JP5059117B2 - 微細孔結晶及びそのコンジュゲートの調製方法 - Google Patents
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Description
本願は、2006年11月2日に出願された英国特許出願No.0627816.8の優先権を主張するものである。
本発明は、生体細胞又はウイルスの画像化、並びに細胞又はウイルスの画像化で使用するための及びインビトロ(in vitro)診断で使用するための修飾されたL型ゼオライト結晶に関する。
ne=Xz/lz×5.21×10-7mol
Xz=サンプル重量(mg)
Lz=L型ゼオライト結晶の平均長(nm)
以下の実施例は、本発明の理解を目的として提供されるものであり、本発明の真の範囲は本願添付の特許請求の範囲に記載される。本発明の精神から逸脱することなく、記載する手順において改変が可能であることを理解されたい。
本実施例で使用した円筒形L型ゼオライト結晶は、平均長2.2μm及び平均直径1.2μmであった。
アミノ末端化L型ゼオライト結晶を(Huber et al., Angew Chem Int Ed 43: 6738, 2004に従って)L型ゼオライト結晶をn-ヘキサンに懸濁し、チャネル口の量を以下のように算出することによって調製した。L型ゼオライトチャネル口の数:ne=(Xz/lz)×5.21×10-7(ne:チャネル口の数(mol)、Xz:ゼオライトの質量(mg)、Iz:ゼオライトの平均長(nm))。9-フルオレニルメチルカルバメートN-ヒドロキシスクシンイミジルエステルを、(3-アミノプロピル)メトキシジメチルシランと共に反応させ、反応産物をチャネル口の量と等しくなるようにしてL型ゼオライト懸濁液に添加した。懸濁液を超音波処理し(20分間)、3時間還流下で加熱した後、遠心した。修飾されたL型ゼオライト結晶を20%(容量/容量)のピペリジンを含有する乾燥DMF(N,N'-ジメチルホルムアミド)に懸濁した。1時間撹拌し、メタノールで洗浄後、図1に示すようなアミノ末端化L型ゼオライト結晶を得た。約40mgのアミノ末端化L型ゼオライト結晶を2mlの乾燥DMFに懸濁し、10mlのトリエタノールアミンと混合した。懸濁液を密封ガラス管内で65℃に加熱した。活性型テルピリジンリガンド (TpyPh2COOSu)(上記式で算出した100倍過剰量)を1mlの乾燥DMFに懸濁し、溶液の半分を加温した懸濁液に加えた。15分間の撹拌後、残りを加え、溶液をさらに2時間撹拌した。遠心分離を行い、DMFから及びメタノールから、テルピリジンリガンド末端化L型ゼオライトを得て、オーブン内で60℃にて12時間乾燥させた。その結果を図1bに示す。
実施例1で説明したチャネル口の官能基化の前に、30nmのL型ゼオライト結晶を以下のように前処理した。
実施例1で説明したように調製した約10mgのリガンド末端化L型ゼオライト結晶を1mlのメタノールに懸濁し、60℃に暖めた。メタノールを溶媒とするZnCl2標準溶液の算出量(2 eqのL型ゼオライトチャネル口:1eqのZnCl2は、実施例1のように算出した)を撹拌した懸濁液中にゆっくりと加えた。反応混合物を1分間超音波処理し、1日半撹拌した。
L型ゼオライト結晶にピロニン色素をCalzaferriら(Angew Chem Int Ed 42:3732-3758, 2003)によるイオン交換法を介して搭載した。色素溶液をL型ゼオライト結晶に加え、混合液を撹拌して、L型ゼオライト結晶のチャネル内に色素分子を取り込ませた。懸濁液を遠心後、上清を捨てた。そして、L型ゼオライトを洗浄して、残った組み込まれていない色素分子を除去した。さらに遠心ステップを経た後、上清を捨てて、色素を搭載したL型ゼオライト結晶を得た。
40mgのL型ゼオライト結晶(1mm)を乾燥トルエン(4ml)に懸濁し、30μlの(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APES)を加えた。その懸濁液を超音波処理(30秒間)し、105℃で4時間撹拌した。
実施例5に記載のように、40mgのL型ゼオライト結晶(30nm)を乾燥トルエン(4ml)に懸濁し、30μlの(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APES)を加えた。懸濁液を超音波処理(30秒)し、105℃で4時間撹拌した。
実施例5で説明した4mgのアミノ官能基化したL型ゼオライト結晶及び6mg (0.0072mmol)のDOTA-NHSを1mlの乾燥DMFに懸濁し、16μlのDIPEA(ジイソプロピルエチルアミン)を添加した。一晩撹拌した後、溶媒を蒸発除去し、DOTA修飾されたL型ゼオライト結晶を約2mlのH2Oに懸濁した。
実施例6で説明したように30mgのアミノ官能基化したL型ゼオライト結晶及び94mg(0.113mmol)のDOTA-NHSを1mlの乾燥DMFに懸濁し、150μlのDIPEAを添加した。一晩撹拌した後、L型ゼオライト結晶を完全に可溶化し、その後、5ml Et2Oの添加によって沈殿させた。遠心後、DOTA修飾されたL型ゼオライト結晶をEt2Oで2回洗浄し、一晩乾燥した。
DMSOを溶媒とする2ml(最大0.013mmol)のDOTA活性化エステル溶液(トリ-t-ブチルDOTA-NHS)を実施例5の記載の4mgのアミノ官能基化したL型ゼオライト結晶に加えた。16μlのDIPEAを添加し、一晩撹拌した後、溶媒を除去した。トリ-t-ブチルDOTA修飾L型ゼオライト結晶を水で1回洗浄した後、一晩乾燥させた。
実施例9に由来する乾燥させたトリ-t-ブチルDOTA修飾したL型ゼオライト結晶を5mlのCH2Cl2に懸濁し、5mlのTFAを滴下で添加した。懸濁液を室温で一晩撹拌した。減圧下で溶媒を除いた後、DCM(2×10ml)、MeOH(2×10ml)、そしてエーテル(2×10ml)を連続的に添加及び蒸発することによって酸を除去し、DOTA修飾したL型ゼオライト結晶を得た。
5.2mgのEuCl3・H2O (0.014mmol)を実施例7及び10に記載したようなDOTA修飾したL型ゼオライト結晶に加えて、H2Oに再懸濁した。3滴の1N NaOHを添加し、懸濁液を一晩撹拌した。遠心後、上清を除き、Eu修飾されたL型ゼオライト結晶をEtOHで10回、洗浄液が増感剤の添加後に発光分光法でユーロピウムシグナルを示さなくなるまで洗浄した。
DOTA修飾したL型ゼオライト結晶の錯体形成は、実施例11のように行った。EuCl3・H2Oの代わりに54.9mgのGdCl3・6H2O(0.148mmol)を添加した。洗浄後、Gd修飾L型ゼオライト結晶を75℃で数日間乾燥させた。
上記方法に続いて、L型ゼオライトを蛍光色素ピロニンで満たし、Eu(III)イオンと錯体形成したDOTAリガンド(上記参照)で表面を官能基化した。その結果得られた二官能系をエタノールで洗浄し、乾燥させた。共焦点顕微鏡での解析で、図9a及びbで示したように、ピロニン及びEu錯体の両方による二重発光が明らかになる。
(材料及び反応)
L型ゼオライト材は、A. Zabala Ruiz, D. Bruhwiler, T. Ban, G. Calzaferri, Monatshefte fur Chemie 136 (2005) 77に記載のように合成した。H.Mas, A.k Khatyr, G.Calzaferri, Micropor. Mesopor. Mater 65 (2203), 233に記載の方法に従って、Pyを合成し、精製した。Oxl及びTRHは、Molecular Probes/Invitrogen社から入手し、さらに精製することなしに使用した。色素を搭載したL型ゼオライトサンプルは、以前にA. Devaux, Z. Popovic, O. Bossart, L. De Cola, A. Kunzmann, G. Calzaferri, Micropor. Mespor. Mater. 90 (2006) 69、G. Calzaferri, S. Huber, H. Maas, C. Minkowski, Angew. Chem. Int. Ed. 42 (2003) 3732及びC. Minkowski, G. Calzaferri, Angew. Chem. Int. Ed. 44 (2005) 5325に既に記載されたイオン交換工程に従って調製した。アミノ基で修飾されたL型ゼオライト結晶は、まずゼオライトをpH5のクエン酸バッファー内で1時間処理した後、S. Huber, G. Calzaferri, Angew. Chem. Int. Ed. 43 (2004) 239で公開された方法に従って調製した。L型ゼオライトのチャネル口へのカルボキシエステル末端基の付加は、T. Phoung, T. Khac-Minh, N. Thi Van Ha, H. Thi Ngoc Phuong, Bioorg. Med. Chem. Lett. 14 (2004) 653に記載の反応を用いて、アミノ基修飾した材料をメチル-3-イソチオシアネートプロピオネートと反応させることによって行った。テキサスレッド・ヒドラジド(TRH)のカルボキシエステル官能基化L型ゼオライトへのカップリングは、以下のように行った。10mgの前駆物質を2mlのメタノールに懸濁し、懸濁液を10分間超音波処理した。1mlのメタノールに溶解したテキサスレッド・ヒドラジド(チャネル口の数に対して3〜4モル当量)を滴下でL型ゼオライト懸濁液に加え、懸濁液を330Kで4時間撹拌した。反応産物を数回メタノールで洗浄した後、353Kで一晩乾燥させた。
FTIRスペクトルをPerkinElmer社FTIR spectrum OneでKBr diskとして、分解能4cm-1で記録した。FT-ラマンスペクトルをBOMEM DA8のラマンアクセサリーで測定した。このスペクトロメーターに、液体窒素冷却したInGaAs検出器及び石英ビームスプリッターを備えた。連続波、ダイオード励起されたNd3+;YAGレーザー(Coherent社;Compass 10642500MN)を励起ビームとして用いた。レイリー散乱を0°位で、2つのホログラフィック・スーパーノッチフィルター(Kaiser Optical Systems HSPF-I064.0-1.0)によって除いた。全ラマンスペクトルを16cm-1の分解能で測定した。Duran(登録商標)ガラスキャピラリーをサンプルホルダーとして供給した。蛍光スペクトルをPerkin-Elmer社蛍光分光光度計LS50Bで、及び吸収スペクトルをPerkin-Elmer社UV/Vis/NIR器Lambda 900で測定した。蛍光顕微鏡画像は、Olympus社のBX60顕微鏡で記録した。
合成法は、平均長30nm及び5000nmのL型ゼオライト結晶で行った。2つの極端な長さの選択により、前記方法が結晶サイズとは無関係であること及び異なる技術で材料の特性解析が可能であることが実証される。第1の、かつ簡単な検査は、官能基化した材料の赤外線及びラマンスペクトルを測定することである。これは、置換基の濃度が表面の増大によって体積比に対してより高くなるため、30nm結晶で行った。
(合成)
リガンドDOTA NHSは、Macrocyclics社(USA)より入手し、そのまま使用した。他の全試薬は、Sigma-Aldrich社より入手し、そのまま使用した。1μm及び30nmの純粋なL型ゼオライト結晶をMegelski, Calzaferri, Adv. Funct. Matter (2001) 277及びZabala Ruiz, Bruhwiler, Ban Calaferri, Monatshefte fur Chemie, 136 (2005), 77に記載のように合成し、特徴づけをした。カリウム交換型を全実験で使用した。
1μmのL型ゼオライト結晶40mgを乾燥トルエン(4mL)に懸濁し、30μLの(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APES)を加えた。懸濁液を30秒間超音波処理し、105℃で4時間撹拌した。室温まで冷却した後、サンプルを遠心し、上清をピペットで除いた。サンプルを2回、トルエンで洗浄した。
30nmのL型ゼオライト結晶40mgを乾燥トルエン(2mL)に懸濁し、30μLの(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン(APES)を加えた。懸濁液を30秒間超音波処理し、105℃で4時間撹拌した。室温まで冷却した後、Et2O(6mL)を加え、サンプルを4000rpmで30分間遠心した。上清をピペットで除いた後、サンプルをメタノールで1回洗浄し、それからオーブンで75℃にて一晩乾燥させた。
(1μm L型ゼオライトの全表面上に取り付けられたNH2基とAtto-NHSとの反応)
1mgのL型ゼオライト結晶及び0.5mg(0.01mmol)のAtto-NHSを2mlの乾燥 DCMに懸濁した。懸濁液を一晩室温で撹拌した。遠心後、Atto発光が洗浄液中に見られなくなるまでサンプルをDCMとMeOH(5×3mL)で洗浄した。
1mgのL型ゼオライト結晶及び0.5mg(0.01mmol)のAtto-NHSを2mlの乾燥 DCMに懸濁した。懸濁液を一晩室温で撹拌した。遠心後、Atto発光が洗浄液中に見られなくなるまでサンプルをDCMとMeOH(6×3mL)で洗浄した。
4mgのL型ゼオライト結晶及び6mg(0.0072mmol)のDOTA-NHSを1mlの乾燥 DMFに懸濁し、16μLのDIPEAを添加した。懸濁液を一晩撹拌した後、サンプルを丸底フラスコに移し、溶媒をロータリーエバポレーターで除いた。その後、溶媒としてH2O(約2mL)を用いてサンプルを遠心管中に戻した。
30mgのL型ゼオライト結晶及び94mg(0.113mmol)のDOTA-NHSを1mlの乾燥 DMFに懸濁し、150μLのDIPEAを添加した。懸濁液を一晩撹拌した後、結晶を可溶化した。5mLのEt2Oを添加した後、サンプルを沈殿させて遠心した。サンプルをEt2Oで2回洗浄し、オーブン中で一晩乾燥させた。
H2O中のDOTA官能基化したL型ゼオライトサンプルに5.2mgのEuCl3・6H2O(0.014mmol)を加えた。1NのNaOHを3滴添加した後、混合液を一晩撹拌した。遠心及び上清の除去後、サンプルをEtOHで10回、洗浄液が増感剤添加後に発光分光法でユーロピウムシグナルを示さなくなるまで洗浄した。
DOTA官能基化したL型ゼオライトサンプルを2mlのH2Oに懸濁し、54.9mgのGdCl3・6H2O(0.148mmol)を加えた。1NのNaOHを数滴添加した後、混合液を一晩撹拌した。遠心及び上清の除去後、サンプルをEtOHで洗浄した。その後、サンプルを、EtOHで洗浄し、オーブン中で75℃にて乾燥させた。生じた過剰な錯体形成していないGd(III)イオンは、水によるGd-DOTA-L型ゼオライト系の24時間の透析で除いた。
定常状態の発光スペクトルは、Xeアークランプ、Hamamatsu R928光電子増倍管及び二重励起・発光モノクロメーターを備えたSpex Fluorolog 1681で記録した。発光スペクトルを標準補正カーブにより線源強度及び検出器応答に対して補正した。発光を直角に検出した。約1μmの長さを有するL型ゼオライト結晶の蛍光顕微鏡画像を撮影した。蛍光顕微鏡検査は、高圧水銀ランプ及び適当なフィルターを備えたOlympus BX 41顕微鏡を用いて行った。走査電子顕微鏡検査は、LEO 1530 VPを用いて行った。
(カチオン性色素を用いたL型ゼオライトの色素搭載)
L型ゼオライト材をE.g. S. Megelski, G. Calzaferri Adv. Funct. Mater. 2001, 11, 277.bに記載のように合成し、特徴づけする。
L型ゼオライト材は、E.g. S. Megelski, G. Calzaferri Adv. Funct. Mater. 2001, 11, 277.bに記載のように合成し、特徴付けする。
10mgのオキサジン1を円盤状のL型ゼオライト(77nm×400nm)内に搭載し、最終容量1mlのMESバッファー中で2mgの重合ジゴキシン抗体と共に15分間インキュベートする。クロスリンク用に、0.1mlの0.1%のEDC溶液を加え、再度2時間インキュベートする。30分間の付加的なインキュベートに続いて反応をグリシンの添加により停止させる。30分間の遠心及び再懸濁の後、ブロッキングステップを1mlの2% BSAの添加によって行った。数回の洗浄ステップ及び遠心による各洗浄ステップ後の分離の後に、ゼオライト-抗体コンジュゲートを、アジ化ナトリウムを保存剤として添加して保存する。動的光散乱実験は、ポリスチレン粒子を用いて行うアナログ法とよく一致する40nmの増加を示す。
手順は、Huber, Calzaferri ChemPhysChem 2004, 5, 239に記載された方法に従う。色素を搭載し、洗浄したゼオライトを100℃で一晩乾燥させる。オキサジン-L型ゼオライト(10mg)を5μlのアミノエチルプロピル-トリエトキシシラン(APTES)を含む5mlの乾燥トルエンに懸濁し、120℃で2時間還流して、外表面に共有結合によって付けられたアミノ基を有するOx1 L型ゼオライト結晶を製造する。結晶をトルエンで2回洗浄した後、100℃で3時間再乾燥させて、5mlのクエン酸バッファーに懸濁する。メチル-3-イソチオシアネートプロピオネートを添加し、ウォーターバスで50〜60℃にて15分間加熱し、室温に14時間放置する。遠心及び再懸濁後、エステル基をKOH溶液で処理することにより切断し、再度遠心して、さらなる修飾のためにpH8のバッファーに再懸濁する。
a)カルボン酸で修飾した10mgのディスク形状 Ox1 L型ゼオライトを、0.1mlの0.1% EDC溶液の添加及び20分間の回転ミキサーを用いた処理によって前活性化する。最終容量1mlのMESバッファーに2mgの重合ジゴキシン抗体を添加した後、混合液を1時間インキュベートする。
それぞれ10mgの色素を搭載した円筒形状の又は円盤形状のL型ゼオライトの連続二官能基化は、S. Huber, G. Calzaferri, Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 6738-6742及び上記の方法に従って合成したFMOC-APMESを用いるチャネル口の修飾によって達成される。壁面修飾は、(3-トリエトキシシリルプロピル)-t-ブチルカルバメート(ABCR Product List AB126796)を用いて、実施例18に記載の条件下で行われる。t-BOC保護基は、標準条件(TFA、トリクロロメタン)を用いることによって選択的に切断することができる。親水性PEG-NHSエステルは、市販のもの(例えば、Sunbright(登録商標)ME050HS;NOF Corporation)を利用でき、それを、アミノ修飾したゼオライトとリン酸バッファー(pH8.0)を用いて反応させる。FMOC保護基は、ゼオライト結晶を0.2mlのピペリジンを含む1mlの乾燥DMFに添加することにより切断される。遠心及び洗浄後(S. Huber, G. Calzaferri, Angew. Chem. Int. Ed. 2004, 43, 6738-6742参照)、アミノ基をさらにジオキサンに溶解した大過剰のビス-N-ヒドロキシスクシンイミドスベレートで処理して、1時間反応させることによって修飾した。別の遠心及び洗浄ステップの後、生体分子での誘導体化は、前記実施例19b)に記載のように行う。
5〜10mgのL型ゼオライト結晶をPTFE管内にて3mlのトルエンに懸濁し、1mgの結晶あたり約1μLの大過剰の(3-アミノプロピル)トリエトキシシラン (APTES)を加えた。この懸濁液を5分間超音波処理して、110℃で約3時間撹拌した。冷却後、懸濁液を、トルエンを用いてガラス遠心管に移し、遠心した。その後、サンプルをトルエン、エタノール及びメタノールで洗浄し、オーブンで70℃にて乾燥させた。
オーブンで乾燥したゼオライト結晶を使用する前に、そのゼオライト結晶を上記飽和KNO3水溶液に22%の相対湿度雰囲気下で一晩放置し、再水和した。サンプルを通常10〜20mg測り、チャネル口の数を算出した。
実施例22由来の3〜5mgの末端修飾したH2N-L型ゼオライトを1.5mLの乾燥アセトニトリルに懸濁し、1滴のトリエタノールアミンを加えた。そして懸濁液を超音波処理後、70℃に加熱した。過剰量のAtto425-NHSエステル又はAtto610-NHSエステルを、1mLの乾燥アセトニトリルに溶解し、その溶液をゆっくりと前記懸濁液に加えた後、混合液をさらに1.5時間70℃で撹拌した。冷却後、懸濁液を遠心し、Atto-L型ゼオライトをメタノールで6回又は上清が弱い蛍光のみを示すようになるまで、洗浄した。
二官能基化された結晶を、実施例23に従ってAtto色素を用いてチャネル口で修飾されたサンプルから合成した。これらの二官能基化結晶を、温和な温度にてオーブン内で乾燥させ、それから全外表面を実施例21で説明したようにAPTESで修飾した。その後、実施例23のように(MeCN中での70℃、2時間の反応)、Atto-NHSエステルで固定されたNH2基全体にわたる反応によってL型ゼオライト結晶の全表面に色付けをした。
実施例21由来の3〜5mgの十分に修飾したH2N-L型ゼオライトを1.5mLの乾燥アセトニトリルに懸濁し、1滴のトリエタノールアミンを加えた。そして懸濁液を超音波処理後、70℃に加熱した。過剰量のAtto425-NHSエステル及びAtto610-NHSエステルを等モル量で、1mLの乾燥アセトニトリルに溶解し、その溶液をゆっくりと前記懸濁液に加え、混合液をさらに1.5時間70℃で撹拌した。冷却後、懸濁液を遠心し、混合Atto-L型ゼオライトをメタノールで6回又は上清が弱い蛍光のみを示すようになるまで、洗浄した。
Claims (10)
- 色素標識されたゼオライト、ストップコック部分、及び、該色素標識されたゼオライト又は該ストップコック部分に共有結合している親和結合剤を含むコンジュゲート。
- 親和結合剤がストップコック部分に結合している、請求項1に記載のコンジュゲート。
- 前記親和結合剤が抗原及び抗体、ビオチン又はビオチン類似体及びアビジン又はストレプトアビジン、糖及びレクチン、核酸又は核酸類似体及び相補的核酸並びに受容体及びリガンドからなる群より選択される、請求項1又は2に記載のコンジュゲート。
- 前記親和結合剤が抗原又は抗体である、請求項1〜3のいずれか1項に記載のコンジュゲート。
- ゼオライトを標識するために用いられる色素が、発光化合物、蛍光化合物、光吸収化合物、感光プレートで視覚化できる放射性化合物、X線を用いて視覚化できる金属化合物、磁気共鳴画像(MRI)を用いて視覚化できる化合物、X線コンピュータ断層画像法(CT)、超音波又は陽電子放出断層撮影法(PET)によって画像化することのできる同位元素からなる群より選択される、請求項1〜4のいずれか1項に記載のコンジュゲート。
- 前記色素が発光化合物、蛍光化合物及び放射性化合物からなる群より選択される、請求項5に記載のコンジュゲート。
- 前記色素がMRI、CT又はPETによって視覚化できる色素である、請求項5に記載のコンジュゲート。
- 請求項1に記載のコンジュゲートを製造する方法であって、
a)ゼオライトを色素で標識するステップ、
b)色素標識されたゼオライトのチャネルをストップコック分子によって閉鎖するステップ、
c)親和結合剤を添加するステップ、及び、
d)カップリング化学反応を用いて、ストップコック分子を有する色素標識されたゼオライトと親和結合剤との間で共有結合を形成するステップ、
を含む、前記方法。 - 診断方法における請求項1〜7のいずれか1項に記載のコンジュゲートの使用。
- インビトロ方法で分析物を測定する方法であって、
a)分析物を含む疑いのある又は含むことがわかっているサンプルを提供するステップ、
b)前記サンプルと請求項1〜7のいずれか1項に記載のコンジュゲートを分析物コンジュゲート複合体の形成に適切な条件下で接触させるステップ、
c)ステップb)で形成された複合体を測定し、それによって分析物の測定値を得るステップ、
を含む、前記方法。
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