフロキサシン（Ｆｌｏｘｉｎ）、ドキシサイクリン（Ｖｉｂｒａｍｙｃｉｎ）、エリスロマイシン）と共に投与することができる。１つの態様において、カルシウム模倣性化合物は、カルシウムまたはポリアミン、例えば、スペルミン、スペルミジン、プトレシンおよびオルニチン代謝産物またはアミノ酸、例えば、Ｌ−トリプトファン、Ｌ−フェニルアラニンとともに投与することができる。別の態様において、カルシウム模倣性化合物は、ナトリウムおよびグルコースとともに投与することができる。

加えて、カルシウム模倣性物質は、手術および非手術治療と合わせて投与することができる。

Ｂ．便秘
本発明はまた、異常な腸の運動障害、例えば便秘の治療法も提供する。本発明の方法は、対象に治療上有効な量のカルシリティック化合物を投与することを含む。

本明細書において用いられる場合、「便秘」なる用語は、困難な、回数が少ない（１週間につき３回よりも少ない）または外観上は不完全な排便の持続性症状をさす。１つの態様において、大便は、硬く、通過が困難であり、硬糞塊状で、腹痛を伴い得る。慢性便秘のいくつかの一般的な原因を表３にまとめる。

１つの態様において、本発明は、便秘を、根底にある疾患の治療法と組み合わせて治療する方法を提供する。例えば、本発明は、対象の食事の変更、例えば、十分なかさ（すなわち、不溶性繊維）の添加と組み合わせて、カルシリティック物質を対象に投与することを含む方法を提供する。１つの態様において、カルシリティック物質を下剤とともに使用できる。

Ｃ．腸液分泌および吸収の調整法
本発明はさらに、腸液分泌および吸収の調整法を提供する。１つの態様において、その目的は、対象において液体の吸収を増加させること、および／または体液分泌を減少させることであり得、従って、本発明の方法は、カルシウム模倣性化合物を含む医薬組成物の有効量を投与することを含み得る。

別の態様において、その目的は、腸液分泌を増加させ、または腸液吸収を減少させることであり得、従って、本発明の方法は、カルシリティック化合物を含む医薬組成物の有効量を投与することを含み得る。１つの態様において、この方法は、個体の手術、例えば、腹部手術または大腸内視鏡検査の準備と組み合わせて使用できる。加えて、この方法は、放射線検査のために腸を準備するために使用できる。

Ｄ．吸収不良および同化不良
本発明は、少なくとも１つのカルシウム模倣性またはカルシリティック化合物を医薬的に許容される担体とともに含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む、対象の腸管における薬物、毒または栄養の吸収または分泌を調節する方法を提供する。

１つの態様において、薬物または栄養吸収は増加し、投与される化合物はカルシウム模倣性である。１つの態様において、本発明は、対象の同化不良または吸収不良の治療法であって、少なくとも１つのカルシウム模倣性物質を医薬的に許容される担体と合わせて含む有効量の医薬組成物を対象に投与することを含む方法を提供する。

本明細書において用いられる場合、「同化不良」なる用語は、次の２つのプロセスのうちの１つにおいて起こる食物消化および吸収のプロセス障害を包含する（１）管腔内障害（食物の消化不良）によるもの、および（２）壁内障害（食物の吸収不良）によるもの。同化不良の臨床症状を表４にまとめる。

１つの態様において、本発明は、対象の同化不良を治療する方法カルシウム模倣性化合物を医薬的に許容される担体と共に含む医薬組成物の有効量を対象に投与することを含む方法を提供する。１つの態様において、本発明の方法は、同化不良の根底にある原因の治療法と組み合わせて実施することができる。例えば、本発明の方法は、食事制限（例えば、炭水化物または脂肪過敏症の場合）と組み合わせて実施できる。別の態様において、カルシウム模倣性物質は、抗生物質（例えば、ゲンタマイシン）、胆汁酸結合剤（例えば、コレスチラミン）または消化酵素（例えば、パンクレリパーゼ）を組み合わせて投与できる。

カルシウム模倣性物質を含む医薬組成物を投与することを含む本発明の方法は、また対象における栄養失調を治療するために実施され得る。例えば、対象は、対象が極めて体重不足（身長に対する体重が標準の８０％より低い）であり、極めて太りすぎ（身長に対する体重が標準の１２０％を超える）であるならば、対象が意図せず体重の１０％以上減少ているならば、胃腸管手術を受けるか、養分損失（例えば、下痢、透析、嘔吐のために）を経験しているならば、代謝要求が増大しているならば（例えば、妊娠、授乳、身体活動性の増大、熱、損傷による）、アルコールまたは薬物常用者（抗生物質、抗うつ剤、利尿剤）であるならば、栄養摂取、吸収、代謝、または利用を妨害する病状を有するならば、歯の状態が悪い（特に、高齢者において）ならば、またはヘルペス、ＨＩＶまたは化学療法のために口のびらんを有するならば、栄養失調であり得る。別の態様において、対象は、食事の危険因子（例えば、食欲喪失、不適切な食物または栄養摂取、変化のない食事、気まぐれ、体重を減らす食生活、不適切な繊維、過度の脂肪、ナトリウム、糖、過度のアルコール、果物、野菜が少なすぎる）により、または社会的危険因子（例えば、慢性健康障害、貧困、食物を購入するためのお金の不足、低い社会経済的状態、非移動性もしくは食物を購入、貯蔵、または調理できないこと、社会的隔離、ほとんど常に孤食、薬物乱用者、対象の食べる能力を制限する状態）のために、栄誉失調であり得る。さらに、本発明の方法は、例えば、環境災害後の生存、海での生存、孤島に置き去りおよび深海での生活または宇宙旅行の間など、対象の栄養入手が制限された場合に実施できる。

例えば、カルシリティック化合物を含む医薬組成物を投与することを含む本発明の方法対象において薬物、化学物質または栄養の腸吸収を減少させるために、実施され得る。１つの態様において、対象は太りすぎであり得る。別の態様において、対象は、毒または薬物の摂取のために危険な状態にあり得る。

次の実施例は、本発明をより十分に説明するために提供され、本発明の範囲を制限すると解釈するべきでない。

この実施例は、腺窩単離および潅流法、様々な種における体液分泌および吸収の評価法ならびに化合物のカルシウム模倣性およびカルシリティック特性の評価法の概要を記載する。カルシウム模倣性またはカルシリティック化合物の、正味流体運動（Ｊｖ）、細胞内カルシウムの変化およびＩＰ３蓄積のＣａＳＲ依存性調節に対する影響は、新しく単離された結腸陰窩または分散された結腸細胞を用いて評価することができる。

インビトロでの腺窩単離および潅流法
１５０から２００ｇの間の体重の絶食していないオスＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットまたは２０から３０ｇの体重のマウスを全ての実験において使用した。ラットまたはマウスのいずれかについて同じプロトコルを行うことができる。動物を殺した後、個々の腺窩を手で切開することにより、遠位結腸から入手する。結腸陰窩、尿細管および胃腺についてすでに詳細に記載されている微細潅流法（Ｇｅｉｂｅｌ，Ｊ．ｅｔ ａｌ．１９８９ Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ ２５７：Ｆ７９０−Ｆ７９７；Ｂｏｒｏｎ，Ｗ．Ｆ．ｅｔ ａｌ．，１９９４．Ｊ．Ｅｘｐ．Ｂｉｏｌ．１９６：３４７−３６０）を用いて、正味流体運動（Ｊｖ）を測定する。簡単に説明すると、１つの手で切開された腺窩を恒温室中で、倒立顕微鏡の試料台上に載せる。同心ガラスマイクロピペットのアセンブリを用いて、腺窩の盲端を保持する。潅流ピペットを使用して、この盲端を穿刺し、メトキシ−^３Ｈ−イヌリンを含有する潅流液を腺窩内腔中に順方向で導入する。マイクロピペットの第二の組を用いて、腺窩の開放端にカニューレを挿入し、流出物を集める。挿管後、内腔および浴溶液をそれぞれ４から１０ｎｌ／分および５ｍｌ／分で連続して流す。体積目盛り付きピペットを用いて流出物をの試料を取る。腺窩の長さおよび直径、流出物が収集ピペット中に蓄積する速度および潅流液および流出物中のメトキシ−^３Ｈ−イヌリンの濃度からＪｖを決定する。［メトキシ−^３Ｈ−イヌリン］はシンチレーションカウンターで測定した。浴（結腸陰窩の血液側、すなわち内腔でない方の液体）も集めて、潅流ピペットまたは腺窩のいずれかからの漏れを制御する。浴［メトキシ−^３Ｈ−イヌリン］がバックグラウンドを超えた場合は常に実験を廃棄する。Ｊｖはｎｌ／ｍｍ分として表される。各データ点は、３回の流出物の５分収集の平均を表す。プラスの値は正味吸収を表し、マイナスの値は正味分泌を表す。

少なくとも５の腺窩を各実験プロトコルにおいて研究する。各実験の最後に、腺窩の生存能力をトリパンブルーで評価し、細胞が色素を排除できなかった実験を捨て；１５％より少ない腺窩が廃棄される。

ラット、マウスまたはヒトから新たに単離された結腸陰窩または結腸細胞
結腸をラットまたはマウスまたはヒトから入手した外科標本から取り出し、縦方向に切開し、洗浄し、次いで裏返して粘膜表面を露出させる。表面細胞を得るために、裏返された結腸を粘膜上でスライドガラスでやさしくこするか、または３７℃で、（ｍＭ）９６ ＮａＣｌ、２７ Ｎａ シトレート、０．８ ＫＨ_２ＰＯ_４、５．６ Ｎａ_２ＨＰＯ_４および１．５ Ｄ−グルコース、ｐＨ ７．４を含有するＮａ−シトレート緩衝液中で１５分間温置する。単離された腺窩を得るために、結腸切片を、１５分間、３７℃で、（ｍＭ）９６ ＮａＣｌ、１．５ ＫＣｌ， ２１ Ｎａ ＥＤＴＡ、５５ ソルビトール、２２ シュークロースおよび１０ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４を含有するＮａ−ＥＤＴＡ緩衝液中で温置する（方法３）。各温置の最後に、結腸切片を３０秒間激しく撹拌して、表面細胞または個々の腺窩を放出させる。放出された細胞または腺窩を直ちに２容積の、（ｍＭ）１２５ ＮａＣｌ、５．０ ＫＣｌ、１．０ ＣａＣｌ_２、１．２ＭｇＳＯ_２、２．０ ＮａＨ_２ＰＯ４、５．０ Ｄ−グルコースおよび３２ ＨＥＰＥＳ、ｐＨ ７．４を含有する標準リンゲル液と混合する。遠心分離（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ Ａｌｌｅｇｒａ ６Ｒ遠心分離器中、２０００ｒｐｍで５分間）により細胞を集め、３回基礎リンゲル液中で洗浄し、および基礎リンゲル液中に再懸濁させる。基礎リンゲル液は、Ｃａ^２＋およびＭｇ^２＋の両方が０．１から０．５ｍＭに減少している以外は、標準リンゲル液と同じ組成を含有する。

腺窩細胞の異なる断片または領域を単離するために、結腸切片のＮａ−ＥＤＴＡ緩衝液中で順次消化を用いる。１５分間Ｎａ−シトレート緩衝液中で温置し、表面細胞を除去した後、結腸をＮａ−ＥＤＴＡ緩衝液中に移し、３７℃で５分間温置する。次に結腸切片を撹拌し、緩衝液から除去し、緩衝液を遠心分離して、腺窩の外側１／３からなるペレットを得る。結腸切片のＮａ−ＥＤＴＡ緩衝液（５分、３７℃）を用いた連続温置と、これに続く激しい撹拌により、腺窩の真ん中の１／３が放出される。さらに３から５分間撹拌しながら温置すると、腺窩の内側１／３が放出された。放出された細胞を２容積の氷冷標準リンゲル液中で希釈し、遠心分離により集める。表面細胞および腺窩細胞の３領域の連続分離は、ｐ−ニトロフェニルホスフェートを基質として使用して、アルカリホスファターゼ活性（ＤＵ（登録商標） ６４０Ｂ分光光度計（Ｂｅｃｋｍａｎ Ｃｏｕｌｔｅｒ）において製造業者（Ｓｉｇｍａ Ｄｉａｇｎｏｓｔｉｃｓ，Ｉｎｃ．，Ｓｔ．Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ）の指示に従って測定）を測定することにより実証できる。結果を、波長４０５ｎｍでのタンパク質１ｍｇあたり、１分あたりの吸収増加で表す。

正味流体（Ｊｖ）測定
単離された潅流結腸陰窩における正味流体運動（Ｊｖ、ｎｌ／分^＊ｍｍ腺窩長さ）の測定に用いられる方法は、Ｇｅｉｂｅｌ，Ｊ．Ｐ．ｅｔ ａｌ．２００１．Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２０：１４４−１５０において詳細に開示されている。Ｊｖは、収集ピペット中に流出物が蓄積する速度および潅流液および流出物中のメトキシ−［^３Ｈ］イヌリンの濃度として計算される。プラスのＪｖ値は、内腔から浴への正味流体運動（吸収）を示し、マイナスの値は、浴から内腔への正味運動（分泌）を示す。図１は、正味Ｊｖ（ｎｌ／分^＊ｍｍ腺窩長さ）の測定値を表し、これは２成分、内腔から浴への大量の流体流動（吸収基礎^ａｂｓＪｖ）および少量の浴から内腔への分泌成分の流れ（分泌促進物質の不在下；基礎^ｓｅｃＪｖ）からなる。追加の基底外側のブメタニドは^ｓｅｃＪｖを無効にし、「純粋な」吸収流れは、^ｎｅｔＪｖ＝^ａｂｓＪｖ＋^ｓｅｃＪｖに等しく；^ａｂｓＪｖはプラスのフラックスであり、^ｓｅｃＪｖはマイナスの流れである。

前記方法は、マウス、ラットおよびヒト物質について使用できる。

結腸細胞における細胞内Ｃａ^２＋反応の測定
化合物のカルシウム模倣性またはカルシリティック特性は、Ｆｌｕｏ−３またはＦｕｒａ−２を用いて、単離された結腸細胞懸濁液の細胞内Ｃａ^２＋の変化の測定を用いて評価することもできる。細胞をＦｌｕｏ−３ ＡＭまたはＦｕｒａ−２ ＡＭのいずれかの溶液に５μＭで２０から３０分間、室温に暴露させて、吸収およびエステル加水分解をさせる。次に細胞を３７℃で約２０分間洗浄して、吸収されなかった、または腺窩の細胞外表面上で脱エステル化された任意の細胞外色素を除去する。細胞懸濁液に関する蛍光測定（Ｆｌｕｏ−３：４８０ｎｍ励起、５２０ｎｍ発光、５ｎｍ帯域；Ｆｕｒａ−２：３４０／３８０ｎｍ励起、５１２ｎｍ発光、５ｎｍ帯域）を、３７℃に維持されたサーモスタット制御の２ｍｌキュベット中で、０．１ｍＭ Ｃａ^２＋を含有する基礎リンゲル液中、一定して撹拌しながら行った。所与の濃度のカルシウム模倣性またはカルシリティック物質での累積的細胞内Ｃａ^２＋反応を測定する。

腸シートにおける短絡回路電流測定
化合物のカルシウム模倣性またはカルシリティック特性は、腸シートにおける短絡回路電流の測定を用いて評価することもできる。結腸または小腸の切片をラットまたはマウス、もしくはヒト外科標本から迅速に取り出す。切片を腸間膜境界に沿ってフラットシートに切り出し、氷冷された基礎ＨＥＰＥＳ−リンゲル溶液（０．１ｍＭ ＣａおよびＭｇを含有）にて洗浄フラッシュする。漿膜、縦および円形筋肉および粘膜下層が剥離された全小腸層または粘膜結腸層を使用する。腸のシートを修飾Ｕｓｓｉｎｇチャンバーの２つの半分の間にのせ、溶液耐性について修正された電圧固定法（ＶＣＣ ＭＣ６；Ｐｈｙｓｉｏｌｏｇｉｃ Ｉｎｓｔｒｕｍｅｎｔｓ）により短絡させる。暴露面積は０．３から１．０ｃｍ^２である。組織の粘膜および漿膜表面を３７℃に維持し、１００％Ｏ_２を連続して吹き込んだ、３から５ｍＬ Ｈｅｐｅｓ−リンゲル溶液（ｐＨ ７．４）を含む容器中に漬ける。組織を最低４０分間安定化させ、基礎記録期間の後、化合物を上皮の頂点または基底外側に添加する。反応を連続して記録し、ＤＡＴＡＱ（商標）装置によりデータを取得し、ＰＣに保存し、プログラムＡｃｑｕａｌｉｚｅＴＭを用いて処理した。Ｈｅｐｅｓ−リンゲル溶液は（ミリモル／Ｌ）：ＮａＣｌ １２５；ＫＣｌ ５；ＭｇＣｌ_２ ０．５；ＨＥＰＥＳ ２２、ＣａＣｌ_２ ０．１または１．６；グルコース １０、ｐＨ ７．４を含有する。溶液に１００％ Ｏ_２を吹き込む。安定な基礎またはホルスコリンに刺激された負の短絡電流を得た後、電流の漿膜または粘膜側の化合物の添加に対する応答を記録する。

ＭＴＣ ６−２３細胞カルシトニン放出
ラットＭＴＣ ６−２３細胞（クローン６）（ＡＴＣＣ（Ｍａｎａｓｓａｓ，ＶＡ）から購入）を、３から４日ごとに取り替えられる増殖培地（ＤＭＥＭ 高グルコースとカルシウム／１５％ ＨＩＨＳ）中で維持する。培養物を毎週１：４分割比で継代させる。処方された増殖培地中のカルシウム濃度は３．２ ｍＭと計算される。細胞を９０％ Ｏ_２／１０％ ＣＯ_２、３７℃の雰囲気中で温置する。実験前に、サブコンフルーエント培養物からの細胞を吸引し、トリプシン溶液で１回洗浄する。フラスコを再度吸引し、室温で、新しいトリプシン溶液とともに５から１０分間温置して、細胞を解離させる。解離した細胞を３．０ｘ１０^５細胞／ｍＬの密度で、増殖培地中に懸濁させ、１．５ｘ１０^５細胞／ウェル（０．５ｍＬ 細胞懸濁液）の密度で、コラーゲン被覆された４８ウェルプレート（Ｂｅｃｔｏｎ Ｄｉｃｋｉｎｓｏｎ Ｌａｂｗａｒｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）中に播種する。細胞を播種後５６時間接着させ、その後、増殖培地を吸引し、０．５ｍＬのアッセイ培地（ＤＭＥＭ 高グルコース／２％ ＦＢＳを含まない）で置換した。次に細胞を、カルシウムに刺激されたカルシトニン放出の決定前に１６時間温置する。この培地中の実際のカルシウム濃度は、０．０７ｍＭ未満と計算される。カルシトニン放出を測定するために、０．３５ｍＬのアッセイ培地中試験薬を各ウェルに添加し、４時間温置した後、培地中のカルシトニン含量を決定する。カルシトニンレベルは、製造業者の指示に従い、ラットカルシトニン免疫放射定量測定法キット（Ｉｍｍｕｔｏｐｉｃｓ、Ｓａｎ Ｃｌｅｍｅｎｔｅ、ＣＡ）を用いて定量化される。

イノシトールホスフェート分析
化合物のカルシウム模倣性またはカルシリティック特性は、ラット脳から得られたクローンされたＣａＳＲを含有する発現ベクター［ＣＨＯ（ＣａＳＲ）］または含有しない発現ベクター［ＣＨＯ（ＷＴ）］で形質移入されたチャイニーズ・ハムスター卵巣（ＣＨＯ）細胞に関して行われる生化学分析において評価することもできる（Ｒｕａｔ Ｍ．＆ Ｓｎｏｗｍａｎ ＡＭ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１，１９９６，ｐ５９７２）。ＣＨＯ（ＣａＳＲ）は、Ｃａ^２＋および他の二価カチオンおよび化合物Ａ（Ｎ−（３−［２−クロロフェニル］−プロピル）−Ｒ−≪−メチル−３−メトキシベンジルアミンＨＣｌ）によるＣａＳＲの活性化に際してトリチウム化イノシトールホスフェート（［^３Ｈ］ＩＰ）蓄積を刺激することが示されている（Ｒｕａｔ ｅｔ ａｌ．，Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ ２７１，１９９６）。従って、１０μＭの各ＣａＳＲ活性化合物により２ｍＭ 細胞外カルシウムの存在下で産生される［^３Ｈ］ＩＰ蓄積を測定し、最大ＣａＳＲ活性化を惹起する濃度である１０ｍＭの細胞外カルシウムにより得られる結果と比較することができる（Ｄａｕｂａｎ Ｐ．ｅｔ ａｌ．，Ｂｉｏｏｒｇａｎｉｃ ＆ Ｍｅｄｉｃｉｎａｌ Ｃｈｅｍｉｓｔｒｙ Ｌｅｔｔｅｒｓ，１０，２０００，ｐ２００１）。この分析は、単離された結腸陰窩または分散された結腸細胞におけるカルシウム模倣性またはカルシリティック化合物に応答した［^３Ｈ］ＩＰ_３蓄積を評価するためにも使用できる（Ｃｈｅｎｇ ｅｔ ａｌ．，Ｇａｓｔｒｏｅｎｔｅｒｏｌｏｇｙ １２６，２００４，ｐ１４８）。

溶液および化学物質
ＨＥＰＥＳ−リンゲル溶液は（ミリモル／Ｌ）：ＮａＣｌ １２５；ＫＣｌ ５；ＭｇＣｌ_２ ０．５；ＨＥＰＥＳ ２２、ＣａＣｌ_２ ０．１または１．６；グルコース １０、ｐＨ ７．４を含有していた。溶液に１００％Ｏ_２を吹き込んだ。ホルスコリン、ＩＢＭＸおよびブメタニドをＳｉｇｍａ Ｃｈｅｍｉｃａｌ（Ｓｔ Ｌｏｕｉｓ，ＭＯ，ＵＳＡ）から入手し、ストック溶液はジメチルスルホキシド（ＤＭＳＯ）中で調製した。ＤＭＳＯの最終濃度は、０．１％（ｖ／ｖ）を超えない。予備実験は、ビヒクルがベースライン電気生理学的パラメータを変更しないことを示した。

ＣＴＸ、ＳＴＡおよびグアニリンをＨＥＰＥＳ−リンゲル緩衝液中に、図２に示される所望の濃度に調合した。

この実験は、流体分泌に対するカルシウム模倣性物質の影響を示す。

結腸上皮細胞におけるＣａＳＲの機能的関連性、特に、下痢状態における腸液流動の調節におけるこの能力を評価するために、内腔または基底外側のＣａＳＲ活性化の効果およびＪｖに対する調節を、ｃＡＭＰおよびｃＧＭＰレベルに影響を及ぼす基礎および薬剤両方において、単離されたラット結腸陰窩において決定した。

図２Ａおよび２Ｂは、ｃＡＭＰ産生を誘発する薬剤（例えば、ホルスコリン、コレラ毒素）の不在下および存在下、浴または内腔潅流液中、細胞外カルシウムを０．１ｍＭから２ｍＭに上昇させる前および後の、潅流結腸陰窩におけるＪｖの変化をまとめる。ホルスコリンまたはコレラ毒素の不在下、平均Ｊｖ値は、正味液体の吸収を表す（ＡおよびＢ、白抜きの棒グラフ）。ホルスコリンまたはコレラ毒素に０．１ｍＭ Ｃａで暴露すると、正味体液分泌が誘発される（ＡおよびＢ、黒の棒グラフ）。浴または内腔潅流液中、Ｃａ^２＋の０．１ｍＭから２ｍＭへの上昇は、ホルスコリンまたはコレラ毒素により誘発される正味体液分泌を逆転させ、その結果、正味液体吸収が得られる（ＡおよびＢ、黒の棒グラフ）。

図２Ｃおよび２Ｄは、ｃＧＭＰ産生を誘発する薬剤（例えば、グアニリン、ＳＴａ）の不在下および存在下での、浴または内腔潅流液中、細胞外カルシウムが０．１ｍＭから２ｍＭに上昇する前後での潅流結腸陰窩におけるＪｖの変化をまとめる。グアニリンまたはＳＴａの不在下で、平均Ｊｖ値は、正味液体の吸収を示す（ＣおよびＤ、白抜きの棒グラフ）。グアニリンまたはＳＴａに０．１ｍＭ Ｃａで暴露すると、正味体液分泌が誘発された（ＡおよびＢ、黒の棒グラフ）。浴または内腔潅流液中Ｃａ^２＋を０．１ｍＭから２ｍＭに上昇させると、グアニリンまたはＳＴａにより誘発される正味体液分泌が逆転し、その結果正味液体吸収が得られた（ＣおよびＤ、黒の棒グラフ）。

図３（Ａ−Ｇ）は、化合物Ａが用量依存的な仕方で、ホルスコリンにより誘発される正味体液分泌を浴中、０．１ｍＭ Ｃａ^２＋の存在下にて弱めることを示す。黒の棒グラフ（パネルＡ−Ｇ）は、ホルスコリンおよび化合物Ａの不在下での正味液体吸収を示す。白抜きの棒グラフは、ホルスコリン（１０μＭ）の存在下での正味体液分泌を示す。斜線の棒グラフ（パネルＡ−Ｇ）は、化合物Ａが用量依存的な方法でＥＣ_５０５．１ｐＭで浴正味体液分泌を弱めることを示す（図３、パネルＨ）。

図４（Ａ−Ｇ）は、Ｒ５６８が用量依存的な仕方で、内腔中、０．１ｍＭ Ｃａ^２＋の存在下で、ホルスコリンにより誘発される正味体液分泌を弱めることを示す。黒の棒グラフ（パネルＡ−Ｇ）は、ホルスコリンおよび化合物Ａ、Ｒ−立体異性体の不在下での正味液体吸収を示す。白抜きの棒グラフは、ホルスコリン（１０μＭ）の存在下での正味体液分泌を示す。斜線の棒グラフは（パネルＡ−Ｇ）は、化合物Ａが用量依存的な方法で、内腔正味体液分泌をＥＣ_５０２３．４ｐＭで弱めることを示す。（図４、パネルＨ）。

図５（Ａ−Ｇ）は、Ｓ５６８が用量依存的な仕方で、ホルスコリンにより誘発される正味体液分泌を、浴中０．１ｍＭ Ｃａ^２＋の存在下で弱めることを示す。黒の棒グラフ（パネルＡ−Ｇ）は、ホルスコリンおよび化合物Ａ、Ｓ−立体異性体の不在下での正味液体吸収を示す。白抜きの棒グラフは、ホルスコリン（１０μＭ）の存在下での正味体液分泌を示す。斜線の棒グラフ（パネルＡ−Ｇ）は、化合物Ａ、Ｓ−立体異性体は、用量依存的な方法で、浴正味体液分泌をＥＣ_５０６１９ｐＭで弱めることを示す（図５、パネルＨ）。

図６（Ａ−Ｇ）は、化合物Ａ、Ｓ−立体異性体が、用量依存的な仕方で、ホルスコリンにより誘発される正味体液分泌を内腔中、０．１ｍＭ Ｃａ^２＋の存在下で弱めることを示す。黒の棒グラフ（パネルＡ−Ｇ）は、ホルスコリンおよび化合物Ａの不在下での正味液体吸収を示す。白抜きの棒グラフは、ホルスコリン（１０μＭ）の存在下での正味体液分泌を示す。斜線の棒グラフ（パネルＡ−Ｇ）は、化合物Ａ、Ｓ−立体異性体が用量依存的な方法で、内腔正味体液分泌をＥＣ_５０７５６ｐＭで弱めることを示す（図６、パネルＨ）。

この実施例は、Ｃａ^２＋およびカルシウム模倣性物質の分泌促進物質により刺激された環状ヌクレオチド蓄積に対する影響を示す。環状ヌクレオチド蓄積は、次の方法を用いて測定された。簡単に言うと、結腸陰窩細胞懸濁液を３７℃で、１μＭ ホルスコリン（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）とともに１５分間、１μＭグアニリンおよび１０μＭ ＳＴａとともに４５分間、１ｍＭ ＩＢＭＸ（３−イソブチル−ｌ−メチルキサンチン）（Ｓｉｇｍａ，Ｓａｉｎｔ Ｌｏｕｉｓ，Ｍｉｓｓｏｕｒｉ）の存在下または不在下で温置した。腺窩を低Ｃａ^２＋（０．１ｍＭ Ｃａ^２＋）または高Ｃａ^２＋（２ ｍＭ）のいずれかまたはＧｄ^３＋（２５０ μＭ）を含有するＨｅｐｅｓ緩衝液に暴露させた。作動物質および／またはＩＢＭＸ（０または１ｍＭ）を添加した後、各時点の最後で、２ｍｌの氷冷された純粋な（１００％）エタノールを１ｍｌの腺窩細胞懸濁液に添加することにより反応を停止させ、その結果、６６％（ｖ／ｖ）エタノールの最終懸濁液体積を得た。懸濁液を沈降させ、次に上清を試験管から除去した。残りの沈殿を氷冷６６％（ｖ／ｖ）エタノールで洗浄し、適切な試験管に添加し、Ｃａ^２＋およびＩＢＭＸ濃度に基づいて標識する。抽出物を２０００ｒｐｍで１５分間、４０℃で遠心分離し、上清を新しい試験管中に移した。次に抽出物を６５℃、真空遠心分離下で凍結乾燥した。サイクリックＡＭＰおよびサイクリックＧＭＰ（細胞タンパク質１ミリグラムあたりのフェムトモル数）を、商業的に入手可能な酵素免疫測定キット（Ａｍｅｒｓｈａｍ，Ｂｕｃｋｉｎｇｈａｍ，Ｅｎｇｌａｎｄ）を用いて測定した。

図７（Ａ、Ｂ）は、ＣａＳＲが不活性である場合、ホルスコリン（Ａ）およびコレラ毒素（Ｂ）はｃＡＭＰ産生を誘発することを示す（黒の棒グラフ、０．１ｍＭ Ｃａ^２＋）。２．０ｍＭの細胞外Ｃａ^２＋によるＣａＳＲの活性化は、ホルスコリンまたはコレラ毒素誘発性サイクリックＡＭＰ産生を弱める。イソブチル−１−メチル−キサンチン（ＩＢＭＸ）、ＰＤＥ阻害剤の添加は、この効果を逆転させる。

図７（Ｃ、Ｄ）は、ＣａＳＲが不活性である場合に、グアニリン（Ｃ）およびＳＴａ（Ｄ）はｃＧＭＰ産生を誘発することを示す（黒の棒グラフ、０．１ｍＭ Ｃａ^２＋）。２．０ｍＭの細胞外Ｃａ^２＋によるＣａＳＲの活性化は、グアニリンまたはＳＴａ誘発性サイクリックＧＭＰ産生を弱める。ＩＢＭＸ（１ｍＭ）の添加は、この効果を逆転させる。

図８（Ａ）は、ＣａｓＲが不活性である場合に、コレラ毒素はサイクリックＡＭＰ産生を誘発することを示す（黒の棒グラフ、０．１ｍＭ Ｃａ^２＋）。２．０ｍＭの細胞外Ｃａ^２＋によるＣａｓＲの活性化は、コレラ毒素誘発性サイクリックＡＭＰ産生を弱める。ＩＢＭＸの添加は、この効果を逆転させる。

図８（Ｂ）は、ＣａｓＲが不活性である場合に、ＳＴａはサイクリックＧＭＰ産生を誘発することを示す（黒の棒グラフ、０．１ｍＭ Ｃａ^２＋）。２．０ｍＭの細胞外Ｃａ^２＋によるＣａｓＲの活性化は、ＳＴａ誘発性サイクリックＧＭＰ産生を弱める。ＩＢＭＸの添加は、この効果を逆転させる。

図８（Ｃ）は、ＣａｓＲが不活性である場合に、コレラ毒素はサイクリックＡＭＰ産生を誘発することを示す（黒の棒グラフ、０．１ｍＭ Ｃａ^２＋）。カルシウム模倣性化合物Ａ（Ｒ−立体異性体）の添加は、用量依存的方法で、サイクリックＡＭＰを対照レベル（白抜きの棒グラフ）まで減少させる（黒の棒グラフ）。

図８（Ｄ）は、ＣａｓＲが不活性である場合に、グアニリンは、サイクリックＧＭＰ産生を誘発することを示す（黒の棒グラフ、０．１ｍＭ Ｃａ^２＋）。カルシウム模倣性物質の添加は、対照レベル（白抜きの棒グラフ）までサイクリックＧＭＰを用量依存的な方法で減少させる（黒の棒グラフ）。

図９Ａ、９Ｂおよび９Ｃは、化合物Ａ（Ｒ−立体異性体）がホルスコリンおよびＰＬＣ阻害剤Ｕ７３１２２の不在下および存在下で、ラット間代性腺窩において、正味Ｊｖに対して影響を及ぼさないことを示す。ホルスコリンの不在下で、平均Ｊｖ値は、正味液体吸収を示す（Ａ、ＢおよびＣ、白抜きの棒グラフ）。ホルスコリンおよびホスファチジルイノシトール−ホスホリパーゼＣ（ＰＬＣ）阻害剤（Ｕ７３１２２、１０μＭ）に、０．１ｍＭカルシウムの存在下で暴露することにより、正味体液分泌が誘発された（Ａ、ＢおよびＣ、黒の棒グラフ）。化合物Ａを内腔または浴に添加することは、正味体液分泌の逆転に有意な影響を及ぼさず（ＡおよびＢ、黒の棒グラフ）、このことは、ＰＩ−ＰＬＣのＣａｓＲにより媒介される活性化についての役割を示す。化合物Ａの内腔および浴両方への添加は、正味体液分泌を完全に逆転させなかった（Ｃ 黒の棒グラフ）。

この実施例は、マウスにおけるカルシウム模倣性のＰ３８−関連ＴＮＦ−α毒性に対する影響を示す。

メスＢＡＬＢ／ｃマウス（１８から２０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、実験前、少なくとも２週間順化させた。ｒＨｕ−ＴＮＦ−αをＡｍｇｅｎ Ｐｒｏｔｅｉｎ Ｓｃｉｅｎｃｅｓから入手した。マウスに２−（（（２Ｓ）−２−アミノ−３−フェニルプロピル）アミノ）−３−メチル−５−（２−ナフタレニル）−６−（４−ピリジニル）−４（３Ｈ）−ピリミジノン（化合物Ｃ）を１０ｍｇ／ｋｇ（２００μｌ／マウス）で、ＴＮＦ−α（１０μｇ／マウス、ＩＶ）による攻撃の１時間前に経口投与した。化合物Ｂ（Ｎ−（（６−（メチルオキシ）−４’−（トリフルオロメチル）−ｌ，１’−ビフェニル−３−イル）メチル）−１−フェニルエタナミン）を化合物Ｃと同時に、１、３、１０、または３０ｍｇ／ｋｇの用量で皮下投与した。各処理群からの１０匹のマウスのうち５匹を、ＴＮＦ−αの投与後３時間に、小腸液蓄積の測定のために殺した。小腸の全長を慎重に切開し、近位および遠位端をクランプでとめ、無傷小腸を腹腔から取り出した。腸の内腔液内容物を円錐管中に排出させ、体積を測定した。各群からの残りの５匹のマウスを生存について記録した。

図１０は、化合物Ｂでの処理は、小腸における液体蓄積の体積において用量依存的な減少を引き起こしたことを示す。３時間を超えて生存したマウスは、化合物ＣおよびヒトＴＮＦ−αの同時投与後に予想されたように１００％死亡率を示した。化合物Ｂ（１０ｍｇ／ｋｇ）での処理は、死亡から完全に保護した（表５）。低い投与量の化合物Ｂは死に対して部分的に保護した。

この実験は、カルシウムおよびカルシウム模倣性物質は分泌促進物質により刺激された正味体液分泌に対してＣａＳＲゼロマウスにおいて影響がないことを示す。

二重Ｃａｓｒ−およびＧｃｍ２−欠損マウスを、Ｑｉｓｈｅｎｇ Ｔｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ Ｉｎｖｅｓｔ．１１１：１０２９から１０３７，２００３において記載されているようにして調製した。Ｃａｓｒ遺伝子の欠損の結果、副甲状腺主細胞からの副甲状腺ホルモン（ＰＴＨ）の無秩序な放出の毒性効果ならびにその結果としての高カルシウム血症の病理学的効果から、出生後早期に死亡する。Ｈｏ，Ｃ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ Ｇｅｎｅｔｉｃｓ １１，３８９から３９４，１９９５。グリア細胞欠損２（Ｇｃｍ２）は、副甲状腺発生に重要な調節遺伝子である。Ｇｃｍ２の欠失の結果、副甲状腺を有さないマウスが得られる。Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４０６，１９９−２０３，２０００。しかしながら、これらのＧｃｍ２^−／−マウスは、骨格の完全性を維持するために十分な胸腺からおそらくは発するＰＴＨの低い循環レベルを示し、このＰＴＨ源は、ＣａＳＲにより調節されない（Ｇｕｎｔｈｅｒ，Ｔ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔｕｒｅ ４０６，１９９−２０３、２０００；Ｔｕ ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１ １０２９から１０３７，２００３）。従って、Ｇｃｍ２の欠失は、Ｃａｓｒゼロマウスにおける早期死亡を解消する。

結腸上皮細胞におけるＣａＳＲの機能的関連性、特に、下痢状態において腸液流動調節におけるこの能力を評価するために、結腸陰窩を野生型マウス（Ｃａｓｒ^＋／＋：Ｇｃｍ２^＋／＋ 正常）およびＣａＳＲが欠失しているマウス（Ｃａｓｒ^−／−：Ｇｃｍ２^−／−）から取り出した。

図１１は、浴中、細胞外カルシウムが０．１ｍＭから２ｍＭに上昇する前後で、ｃＧＭＰ（グアニリン）またはｃＡＭＰ（ＣＴＸ）産生のいずれかを誘発する薬剤の不在下および存在下で、Ｃａｓｒ^＋／＋：Ｇｃｍ２^＋／＋およびＣａｓｒ^−／−：Ｇｃｍ２^−／−マウスからの潅流結腸陰窩における正味Ｊｖにおける変化をまとめる。

平均Ｊｖ値は、毒素の不在下、カルシウム濃度０．１ｍＭでのＣａｓｒ^＋／＋：Ｇｃｍ２^＋／＋またはＣａｓｒ^−／−：Ｇｃｍ２^−／−マウスのいずれかからの潅流結腸陰窩における正味液体吸収（図１１、ＡおよびＣ）を示す。グアニリンまたはＣＴＸ（０．１ｍＭ カルシウム）に暴露することにより、正味体液分泌が誘発された（図１１、ＡおよびＣ；ＣＴＸ、白抜きの棒グラフ、グアニリン、黒の棒グラフ）。細胞外カルシウム濃度を０．１ｍＭから２ｍＭに上昇させることは、Ｃａｓｒ^＋／＋：Ｇｃｍ２^＋／＋マウスからの結腸陰窩において、グアニリンおよびＣＴＸにより誘発される正味体液分泌を逆転させたが（図１１Ａ）、Ｃａｓｒ^−／−：Ｇｃｍ２^−／−からの腺窩においては逆転させなかった（図１１Ｃ）。

化合物Ａ（Ｒ−立体異性体）、１００ｎＭの添加は、０．１ｍＭ カルシウムの存在下で、Ｃａｓｒ^−／−：Ｇｃｍ２^−／−マウスからの結腸陰窩においてグアニリン（黒の棒グラフ）およびＣＴＸ（白抜きの棒グラフ）により誘発される正味体液分泌を逆転させなかったが（図１１Ｄ）、一方、０．１ｍＭ カルシウムの存在下で、Ｃａｓｒ^＋／＋：Ｇｃｍ２^＋／＋マウスからの結腸陰窩においてこれらの薬剤により誘発される正味体液分泌を有効に逆転させた（図１１Ｂ）。図１１において、値は平均±ＳＥＭである。星印、分泌促進物質なしと比較して、Ｐ＜０．００１：＃、ＣａＳＲ作動物質のない分泌促進物質と比較して、Ｐ＜０．０１。

この実施例は、細胞外カルシウムまたは化合物Ａのいずれかが、ラット結腸陰窩における基底外側（血液−間質）から腺窩内腔への塩化物イオンの分泌促進物質誘発性分泌を逆転させることを示す。

結腸陰窩の内腔中への体液分泌は、塩化物イオン（Ｃｌ⁻）の、内腔原形質膜を横切って、嚢胞性線維性膜貫通コンダクタンス制御因子（ＣＦＴＲ）塩化物チャンネルを通る動きに依存する。Ｎｅｖｅｓ，Ｓ．Ｒ．ｅｔ ａｌ．Ｓｃｉｅｎｃｅ ２９６，１６３６−１６３９，２００２。ｃＡＭＰまたはｃＧＭＰの細胞蓄積における分泌促進物質により誘発される増加は、それぞれ、ＰＫＡおよびＰＫＧリン酸化プロセスを促進し（Ｇｏｌｉｎ−Ｂｉｓｅｌｌｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｅｌｌ Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９，Ｃ７０８−Ｃ７１６，２００５；Ｎｅｖｅｓ ｅｔ ａｌ．）、これは、活性化ＣＦＴＲチャンネルを内腔原形質膜へと移動させる。分泌促進物質に刺激された体液分泌中の経上皮Ｃｌ⁻輸送について等しく重要なのは、ブメタニド−感受性Ｎａ−Ｋ−２Ｃ１共輸送体（ＮＫＣＣｌ）による基底外側液から細胞中への増大したＣｌ⁻流入である。ＮＫＣＣｌが欠損した成体マウスＡは、ｃＡＭＰおよびＳＴａに対する異常分泌反応を示す。（Ｆｌａｇｅｌｌａ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２７４，２６９４６−２６９５５，１９９９）。

Ｃｌ⁻測定。細胞Ｃｌ⁻流入測定（Ｅｇａｎ，Ｍ．Ｅ．ｅｔ ａｌ．Ｎａｔ．Ｍｅｄ．８，４８５−４９２，２００２）を、細胞−ｔａｋ（細胞−Ｔａｋ(商標)，ＢＤ ｂｉｏｓｃｉｅｎｃｅ，Ｂｅｄｆｏｒｄ，ＭＡ）で被覆され、２０ｍＭ ＭＱＡＥ［（Ｎ−６−メトキシキノリル）アセトエチルエステル；Ｍｏｌｅｃｕｌａｒ Ｐｒｏｂｅｓ］を負荷したカバーガラス上の単離された、表面潅流された結腸陰窩に関して行った。色素負荷後、腺窩を無Ｃｌ⁻ ＨＥＰＥＳ緩衝液中で、安定な高ベースライン蛍光強度が達成されるまで温置した。細胞Ｃｌ⁻流入速度を、任意のＭＱＡＥ蛍光単位（ΔＡＦＵ／分；Ｅｘ：３４６ｎｍ；ＥＭ：４６０ｎｍ）における減少速度として記録した。

Ｃａ^２＋およびカルシウム模倣性物質の結腸陰窩細胞中へのホルスコリン刺激性基底外側Ｃｌ⁻流入の効果。図１２（ＡおよびＢ）に示された結果は、ラット潅流結腸陰窩において、０．１ｍＭ カルシウムの存在下でのホルスコリンの基底外側の添加は、結腸陰窩細胞中への基底外側のＣｌ⁻流入を刺激することを示す（ＭＱＡＥ蛍光における降下によりモニターされる細胞Ｃｌ⁻における上昇）。ラット潅流結腸陰窩において、ＮＫＣＣｌ共輸送体によるＣｌ⁻流入を阻害する、１００μＭ ブメタニドの基底外側の添加は、結腸陰窩細胞中への基底外側のＣｌ⁻流入による細胞Ｃｌ⁻におけるホルスコリンに刺激された増加を無効にした。カルシウム模倣性化合物Ａ（１００ｎＭ）の基底外側の液への添加はさらに、ホルスコリンに刺激されたＣｌ⁻流入の速度を著しく低下させた。０．１ｍＭの濃度での細胞外Ｃａ^２＋は、ＣＴＸに刺激された結腸陰窩細胞中への基底外側のＣｌ⁻流入を無効にしなかった（図１２Ｂ）。カルシウムの濃度が０．１から２ｍＭに増加すると、ＣＴＸの存在下でのＮＫＣＣｌによるＣｌ⁻流入が阻害された（図１２Ｂ）。Ｂにおける値は、平均±ＳＥＭである。星印、分泌促進物質なしと比較して、Ｐ＜０．０１：＃、阻害剤またはＣａＳＲ作動物質のない分泌促進物質と比較して、Ｐ＜０．０１。かっこ内の数は、実験された腺窩の数である。カルシウム（Ｃａ）濃度はミリモル濃度である。

これらの実験は、ＣａＳＲの活性化は、液体分泌メカニズムの重要な成分であるＮＫＣＣｌ活性を阻害することを示す。

この実施例は、細胞外カルシウムまたは化合物Ａのいずれかは、ラット結腸陰窩における液体吸収の分泌促進物質誘発性阻害を逆転させることを示す。

分泌性下痢における環状ヌクレオチド依存性液体損失は、吸収プロセスにおける減少および分泌プロセスにおける増加により起こる。Ｌｕｃａｓ，Ｍ．Ｌ．Ｊ．Ａｐｐｌ．Ｍｉｃｒｏｂｉｏｌ．９０，７−２６、２００１；Ｇｏｌｉｎ−Ｂｉｓｅｌｌｏ，Ｆ．ｅｔ ａｌ．Ａｍ．Ｊ．Ｃｅｌｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２８９，Ｃ７０８−Ｃ７１６，２００５。結腸上皮腺窩は、これらの２つのプロセスの相対的大きさに依存する正味流体運動（^ｎｅｔＪｖ）の指令で液体を自発的に吸収および分泌するので、腸液輸送を理解するためのモデルを提供する。結腸における液体吸収の主成分は、平行Ｎａ^＋／Ｈ^＋（ナトリウム−水素交換体、ＮＨＥ）および頂点原形質膜に位置するＣｌ⁻／ＨＣＯ_３ ⁻交換により媒介される。Ｋｕｎｚｅｌｍａｎ，Ｋ．ｅｔ ａｌ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８２，２４５−２８９，２００２；Ｄｏｎｏｗｉｔｈ，Ｍ．ｅｔ ａｌ．Ａｎｎｕ．Ｒｅｖ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．４８，１３５−１５０，１９８６。環状ヌクレオチドはＮＨＥ活性を阻害することにより、このＮａ^＋−依存性液体吸収を減少させる。分泌促進物質の不在下で、基底外側の潅流腺窩浴へのブメタニドの添加は、少量の残存する体液分泌の阻害のために、正のまたは吸収の^ｎｅｔＪｖを増加させた（図１３Ａ、第二の棒グラフ）。この基底液体は、おそらく、分泌促進物質の不在下でさえも残存する低レベルの細胞環状ヌクレオチドのためであった。従って、ブメタニドの存在下で、^ｎｅｔＪｖ測定値は、液体輸送の吸収成分を表す。図１３Ａは、この吸収液体流動は細胞浸透性ジブチリル−ｃＡＭＰ（ｄｂ−サイクリックＡＭＰ）の添加により実質的に減少したことを示す。図１３Ｂにおいて、体液分泌は、ブメタニドの基底外側の浴への添加＋５−ニトロ−２−（３−フェニルプロピルアミノ）−安息香酸（ＮＰＰＢ、ＣＩ⁻チャンネル阻害剤）の潅流腺窩の内腔潅流液への添加により阻害された。図１３Ｂは、吸収液体流動は、ホルスコリンにより阻害されることを示す。サイクリックＡＭＰまたはサイクリックＡＭＰ−生成分泌促進物質、ホルスコリンによる液体吸収の阻害は、分泌促進物質により誘発された下痢に重要に貢献する。細胞外Ｃａ^２＋の濃度を２ｍＭに増大させること（図１３Ｂ）および／または化合物Ａ（図１３Ｃ）を基底外側浴に添加すること（０．５ｍＭ カルシウムの存在下）のいずれかは、ｃＡＭＰにより媒介される液体の吸収の減少を著しく無効にした。このＣａＳＲ作動物質の液体吸収に対する後者の効果が、向上された頂点ＮＨＥ活性の結果であるかどうかを調べるために、結腸細胞からのＮａ^＋−依存性プロトン押出に対するＣａ^２＋の効果をホルスコリンの存在下で評価した。ＮＨＥ活性は、基底外側浴Ｃａ^２＋を０．１から２ｍＭに上昇させ、化合物Ａを２ｍＭ Ｃａ^＋−含有浴に添加することにより８倍に増加し、その結果、ＮＨＥ活性がさらに１２倍に増加した（図１３Ｄ）。細胞酸負荷は、ＮＨ_４Ｃｌに暴露することにより達成され、ＮＨ_４Ｃｌの除去後のＮａ^＋−依存性細胞ｐＨ回収を、Ｎａ^＋／Ｈ^＋活性の指数として評価した。Ｓｉｎｇｈ ｅｔ ａｌ．Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｕ．Ｓ．９２ １１５７３−１１５７７、１９９５。Ａ−Ｄにおける値は、平均±ＳＥＭである。星印、分泌促進物質なしと比較して、Ｐ＜０．０１、＃、阻害剤またはＣａＳＲ作動物質と比較して、Ｐ＜０．０１。かっこ内の数は、研究された腺窩の数である。カルシウム（Ｃａ）濃度はミリモル濃度である。

この実施例は、マウスにおけるコレラ毒素誘発性胃腸液蓄積に対するカルシウム模倣性物質の影響を示す。

メスＢＡＬＢ／ｃマウス（１８から２０ｇ）をＣｈａｒｌｅｓ Ｒｉｖｅｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓから入手し、実験前に少なくとも２週間順化させた。コレラ毒素をＢｉｏｍｏｌビブリオ・コレレ（（Ｖｉｂｒｉｏ ｃｈｏｌｅｒａｅ）からの精製コレラ毒素、無アジド）から入手した。マウス（ｎ＝５／群）をコレラ毒素（５０μｇ／マウス）の経口投与前に一夜絶食させた。マウスにビヒクルを３０または１００ｍｇ／ｋｇで、コレラ毒素投与（５０μｇ／マウス、経口）の１時間前に経口投与した。マウスのもう一つの群に化合物Ｂを２０ｍｇ／ｋｇを静脈内（尾静脈）により、コレラ毒素（５０μｇ／マウス経口）の１時間前に投与した。胃腸液蓄積の測定のために、マウスをコレラ毒素投与後６時間で殺した。小腸の全長を慎重に切開し、近位および遠位端をクランプでとめ、無傷小腸を腹腔から取り出した。腸の内腔液内容物を円錐管に排出させ、体積を測定した。

図１４は、１００ｍｇ／ｋｇ経口、または２０ｍｇ／ｋｇ静脈内の用量での化合物Ｂでの治療の結果、コレラ毒素誘発性胃腸液蓄積が統計的に有意に減少したことを示す。パネルＡ、対照；パネルＢ、ビヒクル；パネルＣ。２０ｍｇ／ｋｇ ＩＶ；パネルＤ、３０ｍｇ／ｋｇ ＰＯ；パネルＥ、１００ｍｇ／ｋｇ ＰＯ；＊ｐ ＜ ０．０５ ｖｓ．Ｂｏｎｆｅｒｒｏｎｉ／Ｄｕｎｎ分析によるビヒクル対照。

この実施例は、カルシウム模倣性物質が、潅流腺窩モデルにおいて、近位または遠位結腸野いずれかにおける直接経路により作用することを示す。

正常な齧歯類およびヒトにおいて、腸神経系（主に、粘膜下神経叢）は体液分泌を調節する薬剤を放散する（Ｃｏｏｋｅ，ＨＪ．（１９９８）Ｎｅｗｓ Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｓｃｉ １３：２６９２７４；Ｆｉｅｌｄ、Ｍ．（２００３）Ｊ．Ｃｌｉｎ．Ｉｎｖｅｓｔ．１１１ ：９３１−９４３）。腸神経系が、腸における腸毒素（例えば、コレラ毒素およびＳＴａ）−誘発性体液分泌に関与するというインビボ研究から得られる証拠がある。（Ｆｉｅｌｄ，Ｍ．ｓｕｐｒａ）。これは、テトロドトキシン（ＴＴＸ）、神経毒および有効なニューロン活動電位伝搬を阻害するナトリウムチャンネルブロッカーの使用により測定される。ＴＴＸは腸におけるコレラ毒素誘発性体液分泌を逆転させることが示唆されている。研究は、分泌性下痢を引き起こす腸毒素の影響は、少なくとも部分的に腸クロム親和性細胞（ＥＣ）の活性化による腸神経系（ＥＮＳ）の活性化によることを示している（Ｂｕｒｌｅｉｇｈ ｅｔ ａｌ．（１９９７）Ｄｉｇ Ｄｉｓ Ｓｃｉ，４２：１９６４−１９６８；Ｆｉｅｌｄ Ｍ．ｓｕｐｒａ）。さらに、ＣａＳＲは、腸の上皮細胞において発現されるだけでなく、腸神経系、例えば、平滑筋における筋層間神経叢および粘膜下神経叢においても発現される（Ｃｈａｔｔｏｐａｄｈｙａｙ，Ｎ ｅｔ ａｌ．（１９９８）Ａｍ．Ｊ．Ｐｈｙｓｉｏｌ．２７４：Ｇ１２２−Ｇ１３０）。このことは、腸神経系におけるＣａＳＲの存在は、流体分泌の調節に関与することを示唆する。

分泌促進物質（例えば、ホルスコリン、コレラ毒素、ＳＴａ）により刺激される体液分泌は、腸の上皮細胞（直接的経路）の直接的活性化およびＥＣ−ＥＮＳ（間接的経路）による腸細胞の間接的活性化のいずれか（または両方）により媒介され得る。塩化物分泌が可能な腸細胞を直接活性化する分泌促進物質は、ＴＴＸにより影響を受けないが、ＥＣ−ＥＮＳ直接分泌経路を活性化する分泌促進物質の影響はこの神経毒により無効にされる。したがって、ＴＴＸは分泌促進物質が直接または関節経路により作用するかどうかを区別するために使用できる。ＴＴＸが体液分泌を無効にするかまたは減少させることができないことは、液体分泌におけるＥＮＳの関与が存在しないことの証拠である。単離された腺窩調製物は、無傷腸クロム親和性細胞−腸神経系がないが、腺窩上皮細胞上でＣａＳＲを発現する。従って、単離された腺窩調製物は、腺窩上皮細胞の直接活性化によりホルスコリンにより誘発される正味体液分泌を逆転させるカルシウム模倣性物質の能力にＴＴＸが影響を及ぼすかどうかを試験するために使用された。

直接腸細胞経路
カルシウム模倣性物質のホルスコリンに刺激された液体分泌に対する直接的影響を研究するために、Ｇｅｉｂｅｌ ｅｔ ａｌ．（２００６）Ｎａｔ’ｌ Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．Ｐｒｏｃ．１０３（２５）：９３９０−９３９７において記載されているような標準的潅流腺窩プロトコルを使用した。全てのデータをＧｅｉｂｅｌらにおいて記載されているようにして分析した。簡単に説明すると、近位および遠位結腸腺窩を成体Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットの腸切片から切り出し、および同心ガラスピペット間にのせて、腺窩内腔および血液−間入表面の独立した潅流を行った。［^３Ｈ］イヌリン、非吸収性体積マーカーの活性を用いて、潅流腺窩による液体分泌または吸収を定量化した。

図１５は、２μＭ ＴＴＸが、ホルスコリンにより誘発される液体分泌の大きさ、またはカルシウム模倣性物質（化合物Ａ、１００ｎＭ）が潅流腺窩モデルにおける近位（パネルＡ）および遠位結腸（パネルＢ）における液体吸収のホルスコリンに刺激された増加を逆転される能力に対して影響を及ぼさないことを示す。両パネルにおいて、棒グラフＡ：対照（０．１ｍＭ Ｃａ^２＋ 潅流液および浴リンゲル溶液）、棒グラフＢ：０．１ｍＭ Ｃａ^２＋＋５００ｎＭ ホルスコリン；棒グラフＣ：０．１ｍＭ Ｃａ^２＋＋５００ｎＭ ホルスコリン＋２μＭ ＴＴＸ；棒グラフＤ：０．１ｍＭ Ｃａ^２＋＋５００ｎＭ ホルスコリン＋２μＭ ＴＴＸ＋１００ｎＭ化合物Ａ。星印、分泌促進物質無しと比較して、Ｐ ＜ ０．０１、＃、阻害剤またはＣａＳＲ作動物質のない分泌促進物質と比較して、Ｐ ＜ ０．０１。

ホルスコリンの不在下で、平均Ｊｖ値は、近位（棒グラフＡ；０．３１±０．０２ｎＬ／分／ｍｍ）および遠位（棒グラフＢ；０．３６±０．０１ｎＬ／分／ｍｍ）結腸陰窩の両方における正味液体吸収を示す。ホルスコリン（棒グラフＢ、両パネル）への暴露は、近位および遠位結腸陰窩の両方において正味液体分泌を誘発した（−０．３２±０．０２ｎＬ／分／ｍｍ、近位；−０．３３±０．０１ｎＬ／分／ｍｍ、遠位）。ＴＴＸの添加は、近位および遠位結腸（両パネル、棒グラフＣ）の両方において正味体液分泌を誘発する能力を変更しなかった。棒グラフＤ、両パネルは、カルシウム模倣性化合物Ａがホルスコリンにより誘発される正味体液分泌を弱め、近位および遠位結腸の両方においてこの薬理学的反応に対して影響を及ぼさなかったことを示す。これらのデータは、単離された腺窩における無傷腸クロム親和性細胞−腸神経系の欠損と一致し、カルシウム模倣性物質は、潅流腺窩モデルにおいて近位または遠位結腸のいずれかにおいて直接経路により作用する。

この実験は、カルシウム模倣性物質が体液分泌を無効にすることができ、この効果は、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーモデルを用いて示されるように、腸クロム親和性細胞−腸神経系（ＥＣ−ＥＮＳ）により媒介されることを示す。カルシウム模倣性物質は、近位および遠位結腸の両方において、ならびに幼児および成体動物の両方において有効であることをさらに示す。

腸クロム親和性細胞−腸神経系（ＥＣ−ＥＮＳ）およびＵｓｓｉｎｇチャンバーモデル
実施例１０において記載されるように、腸毒素の分泌性下痢を引き起こす効果は、少なくとも部分的に腸クロム親和性細胞（ＥＣ）の活性化による腸神経系（ＥＮＳ）の活性化であり、ＣａＳＲの腸神経系における存在は、液体分泌の調節に関与する。腸毒素は腸クロム親和性細胞を活性化して、５−ヒドロキシトリプタミン（５−ＨＴ）を放出させ、これは５−ＨＴ１ｂ受容体により腸神経系を刺激する。腸神経系は腸細胞に、血管作用性腸ペプチドおよび他の因子（分泌促進物質）により液体を分泌するようにシグナルを送る。腸毒素の適用は、腸クロム親和性細胞におけるｃＡＭＰおよびｃＧＭＰの増大を刺激し、これは、これらの細胞が、腸液分泌を媒介するニューロン活性ペプチドを放出するきっかけを与える（Ｃｏｏｋｅ；Ｆｉｅｌｄ、ｓｕｐｒａ）。下痢のこのＥＣ−ＥＮＳ媒介性メカニズム（液体分泌）は、ＥＮＳに作用して分泌促進物質の放出をブロックする神経毒、テトロドトキシン（ＴＴＸ）により阻害され得る。

腸毒素により誘発された腸液分泌およびカルシウム模倣性物質の液体バランスに対する影響を、インビボモデル、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーを用いて研究した。このモデルは、ＥＣ−ＥＮＳ経路を含み、およびＬｉ、Ｈ．ｅｔ ａｌ．（２００４）Ｊ．Ｃｙｓｔ．Ｆｉｂｒｏｓｉｓ ３：１２３−１２６において記載されている。簡単に説明すると、近位または遠位結腸切片を乳飲み（２から３週齢）または若年（６から７週齢）Ｓｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットから単離し、氷冷緩衝液中に入れる。全厚さの結腸の小片を切り出し、プレキシガラスＵｓｓｉｎｇチャンバー中、ビカーボネートを含まないリンゲル溶液と共に、粘膜および漿膜チャンバーの両方に載せる。漿膜チャンバーを１００％Ｏ_２でガス処理し、漿膜および粘膜液をどちらも３７℃に温める。開回路経上皮電圧が安定である場合、組織を短絡させ、短絡回路電流（Ｉ_ｓｃ；μＡ／ｃｍ^２）を記録する。短絡回路電流（Ｉ_ｓｃ）は、組織が短絡された場合に、時間あたりの電荷流として定義される。

図１６は、カルシウム模倣性化合物の短絡回路電流（Ｉ_ｓｃ）におけるホルスコリンに刺激された増加を逆転させる能力は、若年ラットにおいてＴＴＸにより無効にされた。実験は、６から７週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いて行われた。Ｕｓｓｉｎｇチャンバーデータを、合計Ｉ_ｓｃ（μＡ／ｃｍ^２）として、または化合物Ａの添加前（対照）対添加後でのＩ_ｓｃ（μＡ／ｃｍ^２ｍｉｎ）における変化率として記録した。比率を線形退縮により決定した。全ての実験について、遠位結腸からの代表的な時間に対するＩ_ｓ ^ｃ曲線も示す。

パネルＡにおいて、ＴＴＸの不在下での浴への５００ｎＭのホルスコリンの添加（５分、第一の矢印）は、近位結腸において負のＩ_ｓｃにおける増加を誘発し、このことは、ホルスコリンにより誘発される液体分泌を示す。これは、１０μＭの化合物Ａの浴適用（２０分、第二の矢印）により逆転された。パネルＣにおいて示されるこの結果は、ＴＴＸの不在下での化合物Ａによる減少（パネルＡ）と対照的に、２μＭのＴＴＸの存在下、１０μＭの化合物Ａの添加（２５分、第二の矢印）はホルスコリンにより誘発されるＩ_ｓｃに対して実質的に影響を及ぼさなかったことを示す。パネルＢおよびＤは、近位および遠位結腸における化合物Ａの添加前（対照）対添加後のＩ_ｓｃ（μＡ／ｃｍ^２分）、Ｙ軸における変化率を示す。パネルＢ、ＴＴＸなし：Ａ、近位結腸、対照（化合物Ａ添加前）；Ｂ、近位結腸、１０μＭ化合物Ａ添加後；Ｃ、遠位結腸、対照（化合物Ａ添加前）；Ｄ、遠位結腸、１０μＭ化合物Ａ添加後。パネルＤ、２μＭ ＴＴＸ：Ａ、近位結腸、対照（化合物Ａ添加前）；Ｂ、近位結腸、１０μＭ化合物Ａの添加後；Ｃ、遠位結腸、対照（化合物Ａ添加後）；Ｄ、遠位結腸、１０μＭ化合物Ａ添加後。

図１７は、カルシウム模倣性物質が短絡回路電流（Ｉ_ｓｃ）におけるホルスコリンに刺激された増加を逆転させる能力は、幼児動物においてＴＴＸにより無効にされることを示す。この実験は、２から３週齢のＳｐｒａｇｕｅ−Ｄａｗｌｅｙラットを用いて、前述のようにして行った。図１６において示された実験と同様に、ＴＴＸの不在下での浴への、５００ｎＭのホルスコリンの添加（図１７、パネルＡ；５分、第一の矢印）は、遠位結腸において負のＩ_ｓｃにおける増加を誘発し、このことは、ホルスコリンにより誘発される液体分泌を示す。これは、１０μＭの化合物Ａの適用（１８分、第二の矢印）により逆転された。パネルＣにおいて示された結果は、ＴＴＸの不在下で化合物ＡによるＩｓｃの減少と対照的に、２μＭのＴＴＸの存在下で、１０μＭの化合物Ａの添加（２２分、第二の矢印）はホルスコリンにより誘発されたＩ_ｓｃに対して事実上影響を及ぼさなかった（パネルＡ）。パネルＢおよびＤは、近位および遠位結腸における、化合物Ａの添加前（対照）対化合物Ａの添加後のＩ_ｓｃ（μＡ／ｃｍ^２分）、Ｙ軸における変化速度をまとめる。パネルＢ、ＴＴＸなし：Ａ、近位結腸、対照；Ｂ、近位結腸、１０μＭ化合物Ａ；Ｃ，遠位結腸、対照；Ｄ、遠位結腸、１０μＭ化合物Ａ。パネルＤ、２μＭ ＴＴＸ：Ａ、近位結腸、対照；Ｂ、近位結腸、１０μＭ化合物Ａ；Ｃ、遠位結腸、対照；Ｄ、遠位結腸、１０μＭ化合物Ａ。

これは、カルシウム模倣性物質が、幼児または成体動物の両方からの近位および遠位結腸の両方においいて体液分泌を無効にでき、カルシウム模倣性物質のこの効果は、腸クロム親和性細胞−腸神経系（ＥＣ−ＥＮＳ）により媒介されることを示す。

本明細書において記載される全ての刊行物、特許および特許出願は、個々の刊行物または特許出願が具体的および個別に表示されているかのように、参照により本発明の一部とされる。前記発明は、説明および明らかに理解するための例として詳細に記載したが、本発明の示唆するものを考慮して、ある変更および修正は本発明の精神または添付の請求の範囲から逸脱することなく行うことができることは、当業者には容易に明らかになるである。

吸収基礎^ｓｅｃＪｖおよび分泌成分^ｓｅｃＪｖの２成分から構成される正味Ｊｖの測定を表す。 内腔または浴Ｃａ^２＋は、インビトロ潅流ラット結腸陰窩における毒素誘発性体液分泌を無効にすることを図式的に表す。 浴中のカルシウム模倣性化合物Ａ（Ｒ−立体異性体）はインビトロ潅流ラット結腸陰窩における毒素誘発性体液分泌を無効にすることを図式的に表す。 内腔中のカルシウム模倣性化合物Ａ（Ｒ−立体異性体）はインビトロ潅流ラット結腸陰窩における毒素誘発性体液分泌を無効にすることを図式的に表す。 浴中のカルシウム模倣性化合物Ａ（Ｓ−立体異性体）は、インビトロ潅流ラット結腸陰窩中毒素誘発性体液分泌を無効にすることを図式的に表す。 内腔中のカルシウム模倣性化合物Ａ（Ｓ−立体異性体）は、インビトロ潅流ラット結腸陰窩における毒素誘発性体液分泌を無効にすることを図式的に表す。 細胞外Ｃａ^２＋によるＣａＳＲの活性化は、分泌促進物質に刺激された環状ヌクレオチド蓄積を減少させることを示す。 毒素誘発性サイクリックＡＭＰまたはＧＭＰ酸性は、用量依存的な方法でカルシウム模倣性により弱められることを示す。 ＰＬＣ阻害剤が、ラット結腸陰窩におけるＦＳＫに刺激された体液分泌に対するカルシウム模倣性物質の影響をブロックすることを示す。 マウスにおけるＰ３８−関連ＴＮＦ−α毒性に対するカルシウム模倣性治療の影響を示す。 Ｃａ^２＋またはカルシウム模倣性化合物Ａの、ＣａＳＲゼロマウスにおける、分泌促進物質に刺激された正味体液分泌に対する影響が無いことを示す。 ラット潅流結腸陰窩において、０．１ ｍＭカルシウムの存在下でのホルスコリンの基底外側の添加は、結腸陰窩細胞中への基底外側のＣｌ⁻の流入を刺激することを示す。 細胞外カルシウムまたは化合物Ａのいずれかは、ラット結腸陰窩における液体の吸収の、分泌促進物質により誘発される阻害を逆転させることを示す。 化合物Ｂでの処置は、１００ｍｇ／ｋｇ経口、または２０ｍｇ／ｋｇ静脈内の用量で、コレラ毒素により誘発された胃腸液蓄積の統計的に有意な減少を媒介したことを示す。 ＴＴＸは、ホルスコリンにより誘発される液体分泌または化合物Ａの潅流腺窩モデルにおける近位および遠位結腸の療法において液体の吸収のホルスコリンに刺激された増加を逆転させる能力の大きさに影響を及ぼさないことを示す。 化合物Ａの、短絡回路電流（Ｉ_ＳＣ）におけるホルスコリンに刺激された増加を逆転させる能力が、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーモデルにおける６−７週齢ラットにおけるＴＴＸにより無効にされることを示す。 化合物Ａの、短絡回路電流（Ｉ_ＳＣ）におけるホルスコリンに刺激された増加を逆転させる能力は、Ｕｓｓｉｎｇチャンバーモデルにおける２−３週齢ラットにおけるＴＴＸにより無効にされることを示す。

Claims (8)

1. 対象における下痢を治療するための医薬組成物であって、
   少なくとも１つのカルシウム模倣性化合物を含み、
   前記カルシウム模倣性化合物は、
   ａ）式Ｉ：
   

   

   ［式中、
   Ｘ _１ およびＸ _２ は、同一であっても異なっていても良く、それぞれ、ＣＨ _３ 、ＣＨ _３ ＣＨ _２ Ｏ、Ｂｒ、Ｃｌ、Ｆ、ＣＦ _３ 、ＣＨＦ _２ 、ＣＨ _２ Ｆ、ＯＨ、ＣＨ _２ ＯＨ、ＣＯＮＨ _２ 、ＣＮ、ＮＯ _２ 、ＣＨ _３ ＣＨ _２ 、プロピル、ブチル、イソブチル、ｔ−ブチル、アセトキシおよびアセチルラジカルから選択されるラジカルであり、またはＸ _１ のうちの２つは一緒になって、メチレンジオキシラジカルを形成し、またはＸ _２ のうちの２つは一緒になって、メチレンジオキシラジカルを形成し得；但し、Ｘ _２ は３−ｔ−ブチルラジカルではなく；
   ｎは０〜５の範囲であり；
   ｍは１〜５の範囲であり；および
   アルキルラジカルは、Ｃ１−Ｃ３アルキルラジカルであって、場合により、飽和および不飽和、直鎖、分枝および環状Ｃｌ−Ｃ９アルキル基、ジヒドロインドリルおよびチオジヒドロインドリル基および２−、３−および４−ピペリジニル基から選択される少なくとも１つの基で置換されているものから選択される］
   の化合物またはこの医薬的に許容される塩；
   ｂ）式ＩＩ：
   

   

   ［式中、
   Ｒ ^１ はアリール、置換アリール、ヘテロサイクリル、置換ヘテロサイクリル、シクロアルキルまたは置換シクロアルキルであり；
   Ｒ ^２ はアルキルまたはハロアルキルであり；
   Ｒ ^３ はＨ、アルキルまたはハロアルキルであり；
   Ｒ ^４ は、Ｈ、アルキルまたはハロアルキルであり；
   存在する各Ｒ ^５ は、アルキル、置換アルキル、アルコキシ、置換アルコキシ、ハロゲン、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＨ、−ＣＮ、−ＮＲ ^ｄ Ｓ（＝Ｏ） _ｍ Ｒ ^ｄ 、−ＮＲ ^ｄ Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ^ｄ Ｒ ^ｄ 、−ＮＲ ^ｄ Ｓ（＝Ｏ） _ｍ ＮＲ ^ｄ Ｒ ^ｄ または−ＮＲ ^ｄ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ^ｄ からなる群から独立して選択され；
   Ｒ ^６ はアリール、置換アリール、ヘテロサイクリル、置換ヘテロサイクリル、シクロアルキルまたは置換シクロアルキルであり；
   各Ｒ ^ａ は独立して、Ｈ、アルキルまたはハロアルキルであり；
   各Ｒ ^ｂ は独立して、アリール、アラルキル、ヘテロサイクリルまたはヘテロサイクリルアルキルであり、このそれぞれは、置換されていなくまたはアルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルコキシ、シアノおよびニトロからなる群から選択される最高３個の置換基で置換されており；
   各Ｒ ^ｃ は独立して、アルキル、ハロアルキル、フェニルまたはベンジルであり、このそれぞれは、置換されていても置換されていなくても良く；
   各Ｒ ^ｄ は独立して、Ｈ、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロサイクリル、またはヘテロサイクリルアルキルであり、アルキル、アリール、アラルキル、ヘテロサイクリルおよびヘテロサイクリルアルキルは、アルキル、ハロゲン、ハロアルキル、アルコキシ、シアノ、ニトロ、Ｒ ^ｂ 、−Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ^Ｃ 、−ＯＲ ^ｂ 、−ＮＲ ^ａ Ｒ ^ａ 、−ＮＲ ^ａ Ｒ ^ｂ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＯＲ ^Ｃ 、−Ｃ（＝Ｏ）ＮＲ ^ａ Ｒ ^ａ 、−ＯＣ（＝Ｏ）Ｒ ^Ｃ 、−ＮＲ ^ａ Ｃ（＝Ｏ）Ｒ ^ｃ 、−ＮＲ ^ａ Ｓ（＝Ｏ） _ｎ Ｒ ^ｃ および−Ｓ（＝Ｏ） _ｎ ＮＲ ^ａ Ｒ ^ａ から選択される、０、１、２、３または４個の置換基で置換されており；
   ｍは１または２であり；
   ｎは０、１または２であり；および
   ｐは０、１、２、３または４であり；
   但し、Ｒ ^２ がメチルであり、ｐが０であり、Ｒ ^６ が非置換フェニルであるならば、Ｒ ^１ は２，４−ジハロフェニル、２，４−ジメチルフェニル、２，４−ジエチルフェニル、２，４，６−トリハロフェニルまたは２，３，４−トリハロフェニルでないとする］
   の化合物またはこの医薬的に許容される塩；
   ｃ）Ｎ−（３−［２−クロロフェニル］−プロピル）−Ｒ−α−メチル−３−メトキシベンジルアミンまたはこの医薬的に許容される塩；
   ｄ）Ｎ−（（６−（メチルオキシ）−４’−（トリフルオロメチル）−１，１’−ビフェニル−３−イル）メチル）−１−フェニルエタナミン、またはこの医薬的に許容される塩；
   ｅ）シナカルセットＨＣｌ
   である、前記医薬組成物。
2. 対象において腸液分泌を減少させるための医薬組成物であって、少なくとも１つのカルシウム模倣性化合物を含み、前記カルシウム模倣性化合物は、請求項１に定義されたものである、前記医薬組成物。
3. 液体の吸収が増加する、請求項２に記載の医薬組成物。
4. 対象が手術の準備をされる、請求項２に記載の医薬組成物。
5. 対象の腸管における薬物、栄養の吸収または分泌を調節するための医薬組成物であって、
   少なくとも１つのカルシウム模倣性化合物を含み、
   前記カルシウム模倣性化合物は、請求項１に定義されたものであり、
   薬物または栄養吸収を増大させる、前記医薬組成物。
6. 対象が栄養失調または同化不良を患っている、請求項５に記載の医薬組成物。
7. 対象の同化不良または栄養失調を治療するための医薬組成物であって、
   少なくとも１つのカルシウム模倣性化合物を含み、
   前記カルシウム模倣性化合物は、請求項１に定義されたものであり、
   同化不良が混合障害、膵機能不全、腸胆汁酸塩濃度の低下、不十分な吸収面、粘膜吸収不良、胆汁酸塩の腸肝循環の中断またはリンパ管の閉塞によるものである、前記医薬組成物。
8. 対象が栄養失調を患っている、請求項７に記載の医薬組成物。

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