JP5220596B2 - ＤＮＡポリメラーゼβを用いた核酸合成法及び１分子シーケンス法 - Google Patents
ＤＮＡポリメラーゼβを用いた核酸合成法及び１分子シーケンス法 Download PDFInfo
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Description
【技術分野】
【０００１】
本発明は、核酸を合成する技術に関する。また、本発明は、生物の核酸を解析する技術に関する。特に、本発明は、１分子の核酸を解析する技術に関する。具体的には、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼβを用いた核酸合成法及び１分子シーケンス法（Method for Synthesizing Nucleic Acid and Single Molecule Sequencing Using DNA Polymerase β）に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のＤＮＡシーケンス法の代表例として、４色蛍光と電気泳動とを用いた、所謂サンガー法がある。また、ＤＮＡ１分子を解析する手法のとして、米国特許第６，８１８，３９５号明細書やProceeding of the National Academy of Science of the United States of America, 100, 3960-3964,(2003)に記載されているような、Quakeらによって行われた、klenow fragment（クレノウフラグメント；ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた手法がある。
【０００３】
【特許文献１】米国特許第６，８１８，３９５号明細書
【非特許文献１】「プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America）」、２００３年、第１００巻、ｐ．３９６０−３９６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の目的
サンガー法では、前処理が複雑であること；一度に読める塩基数は高々８００塩基程度であること；及び、解析時間が１サンプルあたり数時間かかること、などの問題がある。
【０００５】
Quakeによる方法では、以下の問題がある。
まず、鋳型ＤＮＡ上の１種類の塩基を解析するために、異なる蛍光で標識された４種類のデオキシリボヌクレオチドを用意し、順に４種類の溶液を流し、デオキシリボヌクレオチドごとに塩基取り込みの有無を確認しながら解析していくために、多くの解析時間を必要とする。
また、クレノウフラグメントが用いられているが、当該酵素は蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチドを数塩基以上連続して取り込むことができないため、解析塩基長が数塩基以下に限られ、従って、実用的でない。
さらに、クレノウフラグメントは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がわずかながら存在することから、合成した塩基を取り除き再び合成しはじめるため、正確な塩基情報を得ることができない。
【０００６】
そこで本発明の目的は、連続して伸長反応を行うことができる核酸合成法、及び、高速に且つ正確に塩基情報を得ることができる１分子シーケンス法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明者らは、DNAポリメラーゼβを核酸重合酵素として用いることによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の（１）〜（６）の発明を含む。
【０００８】
下記（１）に記載の発明は、基質として蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いて核酸を合成する方法に向けられる。
【０００９】
（１） プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体を形成させる工程と、
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、前記ＤＮＡポリメラーゼβに取り込ませることによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ、前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを結合させる工程と、
前記ＤＮＡポリメラーゼβに、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを連続的に取り込ませることによって、前記結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から前記標的核酸に相補的な核酸を伸長させる工程とを含む核酸合成法であって、
前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、陰イオン性の蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオチドである、核酸合成法。
【００１０】
（２） 前記陰イオン性の蛍光色素は、Alexa Fluor (R) 488、Alexa Fluor(R)532、Alexa Fluor(R)546、フルオレセイン、Oregon Green(R)488、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、及びナフトフルオレセインからなる群から選ばれる、（１）に記載の核酸合成法。
【００１１】
下記（３）に記載の発明は、基質として蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いて核酸を合成する方法を用い、ＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光を検出することにより、１分子シーケンスを行う方法に向けられる。
【００１２】
（３） １分子の核酸分子をシーケンスする方法であって、
プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたシーケンスすべき標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体を形成させる工程と、
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、前記ＤＮＡポリメラーゼβに取り込ませることによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ、前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを結合させる工程と、
前記ＤＮＡポリメラーゼβに、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを連続的に取り込ませることによって、前記結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から前記シーケンスすべき標的核酸に相補的な核酸を伸長させる工程とを含み、
前記ＤＮＡポリメラーゼβによって取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光を順次検出することによって、前記標的核酸のシーケンスを行う、１分子の核酸分子をシーケンスする方法であって、
前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、陰イオン性の蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオチドである、１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
【００１３】
（４） 前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは複数種用意され、複数の前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドそれぞれは、塩基ごとに異なる蛍光標識を有するものである、（３）に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
すなわち、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰから選ばれる少なくとも２種のデオキシリボヌクレオチドの蛍光標識体であり、蛍光標識が、デオキシリボヌクレオチドの塩基によって異なるように設計されたものである。
【００１４】
さらに、下記（５）に記載の発明は、全反射蛍光顕微鏡技術を用いた高速１分子シーケンス法に向けられる。
【００１５】
（５） 前記シーケンスすべき標的核酸及び前記ＤＮＡポリメラーゼβのいずれか一方が基板に固定化されており、
前記基板における、前記シーケンスすべき標的核酸又は前記ＤＮＡポリメラーゼβが固定化された表面に、エバネッセント場を発生させ、
前記ＤＮＡポリメラーゼβによって前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドが取り込まれた際に、前記取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドにおける、前記エバネッセント場によって励起された蛍光を検出する、（３）又は（４）に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
【００１７】
（６） 前記陰イオン性の蛍光色素は、Alexa Fluor(R)488、Alexa Fluor(R)532、Alexa Fluor(R)546、フルオレセイン、Oregon Green(R)488、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、及びナフトフルオレセインからなる群から選ばれる、（５）に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、連続して伸長反応を行うことができる核酸合成法、及び、高速に且つ正確に塩基情報を得ることができる１分子シーケンス法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜核酸合成法＞
本発明の核酸合成法においては、基質に蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを用い、核酸重合酵素としてポリメラーゼβを用いる。テンプレートとなる標的核酸及びプライマーとなるオリゴヌクレオチドについては、特に限定されるものではない。そして、これらの成分を、通常の核酸合成反応条件下に供する。このことによって、プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体が形成され、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれ、プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ結合する。
【００２０】
本発明で核酸重合酵素として用いられるＤＮＡポリメラーゼβは、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドに対する取り込み活性が大変高いことが発明者らによって見出されている。例えば従来から用いられてきた核酸重合酵素のクレノウフラグメントのように、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み及び合成が数塩基で停止することが無く、連続的に取り込み及び合成を行うことができる。
【００２１】
また、多くの核酸重合酵素は校正機能としての３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、すなわち合成した塩基を自ら削り取る機能を有している。しかしながら、本発明で核酸重合酵素として用いられるＤＮＡポリメラーゼβは、従来から修復酵素として知られているものであり、そのような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がない。このため、標的核酸にはじめに結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から、標的核酸に相補的な核酸を安定的に伸張させることができる。
【００２２】
蛍光標識すなわち蛍光官能基の種類としては特に限定されるものではない。ＤＮＡポリメラーゼβへの取り込み活性という観点からは、例えば陰イオン性の蛍光色素であることが好ましい。陰イオン性の蛍光色素としては、例えばAlexa Fluor 488・532・546、fluorescein、Oregon Green 488、Cy3.5・5・5.5、Naphthofluoresceinなどが挙げられる。
【００２３】
本発明の核酸合成法の応用形態の例として、プライマーオリゴヌクレオチド或いは標的核酸のいずれか一方を基板などに固定することによって、これまで安定して伸張固定できなかった、長い蛍光修飾ＤＮＡの伸張固定が可能になる。
【００２４】
本発明の核酸合成法の応用形態の他の例として、通常の核酸複製系に適用し、且つ蛍光検出を行うことによって、複製開始位置或いは複製開始配列を決定することができる。すなわち、複製起点のマッピングを行うことが可能になる。蛍光検出を行う場合は、用いるデオキシリボヌクレオチドの種類それぞれにおいて、異なった波長の蛍光を発するように、蛍光標識を選択することが好ましい。この場合、取り込まれた蛍光標識を検出することによって、シーケンスを行うことが可能になる。このことは、後述の１分子シーケンス法にて詳述する。
【００２５】
＜１分子シーケンス法＞
本発明の１分子シーケンス法においては、基質に蛍光標識デオキシリボヌクレオチド、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用い、上述の核酸合成法において記載したように、核酸合成を行う。そして、取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光を検出することによって、テンプレートとなる標的核酸のシーケンスを行う。蛍光標識は、用いるデオキシリボヌクレオチドの種類それぞれにおいて、異なった波長の蛍光を発するように選択する。
【００２６】
蛍光検出の手段としては特に限定されるものではないが、単塩基分解能で検出を行うことができる手段を用いると良い。
単塩基分解能で検出を行うことができる手段の例としては、米国特許第６，８１８，３９５号明細書やProceeding of the National Academy of Science of the United States of America, 100, 3960-3964,(2003)に記載されている方法が挙げられる。この方法においては、必要な種類（通常４種）の蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを用意し、それら必要な種類の溶液を１種類ずつ順に流し、洗浄することを繰り返すことによって、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドごとに塩基取り込みの有無を確認しながら解析していく。
【００２７】
単塩基分解能で検出を行うことができる手段の他の例としては、全反射蛍光顕微鏡技術（total internal reflection fluorescence microscopy; TIRFM）を用いる方法が挙げられる。この場合、シーケンスすべき標的核酸及びＤＮＡポリメラーゼβのいずれか一方が基板に固定化される。そして、この基板における、シーケンスすべき標的核酸又はＤＮＡポリメラーゼβが固定化された表面に、エバネッセント場を発生させる。核酸合成反応によって、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれたときに、取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光標識がエバネッセント場によって励起される。このように励起された蛍光を検出する。
【００２８】
TIRFMを用いる方法について、具体例を模式的に図１に示す。図１においては、ＤＮＡポリメラーゼβが基板（透明基板）上に固定されており、プライマーを用い、テンプレートとなる標的核酸（鋳型ＤＮＡ）の複製を行う。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼβでなく標的核酸のほうを基板に固定してもよい。そして、必要な種類のデオキシリボヌクレオチドを用意し、それぞれに異なった波長の蛍光を発する修飾を施すことによって、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドとして使用する。
【００２９】
蛍光分子を励起するために、全反射照明を行い、基板の表面にエバネッセント場を発生させる。エバネッセント光が染み出すエリアは基板の表面から約２００ｎｍ以内に限定され、それより遠い領域は非照明領域となる。このため、その限定された領域において生じる蛍光現象の観察を、バックグラウンド蛍光の少ない状態で高感度に行うことが可能になる。
【００３０】
蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチドは、検出用のカメラでは捉えきれない速度でブラウン運動を行っているため、通常は、照明範囲内にある蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは認識することができない。一方、ＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれると、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドはそのブラウン運動が抑えられるため、検出用カメラで認識することが可能になる。このことによって、取り込まれたデオキシリボヌクレオチドと、取り込まれていないデオキシリボヌクレオチドすなわち溶液中を漂う遊離のデオキシリボヌクレオチドを区別することができる。
【００３１】
さらに、励起された蛍光分子は、励起光によって生成した活性酸素の働きにより、次の蛍光分子が取り込まれて発光するまでに消光する、もしくは次の蛍光分子が取り込まれて発光し消光する以前に前の蛍光分子が消光する。このため、読みたい蛍光分子のみを検出することができる。このようにして、発光した蛍光分子の波長及び/又は強度を順に読み取ることによって、標的核酸のシーケンスを行う。TIRFMを用いるシーケンスは、核酸合成における酵素反応を実時間スケールで観察することにより行われる。このため、高速なシーケンスを達成することができる。その速さは、例えば、毎秒１０〜５０塩基程度である。
【００３２】
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドやＤＮＡポリメラーゼβを固定化させる基板としては、核酸伸張を行うための反応溶液より高い屈折率を有し、なお且つ、基板と反応液との界面でレーザーを全反射させたときに、反応液側にエバネッセント場を生じることができるようなものが用いられる。基板は、少なくとも光を透過させる材質から構成されるものが用いられる。例えば、ガラス基板や、ポリカーボネート、ＰＭＭＡなどの樹脂から構成される基板など、高い光透過率を有する材質から構成される基板を好適に用いることができる。
【００３３】
基板への固定化方法としては、特に限定されず、当業者によって適宜選択される。具体的には、例えば、アビジンとビオチンとの結合、ジゴキシゲニンとジゴキシゲニン抗体との結合、アミノ基とカルボキシル基とをＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride）やＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide）を介した共有結合などの、官能基間でのリンカー試薬を用いることにより形成する結合などを利用して適宜行われる。標的核酸を固定化させる場合は、１０〜２０bp程度のプライマー配列を介して固定するとよい。
【００３４】
また、ＤＮＡポリメラーゼβを固定化させる場合は、その活性を失わない状態で固定化するとよい。そのためには、ＤＮＡポリメラーゼβを、アフィニティータグ融合タンパク質として発現させることによる方法を用いると良い。アフィニティータグとしては、ＧＳＴ（Glutathione S-transferase）、６ｘHis（ヒスチジン）、アビジンなどが挙げられる。このとき、それぞれ、ＧＳＴと抗ＧＳＴとの結合、６ｘHisと６ｘHis抗体もしくはNi-NTA（Nitrilotriacetic acid）との結合、アビジンとビオチンとの結合を利用して固定化が行われる。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００３６】
〔１．核酸重合酵素による蛍光標識デオキシリボヌクレオチド取り込み活性比較〕
下記実施例１及び比較例１及び２において、蛍光分子で標識されたデオキシリボヌクレオチドの、核酸重合酵素への取り込み活性の比較を行った。
【００３７】
＜実施例１＞
実施例１では、鋳型ＤＮＡとしてプライマー配列とアデニンからなる核酸（5’-AAAAA AAAAA CCCTC ACGCT GCCAT CCTCC-3’；配列番号１）とジゴキシゲニンを標識したプライマーオリゴヌクレオチド（5’ DIG-GGAGG ATGGC AGCGT GAGGG-3’、配列番号２）を用い、核酸重合酵素として、仔牛由来のＤＮＡポリメラーゼβを用い、基質として、異なる蛍光分子によって標識された２２種のｄＵＴＰに対する取り込み活性について、シーケンスゲル解析した。２２種のｄＵＴＰそれぞれの蛍光標識は、以下のとおりである。
【００３８】
・CascadeBlue
・Coumarine
・Alexa Fluor 488
・Dimethylcoumarine
・BODIPY FL
・Fluorescein
・Fluorescein Chlorotriazinyl
・OregonGreen 488
・Rohdamine Green
・Alexa Fluor 532
・Alexa Fluor 546
・Alexa Fluor 594
・BODIPY TMR
・Cy3
・Lissamine Rohdamine B
・Tetramethylrohdamine
・Texas Red
・BODIPY 630/650
・Cy5
・Cy5.5
・Naptofluorescein
・Cy3.5
【００３９】
シーケンスゲル解析では、はじめに鋳型DNAとプライマーオリゴヌクレオチドを混合し、室温で５分間静置してアニーリングさせた。プライマーオリゴヌクレチドをアニーリングさせた鋳型DNA、DNAポリメラーゼβ、及び上記蛍光標識したdUTPを反応バッファーに含む混合溶液１０μL（最終濃度：0.1μMプライマーオリゴヌクレチド/鋳型DNA、１０μM DNAポリメラーゼβ、10μM蛍光標識dUTP、50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM DTT、5mM 塩化マグネシウム、15v/v% グリセロール）を、３７℃で５分間反応させた。反応終了後に、反応停止液７μL（95v/v% ホルムアミド、20mM EDTA(pH7.5)、0.1w/v% XylenCyanolFF、0.1w/v% BromophenolBlue）を上記混合溶液に添加し、95℃で５分間加熱し、その後氷上に置き急冷した。
【００４０】
反応により伸張したプライマーオリゴヌクレオチドを解析するために、シーケンスゲル板により電気泳動を行った。上記で反応/停止させた溶液３μLをシーケンスゲル（組成：8w/v%ポリアクリルアミド、12M尿素、１ｘTBE）のウェルに入れ、３時間泳動した。泳動後、ナイロンメンブレンをゲルに直接載せて３０分間静置して、泳動したプライマーオリゴヌクレオチドをゲルからナイロンメンブレンに転写した（コンタクトブロッティング）。転写されたナイロンメンブレンをUVクロスリンカーにより２００ｍJ/平方ｃｍで１分間照射して、プライマーオリゴヌクレオチドの固定化を行った。
【００４１】
プライマーオリゴヌクレオチドを化学発光により検出するため、以下の操作を行った（以下全て室温での操作）。プライマーオリゴヌクレオチドが固定されたナイロンメンブレンを洗浄バッファー（0.1Mマレイン酸、0.15M NaCl、0.3v/v% Tween20、ｐH7.5）で１分間振とうした後、ブロッキング溶液（0.1Mマレイン酸、ｐH7.5、10%(w/v)ブロッキング試薬（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製、品番1096176）で３０分間振とうし、その後、アルカリフォスファターゼ標識ジゴキシゲニン抗体溶液（濃度：0.75 U/μL）をブロッキング溶液で1000倍希釈した溶液で１時間振とうした。
次に洗浄バッファーで１０分間振とうし、この洗浄バッファーの洗浄操作を３回繰り返した。メンブレンを検出バッファー（0.1M Tris-HCl,0.1M NaCl, pH9.5）で２分間振とうした。化学発光基質であるCDP-Star溶液（濃度：25mM）を検出バッファーで1000倍希釈した溶液を、上記操作を行ったメンブレン全体に滴下し、15分間静置する。その後X線フィルムに感光し、撮影・現像を行った。この結果を、図２に示す。
【００４２】
＜比較例１>
比較例１では、核酸重合酵素としてklenow fragmentを用いた例であり、重合反応溶液の組成（最終濃度：0.1μMプライマーオリゴヌクレチド/鋳型DNA、2U Klenow fragment、10μM蛍光標識dUTP、50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1mM DTT、7mM 塩化マグネシウム）以外は、実施例１と同様の操作を行うことによって、シーケンスゲル解析を行った。その結果を図３に示す。
【００４３】
＜比較例２＞
比較例２では、核酸重合酵素として、Sequenase Version 2.0（Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’ヌクレアーゼ機能を遺伝子工学的に欠損させたもの；アマシャム社製）を用いた例であり、重合反応溶液の組成（最終濃度：0.1μMプライマーオリゴヌクレチド/鋳型DNA、2U Sequenase Version 2.0、10μM蛍光標識dUTP、40mM Tris-HCl(pH7.5)、50mM NaCl、20mM 塩化マグネシウム）以外は、実施例１と同様の操作を行うことによって、シーケンスゲル解析を行った。その結果を図４に示す。
【００４４】
〔取り込み活性比較の評価〕
核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いた実施例１の方法では、ポリメラーゼβが連続して蛍光標識ｄＵＴＰを取り込むことができたことを示す結果が得られた。図２が示すように、特に、ＢＯＤＩＰＹ(R)シリーズなどの疎水性が高い蛍光標識や、陽イオン性、中性の蛍光標識を有するｄＵＴＰよりも、陰イオン性の蛍光標識を有するｄＵＴＰのほうが取り込み活性に優れていることが分かった。
【００４５】
一方、核酸重合酵素としてklenow fragmentを用いた比較例１では、Coumarineを標識したｄＵＴＰとAlexa Fluor 488を標識したｄＵＴＰとを用いた場合を除いては、全長のＤＮＡを合成することはできず、また核酸重合酵素としてSequenaseを用いた比較例２の方法では、Coumarineを標識したｄＵＴＰを用いた場合を除いては、全長のＤＮＡを合成することはできず、５塩基以下で完全に合成反応が停止してしまったことが分かる。
【００４６】
以上のことから、ＤＮＡポリメラーゼβは、蛍光分子で標識されたデオキシリボヌクレオチドを連続して取り込むことが可能であることが実証された。
【００４７】
〔２．リアルタイム蛍光検出〕
＜実施例２＞
実施例２では、実施例１でＤＮＡポリメラーゼβへの取り込みが良かった、Coumarine（励起：402nm、蛍光：443nm）、Alexa488（励起：495nm、蛍光：519nm）、Cy3.5（励起：550nm、蛍光：570nm）、Cy5（励起：650nm、蛍光：667nm）の４種類の蛍光色素を用い、蛍光分子１分子のリアルタイム検出を行った。このとき用いた光学系を、図５に示す。この光学系においては、全反射型蛍光顕微鏡の一例として対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡（倒立型）を用いた。
【００４８】
図５が示すように、この光学系においては、４種類の蛍光色素それぞれを励起するために、波長が405nm、488nm、532nm、及び633nmの4種類のレーザー光源(11)(12)(13)(14)を導入した。レーザー光源(11)(12)(13)(14)から放出されたレーザー光は、それぞれλ／４偏光板(21)(22)(23)(24)によって円偏光に変換された。変換されたレーザー光は、それぞれダイクロイックミラー(M1)によって、４種類のレーザー光が同軸となるように光軸調整された。
【００４９】
同軸の光路に導かれたレーザー光は、透明基板としてのカバーガラス(50)表面でのエバネッセント場の照明領域を調整するために配置されたビームエキスパンダ(30)によって、ビーム径を調整した。続いて、ビーム径を調整されたレーザー光は、適宜配置された完全反射ミラー(M2)及びダイクロイックミラー(M1)に反射することによって光路を変え、倒立型顕微鏡の対物レンズ(40)へ入射した。対物レンズ(40)とカバーガラス(50)との間には、油浸対物レンズ用オイル(41)を満たし油浸を行った。レーザー光が対物レンズ(40)で屈折し、カバーガラスへ臨界角(61.0度)より大きい角度で入射するように（全反射現象を生じるように）光軸調整することにより、カバーガラス(50)表面上の試料に対してエバネッセント光を照射した。
【００５０】
対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡においては、開口数が1.4よりも大きい対物レンズを使うと、ガラスの屈折率（1.52）と水の屈折率（1.33）とで決まる臨界角（61.0度）より大きい角度でレーザー光を入射すると全反射現象を生じさせることができる。図５の光学系では、対物レンズ(40)として、開口数1.45、倍率150倍のものを用いてエバネッセント場を発生させた。
【００５１】
蛍光色素試料溶液は、最終濃度1nMとなるようにTEバッファー（10mM Tirs-HCl, 1mM EDTA, pH7.4）に溶解し、当該試料溶液１０μLを、厚さ0.12〜0.17mmのカバーガラス(50)上に載置し、その上から同じカバーガラスによってカバーして観察を行った。カバーガラス(50)表面はコーティングなどは行わず、表面に非特異的に吸着した蛍光色素１分子を観察した。
【００５２】
全反射現象を生じさせることにより得られた１分子の蛍光色素の蛍光像は、完全反射ミラー(M2)とともに適宜配置されたダイクロイックミラー(M1)により、波長ごとに４種類に分けられた。図５の光学系では、光路(P1)：Coumarin、光路(P2)：Alexa488、光路(P3)：Cy3.5、及び光路(P4)：Cy5の蛍光色素が観察できるように、それぞれの蛍光色素の上記蛍光波長に対応したダイクロイックミラー(M1)を用いた。同様に、バンドパスフィルター(61)(62)(63)(64)についても、それぞれの蛍光色素の上記蛍光波長に対応したものを用いた。
【００５３】
波長毎に分割された１分子蛍光像は非常に微弱な光であるため、EB-CCDカメラ(81)(82)で検出できるように、イメージインテンシファイア（I.I.と略される）(71)(72)を挿入し光量の増幅を行った。２台のEB-CCDカメラ(81)(82)で得られた１分子蛍光像はビデオフレーム（３０フレーム毎秒）でデジタルビデオ（DV）フォーマットでビデオレコーダ(91)(92)に録画した。２台のビデオレコーダ(91)(92)は、録画のタイミングを合わせるために同期させた。
【００５４】
４種類の１分子の蛍光色素をリアルタイムで検出した例を図６〜９に示す。当該光学システムで目的の波長の蛍光色素１分子だけが観察できていることを確認するために、４種類のレーザー（波長：405nm、488nm、532nm、633nm）を同時に入射した状態で、４種類の色素（Coumarine、Alexa488、Cy3.5、Cy5）ごとに観察を行った。
【００５５】
それぞれの蛍光色素を順に観察すると、該当する１つの画面にのみ検出されていることが判る（図６〜９中では、蛍光色素１分子の蛍光像を白い矢印で示した）。図６〜９のそれぞれにおける４つの画面は、リアルタイムで検出したものである。図６ではCoumarineの青い蛍光のみ、図７ではAlexa488の緑の蛍光のみ、図８ではCy3.5のオレンジの蛍光のみ、図９ではCy5の赤い蛍光のみを検出できることが実証された。
【００５６】
〔３．１分子シーケンス〕
＜実施例３＞
鋳型ＤＮＡとして、アデニン（A）とグアニン（G）とが交互に１０塩基連続した配列を有する核酸（5’- GAGAG AGAGA CCCTC ACGCT GCCAT CCTCC-3’；配列番号３）とビオチンを標識したプライマーオリゴヌクレオチド（5’ Biotin-GGAGG ATGGC AGCGT GAGGG-3’；配列番号４）を用い、基質として、Cy3.5で標識されたdCTP（Cy3.5-dCTP）とCy5で標識されたdUTP（Cy5-dUTP）との２種類を用い、シーケンスを行った。
【００５７】
鋳型ＤＮＡには、図１０に示すように、プライマー配列を介してビオチンが標識されている。そして、当該ビオチン標識を、アビジンコートされたカバーガラスに結合させることによって、鋳型ＤＮＡをカバーガラスに固定させている。この状態で、Cy3.5-dCTPとCy5-dUTPとＤＮＡポリメラーゼβとを含む混合溶液１０μL（最終濃度：10μM DNAポリメラーゼβ、0.5nM Cy3.5-dCTP、0.5nM Cy5-dUTP、12mM Tris-HCl(pH8.0)、0.25mM DTT、1mM 塩化マグネシウム）を流し込むことによってＤＮＡ合成反応を開始し、蛍光の検出を行った。また、反応温度を室温にし、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの濃度を0.5nMにすることで、DNAポリメラーゼβの反応効率を下げてビデオフレームで観察できる遅い合成速度となるようにした。
【００５８】
実時間観察による蛍光の検出の様子を、図１１に示す。取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを分かりやすくするために、各蛍光波長ごとに得られた白黒画像に疑似カラーを付け重ね合わせた画像とした。疑似カラーは、Cy5-dUTPを赤とし、またCy3.5-dCTPを緑とした。図１１に示すように、時間の経過とともに赤（Cy5-dUTP）、緑（Cy3.5-dCTP）、赤（Cy5-dUTP）・・・と蛍光が交互に切り替わって検出されている。すなわち、鋳型ＤＮＡの配列をA、G、A・・・と読むことができ、シーケンスが達成できたことが実証できた。
【００５９】
上記実施例では、本発明の範囲における具体的な形態について示したが、本発明は、これらに限定されることなく他の色々な形態で実施することができる。そのため、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、クレームの均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、TIRFMを用いた本発明の１分子シーケンス法を模式的に示した図である。
【図２】図２は、実施例１において、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いた、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み活性を調べた結果である。
【図３】図３は、比較例１において、核酸重合酵素としてklenow fragmentを用いた、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み活性を調べた結果である。
【図４】図４は、比較例２において、核酸重合酵素としてSequenaseを用いた、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み活性を調べた結果である。
【図５】図５は、実施例２で用いられた光学系を示す図である。
【図６】図６は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Coumarine）１分子が検出されたことを示す結果である。
【図７】図７は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Alexa488）１分子が検出されたことを示す結果である。
【図８】図８は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Cy3.5）１分子が検出されたことを示す結果である。
【図９】図９は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Cy5）１分子が検出されたことを示す結果である。
【図１０】図１０は、実施例３において行われた１分子シーケンス法を模式的に示した図である。
【図１１】図１１は、実施例３において、１分子シーケンスが達成されたことを示す結果である。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
配列番号１は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号２は、プライマーである。
配列番号３は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号４は、プライマーである。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; SHIMADZU CORPORATION
<120> Method for Synthesizing Nucleic Acid and Single Molecule Sequencing Using DNA Polymerase beta
<130> G106168 WO
<150> JP 2006-143619
<151> 2006-05-24
<160> 4
<170> PatentIn version 3.1
<210> 1
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 1
aaaaaaaaaa ccctcacgct gccatcctcc 30
<210> 2
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 2
ggaggatggc agcgtgaggg 20
<210> 3
<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> synthetic oligonucleotide
<400> 3
gagagagaga ccctcacgct gccatcctcc 30
<210> 4
<211> 20
<212> DNA
<213> Artificial
<220>
<223> primer
<400> 4
ggaggatggc agcgtgaggg 20
【０００１】
本発明は、核酸を合成する技術に関する。また、本発明は、生物の核酸を解析する技術に関する。特に、本発明は、１分子の核酸を解析する技術に関する。具体的には、本発明は、ＤＮＡポリメラーゼβを用いた核酸合成法及び１分子シーケンス法（Method for Synthesizing Nucleic Acid and Single Molecule Sequencing Using DNA Polymerase β）に関する。
【背景技術】
【０００２】
従来のＤＮＡシーケンス法の代表例として、４色蛍光と電気泳動とを用いた、所謂サンガー法がある。また、ＤＮＡ１分子を解析する手法のとして、米国特許第６，８１８，３９５号明細書やProceeding of the National Academy of Science of the United States of America, 100, 3960-3964,(2003)に記載されているような、Quakeらによって行われた、klenow fragment（クレノウフラグメント；ＤＮＡポリメラーゼ）を用いた手法がある。
【０００３】
【特許文献１】米国特許第６，８１８，３９５号明細書
【非特許文献１】「プロシーディング・オブ・ザ・ナショナル・アカデミー・オブ・サイエンス・オブ・ザ・ユナイテッド・ステーツ・オブ・アメリカ（Proceeding of the National Academy of Science of the United States of America）」、２００３年、第１００巻、ｐ．３９６０−３９６４
【発明の開示】
【発明が解決しようとする課題】
【０００４】
発明の目的
サンガー法では、前処理が複雑であること；一度に読める塩基数は高々８００塩基程度であること；及び、解析時間が１サンプルあたり数時間かかること、などの問題がある。
【０００５】
Quakeによる方法では、以下の問題がある。
まず、鋳型ＤＮＡ上の１種類の塩基を解析するために、異なる蛍光で標識された４種類のデオキシリボヌクレオチドを用意し、順に４種類の溶液を流し、デオキシリボヌクレオチドごとに塩基取り込みの有無を確認しながら解析していくために、多くの解析時間を必要とする。
また、クレノウフラグメントが用いられているが、当該酵素は蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチドを数塩基以上連続して取り込むことができないため、解析塩基長が数塩基以下に限られ、従って、実用的でない。
さらに、クレノウフラグメントは、３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がわずかながら存在することから、合成した塩基を取り除き再び合成しはじめるため、正確な塩基情報を得ることができない。
【０００６】
そこで本発明の目的は、連続して伸長反応を行うことができる核酸合成法、及び、高速に且つ正確に塩基情報を得ることができる１分子シーケンス法を提供することにある。
【課題を解決するための手段】
【０００７】
発明の概要
本発明者らは、DNAポリメラーゼβを核酸重合酵素として用いることによって、上記本発明の目的が達成されることを見出し、本発明を完成するに至った。
本発明は、以下の（１）〜（６）の発明を含む。
【０００８】
下記（１）に記載の発明は、基質として蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いて核酸を合成する方法に向けられる。
【０００９】
（１） プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体を形成させる工程と、
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、前記ＤＮＡポリメラーゼβに取り込ませることによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ、前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを結合させる工程と、
前記ＤＮＡポリメラーゼβに、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを連続的に取り込ませることによって、前記結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から前記標的核酸に相補的な核酸を伸長させる工程とを含む核酸合成法であって、
前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、陰イオン性の蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオチドである、核酸合成法。
【００１０】
（２） 前記陰イオン性の蛍光色素は、Alexa Fluor (R) 488、Alexa Fluor(R)532、Alexa Fluor(R)546、フルオレセイン、Oregon Green(R)488、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、及びナフトフルオレセインからなる群から選ばれる、（１）に記載の核酸合成法。
【００１１】
下記（３）に記載の発明は、基質として蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いて核酸を合成する方法を用い、ＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光を検出することにより、１分子シーケンスを行う方法に向けられる。
【００１２】
（３） １分子の核酸分子をシーケンスする方法であって、
プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたシーケンスすべき標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体を形成させる工程と、
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、前記ＤＮＡポリメラーゼβに取り込ませることによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ、前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを結合させる工程と、
前記ＤＮＡポリメラーゼβに、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを連続的に取り込ませることによって、前記結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から前記シーケンスすべき標的核酸に相補的な核酸を伸長させる工程とを含み、
前記ＤＮＡポリメラーゼβによって取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光を順次検出することによって、前記標的核酸のシーケンスを行う、１分子の核酸分子をシーケンスする方法であって、
前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、陰イオン性の蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオチドである、１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
【００１３】
（４） 前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは複数種用意され、複数の前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドそれぞれは、塩基ごとに異なる蛍光標識を有するものである、（３）に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
すなわち、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、ｄＡＴＰ、ｄＵＴＰ、ｄＴＴＰ、ｄＣＴＰ及びｄＧＴＰから選ばれる少なくとも２種のデオキシリボヌクレオチドの蛍光標識体であり、蛍光標識が、デオキシリボヌクレオチドの塩基によって異なるように設計されたものである。
【００１４】
さらに、下記（５）に記載の発明は、全反射蛍光顕微鏡技術を用いた高速１分子シーケンス法に向けられる。
【００１５】
（５） 前記シーケンスすべき標的核酸及び前記ＤＮＡポリメラーゼβのいずれか一方が基板に固定化されており、
前記基板における、前記シーケンスすべき標的核酸又は前記ＤＮＡポリメラーゼβが固定化された表面に、エバネッセント場を発生させ、
前記ＤＮＡポリメラーゼβによって前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドが取り込まれた際に、前記取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドにおける、前記エバネッセント場によって励起された蛍光を検出する、（３）又は（４）に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
【００１７】
（６） 前記陰イオン性の蛍光色素は、Alexa Fluor(R)488、Alexa Fluor(R)532、Alexa Fluor(R)546、フルオレセイン、Oregon Green(R)488、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、及びナフトフルオレセインからなる群から選ばれる、（５）に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
【発明の効果】
【００１８】
本発明により、連続して伸長反応を行うことができる核酸合成法、及び、高速に且つ正確に塩基情報を得ることができる１分子シーケンス法を提供することができる。
【発明を実施するための形態】
【００１９】
＜核酸合成法＞
本発明の核酸合成法においては、基質に蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを用い、核酸重合酵素としてポリメラーゼβを用いる。テンプレートとなる標的核酸及びプライマーとなるオリゴヌクレオチドについては、特に限定されるものではない。そして、これらの成分を、通常の核酸合成反応条件下に供する。このことによって、プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体が形成され、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドが、ＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれ、プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ結合する。
【００２０】
本発明で核酸重合酵素として用いられるＤＮＡポリメラーゼβは、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドに対する取り込み活性が大変高いことが発明者らによって見出されている。例えば従来から用いられてきた核酸重合酵素のクレノウフラグメントのように、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み及び合成が数塩基で停止することが無く、連続的に取り込み及び合成を行うことができる。
【００２１】
また、多くの核酸重合酵素は校正機能としての３’→５’エキソヌクレアーゼ活性、すなわち合成した塩基を自ら削り取る機能を有している。しかしながら、本発明で核酸重合酵素として用いられるＤＮＡポリメラーゼβは、従来から修復酵素として知られているものであり、そのような３’→５’エキソヌクレアーゼ活性がない。このため、標的核酸にはじめに結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から、標的核酸に相補的な核酸を安定的に伸張させることができる。
【００２２】
蛍光標識すなわち蛍光官能基の種類としては特に限定されるものではない。ＤＮＡポリメラーゼβへの取り込み活性という観点からは、例えば陰イオン性の蛍光色素であることが好ましい。陰イオン性の蛍光色素としては、例えばAlexa Fluor 488・532・546、fluorescein、Oregon Green 488、Cy3.5・5・5.5、Naphthofluoresceinなどが挙げられる。
【００２３】
本発明の核酸合成法の応用形態の例として、プライマーオリゴヌクレオチド或いは標的核酸のいずれか一方を基板などに固定することによって、これまで安定して伸張固定できなかった、長い蛍光修飾ＤＮＡの伸張固定が可能になる。
【００２４】
本発明の核酸合成法の応用形態の他の例として、通常の核酸複製系に適用し、且つ蛍光検出を行うことによって、複製開始位置或いは複製開始配列を決定することができる。すなわち、複製起点のマッピングを行うことが可能になる。蛍光検出を行う場合は、用いるデオキシリボヌクレオチドの種類それぞれにおいて、異なった波長の蛍光を発するように、蛍光標識を選択することが好ましい。この場合、取り込まれた蛍光標識を検出することによって、シーケンスを行うことが可能になる。このことは、後述の１分子シーケンス法にて詳述する。
【００２５】
＜１分子シーケンス法＞
本発明の１分子シーケンス法においては、基質に蛍光標識デオキシリボヌクレオチド、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用い、上述の核酸合成法において記載したように、核酸合成を行う。そして、取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光を検出することによって、テンプレートとなる標的核酸のシーケンスを行う。蛍光標識は、用いるデオキシリボヌクレオチドの種類それぞれにおいて、異なった波長の蛍光を発するように選択する。
【００２６】
蛍光検出の手段としては特に限定されるものではないが、単塩基分解能で検出を行うことができる手段を用いると良い。
単塩基分解能で検出を行うことができる手段の例としては、米国特許第６，８１８，３９５号明細書やProceeding of the National Academy of Science of the United States of America, 100, 3960-3964,(2003)に記載されている方法が挙げられる。この方法においては、必要な種類（通常４種）の蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを用意し、それら必要な種類の溶液を１種類ずつ順に流し、洗浄することを繰り返すことによって、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドごとに塩基取り込みの有無を確認しながら解析していく。
【００２７】
単塩基分解能で検出を行うことができる手段の他の例としては、全反射蛍光顕微鏡技術（total internal reflection fluorescence microscopy; TIRFM）を用いる方法が挙げられる。この場合、シーケンスすべき標的核酸及びＤＮＡポリメラーゼβのいずれか一方が基板に固定化される。そして、この基板における、シーケンスすべき標的核酸又はＤＮＡポリメラーゼβが固定化された表面に、エバネッセント場を発生させる。核酸合成反応によって、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドがＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれたときに、取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光標識がエバネッセント場によって励起される。このように励起された蛍光を検出する。
【００２８】
TIRFMを用いる方法について、具体例を模式的に図１に示す。図１においては、ＤＮＡポリメラーゼβが基板（透明基板）上に固定されており、プライマーを用い、テンプレートとなる標的核酸（鋳型ＤＮＡ）の複製を行う。あるいは、ＤＮＡポリメラーゼβでなく標的核酸のほうを基板に固定してもよい。そして、必要な種類のデオキシリボヌクレオチドを用意し、それぞれに異なった波長の蛍光を発する修飾を施すことによって、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドとして使用する。
【００２９】
蛍光分子を励起するために、全反射照明を行い、基板の表面にエバネッセント場を発生させる。エバネッセント光が染み出すエリアは基板の表面から約２００ｎｍ以内に限定され、それより遠い領域は非照明領域となる。このため、その限定された領域において生じる蛍光現象の観察を、バックグラウンド蛍光の少ない状態で高感度に行うことが可能になる。
【００３０】
蛍光標識されたデオキシリボヌクレオチドは、検出用のカメラでは捉えきれない速度でブラウン運動を行っているため、通常は、照明範囲内にある蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは認識することができない。一方、ＤＮＡポリメラーゼβに取り込まれると、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドはそのブラウン運動が抑えられるため、検出用カメラで認識することが可能になる。このことによって、取り込まれたデオキシリボヌクレオチドと、取り込まれていないデオキシリボヌクレオチドすなわち溶液中を漂う遊離のデオキシリボヌクレオチドを区別することができる。
【００３１】
さらに、励起された蛍光分子は、励起光によって生成した活性酸素の働きにより、次の蛍光分子が取り込まれて発光するまでに消光する、もしくは次の蛍光分子が取り込まれて発光し消光する以前に前の蛍光分子が消光する。このため、読みたい蛍光分子のみを検出することができる。このようにして、発光した蛍光分子の波長及び/又は強度を順に読み取ることによって、標的核酸のシーケンスを行う。TIRFMを用いるシーケンスは、核酸合成における酵素反応を実時間スケールで観察することにより行われる。このため、高速なシーケンスを達成することができる。その速さは、例えば、毎秒１０〜５０塩基程度である。
【００３２】
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドやＤＮＡポリメラーゼβを固定化させる基板としては、核酸伸張を行うための反応溶液より高い屈折率を有し、なお且つ、基板と反応液との界面でレーザーを全反射させたときに、反応液側にエバネッセント場を生じることができるようなものが用いられる。基板は、少なくとも光を透過させる材質から構成されるものが用いられる。例えば、ガラス基板や、ポリカーボネート、ＰＭＭＡなどの樹脂から構成される基板など、高い光透過率を有する材質から構成される基板を好適に用いることができる。
【００３３】
基板への固定化方法としては、特に限定されず、当業者によって適宜選択される。具体的には、例えば、アビジンとビオチンとの結合、ジゴキシゲニンとジゴキシゲニン抗体との結合、アミノ基とカルボキシル基とをＥＤＣ（1-Ethyl-3-[3-dimethylaminopropyl] carbodiimide Hydrochloride）やＮＨＳ（N-hydroxysuccinimide）を介した共有結合などの、官能基間でのリンカー試薬を用いることにより形成する結合などを利用して適宜行われる。標的核酸を固定化させる場合は、１０〜２０bp程度のプライマー配列を介して固定するとよい。
【００３４】
また、ＤＮＡポリメラーゼβを固定化させる場合は、その活性を失わない状態で固定化するとよい。そのためには、ＤＮＡポリメラーゼβを、アフィニティータグ融合タンパク質として発現させることによる方法を用いると良い。アフィニティータグとしては、ＧＳＴ（Glutathione S-transferase）、６ｘHis（ヒスチジン）、アビジンなどが挙げられる。このとき、それぞれ、ＧＳＴと抗ＧＳＴとの結合、６ｘHisと６ｘHis抗体もしくはNi-NTA（Nitrilotriacetic acid）との結合、アビジンとビオチンとの結合を利用して固定化が行われる。
【実施例】
【００３５】
以下に実施例により本発明をさらに詳しく説明するが、本発明はこれらにより限定されるものではない。
【００３６】
〔１．核酸重合酵素による蛍光標識デオキシリボヌクレオチド取り込み活性比較〕
下記実施例１及び比較例１及び２において、蛍光分子で標識されたデオキシリボヌクレオチドの、核酸重合酵素への取り込み活性の比較を行った。
【００３７】
＜実施例１＞
実施例１では、鋳型ＤＮＡとしてプライマー配列とアデニンからなる核酸（5’-AAAAA AAAAA CCCTC ACGCT GCCAT CCTCC-3’；配列番号１）とジゴキシゲニンを標識したプライマーオリゴヌクレオチド（5’ DIG-GGAGG ATGGC AGCGT GAGGG-3’、配列番号２）を用い、核酸重合酵素として、仔牛由来のＤＮＡポリメラーゼβを用い、基質として、異なる蛍光分子によって標識された２２種のｄＵＴＰに対する取り込み活性について、シーケンスゲル解析した。２２種のｄＵＴＰそれぞれの蛍光標識は、以下のとおりである。
【００３８】
・CascadeBlue
・Coumarine
・Alexa Fluor 488
・Dimethylcoumarine
・BODIPY FL
・Fluorescein
・Fluorescein Chlorotriazinyl
・OregonGreen 488
・Rohdamine Green
・Alexa Fluor 532
・Alexa Fluor 546
・Alexa Fluor 594
・BODIPY TMR
・Cy3
・Lissamine Rohdamine B
・Tetramethylrohdamine
・Texas Red
・BODIPY 630/650
・Cy5
・Cy5.5
・Naptofluorescein
・Cy3.5
【００３９】
シーケンスゲル解析では、はじめに鋳型DNAとプライマーオリゴヌクレオチドを混合し、室温で５分間静置してアニーリングさせた。プライマーオリゴヌクレチドをアニーリングさせた鋳型DNA、DNAポリメラーゼβ、及び上記蛍光標識したdUTPを反応バッファーに含む混合溶液１０μL（最終濃度：0.1μMプライマーオリゴヌクレチド/鋳型DNA、１０μM DNAポリメラーゼβ、10μM蛍光標識dUTP、50mM Tris-HCl(pH8.0)、1mM DTT、5mM 塩化マグネシウム、15v/v% グリセロール）を、３７℃で５分間反応させた。反応終了後に、反応停止液７μL（95v/v% ホルムアミド、20mM EDTA(pH7.5)、0.1w/v% XylenCyanolFF、0.1w/v% BromophenolBlue）を上記混合溶液に添加し、95℃で５分間加熱し、その後氷上に置き急冷した。
【００４０】
反応により伸張したプライマーオリゴヌクレオチドを解析するために、シーケンスゲル板により電気泳動を行った。上記で反応/停止させた溶液３μLをシーケンスゲル（組成：8w/v%ポリアクリルアミド、12M尿素、１ｘTBE）のウェルに入れ、３時間泳動した。泳動後、ナイロンメンブレンをゲルに直接載せて３０分間静置して、泳動したプライマーオリゴヌクレオチドをゲルからナイロンメンブレンに転写した（コンタクトブロッティング）。転写されたナイロンメンブレンをUVクロスリンカーにより２００ｍJ/平方ｃｍで１分間照射して、プライマーオリゴヌクレオチドの固定化を行った。
【００４１】
プライマーオリゴヌクレオチドを化学発光により検出するため、以下の操作を行った（以下全て室温での操作）。プライマーオリゴヌクレオチドが固定されたナイロンメンブレンを洗浄バッファー（0.1Mマレイン酸、0.15M NaCl、0.3v/v% Tween20、ｐH7.5）で１分間振とうした後、ブロッキング溶液（0.1Mマレイン酸、ｐH7.5、10%(w/v)ブロッキング試薬（ロッシュ・ダイアグノスティックス社製、品番1096176）で３０分間振とうし、その後、アルカリフォスファターゼ標識ジゴキシゲニン抗体溶液（濃度：0.75 U/μL）をブロッキング溶液で1000倍希釈した溶液で１時間振とうした。
次に洗浄バッファーで１０分間振とうし、この洗浄バッファーの洗浄操作を３回繰り返した。メンブレンを検出バッファー（0.1M Tris-HCl,0.1M NaCl, pH9.5）で２分間振とうした。化学発光基質であるCDP-Star溶液（濃度：25mM）を検出バッファーで1000倍希釈した溶液を、上記操作を行ったメンブレン全体に滴下し、15分間静置する。その後X線フィルムに感光し、撮影・現像を行った。この結果を、図２に示す。
【００４２】
＜比較例１>
比較例１では、核酸重合酵素としてklenow fragmentを用いた例であり、重合反応溶液の組成（最終濃度：0.1μMプライマーオリゴヌクレチド/鋳型DNA、2U Klenow fragment、10μM蛍光標識dUTP、50mM Tris-HCl(pH7.5)、0.1mM DTT、7mM 塩化マグネシウム）以外は、実施例１と同様の操作を行うことによって、シーケンスゲル解析を行った。その結果を図３に示す。
【００４３】
＜比較例２＞
比較例２では、核酸重合酵素として、Sequenase Version 2.0（Ｔ７ＤＮＡポリメラーゼの３’→５’ヌクレアーゼ機能を遺伝子工学的に欠損させたもの；アマシャム社製）を用いた例であり、重合反応溶液の組成（最終濃度：0.1μMプライマーオリゴヌクレチド/鋳型DNA、2U Sequenase Version 2.0、10μM蛍光標識dUTP、40mM Tris-HCl(pH7.5)、50mM NaCl、20mM 塩化マグネシウム）以外は、実施例１と同様の操作を行うことによって、シーケンスゲル解析を行った。その結果を図４に示す。
【００４４】
〔取り込み活性比較の評価〕
核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いた実施例１の方法では、ポリメラーゼβが連続して蛍光標識ｄＵＴＰを取り込むことができたことを示す結果が得られた。図２が示すように、特に、ＢＯＤＩＰＹ(R)シリーズなどの疎水性が高い蛍光標識や、陽イオン性、中性の蛍光標識を有するｄＵＴＰよりも、陰イオン性の蛍光標識を有するｄＵＴＰのほうが取り込み活性に優れていることが分かった。
【００４５】
一方、核酸重合酵素としてklenow fragmentを用いた比較例１では、Coumarineを標識したｄＵＴＰとAlexa Fluor 488を標識したｄＵＴＰとを用いた場合を除いては、全長のＤＮＡを合成することはできず、また核酸重合酵素としてSequenaseを用いた比較例２の方法では、Coumarineを標識したｄＵＴＰを用いた場合を除いては、全長のＤＮＡを合成することはできず、５塩基以下で完全に合成反応が停止してしまったことが分かる。
【００４６】
以上のことから、ＤＮＡポリメラーゼβは、蛍光分子で標識されたデオキシリボヌクレオチドを連続して取り込むことが可能であることが実証された。
【００４７】
〔２．リアルタイム蛍光検出〕
＜実施例２＞
実施例２では、実施例１でＤＮＡポリメラーゼβへの取り込みが良かった、Coumarine（励起：402nm、蛍光：443nm）、Alexa488（励起：495nm、蛍光：519nm）、Cy3.5（励起：550nm、蛍光：570nm）、Cy5（励起：650nm、蛍光：667nm）の４種類の蛍光色素を用い、蛍光分子１分子のリアルタイム検出を行った。このとき用いた光学系を、図５に示す。この光学系においては、全反射型蛍光顕微鏡の一例として対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡（倒立型）を用いた。
【００４８】
図５が示すように、この光学系においては、４種類の蛍光色素それぞれを励起するために、波長が405nm、488nm、532nm、及び633nmの4種類のレーザー光源(11)(12)(13)(14)を導入した。レーザー光源(11)(12)(13)(14)から放出されたレーザー光は、それぞれλ／４偏光板(21)(22)(23)(24)によって円偏光に変換された。変換されたレーザー光は、それぞれダイクロイックミラー(M1)によって、４種類のレーザー光が同軸となるように光軸調整された。
【００４９】
同軸の光路に導かれたレーザー光は、透明基板としてのカバーガラス(50)表面でのエバネッセント場の照明領域を調整するために配置されたビームエキスパンダ(30)によって、ビーム径を調整した。続いて、ビーム径を調整されたレーザー光は、適宜配置された完全反射ミラー(M2)及びダイクロイックミラー(M1)に反射することによって光路を変え、倒立型顕微鏡の対物レンズ(40)へ入射した。対物レンズ(40)とカバーガラス(50)との間には、油浸対物レンズ用オイル(41)を満たし油浸を行った。レーザー光が対物レンズ(40)で屈折し、カバーガラスへ臨界角(61.0度)より大きい角度で入射するように（全反射現象を生じるように）光軸調整することにより、カバーガラス(50)表面上の試料に対してエバネッセント光を照射した。
【００５０】
対物レンズ型全反射蛍光顕微鏡においては、開口数が1.4よりも大きい対物レンズを使うと、ガラスの屈折率（1.52）と水の屈折率（1.33）とで決まる臨界角（61.0度）より大きい角度でレーザー光を入射すると全反射現象を生じさせることができる。図５の光学系では、対物レンズ(40)として、開口数1.45、倍率150倍のものを用いてエバネッセント場を発生させた。
【００５１】
蛍光色素試料溶液は、最終濃度1nMとなるようにTEバッファー（10mM Tirs-HCl, 1mM EDTA, pH7.4）に溶解し、当該試料溶液１０μLを、厚さ0.12〜0.17mmのカバーガラス(50)上に載置し、その上から同じカバーガラスによってカバーして観察を行った。カバーガラス(50)表面はコーティングなどは行わず、表面に非特異的に吸着した蛍光色素１分子を観察した。
【００５２】
全反射現象を生じさせることにより得られた１分子の蛍光色素の蛍光像は、完全反射ミラー(M2)とともに適宜配置されたダイクロイックミラー(M1)により、波長ごとに４種類に分けられた。図５の光学系では、光路(P1)：Coumarin、光路(P2)：Alexa488、光路(P3)：Cy3.5、及び光路(P4)：Cy5の蛍光色素が観察できるように、それぞれの蛍光色素の上記蛍光波長に対応したダイクロイックミラー(M1)を用いた。同様に、バンドパスフィルター(61)(62)(63)(64)についても、それぞれの蛍光色素の上記蛍光波長に対応したものを用いた。
【００５３】
波長毎に分割された１分子蛍光像は非常に微弱な光であるため、EB-CCDカメラ(81)(82)で検出できるように、イメージインテンシファイア（I.I.と略される）(71)(72)を挿入し光量の増幅を行った。２台のEB-CCDカメラ(81)(82)で得られた１分子蛍光像はビデオフレーム（３０フレーム毎秒）でデジタルビデオ（DV）フォーマットでビデオレコーダ(91)(92)に録画した。２台のビデオレコーダ(91)(92)は、録画のタイミングを合わせるために同期させた。
【００５４】
４種類の１分子の蛍光色素をリアルタイムで検出した例を図６〜９に示す。当該光学システムで目的の波長の蛍光色素１分子だけが観察できていることを確認するために、４種類のレーザー（波長：405nm、488nm、532nm、633nm）を同時に入射した状態で、４種類の色素（Coumarine、Alexa488、Cy3.5、Cy5）ごとに観察を行った。
【００５５】
それぞれの蛍光色素を順に観察すると、該当する１つの画面にのみ検出されていることが判る（図６〜９中では、蛍光色素１分子の蛍光像を白い矢印で示した）。図６〜９のそれぞれにおける４つの画面は、リアルタイムで検出したものである。図６ではCoumarineの青い蛍光のみ、図７ではAlexa488の緑の蛍光のみ、図８ではCy3.5のオレンジの蛍光のみ、図９ではCy5の赤い蛍光のみを検出できることが実証された。
【００５６】
〔３．１分子シーケンス〕
＜実施例３＞
鋳型ＤＮＡとして、アデニン（A）とグアニン（G）とが交互に１０塩基連続した配列を有する核酸（5’- GAGAG AGAGA CCCTC ACGCT GCCAT CCTCC-3’；配列番号３）とビオチンを標識したプライマーオリゴヌクレオチド（5’ Biotin-GGAGG ATGGC AGCGT GAGGG-3’；配列番号４）を用い、基質として、Cy3.5で標識されたdCTP（Cy3.5-dCTP）とCy5で標識されたdUTP（Cy5-dUTP）との２種類を用い、シーケンスを行った。
【００５７】
鋳型ＤＮＡには、図１０に示すように、プライマー配列を介してビオチンが標識されている。そして、当該ビオチン標識を、アビジンコートされたカバーガラスに結合させることによって、鋳型ＤＮＡをカバーガラスに固定させている。この状態で、Cy3.5-dCTPとCy5-dUTPとＤＮＡポリメラーゼβとを含む混合溶液１０μL（最終濃度：10μM DNAポリメラーゼβ、0.5nM Cy3.5-dCTP、0.5nM Cy5-dUTP、12mM Tris-HCl(pH8.0)、0.25mM DTT、1mM 塩化マグネシウム）を流し込むことによってＤＮＡ合成反応を開始し、蛍光の検出を行った。また、反応温度を室温にし、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの濃度を0.5nMにすることで、DNAポリメラーゼβの反応効率を下げてビデオフレームで観察できる遅い合成速度となるようにした。
【００５８】
実時間観察による蛍光の検出の様子を、図１１に示す。取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを分かりやすくするために、各蛍光波長ごとに得られた白黒画像に疑似カラーを付け重ね合わせた画像とした。疑似カラーは、Cy5-dUTPを赤とし、またCy3.5-dCTPを緑とした。図１１に示すように、時間の経過とともに赤（Cy5-dUTP）、緑（Cy3.5-dCTP）、赤（Cy5-dUTP）・・・と蛍光が交互に切り替わって検出されている。すなわち、鋳型ＤＮＡの配列をA、G、A・・・と読むことができ、シーケンスが達成できたことが実証できた。
【００５９】
上記実施例では、本発明の範囲における具体的な形態について示したが、本発明は、これらに限定されることなく他の色々な形態で実施することができる。そのため、上記実施例はあらゆる点で単なる例示に過ぎず、限定的に解釈してはならない。さらに、クレームの均等範囲に属する変更は、すべて本発明の範囲内である。
【図面の簡単な説明】
【００６０】
【図１】図１は、TIRFMを用いた本発明の１分子シーケンス法を模式的に示した図である。
【図２】図２は、実施例１において、核酸重合酵素としてＤＮＡポリメラーゼβを用いた、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み活性を調べた結果である。
【図３】図３は、比較例１において、核酸重合酵素としてklenow fragmentを用いた、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み活性を調べた結果である。
【図４】図４は、比較例２において、核酸重合酵素としてSequenaseを用いた、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの取り込み活性を調べた結果である。
【図５】図５は、実施例２で用いられた光学系を示す図である。
【図６】図６は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Coumarine）１分子が検出されたことを示す結果である。
【図７】図７は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Alexa488）１分子が検出されたことを示す結果である。
【図８】図８は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Cy3.5）１分子が検出されたことを示す結果である。
【図９】図９は、実施例２において、リアルタイムで蛍光分子（Cy5）１分子が検出されたことを示す結果である。
【図１０】図１０は、実施例３において行われた１分子シーケンス法を模式的に示した図である。
【図１１】図１１は、実施例３において、１分子シーケンスが達成されたことを示す結果である。
【配列表フリーテキスト】
【００６１】
配列番号１は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号２は、プライマーである。
配列番号３は、合成オリゴヌクレオチドである。
配列番号４は、プライマーである。
【配列表】
SEQUENCE LISTING
<110> National Institute of Advanced Industrial Science and Technology; SHIMADZU CORPORATION
<120> Method for Synthesizing Nucleic Acid and Single Molecule Sequencing Using DNA Polymerase beta
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<211> 30
<212> DNA
<213> Artificial
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<223> synthetic oligonucleotide
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aaaaaaaaaa ccctcacgct gccatcctcc 30
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Claims (6)
- プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズした標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体を形成させる工程と、
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、前記ＤＮＡポリメラーゼβに取り込ませることによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ、前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを結合させる工程と、
前記ＤＮＡポリメラーゼβに、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを連続的に取り込ませることによって、前記結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から前記標的核酸に相補的な核酸を伸長させる工程とを含む核酸合成法であって、
前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、陰イオン性の蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオチドである、核酸合成法。 - 前記陰イオン性の蛍光色素は、Alexa Fluor(R)488、Alexa Fluor(R)532、Alexa Fluor(R)546、フルオレセイン、Oregon Green(R)488、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、及びナフトフルオレセインからなる群から選ばれる、請求項１に記載の核酸合成法。
- １分子の核酸分子をシーケンスする方法であって、
プライマーオリゴヌクレオチドがハイブリダイズしたシーケンスすべき標的核酸と、ＤＮＡポリメラーゼβとの複合体を形成させる工程と、
蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを、前記ＤＮＡポリメラーゼβに取り込ませることによって、前記プライマーオリゴヌクレオチドの３’末端へ、前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを結合させる工程と、
前記ＤＮＡポリメラーゼβに、蛍光標識デオキシリボヌクレオチドを連続的に取り込ませることによって、前記結合した蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの３’末端から前記シーケンスすべき標的核酸に相補的な核酸を伸長させる工程とを含み、
前記ＤＮＡポリメラーゼβによって取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドの蛍光を順次検出することによって、前記標的核酸のシーケンスを行う、１分子の核酸分子をシーケンスする方法であって、
前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは、陰イオン性の蛍光色素で標識されたデオキシリボヌクレオチドである、１分子の核酸分子をシーケンスする方法。 - 前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドは複数種用意され、複数の前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドそれぞれは、塩基ごとに異なる蛍光標識を有するものである、請求項３に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
- 前記シーケンスすべき標的核酸及び前記ＤＮＡポリメラーゼβのいずれか一方が基板に固定化されており、
前記基板における、前記シーケンスすべき標的核酸又は前記ＤＮＡポリメラーゼβが固定化された表面に、エバネッセント場を発生させ、
前記ＤＮＡポリメラーゼβによって前記蛍光標識デオキシリボヌクレオチドが取り込まれた際に、前記取り込まれた蛍光標識デオキシリボヌクレオチドにおける、前記エバネッセント場によって励起された蛍光を検出する、請求項３又は４に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。 - 前記陰イオン性の蛍光色素は、Alexa Fluor(R)488、Alexa Fluor(R)532、Alexa Fluor(R)546、フルオレセイン、Oregon Green(R)488、Cy3.5、Cy5、Cy5.5、及びナフトフルオレセインからなる群から選ばれる、請求項５に記載の１分子の核酸分子をシーケンスする方法。
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