CN101595208A - 用于控制细胞培养物生长的方法 - Google Patents

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Abstract

本发明提供了一种通过补料分批技术来控制培养基中培养的微生物生长至高细胞密度的方法，其中在具有液相(培养基)和固相或胶相的两相系统中，固相或胶相提供了一种基质投递聚合物源，其以受控方法被酶转变成限制生长基质或pH调节剂。本发明还提供了一种用于在微生物细胞培养物中限制限制生长代谢物合成和阻止氧耗尽的方法。

Description

用于控制细胞培养物生长的方法
发明领域
本发明涉及高细胞密度培养领域。更具体地，本发明涉及一种用于通过补料分批技术(fed-batch)来控制培养基中培养的微生物生长至高细胞密度的方法。
发明背景
振荡培养物通常是在培养之初便添加所有成分的分批培养物。非受控的振荡培养物中容易出现过高的基质(substrate)浓度、不充分的通气、不受控制的生长、有害代谢物的合成(溢流或无氧代谢)、分解代谢物阻遏、甚至基质中毒。振荡的大肠杆菌培养物中的生物质(biomass)产率范围通常为1-2g/l(干重)，微小规模(microscale)时通常更低。通过精心设计的基质补料和pH控制，在常用的常规实验室或工业生物反应器中可生产高达50倍以上的生物质。较大规模中应用的控制策略(连续监测和控制)不易应用于少量的振荡培养物。连续监测和补料的设置在小规模中难以实现。非受控的生长和不充分的通气会很快引起氧耗尽。氧限制期间，发酵产物(乙酸根(acetate)、CO2、甲酸、乳酸、乙醇、琥珀酸)大量形成会抑制细菌生长和损害重组蛋白质过程的量形成。若葡萄糖摄取和糖酵解快于柠檬酸循环的能力，则这些代谢物中的一些还可在需氧条件下合成。在此类溢流代谢期间，乙酰CoA转变成被分泌至培养基的乙酸根。还可在长期暴露于高浓度葡萄糖期间(即使在需氧条件中)发生呼吸作用的分解代谢阻遏(Crabtree效应)。
为了避免氧限制、溢流(over-flow)代谢和Crabtree效应，生物反应器中的高细胞密度培养物通常应用补料分批技术。在基质受限的补料分批培养中，可用一种限制性基质(通常为作为唯一碳源使用的葡萄糖)控制细菌生长率。氧消耗随着呼吸活性(基质使用)和生长率增加。因此，可通过抑制微生物生长，也可通过基质限制来避免氧限制。然而，大多数简单培养是在摇瓶中在没有检测或补料可能性的情况下进行的。所应用的培养方法通常是分批培养。生物质产率通常保持低下，而且如此生产的培养物的品质是不可预测的，并且通常是差的。用分批方法达不到高细胞密度，因为此细胞密度要求如此之高的最初营养物浓度以致其会对微生物有毒。
因为测量和补料装置通常不可应用于简单的振荡培养物，因此已经开发了备选的策略。在医学疗法中，通常通过在一段长时间里缓慢释放基质来提供药物。药物投递样系统很少应用于微生物培养中，因为基质通常是小分子(诸如葡萄糖和氨水)，对此释放率难以控制。通过“药物投递”样系统，Lübbe等(Appl Microbiol Biotechnol(1985)22：424-427)已经在带小棒链霉菌(Streptomyces clavuligerus)培养中提供NH4Cl，而且最近，Jeude等(BiotechnolBioeng(2006)Vol.96，No.3：433-443)已经使用含有葡萄糖的硅氧烷弹性体(聚二甲基硅氧烷)盘来产生补料分批样培养条件(还可参见Büchs等WO2006/119867“Fermentation method and apparatus for its implementation”)。可将这些盘添加至培养容器，但是它们不是培养容器的整合部分。然而，仅可将相对少量的葡萄糖包入此衬质(matrix)中。此外，通常在培养开始时此衬质的葡萄糖释放率最快，此时微生物质最低而溢流代谢的风险最高。这可解释为何此类系统未曾在生物技术方面最重要的细菌种类，即大肠杆菌(Escherichia coli)的简单培养中快速流行。
Tyrell等(J.Bacteriol 75(1958)：1-4；“Biphasic system for growing bacteriain concentrated culture”)已经提出了一种用于将营养物样酵母提取物包入凝胶中的方法。然而，该方法没有控制营养物释放率的可能性，特别地，该凝胶的葡萄糖释放非常快地发生。因此，不可应用于高细胞密度培养。该方法从未变得流行，因为富含营养物的、良好缓冲的复合培养基样超级肉汤(superbroth)或极端肉汤(terrific broth)更易于使用，并提供更高的细胞密度。
Green和James(US3926723“Method of controllably releasing glucose to acell culture medium”1975)已经提出了一项关于动物细胞培养物的有趣申请。他们使用少量的可溶性淀粉作为细胞的碳源。培养基中使用的马、猪或牛血清提供了足够的催化活性以逐渐释放少量的葡萄糖。还可使用所添加的酶替换血清酶。该方法仅使用2g/l淀粉，其在理论上可支持1g/l的最大生物质(细胞)。在人细胞培养物中，没有获得细胞数目的显著增加。它没被用于控制或限制培养物生长率，而是仅被用于阻止一种生长延缓化合物(growthretarding compound)，即乳酸的积累。如此，作者似乎没有意识到作为达到高细胞密度策略的补料分批技术，而且由于他们使用低浓度淀粉，他们的方法不可视为高细胞密度培养。对于细菌培养(例如对于大肠杆菌)，该方法不会起作用：复合培养基(诸如血清、酵母提取物或蛋白胨)包含数种可发挥碳源功能的成分。因此，不可通过限制一种碳源(例如葡萄糖)的浓度来获得生长控制。在微生物补料分批培养中，每次通常使用化学成分确知培养基和仅一种限制生长基质(growth limiting substrate)。此外，如依照本发明会显示的，仅少量的淀粉可在培养基中保持可溶，以便为高细胞密度微生物培养提供足够的葡萄糖。对于需氧生长型微生物，高淀粉量的存在严重减弱培养基的氧传递能力，由此提高无氧代谢的风险。针对该原因，需要一种可将高碳源量装入培养容器中的智能系统。
迄今公布的缓慢释放方法受限于1)可缩放性，2)可被装填至系统的所投递基质量或3)精确控制基质释放的方法。上文所述方法均未提供解决简单振荡培养物中微生物高细胞密度培养的所有这些实质性要求的完整方法。在基于对基质投递聚合物(substrate delivering polymer)的酶促降解的方法中，必须在不损害培养基性质(例如氧传递能力)的情况下向培养容器中加载高的聚合物量。
发明概述
在本发明中，通过对固定化至振荡生物反应器底部凝胶中的聚合物的酶促消化意外获得有益的、受控的基质缓慢释放，所述振荡生物反应器不含计算机辅助控制或外部补料装置。开发两相系统以容许1)装填高碳源量以支持高细胞密度，所述碳源不可由会被培养的细胞直接消化；和2)延缓所述不易消化的碳源向液相的释放。作为一个例子，提出葡糖淀粉酶(glucoamylase)催化葡萄糖从淀粉的释放。可避免氧限制，并可在摇瓶和深孔板中的大肠杆菌培养物中获得较高的生物质。可使用培养基中少量的葡萄糖(添加葡糖淀粉酶之前)以迅速获得足以立即消耗所释放葡萄糖的细菌。通过最优化的方案，可使用显著较高的细胞密度以诱导重组基因的表达，随后可获得较高的产物产率。
本发明提供了一种通过补料分批技术来控制培养基中培养的微生物生长至高细胞密度的方法，其中在具有液相(培养基)和固相或胶相的两相系统中，固相或胶相提供了一种基质投递聚合物源，其以受控方法被酶转变成限制生长基质或pH调节剂。通过利用固相或胶相，可在不损害液相物理性质的情况下以支持高细胞密度的量向系统装填基质投递聚合物。
本发明将补料分批方法应用于非受控振荡微生物培养物以在不进行外部补料的情况下达到高细胞密度(即比通过分批培养获得的细胞密度高得多)。通过酶促释放从被整合或固定化至凝胶的聚合物(例如淀粉)中获得限制生长基质(例如葡萄糖)。两相系统的使用容许将高的聚合物量填入培养容器中，使得其可在不损害液体物理性质(例如氧传递性质)的情况下从固相或胶相缓慢释放至液相中。聚合物不是立即可利用的，而且基质会被酶以受控方式释放以获得想要的释放率。还可调整释放至培养基中的限制生长基质的总量。可仅通过例如控制凝胶成分、控制(即改变)酶浓度或控制(即改变)酶活性(例如通过酶修饰实现)来获得最优化的受控基质释放率。此系统是可缩放的(scaleable)，而且可应用于各种生物反应器系统。
本发明方法的一个优点在于可限制细胞培养物中限制生长代谢物(growth limiting metabolite)的合成。这是通过阻止过量基质补料(溢流代谢的原因)和非受控生长(氧耗尽的原因)获得的。本发明的方法还可用于控制细胞培养物的pH。另一个优点在于不需要泵或其它外部装置，因此培养系统可以是简单而合算的。
本发明的一方面提供了一种用于控制培养基中培养的生物体生长的方法，其中通过酶促作用以受控方式将限制生长基质从基质投递聚合物释放至培养基中。所述限制生长基质可以是例如营养物或pH调节剂。
本发明的另一方面提供了一种用于限制细胞培养物中限制生长代谢物合成的方法，其中使用所述用于控制生长的方法来向细胞缓慢释放限制生长基质以限制限制生长代谢物的合成。
本发明的又一方面提供了一种通过利用上文所述方法来预防细胞培养物中氧限制(或耗尽，因为这些单词可互换使用)的方法。
本发明的又一方面提供了一种用于控制细胞培养物pH的方法，其中通过聚合物降解酶(polymer-degrading enzyme)的酶促作用以受控方式将pH调节剂从聚合物释放至培养基中。
本发明的又一方面提供了能够通过聚合物降解酶的酶促作用以受控方式将限制生长基质释放至细胞培养基中的凝胶样物质的用途，用于通过本发明的方法来控制培养基中培养的生物体的生长。
本发明的又一方面提供了一种基于高细胞密度补料分批技术(highcell-density fed-batch technology-based)的培养系统，用于通过本发明的方法来控制培养基中培养的微生物的生长。
本发明的又一方面提供了一种基于高细胞密度补料分批技术的试剂盒，用于通过本发明的方法来控制培养基中培养的微生物的生长。
附图简述
图1显示了如何可应用本发明方法的原理。基质投递是基于包含液体培养基和基质投递凝胶的两相系统。限制生长基质来源于被结合至凝胶的聚合物。聚合物逐渐释放至培养基，其中一种特定的酶从A)单层凝胶，B)双层凝胶系统，其中覆盖凝胶延缓聚合物的释放，C)微生物自身生成基质消化酶的系统中释放基质。在图1中，所述凝胶或双层凝胶系统处于底板形式。
图2显示了可通过优化葡糖淀粉酶浓度获得从淀粉至葡萄糖的期望释放率，所述葡糖淀粉酶自淀粉(A)中移去单个葡萄糖。可通过在淀粉琼脂凝胶(B)上部投放琼脂薄层(上部凝胶)来延缓淀粉从凝胶向培养基的释放。
图3显示了在大肠杆菌振荡培养中所述方法在控制生长和提供高细胞密度方面起作用。在600nm或490nm波长处光学测量细菌生长。A)含10g/l初始葡萄糖浓度的无机盐培养基中的非优化振荡分批培养。非受控生长不久便消尽所有氧。有害代谢物的积累使生长停止。B)在摇瓶培养中通过本发明方法获得的微生物生长控制。葡萄糖浓度不久便变为限制生长，并且获得高细胞密度。C)微量滴定板培养(100μl液体体积)中的细胞产率和生长速度。通过正确的酶定量给料，可获得高细胞密度。
图4显示了诱导细胞密度对深孔板培养(培养基体积0.7ml，0.5ml双层淀粉-琼脂层)中大肠杆菌生成的重组溶菌酶的产率的影响。用0.5mM IPTG进行重组基因表达的诱导。作为参照，显示了LB培养基中的培养诱导(诱导细胞密度OD600＝0.6)。通过本发明的方法，可使用比普通方案(通常使用0.2-0.6的诱导细胞密度(OD600))高得多的细胞密度。
发明详述
本发明提供了一种通过补料分批技术来控制培养基中培养的微生物生长至高细胞密度的方法
在用于本文时，“高细胞密度培养”指产生极其多个微生物细胞的培养。这需要大量的营养物。为了避免高营养物浓度的抑制或毒性效应，通常必须应用如在膜生物反应器中连续冲洗(flushing)营养物和代谢物或缓慢的基质补料(补料分批)等策略。高细胞密度值依赖于微生物。它可被定义为在不进行营养物逐渐添加(补料分批)的情况下、在不对微生物产生毒性的前提下不会达到的细胞密度。
在用于本文时，“分批培养”指在培养之初便添加所有成分的培养方法。培养过程中不发生外部补料。在用于本文时，“补料分批”指培养过程中逐渐加进营养物的培养。在用于本文时，“基质受限的补料分批”指用一种限制性营养物(例如通过利用葡萄糖作为唯一碳源)控制微生物生长的培养方法。
本发明包含具有液相和固相或胶相的两相系统。
“液相”在用于本文时指能够起培养基作用的任何合适液相。液相的例子包括常用的化学成分确知培养基(也称为无机盐培养基)的衍生形式。可通过省略一种或多种成分(例如为所培养生物体碳源的化学品)容易地改良此类培养基，如此为通过本发明方法进行的受控的、基质受限补料分批提供基础。一般而言，液相包含细胞和酶。
“固相”指能够提供基质投递聚合物源(source of substrate-deliveringpolymer)的任何合适固相。固相的一个实施方案是凝胶或凝胶样衬质。“凝胶样基质”在用于本文时指依照本发明有用的任何合适凝胶或凝胶样衬质，诸如琼脂凝胶、角叉菜凝胶或明胶凝胶。合适固相的非限制性例子还包括任何不被自由分散至液相的基质投递聚合物。在一个实施方案中，在所述第一层固相或胶相(first solid or gel phase)上还有另外的第二层凝胶(second gel)，以便延缓限制生长基质的释放(双层凝胶系统)。第二层凝胶可以是例如底板上的上部凝胶或珠子上的一层。
所述固相提供了基质投递聚合物源。在一个实施方案中，基质投递聚合物是整合或固定化在凝胶样衬质中的。这可以通过将基质投递聚合物添加至含有凝胶形成化合物(gel-forming compound)(如琼脂)的水或培养基中来实现。该液体的加热溶解凝胶形成化合物，其在冷却后使基质投递聚合物陷入凝胶衬质中。还可由通过其它化学品或光的作用而聚合的化合物形成凝胶。在此类情况中，衬质不可通过所述酶促作用降解，而是仅充当稳定物或支持物。直接位于衬质上的或在衬质中的基质投递聚合物可受到酶降解，其中该酶能够降解聚合物或者其能够掺入衬质中，或者基质投递聚合物在通过扩散而从衬质中释放入培养基之后受到酶降解。在一个实施方案中，在添加液体部分后，基质投递聚合物开始分散至液相中。在一个实施方案中，基质投递聚合物不可被微生物直接利用。
适于该酶的、能够起基质投递聚合物作用的聚合物包括数类聚合物。在一个实施方案中，聚合物是多糖，诸如淀粉、琼脂、角叉菜、糖原和肽聚糖等。多糖聚合物的一个特定例子是淀粉，其可被葡糖淀粉酶消化以生成葡萄糖。在另一个实施方案中，聚合物是蛋白质或多肽，诸如胶原、明胶等，并且氨基酸或肽是酶促释放的。在又一个实施方案中，聚合物是含磷酸酯/盐(phosphate)的化合物，诸如核酸和多磷酸盐等。在又一个实施方案中，聚合物是含氮化合物，诸如聚丙烯酰胺、多胺、或蛋白质。
适于在本发明方法中使用的酶包括本领域中已知的、能够消化用于提供pH调节剂或向细胞提供营养物的聚合物的所有酶。此类酶的非限制性例子包括用于淀粉的淀粉酶和葡糖淀粉酶，和用于蛋白质、多肽和富含氨基的化合物的蛋白酶、肽酶和酰胺酶。说明应用潜力的别的非限制性例子是核酸酶进行的核酸降解、利用酰胺酶从聚合物中释放铵基、或用于降解脂类的脂肪酶。酶可以是添加至培养基的，或者其可以是由微生物所生成的。在后者情况中，其可以是由生物体天然生成的野生型酶，或者其可以是重组酶。可使用所添加的酶量或由生物体所生成的酶水平来控制营养物从聚合物的释放。作为与用微生物生成酶对直接悬浮至培养基中的聚合物(如淀粉)的天然存在消化的区别，本发明提供了一种两相系统，其可在不损害培养基物理性质的情况下为高细胞密度提供基质补料。为了为特定应用提供最优化条件，还可使用酶混合物，并且可在同一次培养中一起应用数种聚合物。
为了控制微生物生长，基质投递聚合物被酶转变成限制生长基质或pH调节剂。为了提供限制基质的条件，可控制所使用酶的活性或量(图2)。
“限制生长基质”在用于本文时指影响所培养生物体生长能力的任何合适物质。在一个实施方案中，限制生长基质是营养物，诸如大量营养物，例如葡萄糖。在另一个实施方案中，限制生长基质是影响培养基pH的pH调节剂(诸如氨水)，因此控制生长不仅基于其利用度，而且依据环境(pH)控制，如此影响细胞的生长率。可能有益的是，仅使用一类限制生长基质以获得较好的细胞生长可控性。
限制生长基质源(即能够释放基质的聚合物)可以固定化或整合至固相或胶相。这提供了包含液体培养基和基质储存凝胶(reservoir gel)的两相系统。固定化或整合可基于基质源的凝胶形成性质或基于其它凝胶形成物质(例如琼脂、角叉菜、明胶、胶原)的使用。通过使用提供基质的凝胶替换直接将聚合物悬浮于液相中，可在没有严重增加培养基粘度或损害培养基氧传递率风险的情况下为高细胞密度培养提供足够量的基质。
可通过对聚合物(或基质聚合物)的酶促消化来获得限制生长基质的补料，所述聚合物被固定化至凝胶(图1)，在那里其被逐渐释放至培养基，在该培养中一种特定的酶降解所述聚合物以产生细胞可利用的基质。基质的释放率可通过酶定量给料紧密控制，所述酶定量给料与基于自硅弹性体衬质系统的葡萄糖释放的系统相比提供了好得多的基质释放控制。在一个实施方案中，聚合物结合至单层凝胶(图1A)。在另一个实施方案中，聚合物结合至双层凝胶系统，在那里覆盖凝胶延缓聚合物的释放(图1B)。在又一个实施方案中，聚合物释放至培养基，在那里微生物自身生成消化酶。在一个实施方案中，凝胶或凝胶样衬质处于底板形式。在另一个实施方案中，凝胶或凝胶样衬质处于珠子形式，所述珠子能够浸泡(swimming)于溶液中的。此类珠子在本领域中是公知的，并且其大小范围可以是例如0.5-10mm。一般而言，该大小的珠子可用于在琼脂或角叉菜凝胶中固定化微生物。
还可将基于酶的投递方法的原理应用于提供氮和提高pH。提供氮的聚合物化学品可受合适的酶消化。此类系统的例子包括1)可由例如酰胺酶酶促释放氨基的聚丙烯酰胺或相应化学品和2)由蛋白酶、肽酶或酰胺酶逐渐消化的凝胶形成蛋白质(例如明胶)。自此类化合物的氨释放可提高pH，并可在简单培养中促进pH的控制。
可如下控制本发明的方法，即优化数个参数(诸如凝胶成分、酶浓度、酶促活性)、或与会立即消耗所释放基质的大量微生物一起培养或在少量限制基质存在下在添加酶之前实施分批培养。
本发明的方法可在宽泛的体积范围里缩放，并可在数种不同的培养设备和体积上应用。例如，培养容器可以是简单的振荡生物反应器或发酵罐。培养体积的范围可以是1-1000升(诸如实验室发酵罐)、1-100m3以上(诸如工业生产反应器)、10ml-5l(诸如摇瓶)、1-10ml(诸如试管、玻璃小瓶、Falcon管等)、5μl-1ml(诸如微量滴定板、迷你生物反应器(minibioreaction)等)。
本发明还提供了一种用于在通过补料分批技术而在培养基中培养至高细胞密度的微生物培养物中限制限制生长代谢物合成的方法，其中使用本发明的方法来向所述细胞释放所述限制生长基质以限制限制生长代谢物的合成。
本发明还提供了一种用于在培养至高细胞密度的微生物细胞培养物中预防氧限制的方法，其中使用本发明的方法来向所述细胞缓慢释放所述限制生长基质以限制氧消耗。
本发明还提供了能够将基质投递聚合物释放至微生物细胞培养基中的凝胶样物质在本发明方法中的用途。
本发明还提供了一种用于控制培养基中培养的微生物生长的基于高细胞密度补料分批技术的培养系统，其包含具有液相(培养基)和固相或胶相的两相系统，所述固相或胶相提供基质投递聚合物，所述聚合物被安排为以受控方法被酶转变成限制生长基质。
本发明还提供了一种用于控制培养基中培养的微生物生长的高细胞密度补料分批技术培养试剂盒，其包含具有液相(培养基)和固相或胶相的两相系统，所述固相或胶相提供基质投递聚合物，所述聚合物被安排为以受控方法被酶转变成限制生长基质。试剂盒还可包含合适的酶和任何所需的合适瓶子、管形瓶、管、容器、微量滴定板等，而且还包含其如何使用的印刷说明书。
作为一个非限制性例子，描述用葡糖淀粉酶对淀粉的消化。将可溶性淀粉固定化至摇瓶或其它简单生物反应器的底部。两相系统的设置能为高细胞密度培养物包装足够的聚合物。它还能延缓聚合物释放至液相中，使得培养基的氧传递潜力不被立即破坏。虽然淀粉可形成稳定的凝胶，但是还可添加琼脂以加强凝胶，并控制淀粉向培养基的释放率。聚合物不可立即由缺乏聚合物降解酶的微生物用作碳源。通过聚合物降解酶的精确定量给料，可实现规定的限制生长基质释放率。用不同量的酶和通过对凝胶成分的改良，可控制基质(例如葡萄糖)释放率。
实施例
将淀粉固定化至凝胶的可操作制备方法的例子是：将淀粉(5-10％w/v)和琼脂(5-7％w/v)与培养基或水一起混合。在高压灭菌器中对混合物进行灭菌，冷却至60℃，振荡，然后在冷水中快速冷却以获得同质凝胶结构。凝固后，添加培养基(通常为不含葡萄糖或具有低葡萄糖含量的无机盐培养基)和微生物。
图1显示了如何可应用本发明方法的原理。限制生长基质来源于聚合物。将聚合物固定化至完全或部分由所述聚合物组成的凝胶衬质中。聚合物逐渐释放至培养基中，其中合适的酶(手动添加的)从聚合物中释放限制生长营养物。为了延缓聚合物释放率，可在聚合物凝胶上放置额外的凝胶(图1B)。为了进一步限制限制生长营养物的利用度，可调节酶定量给料。图1C证实微生物编码聚合物降解酶的情况。该酶可以是微生物的天然产物或重组产物。此类系统的一个例子是使用淀粉，其用葡糖淀粉酶(E.C.3.2.1.3.)消化。
如图2中所见，可通过用葡糖淀粉酶从淀粉中酶促消化葡萄糖来获得受控的葡萄糖释放。通过调节酶浓度，可控制反应速率。可通过改变淀粉凝胶的成分(例如通过在该凝胶上方投放不含淀粉或含低淀粉浓度的上部凝胶)来控制淀粉从凝胶的机械释放率。
图3显示摇瓶中典型的分批培养(A)的特征在于非受控的生长、氧耗尽、酸性代谢物的积累和细胞产率低下(以低OD600观察的)。比较而言，本发明的方法(B)可提供葡萄糖限制、缓慢但恒定的生长，预防氧耗尽，并降低使培养基酸化的代谢物的积累。图3显示了通过优化酶定量给料还可在微量滴定板培养(100μl液体体积)中获得受控的生长。
用携带编码乳杆菌(Lactobacillus)噬菌体LL-H溶菌酶(muramidase，lysozyme)的基因mur的重组大肠杆菌菌株BL21(DE3)pET21c调查本方法对诱导型重组蛋白质生产的适用性。Mur的过量生成对分裂细胞是有害的，因为被泄漏至周质中时，其水解细胞壁胞壁质，导致细胞溶解。可容易地定量Mur活性[Vasala A，Valkkila M，Caldentey J，Alatossava T：Genetic andbiochemical characterization of the Lactobacillus delbrueckii subsp.lactisbacteriophage LL-H lysin.Appl Environ Microbiol 1995，61：4004-4011]，开且先前已经描述了高细胞密度补料分批重组蛋白质生物反应器方法[ViitanenMI，Vasala A，Neubauer P，Alatossava T：Cheese whey-inducedhigh-cell-densities production of recombinant proteins in Escherichia coli.Microb Cell Fact 2003，2：2]。依照这些研究，每细胞群(cell mass)的Mur产量不可获得实质性改善。因此，成功的生产策略是基于高诱导细胞密度的使用。使用具有48个样品位置(2ml体积)的深孔板。样品孔含有0.6ml淀粉-琼脂凝胶(包含0.5ml底部凝胶和0.1ml上部凝胶的双层凝胶)和含有葡糖淀粉酶的0.7ml培养基。用各种细胞密度进行的重组Mur生产(图4)证实所发明的方法适用于非受控培养中小规模的重组蛋白质生产。用1mM IPTG(基因mur的诱导物)在不同的细胞密度诱导用本发明方法进行培养的细菌，并添加0.5g/l葡萄糖以确保碳源不会限制蛋白质生产。诱导4小时后，获得诱导细胞密度和Mur活性之间的线性关系，此时诱导细胞密度(OD600)高于0.9。用最高的诱导细胞密度获得最高的Mur生产。作为参照系统，使用Luria-Bertani(LB)培养基中培养的、且在OD6000.6诱导的培养物，因为分批培养中较高的诱导细胞密度通常产生较低的重组蛋白质产率。该实验证实本发明的方法可应用于在简单振荡培养物中生产重组蛋白质，并容许使用比标准实验室方案高得多的细胞密度。
本发明已经着重描述了一些优选的实施方案和应用。但是，对本领域技术人员显而易见的是，可制备和使用所公开实施方案的变化形式，而且在下列权利要求书的范围内可以本文明确所述方式以外的方式实施本发明。
权利要求书(按照条约第19条的修改)
1.一种通过补料分批技术来控制培养基中培养的微生物生长至高细胞密度的方法，其特征在于从具有液相和固相或具有液相和胶相的两相系统的固相或胶相中提供基质投递聚合物源，而且所述基质投递聚合物以受控方式被酶转变成限制生长基质或pH调节剂，以控制所述微生物的生长。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述基质投递聚合物是固定化或整合至所述固相或胶相中的。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于通过控制所述凝胶组成、控制所述酶浓度或控制所述酶活性来获得受控的基质释放率。
4.权利要求3的方法，其特征在于所述基质投递聚合物不可被所述微生物直接利用。
5.上述权利要求任一项的方法，其特征在于在添加所述液体部分后所述基质投递聚合物开始分散至所述液相中。
6.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述酶是添加至所述培养基中的。
7.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述酶是由所述微生物生成的。
8.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述固相或胶相处于底板形式。
9.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述固相或胶相处于珠子形式。
10.上述权利要求任一项的方法，其特征在于在所述第一层固相或胶相上还有另外的第二层凝胶。
11.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述基质投递聚合物是多糖。
12.权利要求11的方法，其特征在于所述多糖选自淀粉、琼脂、角叉菜、糖原和肽聚糖。
13.权利要求1-7任一项的方法，其特征在于所述基质投递聚合物是蛋白质或多肽。
14.权利要求13的方法，其特征在于所述蛋白质或多肽选自胶原和明胶。
15.权利要求1-7任一项的方法，其特征在于所述基质投递聚合物是包含磷酸盐/酯的化合物。
16.权利要求15的方法，其特征在于所述包含磷酸酯/盐的化合物选自核酸和多磷酸盐。
17.权利要求1-7任一项的方法，其特征在于所述基质投递聚合物是含氮化合物。
18.权利要求17的方法，其特征在于所述含氮化合物选自聚丙烯酰胺、多胺、或蛋白质。
19.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述限制生长基质是营养物。
20.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述限制生长基质是pH调节剂。
21.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述酶选自淀粉酶、蛋白酶、肽酶、核酸酶和酰胺酶。
22.一种用于在通过补料分批技术而在培养基中培养至高细胞密度的微生物培养物中限制限制生长代谢物合成的方法，其特征在于使用权利要求1-21任一项的方法来向所述细胞释放所述限制生长基质以限制限制生长代谢物的合成。
23.一种用于在培养至高细胞密度的微生物细胞培养物中预防氧限制的方法，其特征在于使用权利要求1-22任一项的方法来向所述细胞缓慢释放所述限制生长基质以限制氧消耗。
24.一种用于控制培养基中培养的微生物生长的基于高细胞密度补料分批技术的培养系统，其特征在于其包含具有液相和固相或具有液相和胶相的两相系统，所述固相或胶相提供基质投递聚合物，所述基质投递聚合物被安排为以受控方式被酶转变成限制生长基质。
25.一种用于控制培养基中培养的微生物生长的高细胞密度补料分批技术培养试剂盒，其特征在于其包含具有液相和固相或具有液相和胶相的两相系统，所述固相或胶相提供基质投递聚合物，所述基质投递聚合物被安排为以受控方式被酶转变成限制生长基质。

Claims (26)

1.一种通过补料分批技术来控制培养基中培养的微生物生长至高细胞密度的方法，其特征在于在具有液相和固相或具有液相和胶相的两相系统中，固相或胶相提供基质投递聚合物源，而且所述基质投递聚合物以受控方式被酶转变成限制生长基质或pH调节剂。
2.权利要求1的方法，其特征在于所述基质投递聚合物是固定化或整合至所述固相或胶相中的。
3.权利要求1或2的方法，其特征在于通过控制所述凝胶组成、控制所述酶浓度或控制所述酶活性来获得受控的基质释放率。
4.权利要求3的方法，其特征在于所述基质投递聚合物不可被所述微生物直接利用。
5.上述权利要求任一项的方法，其特征在于在添加所述液体部分后所述基质投递聚合物开始分散至所述液相中。
6.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述酶是添加至所述培养基中的。
7.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述酶是由所述微生物生成的。
8.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述固相或胶相处于底板形式。
9.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述固相或胶相处于珠子形式。
10.上述权利要求任一项的方法，其特征在于在所述第一层固相或胶相上还有另外的第二层凝胶。
11.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述基质投递聚合物是多糖。
12.权利要求11的方法，其特征在于所述多糖选自淀粉、琼脂、角叉菜、糖原和肽聚糖。
13.权利要求1-7任一项的方法，其特征在于所述基质投递聚合物是蛋白质或多肽。
14.权利要求13的方法，其特征在于所述蛋白质或多肽选自胶原和明胶。
15.权利要求1-7任一项的方法，其特征在于所述基质投递聚合物是包含磷酸盐/酯的化合物。
16.权利要求15的方法，其特征在于所述包含磷酸酯/盐的化合物选自核酸和多磷酸盐。
17.权利要求1-7任一项的方法，其特征在于所述基质投递聚合物是含氮化合物。
18.权利要求17的方法，其特征在于所述含氮化合物选自聚丙烯酰胺、多胺、或蛋白质。
19.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述限制生长基质是营养物。
20.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述限制生长基质是pH调节剂。
21.上述权利要求任一项的方法，其特征在于所述酶选自淀粉酶、蛋白酶、肽酶、核酸酶和酰胺酶。
22.一种用于在通过补料分批技术而在培养基中培养至高细胞密度的微生物培养物中限制限制生长代谢物合成的方法，其特征在于使用权利要求1-21任一项的方法来向所述细胞释放所述限制生长基质以限制限制生长代谢物的合成。
23.一种用于在培养至高细胞密度的微生物细胞培养物中预防氧限制的方法，其特征在于使用权利要求1-22任一项的方法来向所述细胞缓慢释放所述限制生长基质以限制氧消耗。
24.能够将基质投递聚合物释放至微生物细胞培养基中的胶样物质在权利要求1-22任一项所述的方法中的用途。
25.一种用于控制培养基中培养的微生物生长的基于高细胞密度补料分批技术的培养系统，其特征在于其包含具有液相和固相或具有液相和胶相的两相系统，所述固相或胶相提供基质投递聚合物，所述基质投递聚合物被安排为以受控方式被酶转变成限制生长基质。
26.一种用于控制培养基中培养的微生物生长的高细胞密度补料分批技术培养试剂盒，其特征在于其包含具有液相和固相或具有液相和胶相的两相系统，所述固相或胶相提供基质投递聚合物，所述基质投递聚合物被安排为以受控方式被酶转变成限制生长基质。
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