JP5099765B2 - 酵素活性の高感度測定方法 - Google Patents
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Description
項1.酵素と基質を反応させることにより生じる酵素反応生成物を検出することにより該酵素の活性を測定する方法であって、疎水処理された表面を有する光導波路を用いて酵素反応生成物を検出する工程を含む、酵素活性の測定方法。
項2.疎水処理された表面を有する光導波路の水接触角が60°以上である、項1に記載した酵素活性の測定方法。
項3.疎水処理がシランカップリング剤を用いて行われる、項1または2に記載した酵素活性の測定方法。
項4.シランカップリング剤がオクチルトリクロロシランまたはオクタデシルトリクロロシランである、項3に記載した酵素活性の測定方法。
項5.光導波路が石英またはガラスである、項1〜4のいずれかに記載した酵素活性の測定方法。
項6.光導波路がスラブ光導波路である、項1〜5のいずれかに記載した酵素活性の測定方法。
項7.酵素反応生成物が吸収スペクトルにより測定可能である項1〜6に記載した酵素活性の測定方法。
項8.基質が、酵素の作用によって基質とは異なる吸収スペクトルを呈する酵素反応生成物を生じさせるものである、項1〜7に記載した酵素活性の測定方法。
1.光導波路
本発明において使用される光導波路の材質は限定されない。当該材質としてはガラス、石英、プラスチック、サファイヤ、フッ素化ポリイミド、ポリメチルメタクリレート(PMMA)、シリコーン樹脂等が例示され、好ましくはガラス、石英、プラスチック、サファイヤ、さらに好ましくはガラス、石英である。
2.光導波路表面の疎水処理
本発明において光導波路の表面を疎水処理する方法は、目的とする酵素反応生成物が効率良く吸着・濃縮できるように光導波路の表面を疎水化できる限り限定されず、主に酵素、基質、及び酵素反応生成物の性質、特に酵素反応生成物の性質により適宜選択できる。光導波路の表面を疎水処理する方法としては、含浸法、ディップコーティング法、スピンコーティング法、スパッタリング法、プラズマ重合法等の手法が例示される。光導波路を高分子で作製した場合、その末端基に疎水性の官能基を導入することで、その表面を疎水化することもできる。また、例えば本発明の一実施形態について説明すると、光導波路の表面を公知のシランカップリング剤で処理する方法が例示でき、これはシランカップリング剤を含む溶液に光導波路を含浸させるなど、公知の方法に従い行うことができる。
3.酵素、基質及び酵素反応生成物
酵素反応では、酵素と基質とが反応することにより酵素反応生成物が得られる。本発明の酵素活性の測定方法において検出・測定しようとする酵素反応生成物は、前記に従い疎水処理された光導波路の表面に吸着・濃縮できるものであれば限定されない。
、測定対象である酵素の作用により基質とは異なる吸収スペクトルを呈する第1呈色化合物を生成させる構造を有するものであってもよい。また、本発明で使用される基質としては、測定対象とする酵素の作用によって、第2呈色化合物を生成させるための呈色誘導化合物を生じさせる構造を有するものであってもよい。
4.酵素活性の測定方法
前記酵素及び基質を反応させる条件は限定されず、公知の方法に従い、酵素及び基質を所望の温度で一定時間、溶液中で接触させることにより行うことができる。また、本発明の測定方法においては、得られた酵素反応生成物と光導波路を接触させることにより該光導波路に酵素反応生成物を吸着・濃縮させることができるが、この場合、酵素と基質を接触後直ちに光導波路に接触させてよい。また、酵素反応の終了後直ちに、得られた酵素反応生成物と光導波路とを接触させてもよく、また酵素と基質との反応を停止させた後に、得られた酵素反応生成物と光導波路とを接触させてもよい。酵素と基質との反応の停止は、本発明の効果を妨げない範囲で物理的または化学的に行うことができ、必要に応じて反応停止液等を用いてもよい。
5.酵素活性測定装置
本発明の測定方法では、疎水処理された表面を有する光導波路を用いて酵素反応生成物を検出・測定できる酵素活性測定装置が使用される。当該酵素活性測定装置としては従来公知の装置が使用でき、図3に記載する装置が例示される。
1.試料と酵素活性測定装置
本発明において、モデル酵素としてβ−グルクロニダーゼを用い、基質は5-ブロモ-4-クロロ-3-インドリル-β-D-グルクロニド(X-gluc)を用いた。また、本発明において、モデル光導波路としてガラス製スラブ光導波路(slab optical wave guide; SOWG)を用いた。酵素活性測定装置として図3に示す装置を用いた。
2.光導波路の表面修飾
各種シランカップリング剤(ODS;オクタデシルトリクロロシラン、OTS;オクチルトリクロロシラン、APS;3-アミノプロピルトリエトキシシラン)をトルエンを溶媒として1 %となるように調製した。各種シランカップリング剤を1 %含むトルエン溶液に洗浄したスラブ光導波路を室温で1分間含浸し、表面修飾をおこなった。ここで、疎水化可能なシランカップリング剤としてODSを使用した例を実施例1、OTSを使用した例を実施例2とする。疎水化に適さない、すなわち疎水化可能ではないシランカップリング剤としてAPSを使用した例を比較例1とする。また、スラブ光導波路を表面修飾していない例を比較例2とする。
実施例1及び2、ならびに比較例1及び2にグリセリンを滴下し、このグリセリン滴に光源から光を導く光ファイバを挿入し、スラブ光導波路内に光を導入した。試料を保持するために内法が縦20 mm × 横5 mm × 高さ2 mmのシリコンゴム製試料セルをスラブ光導波路上に密着させた。スラブ光導波路内を伝播した光は端面の光出射部から出射し、受光レンズにより集光されたのち、CCD検出器に導かれた。この際に検出された信号をコンピューターで処理することで、吸収スペクトルを得た。
4.結果
得られた吸収スペクトルの測定結果を図4に示す。本実験の結果から、表面修飾をおこない疎水処理したスラブ光導波路(実施例1及び2)が未修飾のスラブ光導波路(比較例2)と比較してβ-グルクロニダーゼ活性をより高感度に検出できることがわかった。また、表面の疎水化が可能なシランカップリング剤を使用したスラブ光導波路(実施例1及び2)は、表面の疎水化に適さないシランカップリング剤を使用したスラブ光導波路(比較例1)と比較してβ-グルクロニダーゼ活性をより高感度に検出できることがわかった。これはスラブ光導波路の表面を疎水性にすることによりβ-グルクロニダーゼの作用で発色したX-glucと該表面との親和性が向上し、発色したX-glucがスラブ光導波路の表面により吸着しやすくなったものと考えられる。また、このように吸着による濃縮効果が酵素活性測定の高感度化に極めて効果的であることがわかった。
5.従来法との比較
希薄な酵素−基質混合溶液(β-グルクロニダーゼ;0.21 units/ml、X-gluc;0.96 μM)を用いて、本願発明の方法と従来法との比較を行った。本願発明の方法においては、上記実施例1として示した、ODSにより疎水処理したスラブ光導波路を使用した。試料を保持するために内法が縦30 mm × 横5 mm × 高さ2 mmのシリコンゴム製試料セルを用いた。試料セルに酵素及び基質を含まないPBSを300 μl導入し、この状態で検出される信号を本測定におけるベースラインとした。次にPBSを取り除いたのち、混合直後の酵素−基質混合溶液を試料セルに300 μl導入し、吸収スペクトルを測定した。従来法として、以下の手順に従って酵素活性を測定した。
12、22、32 液滴
13、23、33 光導入用光導波路(光ファイバ)
13a、23a、33a 光導入用光導波路の先端
24、34 支持基板
25、35 シリコンゴムシート
26、36 試料セル
27、37 光出射部
38 光源
39 受光レンズ
Claims (10)
- 酵素と基質を反応させることにより生じる酵素反応生成物を検出することにより該酵素の活性を測定する方法であって、疎水処理された表面を有する水接触角が60°以上の光導波路を用いて酵素反応生成物を検出する工程を含む、酵素活性の測定方法。
- 疎水処理がシランカップリング剤を用いて行われる、請求項1に記載した酵素活性の測定方法。
- シランカップリング剤がオクチルトリクロロシランまたはオクタデシルトリクロロシランである、請求項1または2に記載した酵素活性の測定方法。
- 光導波路が石英またはガラスである、請求項1〜3のいずれかに記載した酵素活性の測定方法。
- 光導波路がスラブ光導波路である、請求項1〜4のいずれかに記載した酵素活性の測定方法。
- 酵素反応生成物が吸収スペクトルにより測定可能である請求項1〜5のいずれかに記載した酵素活性の測定方法。
- 基質が、酵素の作用によって基質とは異なる吸収スペクトルを呈する酵素反応生成物を生じさせるものである、請求項1〜6のいずれかに記載した酵素活性の測定方法。
- 基質、酵素及び発色剤の共存下で発色剤が、酵素及び基質の作用によって発色剤とは異なる吸収スペクトルを呈する酵素反応生成物を生じさせるものである、請求項1〜6のいずれかに記載した酵素活性の測定方法。
- 酵素反応生成物が5,5−ジブロモ−4,4−ジクロロインディゴ及び/または5,5−ジブロモ−6,6−ジクロロインディゴであるか、酵素としてアルカリフォスファターゼ及び基質としてニトロ−ブルーテトラゾリウムクロリド/5−ブロモ−4−クロロ−3−インドリルフォスフェートトルイジン塩が用いられるものである、請求項1〜7のいずれかに記載した酵素活性の測定方法。
- 酵素としてペルオキシダーゼ、基質として過酸化水及び/または尿素過酸化水素、発色剤として3,3’,5,5’−テトラメチルベンジジン、3,3’−ジアミノベンジジン及び2,2’−アジノ−ビス(3−エチルベンゾチアゾリン−6−スルホン酸)からなる群より選択される少なくとも1種が用いられるものである、請求項1〜6及び8のいずれかに記載した酵素活性の測定方法。
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