JP5199272B2 - 細胞培養の増殖を制御する方法 - Google Patents
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Description
本発明は、高細胞密度培養の分野に関する。より具体的には、本発明は、流加培養技術によって、培地中で高細胞密度に増殖した微生物の増殖を制御する方法に関する。
振盪培養は、通常、全ての成分が培養開始時に添加される回分培養である。非常に高い基質濃度、不十分な給気、無制御の増殖、有害な代謝産物の合成(オーバーフロー代謝または嫌気的代謝)、異化代謝産物抑制、および基質による中毒さえも、無制御の振盪培養では容易に起こる。大腸菌の振盪培養におけるバイオマス収量は、通常1〜2g/lの範囲内であり、微小規模では大抵よりずっと低い値となる。基質供給およびpHの調節をうまく計画することで、最大50倍のバイオマスが、一般的に使用される標準的な実験室レベルで、または工業用バイオリアクターで産生され得る。より大きな規模において適用される制御方法(継続的な監視および制御)は、小規模の振盪培養においては容易に適用できない。継続的な監視および供給を行う設定は、小規模において実現することは困難である。無制御の増殖および不十分な給気は、速やかに酸素欠乏を引き起こす。酸素が制限されている間に、細菌の増殖を阻害し、組み換えタンパク質の製造を減ずる発酵産物(酢酸、二酸化炭素、ギ酸、乳酸、エタノール、コハク酸)が大量に製造される。グルコースの取り込み、およびグリコリシスが、クエン酸回路の能力以上に早いならば、これらの代謝産物のいくつかは、好気条件下においても合成される。そのようなオーバーフロー代謝中において、アセチルCoAは、培養液中に分泌される酢酸塩に変換される。呼吸における異化代謝産物抑制(クラブトリー効果)もまた、好気条件下においても、高グルコース濃度に長期間曝露されている間に起こり得る。
本発明において、有利な、制御された基質の徐放は、驚くべきことに、コンピュータによる制御または外部からの供給装置の無い振盪バイオリアクターの底部のゲル中に固定化された重合体の酵素消化によってなされた。二相系が、1)高細胞密度を支持するようになる細胞によって直接的に消化されない多量の炭素源の積込み、2)前記の非消化性炭素源の液相への徐放、を可能にするために開発された。一例として、グルコアミラーゼが触媒する、デンプンからのグルコースの放出が挙げられる。酸素制限は避けられ、そしてより多量のバイオマスが、大腸菌の培養において、振盪フラスコおよびディープウェルプレート中において得られる。(グルコアミラーゼの添加より先に)培地中の少量のグルコースが、放出されたグルコースを速やかに消費するための十分な量の細菌を、早急に得るために使用され得る。最適化された手順により、より著しく高い細胞密度が、組み換え遺伝子の発現の誘導のために使用され、そしてその結果として、より高い産物収量が得られる。
本発明は、流加培養技術によって培地中で高細胞密度に増殖した微生物の増殖を制御する方法を提供する。
Claims (25)
- 流加培養技術によって、培養培地中で高細胞密度に増殖した微生物の増殖を制御する方法であって、以下のステップ:
− 液相および固相またはゲル相を有する二相系を提供し、ここで前記二相系は、前記固相またはゲル相から基質送達重合体源を提供し、そして前記液相は培養培地として働き;
− 酵素を提供し、そして前記基質送達重合体から、制御された方法で、増殖制限基質またはpH調節剤を酵素的に放出し;そして
− 前記微生物の増殖を制御するために所望される放出速度を得るために、前記増殖制限基質またはpH調節剤の放出速度を制御すること
を特徴とする、前記方法。 - 前記基質送達重合体が、固相またはゲル相中に固定化されているか、または結合されていることを特徴とする、請求項1記載の方法。
- 制御された前記放出速度が、前記ゲルの組成の変更による前記ゲルの組成の制御、前記酵素の濃度の制御または前記酵素の活性の制御によって得られることを特徴とする、請求項1または2記載の方法。
- 前記微生物が重合体分解酵素を欠いており、そして前記基質送達重合体が、前記微生物によって速やかに炭素源として使用されないことを特徴とする、請求項3記載の方法。
- 液体部分の添加後、前記基質送達重合体が、前記液相中へ分散し始めることを特徴とする、請求項1〜4のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が、前記培地に添加されることを特徴とする、請求項1〜5のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が、前記微生物によって産生されることを特徴とする、請求項1〜6のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固相またはゲル相が、底板の形態にあることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記固相またはゲル相が、ビーズの形態にあることを特徴とする、請求項1〜8のいずれか一項に記載の方法。
- 第一の固相またはゲルの上に、第二のゲルがさらに存在することを特徴とする、請求項1〜9のいずれか一項に記載の方法。
- 前記基質送達重合体が、多糖であることを特徴とする、請求項1〜10のいずれか一項に記載の方法。
- 前記多糖が、デンプン、寒天、カラギーン、グリコーゲンおよびペプチドグリカンから選択されることを特徴とする、請求項11記載の方法。
- 前記基質送達重合体が、タンパク質またはポリペプチドであることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記タンパク質またはポリペプチドが、コラーゲンまたはゼラチンから選択されることを特徴とする、請求項13記載の方法。
- 前記基質送達重合体が、リン酸含有化合物であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記リン酸含有化合物が、核酸またはポリリン酸から選択されることを特徴とする、請求項15記載の方法。
- 前記基質送達重合体が、窒素含有化合物であることを特徴とする、請求項1〜7のいずれか一項に記載の方法。
- 前記窒素含有化合物が、ポリアクリルアミドもしくはポリアミンまたはタンパク質から選択されることを特徴とする、請求項17記載の方法。
- 前記増殖制限基質が、栄養素であることを特徴とする、請求項1〜18のいずれか一項に記載の方法。
- 前記増殖制限基質が、pH調節剤であることを特徴とする、請求項1〜19のいずれか一項に記載の方法。
- 前記酵素が、アミラーゼ、プロテアーゼ、ペプチダーゼ、ヌクレアーゼおよびアミダーゼから選択されることを特徴とする、請求項1〜20のいずれか一項に記載の方法。
- 流加培養技術によって、培地中で高細胞密度に増殖した微生物培養中の増殖制限代謝産物の合成を制限する方法であって、前記増殖制限代謝産物の合成を制限するために、請求項1〜21のいずれか一項に記載の方法が、前記増殖制限基質の放出速度を制御して前記増殖制限基質を前記細胞へ放出するために使用されることを特徴とする、前記方法。
- 高細胞密度に増殖した微生物細胞培養中における酸素制限を抑制する方法であって、酸素消費を制限するために、請求項1〜22のいずれか一項に記載の方法が、前記増殖制限基質を徐々に前記細胞へ放出するために使用されることを特徴とする、前記方法。
- 培地中で培養された微生物の増殖を制御するための、高細胞密度流加培養技術を基礎とした培養系であって、液相および固相またはゲル相を有する二相系を含み、それが、酵素によって制御された方法で、増殖制限基質又はpH調節剤に変化されるように配置されている基質送達重合体を提供することを特徴とする、前記培養系。
- 培地中で培養された微生物の増殖を制御するための、高細胞密度流加培養技術培養キットであって、液相および固相またはゲル相を有する二相系を含み、それが、酵素によって制御された方法で、増殖制限基質又はpH調節剤に変化されるように配置されている基質送達重合体を提供することを特徴とする、前記培養キット。
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