KR101919427B1 - 항체 작용화 방법 및 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 방법 - Google Patents

항체 작용화 방법 및 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 방법 Download PDF

Info

Publication number
KR101919427B1
KR101919427B1 KR1020170034521A KR20170034521A KR101919427B1 KR 101919427 B1 KR101919427 B1 KR 101919427B1 KR 1020170034521 A KR1020170034521 A KR 1020170034521A KR 20170034521 A KR20170034521 A KR 20170034521A KR 101919427 B1 KR101919427 B1 KR 101919427B1
Authority
KR
South Korea
Prior art keywords
antibody
group
nanoparticle
nanoparticles
functional group
Prior art date
Application number
KR1020170034521A
Other languages
English (en)
Other versions
KR20180106344A (ko
Inventor
이윤상
이윤식
정대홍
이동수
정재민
강건욱
박지용
정신영
Original Assignee
서울대학교산학협력단
Priority date (The priority date is an assumption and is not a legal conclusion. Google has not performed a legal analysis and makes no representation as to the accuracy of the date listed.)
Filing date
Publication date
Application filed by 서울대학교산학협력단 filed Critical 서울대학교산학협력단
Priority to KR1020170034521A priority Critical patent/KR101919427B1/ko
Publication of KR20180106344A publication Critical patent/KR20180106344A/ko
Application granted granted Critical
Publication of KR101919427B1 publication Critical patent/KR101919427B1/ko

Links

Images

Classifications

    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K16/00—Immunoglobulins [IGs], e.g. monoclonal or polyclonal antibodies
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/51—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent
    • A61K47/52—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the non-active ingredient being a modifying agent the modifying agent being an inorganic compound, e.g. an inorganic ion that is complexed with the active ingredient
    • A—HUMAN NECESSITIES
    • A61—MEDICAL OR VETERINARY SCIENCE; HYGIENE
    • A61K—PREPARATIONS FOR MEDICAL, DENTAL OR TOILETRY PURPOSES
    • A61K47/00—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient
    • A61K47/50—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates
    • A61K47/69—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit
    • A61K47/6921—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere
    • A61K47/6925—Medicinal preparations characterised by the non-active ingredients used, e.g. carriers or inert additives; Targeting or modifying agents chemically bound to the active ingredient the non-active ingredient being chemically bound to the active ingredient, e.g. polymer-drug conjugates the conjugate being characterised by physical or galenical forms, e.g. emulsion, particle, inclusion complex, stent or kit the form being a particulate, a powder, an adsorbate, a bead or a sphere the form being a microcapsule, nanocapsule, microbubble or nanobubble
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D225/00—Heterocyclic compounds containing rings of more than seven members having one nitrogen atom as the only ring hetero atom
    • C07D225/04—Heterocyclic compounds containing rings of more than seven members having one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings or ring systems
    • C07D225/08—Heterocyclic compounds containing rings of more than seven members having one nitrogen atom as the only ring hetero atom condensed with carbocyclic rings or ring systems condensed with two six-membered rings
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07D—HETEROCYCLIC COMPOUNDS
    • C07D487/00—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00
    • C07D487/02—Heterocyclic compounds containing nitrogen atoms as the only ring hetero atoms in the condensed system, not provided for by groups C07D451/00 - C07D477/00 in which the condensed system contains two hetero rings
    • C07D487/04—Ortho-condensed systems
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K17/00—Carrier-bound or immobilised peptides; Preparation thereof
    • C07K17/14—Peptides being immobilised on, or in, an inorganic carrier
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/54313—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being characterised by its particulate form
    • G01N33/54346—Nanoparticles
    • G—PHYSICS
    • G01—MEASURING; TESTING
    • G01N—INVESTIGATING OR ANALYSING MATERIALS BY DETERMINING THEIR CHEMICAL OR PHYSICAL PROPERTIES
    • G01N33/00—Investigating or analysing materials by specific methods not covered by groups G01N1/00 - G01N31/00
    • G01N33/48—Biological material, e.g. blood, urine; Haemocytometers
    • G01N33/50—Chemical analysis of biological material, e.g. blood, urine; Testing involving biospecific ligand binding methods; Immunological testing
    • G01N33/53—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor
    • G01N33/543—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals
    • G01N33/551—Immunoassay; Biospecific binding assay; Materials therefor with an insoluble carrier for immobilising immunochemicals the carrier being inorganic
    • G01N33/552—Glass or silica
    • C—CHEMISTRY; METALLURGY
    • C07—ORGANIC CHEMISTRY
    • C07K—PEPTIDES
    • C07K2317/00—Immunoglobulins specific features
    • C07K2317/50—Immunoglobulins specific features characterized by immunoglobulin fragments
    • C07K2317/52—Constant or Fc region; Isotype

Landscapes

  • Chemical & Material Sciences (AREA)
  • Health & Medical Sciences (AREA)
  • Life Sciences & Earth Sciences (AREA)
  • Organic Chemistry (AREA)
  • Immunology (AREA)
  • Engineering & Computer Science (AREA)
  • Molecular Biology (AREA)
  • Medicinal Chemistry (AREA)
  • General Health & Medical Sciences (AREA)
  • Biomedical Technology (AREA)
  • Biochemistry (AREA)
  • Hematology (AREA)
  • Urology & Nephrology (AREA)
  • Inorganic Chemistry (AREA)
  • Analytical Chemistry (AREA)
  • Pharmacology & Pharmacy (AREA)
  • Food Science & Technology (AREA)
  • Microbiology (AREA)
  • Cell Biology (AREA)
  • General Physics & Mathematics (AREA)
  • Pathology (AREA)
  • Nanotechnology (AREA)
  • Bioinformatics & Cheminformatics (AREA)
  • Physics & Mathematics (AREA)
  • Epidemiology (AREA)
  • Animal Behavior & Ethology (AREA)
  • Public Health (AREA)
  • Veterinary Medicine (AREA)
  • Biotechnology (AREA)
  • Biophysics (AREA)
  • Genetics & Genomics (AREA)
  • Proteomics, Peptides & Aminoacids (AREA)
  • Peptides Or Proteins (AREA)
  • Medicines Containing Antibodies Or Antigens For Use As Internal Diagnostic Agents (AREA)

Abstract

본 발명은 항체의 생체활성을 유지하면서도 높은 효율로 항체를 작용화하는 방법 및 항체의 배향이 제어된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법에 관한 것으로, 본 발명의 항체 작용화 방법은 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기만을 환원시키기 때문에, 항체의 생체활성이 그대로 유지된 상태에서 항체를 작용화할 수 있고, 높은 결합 효율로 항체를 나노입자와 결합시킬 수 있으며, 나노입자와 결합된 항체의 배향을 제어하는 것이 가능하다.
또한, 우수한 결합 효율로 항체가 나노입자의 표면에 결합되기 때문에, 나노플랫폼을 제조하기 위해 필요한 항체 및 나노입자의 수가 최적화되어 비용이 절감되고, 제조된 나노플랫폼의 민감성이 매우 높고, 표적 분자와의 결합 활성도 매우 우수하다. 나아가, 결합된 항체의 개수 및 표적 결합 능력을 정량적/실험적으로 측정하는 것이 가능하여, 고비용 진단 및 치료 용도에 적용하기에 적합하고, 진단 키트 등과 같이 상업화하는 것이 용이하다.

Description

항체 작용화 방법 및 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 방법{Antibody-functionalization Method and Method for Manufacturing Nanoparticle-Antibody Conjugated Nano-platform}
본 발명은 항체 작용화 방법 및 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 방법에 관한 것으로, 더욱 상세하게는 항체의 생체활성을 유지하면서도 높은 효율로 항체를 작용화하는 방법, 항체의 배향이 제어된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법, 항체의 생체활성이 유지된 작용화된(functionalized) 항체, 및 항체의 배향이 제어된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼에 관한 것이다.
항체는 높은 친화도(affinity), 특이성(specificity) 및 범용성으로 인하여, 면역분석법(immunoassays), 나노입자-표적화 분자 진단법(nanoparticle-targeted molecular diagnosis), 표적지향 약물전달(targeted drug delivery), 방사면역치료법(radioimmunotherapy) 등과 같은 진단 및 치료 분야에서 표적 잔기(targeting moiety)로서 널리 사용되어 왔다.
이들 분야에서 항체가 갖는 이점들을 살리기 위해서는, 항체를 나노입자와 같은 나노프로브와 결합시키는 것이 필수적이다. 그러나, 지금까지 알려진 대부분의 결합 방법들은 비균질성, 낮은 결합 효율 및 낮은 재현성 등과 같은 다양한 제한들로 인하여 활용되기 어려운 문제가 있었다. 특히, 항체가 고체 표면에 결합되는 경우, 결합된 항체의 배향(orientation)에 따라 움직임의 자유가 제한되고 이에 따라 항원 결합 부위의 접근성이 제한되기 때문에, 결합된 항체의 배향은 생체 표적의 탐지를 위한 중요한 요소이다. 결국, 항체를 이용하는 의학 분야에서 면역 센서의 민감성이나 표적화 치료의 효험은 항체 결합 방법에 의해 크게 영향을 받는다. 따라서 항체의 생체작용성을 보전하면서도 효율적으로 항체를 결합할 수 있는 항체 결합 방법을 개발하기 위한 노력이 계속되었다.
한편, 나노입자(nanoparticle)는 입자 크기가 수 nm에서 수백 nm 크기의 범주에 속하는 입자를 말하는데, 다양한 작용기들을 함유할 수 있고 주어진 목적에 따라서 그들의 물리화학적 성질을 세밀하게 조정할 수 있기 때문에, 분자적 표적화제, 약물 전달 수단, 및 항체를 표면에 결합시키는 분자 이미징을 위한 콘트라스트 촉진제로서 사용되어 왔다. 나노입자를 이용한 의약학 분야에 있어서, 나노입자에 특이성을 부여하는 것은 특정 조직에 선택적으로 나노 입자를 운반하는 기술을 체내 적용할 수 있고, 조직염색학이나 세포결합분석 등 시험관 내 연구분야에도 유용하게 이용될 수 있다. 특히, 항체가 결합된 나노입자는 표적 분자에 대한 친화도 및 특이성 향상으로 인하여, 탐지, 독성시험, 및 원치 않는 축적으로 인한 암소음(background noise)에 사용되는 나노입자의 필요량을 줄이는 등의 상당한 이점을 갖는다.
이와 같은 이점으로 인하여, 항체를 나노입자 표면 상에 결합시키기 위한 다양한 전략들이 개발되어 왔다. 통상적인 항체 결합 방법 중 하나는 1-에틸-3-(3-디메틸아미노프로필)-카르보디이미드 하이드로클로라이드(1-ethyl-3-(3-dimethylaminopropyl)-carbodiimide hydrochloride; EDC) 및/또는 N-하이드록시설포숙신이미드(N-hydroxysulfosuccinimide; Sulfo-NHS)를 커플링 시약으로 사용하여 항체 내의 1차 아민 작용기를 이용하는 방법이다. 이 결합 방법은 나노입자와 항체 사이에 공유 아미드 결합을 형성함으로써 다양한 생물학적 조건에서 높은 안정성을 제공한다. 그러나, 1차 아민 작용기는 항체 내에서 무작위로 존재하기 때문에 1차 아민 작용기를 활용한 항체 결합 방법에 의해 고체 표면에 결합된 항체도 무작위로 배향되게 되어, 항원 결합 부위에 입체 장해가 발생하고, 결과적으로 선택적 결합능력이 약화되는 문제가 있었다. 더욱이, 상기 EDC/Sulfo-NHS 커플링 방법은 1 내지 20%의 항체만이 고체 표면과 결합하는 매우 저조한 커플링 효율을 나타내기 때문에, 선택적으로 추적가능한 나노입자를 제조하기 위한 비용이 많이 소요되며, 화학 반응 중에 항체의 부분적인 변성이 발생할 수 있어서 항원 결합 능력이 감소되는 문제 또한 존재하였다.
이에 대한 대안으로서, 클릭 화학(click chemistry)이 항체를 나노입자와 결합시키기 위한 방법으로 제안되었다. 클릭 화학에 의한 항체-나노입자의 결합은 높은 결합 효율 및 재현성을 나타내고, 아자이드 및 알킨 작용기와의 우수한 반응 특이성을 나타내며, 트리아졸을 형성함으로써 서로 반응하기 때문에 체내 시스템에서 체내의 생물학적 물질을 간섭하지 않아 생체분자를 조사하는 것을 가능하게 한다. 특히, 클릭 반응은 Stain-promoted alkyne-azide cycloaddition (SPAAC) 반응을 사용하기 때문에 온화한 조건에서도 진행될 수 있어, 결합 반응 중에 발생할 수 있는 항체의 화학적 데미지를 최소화할 수 있다. 또한, 클릭 화학 기반의 항체 결합 방법의 적용 가능성은 형광, 세포 독소(cytotoxin), 및 방사성 핵종(radionuclide)과 같은 추가의 작용기들을 함유하는 다수의 클릭 화합물을 사용함으로서 쉽게 확장될 수 있다. 그러나, 통상의 클릭 화학 기반의 항체 결합 키트는 항체 내의 아민기를 이용하기 때문에, 결합된 항체의 배향을 조절할 수 없다는 문제가 여전히 남아 있었다.
또한, 지금까지 개발된 항체-나노입자 결합 방법으로는 단일 나노입자에 결합된 항체의 개수 및 결합된 항체의 표적 결합 능력을 정량적/실험적으로 결정할 수 없기 때문에, 항체 결합된 나노입자로 표지된 생물학적 분석의 결과를 적절하게 해석하는 것이 어려운 문제가 있었다. 비록 나노입자와 결합된 항체의 수를 정량적으로 측정하기 위한 다수의 노력들이 있어 왔지만, 결합된 항체의 항원 결합 능력의 평가를 위한 정량적/실험적 분석법은 여전히 충분하지 못하였다.
이와 같은 배경하에, 본 발명자들은 항체 고정화 방법과 항체와 나노입자를 결합한 나노플랫폼에 대한 문제점을 해결하고자 노력한 결과, 특정 환원 조건에서 항체를 환원시키고 작용기를 도입하는 경우, 항체의 생체활성이 유지되면서 높은 효율로 항체를 나노입자와 결합할 수 있고, 결합된 항체의 배향을 제어할 수 있으며, 나아가 결합된 항체의 개수 및 표적 결합 능력을 정량적으로 측정할 수 있다는 것을 확인하여 본 발명을 완성하였다.
본 발명의 목적은 항체의 생체활성을 유지하면서도 높은 효율로 항체를 작용화하는 방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 다른 목적은 항체의 배향이 제어된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법을 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항체의 생체활성이 유지된 작용화된(functionalized) 항체를 제공하는 것이다.
본 발명의 또 다른 목적은 항체의 배향이 제어된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제공하는 것이다.
상기 목적을 달성하기 위한 본 발명의 일 양태는 환원제를 이용하여 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드(disulfide)기를 티올(thiol)기로 환원시키는 단계 및 상기 티올기에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A를 연결시키는 단계를 포함하는 항체 작용화(antibody-functionalization) 방법을 제공한다.
[화학식1]
R-L-A
상기 식에서,
R은 C6~C30의 알켄기 또는 알킨기, 또는 아자이드기를 나타내고,
L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기를 나타내며,
A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기를 나타낸다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 환원제는 2-머캅토에탄올 또는 다이클로로-다이페닐-트리클로로에탄(dichloro-diphenyl-trichloroethane; DDT)인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 항체 및 환원제는 1:500 내지 1:2000의 몰비, 바람직하게는 1:500 내지 1:1000의 몰비로 사용되는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태는, 상기 화학식 1의 R이 C6~C30의 알킨기인 것을 특징으로 하는 항체 작용화 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 알킨기는 사이클로옥틴(cyclooctyne)기인 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 사이클로옥틴기는
Figure 112017027220117-pat00001
,
Figure 112017027220117-pat00002
,
Figure 112017027220117-pat00003
,
Figure 112017027220117-pat00004
,
Figure 112017027220117-pat00005
,
Figure 112017027220117-pat00006
,
Figure 112017027220117-pat00007
,
Figure 112017027220117-pat00008
또는
Figure 112017027220117-pat00009
인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는, 상기 화학식 1의 R이 아자이드기인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 양태는, 상기 화학식 1의 L이 (polyethylene glycol)4인 것을 특징으로 하는 항체 작용화 방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 A가 말레이미드기인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예는, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 아자-디벤조사이클로옥틴-말레이미드(aza-dibenzocyclooctyne-maleimide; ADIBO-Mal), 아자-디벤조사이클로옥틴-(폴리에틸렌글리콜)4-말레이미드(aza-dibenzocyclootyne-(polyethylene glycol)4-maleimide; ADIBO-PEG4-Mal), ADIBO-S-S-Mal, N3-Mal, N3-PEG4-Mal 및 N3-S-S-Mal로부터 선택되는 것을 특징으로 하는 항체 작용화 방법을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 힌지 부위가 살아있는 모든 항체에 대해서 적용가능하며, 바람직하게는 상기 항체가 IgG인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 다른 양태는, 나노입자의 표면에 아자이드(N3) 작용기를 도입하는 단계; 및 상기 아자이드(N3) 작용기가 도입된 나노입자를 상술한 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 실리카 나노입자 또는 실리카-캡슐화된(silica-encapsulated) 나노입자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예는, 상기 아자이드 작용기를 도입하는 단계가 아자이드 작용기를 갖는 화합물을 나노입자 표면의 하이드록시기와 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법을 제공한다. 본 발명에 있어서, 상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물은 에톡시실록산 말단을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 본 발명의 바람직한 구현예에 있어서, 상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물은 N-[3-(트리에톡시실릴)프로필]-2-아지도아세트아미드(N-[3-(triethoxysilyl)propyl]-2-azidoacetamide; NTPA)일 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 아자이드 작용기가 상기 화학식 1의 R과 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예에 있어서, 상기 나노입자는 실리카 나노입자, 양자점, 산화철(iron oxide), 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticle; UCNP), 표면 증감 라만 산란 나노프로브(surface enhanced Raman scattering nanoprobe; SERS Dot), 및 형광 SERS dot으로부터 선택될 수 있다.
본 발명의 다른 양태는, 나노입자의 표면에 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계; 및 상기 사이클로옥틴 작용기가 도입된 나노입자를 상술한 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법을 제공한다.
본 발명의 일 구현예에서, 상기 나노입자는 표면에 올레산(oleic acid) 작용기를 갖는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에서, 상기 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계는 사이클로옥틴 작용기를 갖는 화합물을 나노입자 표면의 올레산 작용기와 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 할 수 있다.
상기 사이클로옥틴 작용기를 갖는 화합물은 소수성 말단을 갖는 것을 특징으로 할 수 있으며, 바람직하게는 ADIBO-PEG4-C18 또는 ADIBO-PEG2000-DSPE인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 사이클로옥틴 작용기는 상기 화학식 1의 R과 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응하는 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 또 다른 양태는, 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기가 환원되어 생성된 티올기에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A가 연결된 구조를 갖는 것을 특징으로 하는 작용화된 항체(functionalized antibody)를 제공한다.
본 발명의 또 다른 하나의 양태는, 나노입자의 표면에 본 발명의 일 양태에 따른 작용화된 항체가 고정된 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제공한다.
본 발명에 있어서, 상기 나노입자는 실리카-캡슐화된 나노입자인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명의 일 구현예는, 상기 나노입자에 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 비타민, 호르몬, 신경전달물질, 당, 킬레이트화제 및 형광염료로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제공한다.
본 발명의 항체 작용화 방법은 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기만을 환원시키기 때문에, 항체의 생체활성이 그대로 유지된 상태에서 항체를 작용화할 수 있고, 높은 결합 효율로 항체를 나노입자와 결합시킬 수 있으며, 나노입자와 결합된 항체의 배향을 제어하는 것이 가능하다.
또한, 우수한 결합 효율로 항체가 나노입자의 표면에 결합되기 때문에, 나노플랫폼을 제조하기 위해 필요한 항체 및 나노입자의 수가 최적화되어 비용이 절감되고, 제조된 나노플랫폼의 민감성이 매우 높고, 표적 분자와의 결합 활성도 매우 우수하다. 나아가, 결합된 항체의 개수 및 표적 결합 능력을 정량적/실험적으로 측정하는 것이 가능하여, 고비용 진단 및 치료 용도에 적용하기에 적합하고, 진단 키트 등과 같이 상업화하는 것이 용이하다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 공정을 나타낸 것이다.
도 2는 온전한 전체 항체가 환원에 의해 생성될 수 있는 절편들을 나타낸다.
도 3는 실시예 1의 환원조건에 따라 환원된 항체를 나트륨 도데실설폰산염 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE) 분석법으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 4는 실시예 2의 환원조건에 따라 환원된 항체를 SDS-PAGE 분석법으로 분석한 결과를 나타낸다.
도 5a은 방사선 동위원소 64Cu가 표지된 NOTA-실리카 나노입자(SiNP)의 radio-ITLC-SG 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 5b는 방사선 동위원소 64Cu가 표지된 NOTA-항체의 radio-ITLC-SG 측정 결과를 나타낸 것이다.
도 6a는 형광 항체를 클릭 화학에 의해 실리카 나노입자와 결합하는 과정을 도식화한 것이다.
도 6b는 ADIBO 결합된 형광 항체를 IVIS로 측정한 형광 이미지이다.
도 6c는 형광 신호를 이용하여 단일 실리카 나노입자 상에 결합된 항체의 수를 정량적으로 분석한 것이다.
도 7a는 형광 HER2 항원을 이용한 생물학적 정량 방법을 도식화한 것이다.
도 7b는 소혈청 알부민(BSA) 처리된 실리카 나노입자, EDC/NHS 커플링 방법으로 제조된 anti-HER2 항체 결합된 실리카 나노입자, 및 본 발명의 방법으로 제조된 anti-HER2 항체 결합된 실리카 나노입자의 형광 이미지를 나타낸다.
도 7c는 각 방법에 따라 포획된 형광 항원의 수를 나타낸다.
도 8a는 본 발명의 방법으로 제조된 anti-HER2-QD2 click에 의해 표적화된 암 세포의 형광 이미지를 나타낸다.
도 8b는 종래의 EDC/NHS 커플링에 의해 제조된 anti-HER2-QD2 EDC / NHS에 의해 표적화된 암 세포의 형광 이미지를 나타낸다.
도 8c는 항체가 결합되지 않은 소혈청 알부민(BSA) 처리된 QD2를 사용한 형광 이미지를 나타낸다.
도 9는 본 발명의 일 실시예에 따라 다양한 나노입자와 결합된 항체의 SDS-PAGE 분석결과를 나타낸다.
다른 식으로 정의되지 않는 한, 본 명세서에서 사용된 모든 기술적 및 과학적 용어들은 본 발명이 속하는 기술 분야에서 숙련된 전문가에 의해서 통상적으로 이해되는 것과 동일한 의미를 갖는다. 일반적으로, 본 명세서에서 사용된 명명법은 본 기술 분야에서 잘 알려져있고 통상적으로 사용되는 것이다.
본 발명은 항체의 생체활성을 유지하면서도 높은 효율로 항체를 작용화하는 방법을 및 항체의 배향이 제어된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법을 제공하는 것이다.
이와 같은 목적에서 본 발명은, 환원제를 이용하여 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드(disulfide)기를 티올(thiol)기로 환원시키는 단계; 및 상기 티올기에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A를 연결시키는 단계를 포함하는 항체 작용화 방법에 관한 것이다.
[화학식 1]
R-L-A
상기 식에서,
R은 C6~C30의 알켄기 또는 알킨기, 또는 아자이드기를 나타내고,
L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기를 나타내며,
A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기를 나타낸다.
본 발명에 따른 항체 작용화 방법은, 종래 항체 내의 아민기를 사용하는 방법과는 달리, 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기만을 환원시키고, 상기 디설파이드기가 환원된 티올기를 이용하여 항체를 작용화시키기 때문에, 항체의 생체활성이 전혀 저해되지 않고, 항체의 배향을 제어할 수 있으며, 항체를 나노입자와 결합시키는 경우 결합 효율이 매우 우수하고, 결합된 항체의 개수를 정량적으로 측정할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 항체는 힌지 부위가 살아있는 모든 항체에 대해서 적용가능하며, 바람직하게는 상기 항체가 IgG인 것을 특징으로 할 수 있다.
본 발명에 있어서, 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기를 환원시키기 위해 사용되는 환원제는 2-머캅토에탄올 또는 다이클로로-다이페닐-트리클로로에탄(dichloro-diphenyl-trichloroethane; DDT)로부터 선택되는 것이 바람직하며, 특히, 2-머캅토에탄올을 환원제로서 사용하는 것이 바람직하다.
일반적으로 항체 내에 존재하는 디설파이드기를 환원시키는 경우, 도 2에 나타낸 바와 같이, 아래의 4가지 생성물이 생성될 수 있다:
- 부분적으로 환원된 온전한 전체 항체(분자량: 150 kD)
- 반으로 쪼개진 절편(75 kD)
- 중쇄(heavy chain)(50kD)
- 경쇄(light chain)(25kD)
이들 생성물 중에서, 부분적으로 환원된 온전한 전체 항체(150 kD) 및 반으로 쪼개진 절편(75 kD)만이 특정 표적과 결합가능한 생체-활성을 가지며, 중쇄 또는 경쇄로만 이루어진 절편은 생체 활성을 나타내지 않는다. 이러한 이유로, 항체의 생체작용성을 보전하기 위해서는, 항원-결합 부위 내의 디설파이드가 환원되지 않도록 환원조건을 최적화하는 것이 중요하다.
본 발명의 구체적인 일 실시예에서는, 상기 항체의 환원 조건을 조절함으로써, 온전한 전체 항체 및 반으로 쪼개진 절편만을 생성하고, 중쇄 또는 경쇄 절편이 생성되지 않도록 하는 환원 조건을 확인하였다.
구체적으로, 상기 항체 및 환원제는 1:500 내지 1:2000의 몰비, 바람직하게는 1:500 내지 1:1000의 몰비로 사용되는 것이 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기만을 환원시키기 위해 바람직하다. 항체 및 환원제를 1:500 내지 1:1000의 몰비로 사용하는 경우, 환원 이후에도 항체가 절반으로 쪼개지지 않고 전체-길이 항체의 형태를 유지할 수 있어 특히 바람직하다. 상기 항체 및 환원제를 1:2000 초과의 몰비로 사용하는 경우, 항체의 Fc 도메인과 Fab 도메인 사이의 디설파이드기가 환원되어 항체가 중쇄(heavy chain) 절편 및 경쇄(light chain) 절편까지 쪼개지게 되어, 항체의 생체 활성을 잃게 된다.
본 발명의 일 양태에 있어서, 상기와 같이 Fc 도메인 내의 디설파이드기가 티올기로 환원된 항체에 상기 화학식 1로 표시되는 화합물을 연결함으로써, 항체를 작용화(functionalization)시킬 수 있다.
상기 화학식 1에서 식에서, R은 C6~C30의 알켄기 또는 알킨기, 또는 아자이드기를 나타내고, L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기를 나타내며, A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기를 나타낸다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 R은 C6~C30의 알킨기인 것이 바람직하다. 상기 R을 C6~C30의 알킨기로 함으로써, 추후 나노입자와 항체를 결합하는 과정에서 나노입자에 작용화된 아자이드기와 클릭 화학(click chemistry) 반응에 의해 연결될 수 있다.
이와 같은 관점에서, 상기 화학식 1의 R은 사이클로옥틴(cyclooctyne)기인 것이 바람직하다. 본 발명에서 사이클로옥틴기란 ring strain을 받고 있는 삼중결합을 포함하는 8원 지방족 고리를 말하며, 특히 구리 촉매 없는 클릭 화학(Cu-Free click chemistry)의 일종인 1,3-dipolar cycloaddition 반응에서 전자수용체(electron acceptor) 역할을 하여, triaza-5-membered ring을 만드는 역할을 하는 것으로 알려져 있다. 사이클로옥틴(Cyclooctyne)의 구조적 특징, 즉 ring strain을 받고 있는 삼중결합 구조로 인하여 Cu(I) 촉매 없이도 클릭 화학이 가능하다.
본 발명에 있어서, 사이클로옥틴기는 4-cyclooctyn-1-yl(
Figure 112017027220117-pat00010
), 3-cyclooctyn-1-yl(
Figure 112017027220117-pat00011
), 2-cyclooctyn-1-yl(
Figure 112017027220117-pat00012
), Monofluorinated cyclooctyne(MOFO)(
Figure 112017027220117-pat00013
), Difluororinated cyclooctyne(DIFO)(
Figure 112017027220117-pat00014
), Dimethoxyazacyclooctyne(DIMAC)(
Figure 112017027220117-pat00015
), Dibenzocyclooctyne(DIBO)(
Figure 112017027220117-pat00016
), Azadibenzocyclooctyne(ADIBO)(
Figure 112017027220117-pat00017
) 또는 Bizrylazacyclooctynone(BARAC)(
Figure 112017027220117-pat00018
)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 사이클로옥틴기는 ADIBO인 것이 클릭 화학 반응의 효율의 관점에서 바람직하다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 A는 항체의 Fc 도메인의 디설파이드기가 환원되어 형성된 티올기와 반응하여 연결되는 역할을 한다. 상기 A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기인 것이 바람직하며, 가장 바람직하게는 말레이미드기일 수 있다. A가 말레이미드기인 경우, 항체의 티올기가 말레이미드의 5원환의 이중결합을 구성하는 탄소와 연결되어, 항체를 고정화시킬 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 화학식 1의 L은 클릭 화학 반응에 참여하는 R과 항체와 연결되는 A를 연결하는 연결기의 역할을 한다. 본 발명의 일 양태에서, 상기 L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기일 수 있다. 본 발명에 있어서, 상기 L은 (polyethylene glycol)4일 수 있다. L로서 PEG가 3개 이상 연결된 기를 사용하는 경우 비특이적 결합을 방지할 수 있다.
본 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 아자-디벤조사이클로옥틴-말레이미드(aza-dibenzocyclooctyne-maleimide; ADIBO-Mal), 아자-디벤조사이클로옥틴-(폴리에틸렌글리콜)4-말레이미드(aza-dibenzocyclootyne-(polyethylene glycol)4-maleimide; ADIBO-PEG4-Mal), ADIBO-S-S-Mal, N3-Mal, N3-PEG4-Mal 및 N3-S-S-Mal로부터 선택될 수 있으며, 가장 바람직하게는 ADIBO-PEG4-Mal일 수 있다.
본 발명에서, 상기 화학식 1로 표시되는 화합물은 항체와 1:5 내지 1:20의 항체:화학식 1로 표시되는 화합물의 몰비로 도입되는 것이 가장 안정적으로 항체를 작용화시킬 수 있다. 본 발명의 일 실시예에서는 항체와 ADIBO-PEG4-Mal을 1:10의 몰비로 반응시키는 경우 가장 안정적으로 ADIBO 작용화된 항체를 제조할 수 있다는 것을 확인하였다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기가 환원되어 생성된 티올기에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A가 연결된 구조를 갖는 작용화된 항체(functionalized antibody)에 관한 것이다.
[화학식1]
R-L-A
상기 식에서, R, L 및 A는 앞서 설명한 것과 동일한 기를 나타낸다.
본 발명은 다른 양태에 있어서, 나노입자의 표면에 아자이드(N3) 작용기를 도입하는 단계; 및 상기 아자이드(N3) 작용기가 도입된 나노입자를 앞서 설명한 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법으로 작용화된 항체는 쪼개지지 않은 전체-길이 항체의 Fc 도메인이 작용화된 구조를 갖기 때문에, 항체의 생체 활성이 유지된 채로 나노입자와 결합하고, 결합시 항체의 배향을 제어할 수 있으며, 높은 효율로 나노입자와 결합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 아자이드(azide, N3)기란 질소 3개에 의해서 이루어진 반응기로, 높은 반응성을 가지며, 특히 Cu-Free click chemistry의 일종인 1,3-dipolar cycloaddition 반응에서 전자공여체(electron donor) 역할을 하여 triaza-5-membered ring을 만드는 역할을 하는 것으로 알려져 있다.
본 발명의 일 실시형태에서, 상기 나노입자는 실리카 나노입자 또는 실리카-캡슐화된(silica-encapslated) 나노입자인 것이 바람직하며, 이들 나노입자 표면의 하이드록시기를 아자이드 작용기를 갖는 화합물과 반응시켜, 아자이드 작용화된 나노입자를 제조할 수 있다.
본 발명에 있어서, 상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물은 에톡시실릴(ethoxysilyl) 말단을 갖는 것이 실리카 나노입자의 표면에서 하이드록시기와 반응하여 결합하기 위해 바람직하다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물은 N-[3-(트리에톡시실릴)프로필]-2-아지도아세트아미드(N-[3-(triethoxysilyl)propyl]-2-azidoacetamide; NTPA)일 수 있다.
본 발명에 있어서, 나노입자의 표면에 아자이드 작용기를 도입하는 단계는 나노입자의 실리카 표면 상의 하이드록시기와 아자이드 작용기를 갖는 화합물의 에톡시실릴 말단의 실란 커플링에 의해 이루어질 수 있다.
이와 같이 아자이드 작용화된 나노입자를 앞서 설명한 방법에 의해 작용화된 항체와 실온에서 혼합함으로써, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제조할 수 있다. 본 발명에 따른 작용화된 항체가 알킨 작용기를 포함하는 경우, 알킨 작용기와 아자이드 작용기 사이의 클릭 화학에 의해 항체와 나노입자를 결합시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, ADIBO-작용화된 항체를 아자이드-작용화된 나노입자와 결합하는 경우, 하나의 ADIBO 분자 내에서 두 벤젠고리가 사이클로옥틴과 결합되어 있기 때문에, 아자이드 작용기와의 클릭 화학 반응이 높은 효율과 재현성으로 진행될 수 있다.
상기 작용화된 나노입자는 작용화된 항체와 10:1 내지 1000:1의 질량비, 바람직하게는 50:1 내지 200:1의 질량비로 혼합할 수 있다.
도 1은 본 발명의 바람직한 실시예에 따른 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 공정을 나타낸 것이다. 도 1의 좌상단 그림은 실리카 캡슐화된 나노입자 표면의 하이드록시기와 NTPA의 에톡시실릴기가 실란 커플링에 의해 연결됨으로써, 아자이드-작용화된 실리카 나노입자를 형성하는 과정을 나타낸다. 도 1의 우상단 그림은 ADIBO-PEG4-Maleimide의 말레이미드 작용기가 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기가 환원된 티올기와 결합하는 과정을 나타낸다. 이렇게 형성된 아자이드-작용화된 실리카 나노입자 및 ADIBO-작용화된 항체는 도 1의 중단의 그림에서 나타낸 바와 같이 아자이드기와 ADIBO의 클릭 화학으로 연결되게 되고, 최종적으로 도 1의 하단 그림에서 나타낸 바와 같은 형태의 나노입자-항체 결합 나노플랫폼이 제조되게 된다.
본 발명에 따른 항체-나노입자 결합 방법은 실리카 표면을 갖는 나노입자라면 종류에 상관없이 쉽고 안정적으로 적용될 수 있다. 예를 들어, 본 발명의 나노입자는 실리카 나노입자, 양자점, 산화철(iron oxide), 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticle; UCNP), 표면 증감 라만 산란 나노프로브(surface enhanced Raman scattering nanoprobe; SERS Dot), 및 형광 SERS dot으로부터 선택하여 사용할 수 있다.
또 다른 하나의 양태로서, 본 발명은 나노입자의 표면에 작용화된 항체가 결합된 것을 특징으로 하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼에 관한 것이다. 상기 나노입자-항체 결합 나노플랫폼에 있어서, 상기 나노입자는 실리카-캡슐화된 나노입자인 것이 바람직하다.
본 발명은 또 다른 양태에 있어서, 나노입자의 표면에 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계; 및 상기 사이클로옥틴 작용기가 도입된 나노입자를 앞서 설명한 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법에 관한 것이다.
본 발명의 방법으로 작용화된 항체는 쪼개지지 않은 전체-길이 항체의 Fc 도메인이 작용화된 구조를 갖기 때문에, 항체의 생체 활성이 유지된 채로 나노입자와 결합하고, 결합시 항체의 배향을 제어할 수 있으며, 높은 효율로 나노입자와 결합할 수 있다.
본 발명에 있어서, 사이클로옥틴 작용기는 4-cyclooctyn-1-yl(
Figure 112017027220117-pat00019
), 3-cyclooctyn-1-yl(
Figure 112017027220117-pat00020
), 2-cyclooctyn-1-yl(
Figure 112017027220117-pat00021
), Monofluorinated cyclooctyne(MOFO)(
Figure 112017027220117-pat00022
), Difluororinated cyclooctyne(DIFO)(
Figure 112017027220117-pat00023
), Dimethoxyazacyclooctyne(DIMAC)(
Figure 112017027220117-pat00024
), Dibenzocyclooctyne(DIBO)(
Figure 112017027220117-pat00025
), Azadibenzocyclooctyne(ADIBO)(
Figure 112017027220117-pat00026
) 또는 Bizrylazacyclooctynone(BARAC)(
Figure 112017027220117-pat00027
)일 수 있다. 본 발명의 일 실시예에 있어서, 상기 사이클로옥틴기는 ADIBO인 것이 클릭 화학 반응의 효율의 관점에서 바람직하다.
본 발명에서, 나노입자의 표면에 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계는 유기용매에 나노입자를 분산시키고, 사이클로옥틴기를 갖는 화합물을 혼합하여 수행할 수 있다. 이때, 상기 사이클로옥틴기를 갖는 화합물은 소수성 말단 작용기를 갖는 화합물이 바람직하다. 예를 들어, 상기 사이클로옥틴기를 갖는 화합물로서 ADIBO-PEG4-C18 또는 ADIBO-PEG2000-DSPE를 사용할 수 있다. 상기 C18은 탄소수 18개의 알킬기로서, 예를 들어 올레산기일 수 있다. 상기 PEG2000은 분자량 약 2000의 PEG를 의미하며, DSPE는 distearoyl phosphoethanolamine을 의미한다.
본 발명에서 나노입자는 올레산(oleic acid) 작용기를 갖는 것이 바람직하다. 구체적으로, 유기용매에 나노입자와 사이클로옥틴기를 갖는 화합물을 혼합하고, 초음파을 이용하여 분산시키면, 나노입자 표면의 올레산의 소수성 사슬과 사이클로옥틴기를 갖는 화합물의 소수성 사슬이 소수성-소수성 상호작용하여 서로 연결되게 된다.
상기 나노입자와 사이클로옥틴기를 갖는 화합물의 반응은 계면활성제의 존재 하에서 수행될 수 있다. 상기 계면활성제는 Tween-20, Tween-40, Tween-60, Tween-80, BriJ-35 등을 사용할 수 있으나, 이에 제한되는 것은 아니다. 본 발명에서 사용되기에 가장 바람직한 계면활성제는 Tween-60을 사용할 수 있다. 상기 계면활성제는 미셀(micelle)의 형태로 도입되는 것이 바람직하다. 상기 계면활성제는 전체 용액에 대하여 10 v/v% 이하로 포함되는 것이 바람직하다.
이와 같이 사이클로옥틴 작용화된 나노입자를 앞서 설명한 방법에 의해 작용화된 항체와 실온에서 혼합함으로써, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제조할 수 있다. 상기 작용화된 나노입자는 작용화된 항체와 10:1 내지 1000:1의 질량비, 바람직하게는 50:1 내지 200:1의 질량비로 혼합할 수 있다.
본 발명에 따른 작용화된 항체가 아자이드 작용기를 포함하는 경우, 사이클로옥틴 작용기와 아자이드 작용기 사이의 클릭 화학에 의해 항체와 나노입자를 결합시킬 수 있다. 특히, 본 발명의 바람직한 일 실시예에 있어서, 아자이드-작용화된 항체를 ADIBO-작용화된 나노입자와 결합하는 경우, 하나의 ADIBO 분자 내에서 두 벤젠고리가 사이클로옥틴과 결합되어 있기 때문에, 아자이드 작용기와의 클릭 화학 반응이 높은 효율과 재현성으로 진행될 수 있다.
본 발명에 따른 항체-나노입자 결합 방법은, 예를 들어, 실리카 나노입자, 양자점, 산화철(iron oxide), 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticle; UCNP), 표면 증감 라만 산란 나노프로브(surface enhanced Raman scattering nanoprobe; SERS Dot), 및 형광 SERS dot으로부터 선택되는 나노입자를 사용할 수 있다.
본 발명의 방법으로 제조된 나노입자-항체 결합 나노플랫폼은 항체가 완전한 항원 결합 능력을 유지되고 배향이 제어될 수 있기 때문에, 나노플랫폼의 민감성과 결합 활성이 매우 우수하고, 종래의 EDC/NHS 커플링을 이용한 방법에 비하여 현저히 우수한 결합 효율을 나타낸다. 또한, 선택적으로 표적가능한 나노입자를 제조하기 위해 필요한 항체의 양이 크게 감소될 수 있으며, 커플링 효율을 증가시킴으로써 결합된 항체의 수도 크게 증가할 수 있다.
또한, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼에 추가의 작용기를 함유하는 다수의 클릭 화합물을 사용함으로써 적용가능성을 쉽게 확장할 수 있다. 예를 들어, 본 발명에 따른 나노입자-항체 결합 나노플랫폼은, 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 비타민, 호르몬, 신경전달물질, 당, 킬레이트화제 및 형광염료로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 결합되어, 원하는 목적에 따른 나노플랫폼으로서 활용될 수 있다.
이하 실시예를 통하여 본 발명을 보다 상세하게 설명한다. 단, 이들 실시예는 본 발명을 예시적으로 설명하기 위하여 일부 실험방법과 조성을 나타낸 것으로, 본 발명의 범위가 이러한 실시예에 제한되는 것은 아니다.
실시예 1: 환원 조건에 따른 항체의 절편 확인
환원 조건에 따라 생성되는 항체의 절편을 확인하기 위해서, 항체와 환원제의 비율을 아래의 4가지로 조정하여 항체의 환원을 실시하였다.
(1) 반응조건 1 - 항체:환원제 = 1:500
인간 면역글로블린 G(IgG)를 사용하고, 환원제는 500㎕ 인산완충식염수(phosphate-buffer saline; PBS) 용액에 0.3M의 에틸렌디아민테트라아세트산(EDTA) 2㎕, 1M의 나트륨바이카보네이트(sodiumbicarbonate) 버퍼 2㎕ 및 β-머캅토에탄올 2.5㎕(1500nmole/μL)을 첨가하여 사용하였다. 항체와 환원제가 1:500의 몰비가 되도록 함량을 조절하여 사용하였다.
(2) 반응조건 2 - 항체:환원제 = 1:800
반응조건 1과 동일한 항체와 환원제를 사용하되, 항체와 환원제의 비율을 1:800으로 구성하여 사용하였다.
(3) 반응조건 3 - 항체:환원제 = 1:1000
반응조건 1과 동일한 항체와 환원제를 사용하되, 항체와 환원제의 비율을 1:1000으로 구성하여 사용하였다.
(4) 반응조건 4 - 항체:환원제 = 1:2000
반응조건 1과 동일한 항체와 환원제를 사용하되, 항체와 환원제의 비율을 1:2000으로 구성하여 사용하였다.
상기 반응조건 1-4의 반응을 모두 37℃에서 30분간 동안 온치한 후, 환원된 항체를 PD-10 컬럼(GE Healthcare로부터 입수가능)을 사용하여 PBS로 정제하였다.
정제된 항체를 나트륨 도데실설폰산염 폴리아크릴아미드 겔 전기 영동(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis; SDS-PAGE) 분석법으로 분석한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 3에서 확인할 수 있는 바와 같이, 반응조건 1 내지 4에서 모두 160kD에 해당하는 위치에 강한 쿠마시 블루(coomassie blue) 얼룩의 밴드가 나타났다. 이는 항체가 온전한 형태를 갖도록 환원되었다는 것을 의미한다.
특히, 반응조건 1 및 2에서는 오직 160kD 위치에서만 밴드가 나타내서 모든 항체가 온전한 형태를 갖도록 환원되었다는 것을 알 수 있으며, 반응조건 3 및 4에서는 대부분의 항체가 온전한 형태로 환원되었으며, 극소수는 반으로 쪼개진 절편의 형태로 환원되었다는 것을 알 수 있다.
즉, 항체와 환원제를 1:500 내지 1:2000의 몰비로 사용하는 경우 환원된 항체가 모두 온전한 생체-활성을 갖는다는 것을 확인할 수 있다.
실시예 2: 항체와 환원 조건에 따른 항체의 절편 확인
항체로서 헤르셉틴(herceptin) 및 IgG를 각각 사용하고, 항체:환원제의 몰비를 각각 1:1000, 1:2000, 1:4000 및 1:8000으로 하여 실시예 1과 동일한 방법으로 SDS-PAGE 분석을 수행하였다.
도 4에서 확인할 수 있는 바와 같이, 헤르셉틴과 IgG에서 유사한 결과를 얻을 수 있었다. 구체적으로, 두 항체 모두 항체:환원제=1:1000의 조건에서 오직 160kD에 해당하는 위치에 쿠마시 블루 얼룩의 밴드가 나타나, 모든 항체가 온전한 형태를 갖도록 환원되었다는 것이 확인되었다.
또한, 항체:환원제=1:2000에서는 160kD 위치에 밴드가 나타났으며, 75kD 위치에는 미약한 밴드가 나타났다. 이는, 대부분의 항체가 온전한 형태로 환원되고, 일부 항체가 반으로 쪼개진 절편의 형태로 환원되었다는 것을 의미한다.
한편, 항체:환원제=1:4000 및 1:8000에서는, 중쇄와 경쇄의 분자량에 해당하는 50kD 및 25kD 위치에서도 밴드가 관측되어, 항체가 중쇄 및 경쇄 절편으로까지 환원되었다는 것을 알 수 있다.
따라서, 항체:환원제를 1:2000의 몰비 이하로 사용하는 것이 환원 후에도 항체가 온전한 생체-활성을 갖도록 할 수 있다는 것을 확인하였다.
실시예 3: 나노입자-항원 결합 나노플랫폼의 제조
도 1에 나타낸 절차에 따라 나노입자-항원 결합 나노플랫폼을 제조하였다.
3-1. 항체 작용화
실시예 1의 반응조건 1을 사용하여 항체를 환원한 후(항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기만을 티올기로 환원), 20nmole/μL로 DMSO 용액에 녹인 ADIBO-PEG4-maleimide 3 μL 와 혼합한 후, 상온에서 2시간 동안 반응시켰다. 이때, 항체와 ADIBO-PEG4-maleimide는 1:10의 몰비로 혼합하였다.
반응 후 PD-10 컬럼을 이용하며 분획을 얻고, 얻은 분획을 쿠마시 블루(coomassie blue) 염색을 통해 단백질이 있는 분획만을 선택적으로 수득하여 ADIBO-작용화된 항체를 제조하였다.
3-2. 나노입자 표면에 아자이드 작용기 도입
약 230nm 크기의 실리카 나노입자(SiNP)를 Stober 방법을 사용하여 제조하였다.
테트라에틸 오쏘실리케이트(TEOS, 16mL)를 무수 에탄올 35mL 및 탈염수 5mL의 혼합물에 용해시킨 후, 산화암모늄(NH4OH, 27%, 5mL)를 첨가하였다. 혼합물을 마그네틱 바를 이용하여 25℃에서 20시간 동안 교반하였다. 원심분리를 통하여 SiNP를 분리한 후, 과량의 시약을 제거하기 위하여 에탄올로 여러 번 세척하였다.
제조된 SiNP 1mg을 NTPA 50㎍ 및 NH4OH(27%) 10㎛을 함유하는 에탄올 1mL에 분산시켰다. 혼합물을 25㎍에서 1시간동안 교반함으로써, NTPA의 에톡시실릴기가 실리카 나노입자 표면 상의 하이드록시기와 실란 커플링에 의해 연결되어, 아자이드 작용기가 실리카 캡슐화된 나노입자의 표면에 도입되도록 하였다. 제조된 N3-SiNP를 원심분리하고, 에탄올과 PBS를 이용하여 수차례 세척하였다.
3-3. 항체-나노입자 결합 나노플랫폼 제조
아자이드-작용화된 실리카 나노입자 1mg 및 ADIBO-작용화된 항체 50㎍을 1mL의 PBS에 첨가하여 25℃에서 1시간동안 반응시켰다. 반응이 완료된 후, 항체-작용하된 나노입자를 원심분리하고, 0.1%(w/v) Tween-20를 함유하는 PBS를 이용하여 수차례 세척하였다.
하나의 ADIBO 분자 내에서 두 벤젠고리가 사이클로옥틴과 결합되어 있기 때문에, 구리 없는 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응으로 알려진 strain-promoted alkyne-azide cycloaddition(SPAAC)에 의해, 항체의 ADIBO 작용기와 실리카 나노입자의 아자이드 작용기가 높은 효율과 재현성으로 결합함으로써, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼을 제조하였다.
실시예 4: 작용기 변화 평가
실리카 나노입자 및 항체의 작용기 변화를 평가하기 위하여, 방사성 박막 크로마토그래피(radio thin-layer chromatohraphy; TLC) 분석법을 수행하였다.
방사성동위원소 64Cu를 함유하는 유리병을 흄후드에서 1시간동안 건조한 N2 가스를 불어넣어 건조하였다. 유리병이 완전히 건조된 후, 1M의 나트륨 아세테이트 완충액(pH5.3) 200㎕를 pH 5가 될 때까지 첨가하였다. 7.5nmol의 azido-NOTA 및 NOTA-ADIBO를 각각 첨가하고, 60℃에서 30분간 가열 블록 상에서 온치하여, 64Cu로 표지된 azido-NOTA 및 NOTA-ADIBO를 제조하였다.
이후, 아자이드-작용화된 실리카 나노입자를 64Cu-표지된 NOTA-ADIBO와 결합하고, 다른 편에서는, ADIBO-작용화된 항체를 64Cu-표지된 azido-NOTA와 반응시켰다. 이들 각각을 radio-instant thin layer chromatography-silica gel(radio-ITLC-SG)를 사용하여 측정한 결과를 도 3에 나타내었다.
도 5a에서 확인할 수 있는 바와 같이, 64Cu-표지된 NOTA와 아자이드-작용화된 실리카 나노입자를 클릭 반응시킨 이후, 각 피크가 초기 위치 쪽으로 이동된 것을 알 수 있다. 또한, 도 5b에서 확인할 수 있듯이, 64Cu-표지된 NOTA를 ADIBO-작용화된 항체와 클릭 반응시킨 경우에도, 각 피크가 초기 위치 쪽으로 이동하였다. 이와 같은 결과로부터, 실리카 나노입자 및 항체가 모두 성공적으로 작용화되었다는 것을 알 수 있다.
한편, 작용화되지 않은 항체와 ADIBO-PEG4-maleimide(분자량 674.74g/mol)와 결합된 항체에 대해서 MALDI-TOF 질량분석기를 사용하여 질량을 분석하였다. 그 결과, 항체의 질량은 ADIBO-PEG4-Maleimide와 결합한 이후 약 2200g/mol 증가하였는데, 이는 ADIBO-PEG4-maleimide 3분자의 질량과 일치한다. 즉, 항체가 ADIBO-작용화되었다는 것을 확인할 수 있을 뿐만 아니라, 하나의 항체에 결합된 ADIBO 분자의 정량적인 함유량 또한 확인할 수 있었다.
실시예 5: 나노입자에 결합된 항체의 수의 정량적 평가
하나의 실리카 나노입자 상에 결합된 항체의 수를 정량적/실험적으로 평가하기 위해서 형광성 항체(FL-항체)를 실리카 나노입자와 클릭 화학을 이용하여 결합하는 실험을 진행하였다.
우선, FL-항체를 ADIBO-PEG4-maleimide를 사용하여 ADIBO-작용화하고, 그 다음으로 ADIBO-FL-항체의 농도를 늘려가면서 azido-실리카 나노입자와 클릭 반응을 진행하였다. 정량적인 분석을 위해 azido-실리카 나노입자의 농도는 추적 분석(nanoparticle tracking analysis; NTA)(NanoSightTM)을 사용하여 결정하였으며, ADIBO-FL-항체의 농도는 Nano-DropTM 분광광도계로 결정하였다. FL-항체 결합된 실리카 나노입자의 형광 신호를 형광 이미징 장치(IVISTM)를 사용하여 형광 이미지를 얻음으로써 측정하였다. 도 6에서 나타낸 바와 같이, 각각의 실리카 나노입자와 결합된 FL-항체는 ADIBO-FL-항체의 표준 곡선에 근거하여 정량적으로 분석되었다.
분석 결과, 230nm의 직경을 갖는 단일 실리카 나노입자의 표면에 약 450개의 항체가 결합되었다는 것을 확인할 수 있었다. 이론적으로 230nm 구체로 생긴 실리카 나노입자는 오직 항체의 직경(약 15nm)과 실리카 나노 입자의 표면적만을 고려할 경우 약 900개의 항체를 결합할 수 있는데, 전체-길이 항체 사이의 반발력을 고려할 때, 실리카 나노입자 상의 가용한 아자이드 작용기 대부분이 ADIBO-항체와 반응했다는 것을 확인할 수 있다.
이와 같은 결과는, 종래 기술의 EDC/NHS 커플링의 결합 효율(20% 이하)과 비교할 때 현저히 우수한 결합 효율을 나타낸다. 따라서, 본 발명의 방법에 따르면 선택적으로 표적가능한 나노입자를 제조하기 위해 필요한 항체의 양이 크게 감소할 수 있으며, 또한, 커플링 효율을 증가시킴으로써, 결합된 항체의 수도 크게 증가할 수 있다. 이는 본 발명에 따른 항체-결합된 나노입자가 매우 민감성이 높고, 결합 활성도 우수하다는 것을 의미한다.
실시예 6: 단일 실리카 나노입자에 결합된 항체들의 표적 능력
단일 실리카 나노입자에 결합된 항체들의 표적 능력을 평가하기 위하여, 형광 항원을 사용한 정량적 평가를 수행하였다.
항-인간 상피 증식인자 수용체(anti-human epidermal growth factor receptor 2; anti-HER2) 항체들을 본 발명에 따른 방법 및 종래의 EDC/NHS 방법으로 각각 실리카 나노입자와 결합하였다. 그 다음, 두 방법으로 결합된 anti-HER2-실리카 나노입자들을 각각 형광 염료(FNR-648)로 표지된 HER2 항원과 반응시켰다.
도 7c에서 확인 가능한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 단일 anti-HER2-실리카 나노입자는 약 800개의 형광 항원과 결합하였으나, EDC/HNS 커플링 방법에 의해 제조된 단일 anti-HER2 실리카 나노입자는 약 100개의 항원만을 포획하였다는 것을 알 수 있다. 실시예 5에서 확인한 바와 같이, 본 발명의 방법에 의해 제조된 단일 실리카 나노입자에는 약 450개의 항체가 결합되어 있다는 것을 고려할 때, 결합된 항체의 대부분이 생체활성이 우수하다는 것을 알 수 있다. 이는, 본 발명에 따른 항체 고정화 방법은 항체 내의 부위-특이적 티올 작용기만이 반응에 참여함으로써 항체의 생체활성을 저해하지 않기 때문이다. 반면, EDC/NHS 커플링 방법은 항체를 고정하기 위하여 항체 내에 무작위로 배치된 1차 아민 작용기를 이용하기 때문에, 항체와의 결합 효율이 낮고, 항체가 나노입자 상에 무작위 배향된 상태로 결합되기 때문에, 항체의 생체활성이 낮다는 것을 알 수 있다.
실시예 7: 표적 결합 능력
본 발명의 방법에 의해 나노입자에 결합된 항체와 종래의 EDC/HNS 커플링 방법으로 나노입자에 결합된 항체의 표적 결합 능력을 비교하기 위하여, 유방암 세포인 MDA-MB 231/HER2에 in vitro 면역분석법을 수행하였다.
선택적인 추적가능 나노프로브로서는, 실리카 캡슐화된 양자점을 내장시킨 실리카 나노입자(QD2)를 단일 양자점보다 훨씬 더 밝은 anti-HER2 항체와 결합하여 이용하였다. Anti-HER2-QD2의 표적 결합 능력 평가는 anti-HER2-QD2 처리된 암 세포의 형광 이미지(도 8)를 공초점 레이져 현미경(confocal laser scanning microscopy; CLSM)을 사용하여 얻음으로써 평가하였다.
도 8에서, 스케일바(scale bar)는 20㎛를 나타내며, anti-HER2-QD2는 붉은색으로 표시되고, DAPI(4,6-diamidino-2-phenylindole)에 의해 염색된 핵은 파란색으로 표시된다. 도 8a는 본 발명의 방법으로 제조된 anti-HER2-QD2 click에 의해 표적화된 암 세포의 형광 이미지이고, 도 8b는 종래의 EDC/NHS 커플링에 의해 제조된 anti-HER2-QD2 EDC/NHS에 의해 표적화된 암 세포의 형광 이미지이며, 도 8c는 음성대조군으로서, 항체가 결합되지 않은 소혈청 알부민(bovine serum albumin; BSA) 처리된 QD2를 사용한 형광 이미지이다.
도 8a 및 8b로부터 확인할 수 있는 바와 같이, 50pM의 anti-HER2 QD2가 세포에 처리되었을 때, 본 발명의 방법으로 제조된 anti-HER2-QD2 click가 anti-HER2-QD2 EDC / NHS에 비하여 훨씬 더 높은 표적 결합 능력을 나타내었다. 이는 본 발명의 방법으로 결합된 항체는 배향성이 제어되고 높은 결합 효율로 결합되며, 온전한 생체작용성을 나타내기 때문이며, 이와 같은 결과는 실시예 5에서의 정량적 평가 결과(본 발명에 의해 제조된 항체 결합된 실리카 나노입자는 EDC/NHS 커플링 방법보다 8배 뛰어난 표적 결합 능력을 나타냄)와도 일치한다.
한편, 도 8c에서 확인할 수 있듯, 항체가 결합되지 않은 BSA-QD2는 형광 이미지에서 관측되지 않았다.
실시예 8: 본 발명의 항체 작용화 방법의 적용가능성 평가
본 발명에 따른 항체 작용화 방법의 적용가능성을 평가하기 위해, anti-HER2 항체를 QD2, 표면 증감 라만 산란 나노프로브(surface enhanced Raman scattering nanoprobe; SERS Dot), 및 형광 SERS 점(F-SERS dots)의 실리카 캡슐화된 나노프로브와 각각 결합하였다. 그리고나서, SDS-PAGE 분석법을 이용하여 항체가 각각의 나노프로브와 어떠한 형태로 결합하였는지 분석하였다.
SDS-PAGE 분석한 결과, 도 9에서 확인 가능한 바와 같이, 모든 종류의 나노프로브에서 오직 SDS-PAGE 겔의 탑에서만 밴드가 관측되었다. 이는 모든 종류의 나노프로브에서 항체가 깨어짐 없이 성공적으로 결합하였다는 것을 의미한다.
이와 같은 결과는, 본 발명의 항체 작용화 방법을 이용한 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법이 캡슐화된 나노입자 내부의 구조와는 상관없이 모든 종류의 나노프로브에 항체를 결합시킬 수 있는 매우 넓은 적용 가능성을 갖는다는 것을 의미한다. 이 결과는 또한 본 발명의 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법이 유리 기판 상의 면역 센서에도 광범위하게 사용될 수 있다는 것을 의미한다.
이상의 설명으로부터, 본 발명이 속하는 기술분야의 당업자는 본 발명이 그 기술적 사상이나 필수적 특징을 변경하지 않고서 다른 구체적인 형태로 실시될 수 있다는 것을 이해할 수 있을 것이다. 이와 관련하여, 이상에서 기술한 실시 예들은 모든 면에서 예시적인 것이며 한정적인 것이 아닌 것으로서 이해해야만 한다. 본 발명의 범위는 상기 상세한 설명보다는 후술하는 특허 청구범위의 의미 및 범위 그리고 그 등가 개념으로부터 도출되는 모든 변경 또는 변형된 형태가 본 발명의 범위에 포함되는 것으로 해석되어야 한다.

Claims (27)

  1. 환원제를 이용하여 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드(disulfide)기를 티올(thiol)기로 환원시키는 단계; 및
    상기 티올기에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A를 연결시키는 단계
    를 포함하되,
    상기 항체와 환원제를 1:500 내지 1:1000의 몰비로 사용하는 항체 작용화(antibody-functionalization) 방법:
    [화학식1]
    R-L-A
    상기 식에서,
    R은 C6~C30의 알켄기 또는 알킨기, 또는 아자이드기를 나타내고,
    L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기를 나타내며,
    A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기를 나타낸다.
  2. 제 1 항에 있어서,
    상기 환원제가 2-머캅토에탄올 또는 다이클로로-다이페닐-트리클로로에탄(dichloro-diphenyl-trichloroethane; DDT)인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
  3. 삭제
  4. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 1의 R이 C6~C30의 알킨기인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
  5. 제 4 항에 있어서,
    상기 알킨기가 사이클로옥틴(cyclooctyne)기인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
  6. 제 5 항에 있어서,
    상기 사이클로옥틴기가
    Figure 112017027220117-pat00028
    ,
    Figure 112017027220117-pat00029
    ,
    Figure 112017027220117-pat00030
    ,
    Figure 112017027220117-pat00031
    ,
    Figure 112017027220117-pat00032
    ,
    Figure 112017027220117-pat00033
    ,
    Figure 112017027220117-pat00034
    ,
    Figure 112017027220117-pat00035
    또는
    Figure 112017027220117-pat00036
    인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
  7. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 1의 L이 (polyethylene glycol)4인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
  8. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 1의 A가 말레이미드기인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
  9. 제 1 항에 있어서,
    상기 화학식 1로 표시되는 화합물이 아자-디벤조사이클로옥틴-말레이미드(aza-dibenzocyclooctyne-maleimide; ADIBO-Mal), ADIBO-(폴리에틸렌글리콜)4-Mal(ADIBO-PEG4-Mal), ADIBO-S-S-Mal, N3-Mal, N3-PEG4-Mal 및 N3-S-S-Mal로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
  10. 제 1 항에 있어서,
    상기 항체가 IgG인 것을 특징으로 하는, 항체 작용화 방법.
  11. 나노입자의 표면에 아자이드(N3) 작용기를 도입하는 단계; 및
    상기 아자이드(N3) 작용기가 도입된 나노입자를 제 1 항의 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계
    를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  12. 제 11 항에 있어서,
    상기 나노입자가 실리카 나노입자 또는 실리카-캡슐화된(silica-encapsulated) 나노입자인 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  13. 제 12 항에 있어서,
    상기 아자이드 작용기를 도입하는 단계는 아자이드 작용기를 갖는 화합물을 나노입자 표면의 하이드록시기와 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  14. 제 13 항에 있어서,
    상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물이 에톡시실록산 말단을 갖는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  15. 제 14 항에 있어서,
    상기 아자이드 작용기를 갖는 화합물이 N-[3-(트리에톡시실릴)프로필]-2-아지도아세트아미드(N-[3-(triethoxysilyl)propyl]-2-azidoacetamide; NTPA)인 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  16. 제 11 항에 있어서,
    상기 아자이드 작용기가 상기 화학식 1의 R과 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응하는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  17. 제 11 항에 있어서,
    상기 나노입자가 실리카 나노입자, 양자점, 산화철(iron oxide), 업컨버전 나노입자(upconversion nanoparticle; UCNP), 표면 증감 라만 산란 나노프로브(surface enhanced Raman scattering nanoprobe; SERS Dot), 및 형광 SERS dot으로부터 선택되는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  18. 나노입자의 표면에 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계; 및
    상기 사이클로옥틴 작용기가 도입된 나노입자를 제 1 항의 방법에 의해 작용화된 항체와 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응시키는 단계
    를 포함하는 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  19. 제 18 항에 있어서,
    상기 나노입자가 표면에 올레산(oleic acid) 작용기를 갖는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  20. 제 18 항에 있어서,
    상기 사이클로옥틴 작용기를 도입하는 단계는 사이클로옥틴 작용기를 갖는 화합물을 나노입자 표면의 올레산 작용기와 반응시켜 이루어지는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  21. 제 20 항에 있어서,
    상기 사이클로옥틴 작용기를 갖는 화합물이 소수성 말단을 갖는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  22. 제 21 항에 있어서,
    상기 사이클로옥틴 작용기를 갖는 화합물이 ADIBO-PEG4-C18 또는 ADIBO-PEG2000-DSPE인 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  23. 제 18 항에 있어서,
    상기 사이클로옥틴 작용기가 상기 화학식 1의 R과 구리 촉매 없이 클릭 화학(Cu-free click chemistry) 반응하는 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조방법.
  24. 항체의 Fc 도메인 내의 디설파이드기가 환원되어 생성된 티올기에 하기 화학식 1로 표시되는 화합물의 A가 연결된 구조를 갖되,
    상기 환원이 환원제를 1:500 내지 1:1000의 항체:환원제 몰비로 사용하여 수행된 것을 특징으로 하는, 작용화된 항체(functionalized antibody):
    [화학식1]
    R-L-A
    상기 식에서,
    R은 C6~C30의 알켄기 또는 알킨기, 또는 아자이드기를 나타내고,
    L은 단일결합, C1~C18의 알킬기, 알켄기 또는 알킨기, -S-S- 및 (polyethylene glycol)n(n=1~6의 정수)로부터 선택되는 연결기를 나타내며,
    A는 말레이미드, SCN기, OCN기, 에폭사이드 및 C5~C12의 알킬할라이드로부터 선택되는 작용기를 나타낸다.
  25. 나노입자의 표면에 제 24 항에 따른 작용화된 항체가 고정된 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼.
  26. 제 25 항에 있어서,
    상기 나노입자가 실리카 나노입자 또는 실리카-캡슐화된 나노입자인 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼.
  27. 제 25 항에 있어서,
    상기 나노입자에 아미노산, 펩타이드, 단백질, 핵산, 비타민, 호르몬, 신경전달물질, 당, 킬레이트화제 및 형광염료로 이루어진 군에서 선택된 1종 이상이 추가로 결합된 것을 특징으로 하는, 나노입자-항체 결합 나노플랫폼.
KR1020170034521A 2017-03-20 2017-03-20 항체 작용화 방법 및 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 방법 KR101919427B1 (ko)

Priority Applications (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170034521A KR101919427B1 (ko) 2017-03-20 2017-03-20 항체 작용화 방법 및 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 방법

Applications Claiming Priority (1)

Application Number Priority Date Filing Date Title
KR1020170034521A KR101919427B1 (ko) 2017-03-20 2017-03-20 항체 작용화 방법 및 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 방법

Publications (2)

Publication Number Publication Date
KR20180106344A KR20180106344A (ko) 2018-10-01
KR101919427B1 true KR101919427B1 (ko) 2018-11-16

Family

ID=63877292

Family Applications (1)

Application Number Title Priority Date Filing Date
KR1020170034521A KR101919427B1 (ko) 2017-03-20 2017-03-20 항체 작용화 방법 및 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 방법

Country Status (1)

Country Link
KR (1) KR101919427B1 (ko)

Families Citing this family (1)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Publication number Priority date Publication date Assignee Title
WO2022214562A1 (en) * 2021-04-06 2022-10-13 Lumito Ab Functionalized nanoparticles

Non-Patent Citations (4)

* Cited by examiner, † Cited by third party
Title
Bioconjugate Chem. 2014, 25:1272-1281.*
DARU 2006, 14(1):51.*
Molecules 2013, 18:9833-9849.*
서울대학교 대학원 박사학위논문, 생체 내 다중 분자 진단을 위한 형광-라만 내시경 시스템에 관한 연구, 정신영(2016.8).*

Also Published As

Publication number Publication date
KR20180106344A (ko) 2018-10-01

Similar Documents

Publication Publication Date Title
Foubert et al. Bioconjugation of quantum dots: Review & impact on future application
Jeong et al. Highly robust and optimized conjugation of antibodies to nanoparticles using quantitatively validated protocols
Montalti et al. Dye-doped silica nanoparticles as luminescent organized systems for nanomedicine
Schieber et al. Conjugation of Transferrin to Azide‐Modified CdSe/ZnS Core–Shell Quantum Dots using Cyclooctyne Click Chemistry
Hainfeld et al. New frontiers in gold labeling
US6369206B1 (en) Metal organothiol particles
US7498177B2 (en) Quantum dots and their uses
US9395371B2 (en) Synthesis of fluorescent noble metal nanoparticles
JP5059117B2 (ja) 微細孔結晶及びそのコンジュゲートの調製方法
KR20050109455A (ko) 형광 실리카-기초 나노입자
JP2020520930A (ja) 機能性ナノ粒子及びそれを製造する方法並びに使用する方法
Quevedo et al. Streptavidin conjugation and quantification—a method evaluation for nanoparticles
Lišková et al. Conjugation reactions in the preparations of quantum dot-based immunoluminescent probes for analysis of proteins by capillary electrophoresis
US20220175978A1 (en) Functionalized silica nanorings, methods of making same, and uses thereof
Alric et al. Covalent conjugation of cysteine-engineered scFv to PEGylated magnetic nanoprobes for immunotargeting of breast cancer cells
Ji et al. Increased sensitivity in antigen detection with fluorescent latex nanosphere− IgG antibody conjugates
KR101919427B1 (ko) 항체 작용화 방법 및 나노입자-항체 결합 나노플랫폼의 제조 방법
US20240149245A1 (en) Ultrasmall nanoparticles and methods of making, using and analyzing same
JP5540867B2 (ja) 有機蛍光色素内包シリカナノ粒子、その製造方法、それを用いた生体物質標識剤
Malawska et al. Bioconjugation of Au25 Nanocluster to Monoclonal Antibody at Tryptophan
CN103901187A (zh) 纳米金靶向标记抗体复合物及其制备方法
KR101368076B1 (ko) 수용액에서 우수한 분산성을 가지는 표면 개질된 형광 실리카 나노입자 및 그 제조방법
EP4320436A1 (en) Functionalized nanoparticles
Yudhistira et al. Biotinylated fluorescent polymeric nanoparticles for enhanced immunostaining
JP2014149172A (ja) 新規なビーズアッセイシステム

Legal Events

Date Code Title Description
A201 Request for examination
E902 Notification of reason for refusal
E701 Decision to grant or registration of patent right
GRNT Written decision to grant